EVALUACIÓN DE LA REPARACIÓN CORNEAL EN ÚLCERAS …
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EVALUACIÓN DE LA REPARACIÓN CORNEAL EN ÚLCERAS INDUCIDAS
EXPERIMENTALMENTE Y CONTAMINADAS CON MORAXELLA OVIS EN
OVINOS TRATADOS CON PLASMA RICO EN PLAQUETAS SÓLO Y EN
COMBINACIÓN CON UN ANTIBIÓTICO
KAREN LORENA MONTOYA BERNAL
TUTORA:
DUNA YISELA TRUJILLO PISO
UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA
MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
IBAGUÉ -TOLIMA
2020
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Contenido
INTRODUCCION ..................................................................................................... 6
OBJETIVOS GENERALES ...................................................................................... 8
OBJETIVOS ESPECIFICOS .................................................................................... 9
MATERIALES Y METODOS .................................................................................. 10
RESULTADOS ....................................................................................................... 13
DISCUSION ............................................................. ¡Error! Marcador no definido.
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RESUMEN
La queratoconjuntivitis infecciosa es la alteración ocular más importante de los
rumiantes en el mundo, pues, aunque causa índices de mortalidad bajos, los índices
de morbilidad pueden llegar al 80% y sus consecuencias afectan directamente la
producción en el ganado. Diferentes factores influyen en la presentación de la
enfermedad, pero la presencia de Moraxella spp. es determinante. El objetivo de
este estudio es evaluar la reepitelización corneal en ovinos con úlcera corneal y
queratoconjuntivitis infecciosa inducida experimentalmente, tratados con plasma
rico en plaquetas (PRP) solo y en combinación con un antibiótico. Metodología:
fueron empleados 30 ovinos, distribuidos en 3 grupos. Los animales se sometieron
a queratectomía laminar superficial unilateral y posteriormente recibieron un inóculo
con una cepa de Moraxella ovis en la córnea. El primer grupo (G1) recibió
tratamiento con PRP 1ml vía subconjuntival, el segundo grupo (G2) recibió 1ml de
PRP subconjuntival y 50μl de gentamicina cada 8 horas aplicado por instilación,
durante 11 días. Un último grupo (GC) recibió tratamiento con 50μl de solución
salina cada 8 horas, durante 11 días. Diariamente el ojo ulcerado fue teñido con
fluoresceína y fue fotografiado para análisis de la velocidad de reepitelización con
ayuda de Software Image J. Cinco y once días después de la inducción experimental
de la úlcera corneal y la inoculación bacteriana, la mitad de los pacientes de cada
grupo experimental fueron sometidos a eutanasia y sus córneas colectadas para
pruebas adicionales a la reepitelización corneal. Resultados: el grupo control
mostró una mayor velocidad de regeneración del epitelio corneal con respecto al
grupo 1 y grupo 2, por tanto, existe evidencia estadística para afirmar que el plasma
rico en plaquetas retarda el proceso de reparación corneal.
Palabras clave: Moraxella spp, metaloproteinasas, ulcera corneal, plasma rico en
plaquetas, gentamicina, Soffware ImageJ.
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INTRODUCCION
La queratoconjuntivitis infecciosa de los rumiantes conocida con el nombre de “Pink
eye” o “enfermedad del ojo rosado” o IBK (Infectious bovine keratoconjunctivitis) es
una enfermedad cosmopolita, estacional que afecta a bovinos, caprinos y ovinos,
sin distinción de raza, edad y sexo, aunque los animales más jóvenes y mayores
son más susceptibles; se caracteriza también por una reacción inflamatoria aguda
de la conjuntiva, seguida de hiperemia de la esclerótica, lagrimeo, fotofobia y
secreción ocular [1].
El género de bacterias causantes de la IBK es Moraxella, siendo Moraxella bovis la
especie de bacteria principalmente aislada en bovinos [4,5]. M. ovis [6]. Moraxella
spp es el agente causal más importante en la aparición de la queratoconjuntivitis
infecciosa en los rumiantes, a pesar de que otros microorganismos pueden actuar
de forma concomitante, y han sido aislados en la microbiota conjuntival de animales
sanos y enfermos [2,3].
En ovinos y caprinos se reconoce como agente causal a Moraxella ovis
(Branhamella-Neisseria) [21,22], aunque algunos reportes han sugerido a
Mycoplasma conjunctivae como un agente etiológico probable [23,10]. En caprinos,
relatos aislados han reportado brotes de queratoconjuntivitis causados por
Moraxella bovis [24]
La bacteria es particularmente sensible a estreptomicina, gentamicina, neomicina,
oxaciclina, penicilina, sulfas y tetraciclina [7], pero en el tratamiento de la IBK, otras
opciones farmacológicas diferentes a antibióticos y no farmacológicas pueden ser
necesarias [8,9].
En el tratamiento de las ulceras corneales existen otros hemoderivados como el
suero sanguíneo y este sobresale en los resultados obtenidos con el plasma rico en
plaquetas (PRP). [10].
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El plasma rico en plaquetas es también un hemoderivado que puede emplearse en
el tratamiento de úlceras corneales y su papel terapéutico en éstos casos aunque
reciente, despierta el interés por un gran número de investigadores que procuran de
la manera más eficiente aprovechar las bondades de las plaquetas, pues
aproximadamente 30 sustancias biológicamente activas son encontradas de sus
gránulos alfa, dentro de los que se encuentran: Factor de crecimiento derivado de
plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante b (TGF b), factor de
crecimiento insulínico (IGF), factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), factor
de crecimiento epidermal (EGF), factor de crecimiento fibroblástico (FGF) [11].
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OBJETIVO GENERAL
Evaluar el proceso de reparación corneal en úlceras inducidas experimentalmente
y contaminadas con Moraxella Ovis en ovinos tratados con plasma rico en plaquetas
solo y en combinación con gentamicina.
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OBJETIVOS ESPECIFICOS
Determinar si el plasma rico en plaquetas contribuye en el proceso de
reepitelización corneal al reducir el área ulcerada en úlceras infectadas por
Moraxella ovis.
Evaluar la efectividad del plasma rico en plaquetas en úlceras corneales
contaminadas con Moraxella ovis en términos de tiempo, al acelerar o reducir
el proceso de reparación corneal.
Determinar si el plasma rico en plaquetas en combinación con gentamicina
es efectivo en el proceso de reepitelización corneal de ulceras infectadas por
Moraxella ovis, evaluado a través del tiempo y área ulcerada.
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MATERIALES Y METODOS
Animales
Treinta ovinos de pelo colombiano, adultos, machos, con peso promedio de
40kg. Los animales fueron clínicamente sanos, evaluados a través de un
examen clínico general y por la especialidad de oftalmología veterinaria.
Fueron asignados en corrales fijos, cubiertos por malla mosquitera, con
capacidad para 10 animales cada uno, en condiciones óptimas de
ventilación, bajo estrictos parámetros de limpieza e higiene, con dieta a base
de forraje de corte, concentrado y agua “ad libitum”.
Grupos experimentales y protocolos terapéuticos:
Fueron constituidos en 3 grupos de estudio con 10 ovinos en cada uno de
ellos. Todos los animales fueron sometidos a queratectomía laminar axial de
su ojo derecho e inoculados con Moraxella ovis.
Un primer grupo, (G1) fue tratado con 1ml de plasma rico en plaquetas,
aplicado por vía subconjuntival. El segundo grupo (G2) fue tratado con una
dosis de 1,0ml plasma rico en plaquetas aplicado por vía subconjuntival,
además de antibióticoterapia tópica con gentamicina 50µl dos veces al día
hasta la reepitelización de las lesiones. Un último grupo (GC) denominado
Grupo Control, que recibió tratamiento tópico con solución salina 50 µl tres
veces al día hasta el día 11 pos ulceración corneal o hasta la resolución de
la úlcera (Test de fluoresceína negativo).
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Cinco días después de haber realizado las lesiones corneales, 5 animales de
cada grupo fueron sometidos a eutanasia humanitaria con pentobarbital
sódico (Euthanex®) 100mg/kg [56]. Sus ojos fueron enucleados y las corneas
disectadas para evaluar el tejido corneal. El mismo procedimiento fue
desarrollado en los restantes 5 animales de cada grupo en el día 11 o cuando
el test de fluoresceína diera negativo.
Ulceración corneal
Medicación preanestésica fue realizada en cada animal con una dosis de
xilacina (0,1mg/kg) via intravenosa, inducción con propofol (4mg/kg) y
mantenimiento anestésico con propofol en infusión 0,5mg/kg/minuto [12]
Con el animal en decúbito lateral izquierdo fue realizada tricotomía periocular,
se procedió a la instilación de anestesia local con proximetacaina tópica y
antisepsia de la córnea y conjuntiva con yodopolivinil pirrolidona diluida en
solución salina fisiológica (1:50). El ojo fue centralizado con ayuda de sutura
de Nylon 6-0 a través de puntos directrices esclero-conjuntivales. La
queratectomía laminar axial fue realizada en el ojo derecho con ayuda de un
trépano de 6mm de diámetro y 300 μm de profundidad, bisturí de 3,5mm
angulado en 15 grados.
Plasma rico en plaquetas
Para obtener el plasma rico en plaquetas, se colectaron 12ml de sangre total
por punción venosa yugular. 1ml de sangre fue empelado para realizar un
cuadro hemático. La sangre restante: 11ml se dividió y se depositó en tres
tubos de ensayo estériles conteniendo cada uno 0,5ml de citrato de sodio y
se llevó a centrifugación por 5 minutos a 2.500 rpm, manteniendo
temperatura de entre 21-24°C y obteniendo así la clásica división de los
componentes sanguíneos: En la parte superior el plasma, seguido por una
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capa intermedia de leucocitos y una inferior conteniendo eritrocitos. Con la
ayuda de una pipeta Pasteur, se colecto 1ml de material localizado entre la
porción inferior del plasma y la porción superior de los eritrocitos se colecto
y transfirió para dos tubos de ensayo. El plasma rico en plaquetas obtenido
se mezcla en un solo tubo, de donde 1ml se lleva para conteo de plaquetas
con el objetivo de garantizar que la concentración obtenida en el PRP es
superior a la hallada en el cuadro hemático de sangre total [13].
CRITERIOS DE EVALUACION
Tiempo de reepitelización
Las córneas de los dos ojos fueron evaluados por biomicroscopía con
lámpara de hendidura y filtro azul cobalto antes y después de realizar
el test de fluoresceína, cada 24 horas, por el mismo observador,
inmediatamente después de haber sido realizada la ulcera corneal y
hasta que el test mencionado sea negativo.
Los ojos fueron fotografiados, a una distancia focal fija de 15
centímetros. Las imágenes fotográficas fueron evaluadas en Software
Image J, que cuantifica el área ulcerada y su evolución [14]. Las
imágenes fueron seleccionadas y el área ulcerada se marca y se
obtiene un valor de área marcada (analyze/measure), posteriormente
transformado en porcentaje por regla de tres simple y tabulado para el
estudio estadístico.
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RESULTADOS
Para realizar la comparación de la superficie ulcerada entre los grupos en cada uno
de los momentos de muestreo se utilizó ANOVA con un nivel de confianza del 95%.
Grupo control:
1. Se obtuvo una reducción del 14% del área afectada en las primeras 36 horas.
2. A las 72 horas se presenció una reducción del 67% en el área lesionada. 3. Se pudo evidenciar que en las 144 horas se demuestra una mejoría del
100% de la superficie lesionada. Grupo 1:
1. Se observó un descenso del 27% en las primeras 36 horas con la
aplicación del plasma rico en plaquetas. 2. En las primeras 72 horas se encontró una disminución del 43% en el área
lesionada. 3. En las 144 horas se observa una disminución del 43% en el área
lesionada. Grupo 2:
1. En las primeras 36 horas no se encuentra evolución.
2. En las 72 horas se disminuyó la lesión a un 24 %.
3. Observamos a las 144 horas una reducción del 67% de la lesión superficial.
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0
500
1000
1500
2000
2500
SU
PE
RF
ICIE
LE
SIO
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DA
(M
M)
MOMENTO DE MUESTREO
control Grupo 1 Grupo 2
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DISCUSIÓN
Algunos autores informan una mejora significativa de la ulceración cuando se usa
PRP reflejada en el tiempo de reepitelización y reducción del área. [10] PRP es una
fuente autógena, no tóxica y no inmunogénica de crecimiento que presenta, en su
constitución plasma, leucocitos y plaquetas. [13] El hecho de que las plaquetas
secreten factores de crecimiento y metabolitos activos significa que su uso aplicado
puede tener una influencia positiva en situaciones clínicas que requieren curación
rápida y regeneración de tejidos. [15]
El PRP contiene plaquetas que a su vez contienen factores de crecimiento (FC) y
algunos de estos FC, como los factores derivados de plaquetas (PDGF), factores
de crecimiento transformantes y (TGF- y TGF-), factores de crecimiento endotelial
vascular (VEGF), factores de crecimiento epitelial (EGF) y los factores de
crecimiento de tipo insulina I y II (IGF-I e IGF-II) están contenidos en sus gránulos
[18].
El PRP es una fuente de factores de crecimiento autógena, no tóxica y no
inmunogénica que presenta, en su plasma, leucocitos y plaquetas. El plasma
contiene varios factores de coagulación, leucocitos que proporcionan resistencia
natural a agentes infecciosos e inmunogénicos y plaquetas que sufren
desgranulación en los sitios de la lesión, liberando factores de crecimiento. [18]
Debido a que el PRP también mejora la cicatrización de la piel y la mucosa de los
tejidos blandos, se utiliza en injertos de tejido conectivo, injertos palatinos, injertos
gingivales, colgajos mucosos junto con compuestos activos sintéticos como el
Alloderm de BioHorizons Birmingham AL para cobertura radicular, sitios donantes y
receptores de injertos de piel, grasa dérmica injertos, estiramientos faciales,
blefaroplastia y cirugía de rejuvenecimiento con láser. [19
Autores como Marx (2004) y colaboradores, Tonzum y Demiralp (2004), sugieren
que el uso de PRP en úlceras corneales puede coadyuvar en el tratamiento ya que
la acción conjunta de estos factores da como resultado la señalización para que las
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células mesénquimales y epiteliales migren al sitio lesionado, experimenten división
mitótica, estimulen la síntesis de matriz y colágeno, lo que resulta en una curación
más rápida y eficiente. Además, otras proteínas plaquetarias como la fibrina,
fibronectina y vitronectina, actúan como moléculas de adhesión celular,
osteoconducción y osteoinducción. [18]
Lagnado y colaboradores (2004), determinaron que las gotas oftálmicas de PRP
pueden contener una gran cantidad de proteínas y por lo tanto podría ser un riesgo
significativo de contaminación microbiana, ya que no hay la posible presencia de
conservantes y debido a la posibilidad de toxicidad que estos pueden causar
excluyen cualquier efecto beneficioso del mismo. Igualmente, Poon y colaboradores
(2001), menciona que las gotas oftálmicas de PRP deben elaborarse, en
condiciones estériles e individualizada para cada paciente, pero no siendo libres de
riesgo de contaminación, tambien durante la preparación, almacenamiento y uso de
las gotas de PRP, se han reportado infecciones graves durante el uso de gotas para
los ojos, siendo probable que su almacenamiento y mal uso puede causar el
crecimiento de microorganismos patológicos. [17]
También se ha demostrado que el plasma rico en plaquetas tiene efectos positivos,
no solo sobre las células diana para los factores de crecimiento, sino también como
matriz extracelular, para la estimulación de la reparación, regeneración, o ambas,
del tejido de un modo global. Y a su vez se ha corroborado que produce cambios
clínicos notables sobre la piel envejecida, restaura la vitalidad cutánea, aumentar
su grosor, recuperar la consistencia elástica, mejorar la afluencia vascular, estimular
la tersura, el tono y su apariencia. Estos cambios a nivel periocular generan un mejor
aspecto de la región ocular, por consiguiente, una mejoría de la calidad de vida del
paciente afectado por patologías oculares. [21]
El PRP se empezó a utilizar, a diferencia de los otros tratamientos expuestos,
porque además de reparar una herida logra la regeneración de los tejidos perdidos,
que se define como la restauración del mismo sin que conserve su arquitectura
original ni tampoco su función, lo que ocasiona una cicatrización; por otro lado la
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regeneración tiene lugar cuando la restauración de dicho tejido posee propiedades
indistinguibles del original. El tejido cicatricial no recupera las propiedades
mecánicas ni la función fisiológica del tejido u órgano que ha sido dañado, por lo
que el interés en el PRP radica en regenerar, reconstruir la forma y restaurar la
función.
De tal forma, la estrategia terapéutica utilizando PRP se fundamenta en la
modulación y aceleración de los procesos regenerativos a través de los factores de
crecimiento presentes en las plaquetas, conocidos como iniciadores universales de
casi todo proceso de regeneración, por medio de los cuales se ha demostrado que
el factor de crecimiento epidérmico (EGF) está presente tanto en la secreción
lagrimal basal como refleja, en concentraciones algo inferiores a las que presenta
en el suero; su función es acelerar el proceso de migración de las células epiteliales.
Otro factor importante es el TGF-BETA implicado en los procesos de reparación
epitelial y estromal; tiene concentraciones en suero casi 3 veces mayores que la
encontrada en la lágrima. La fibronectina es un importante factor en la migración
celular, la cual está en concentraciones inferiores con respecto al suero. [22]
Panda y col. (2012) y Kim et al. (2012) compararon el tratamiento con gotas
oftálmicas de suero autólogo y plasma rico en plaquetas, como un complemento en
la terapia para las úlceras por quemaduras y para las úlceras indolentes en
humanos, respectivamente.
El PRP autógeno es una fuente segura de factores de crecimiento y plaquetas sin
riesgo de reacción inmune o transmisión de enfermedades ya que se obtiene de la
sangre del paciente. Por consiguiente han demostrado una gran efectividad a corto
plazo de un problema tan serio y severo como una perforación corneal debida a una
úlcera crónica. Por lo tanto, es una excelente alternativa al uso de membrana
amniótica en combinación con PRP y que se puede adquirir fácilmente, no caduca
ni requiere condiciones biológicas especiales para su conservación. Debido a esto,
esta membrana colágena es una buena opción para todos aquellos casos en los
que no se ven resultados positivos solo con el PRP. [23]
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El plasma rico en plaquetas es el único producto disponible que contiene altos
niveles de muchos factores de crecimiento. Estos factores de crecimiento se
mantienen precisamente en las mismas proporciones que se encuentran circulando
en el cuerpo. Aunque se dispone de productos recombinantes, estos productos
suelen ser derivados sintéticos de un solo factor de crecimiento. El pegamento de
fibrina es otro producto disponible para el médico que se ha utilizado previamente
en cirugía ocular. Sin embargo, las colas de fibrina actualmente en el mercado no
contienen ningún factor de crecimiento y son derivados de componentes
sanguíneos inactivados viralmente, extraídos de otros donantes. [24]
Dentro de estas terapias regenerativas se encuentran el plasma rico en plaquetas
(PRP) y las células madre (CM). El PRP ha sido utilizado en el manejo de diferentes
patologías, ya que brinda beneficios en cuanto al crecimiento y maduración ósea,
estabilización de injertos e implantes, hemostasia y sellado y cicatrización de
heridas. Esta preparación tiene como objetivo incrementar las probabilidades de
una eficiente recuperación de un tejido después de sufrir una lesión o una cirugía,
promoviendo la regeneración tisular, previniendo o tratando infecciones y
restaurando la función del tejido afectado. Por su parte, las CM también han sido
ampliamente utilizadas en el tratamiento de diferentes enfermedades, gracias a que
contribuyen a la reparación estructural y funcional de los tejidos puesto que cuentan
con propiedades antiinflamatorias, regenerativas, inmunomoduladoras,
antioxidantes y estimulantes de la angiogénesis. Teniendo en cuenta que las ulceras
corneales son una de las patologías oculares más frecuentes en la práctica de la
medicina veterinaria y que la falla en el tratamiento puede desencadenar en un daño
que comprometa la visión del paciente, el conocimiento de terapias alternativas en
el área de la oftalmología veterinaria es necesario, puesto que en muchas ocasiones
los tratamientos convencionales no son suficientes para la resolución de estas
lesiones. [26]
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Panda y col. (2012) encontraron una curación epitelial más rápida y una menor
opacidad corneal. Kim y col. (2012) midieron la cantidad de factores de crecimiento
(EGF y TGF-β) en ambas terapias y encontraron una mayor concentración de estos
factores en el PRP en comparación con el suero. Los autores concluyeron que la
alta concentración contribuyó a una recuperación más acentuada del defecto
epitelial y que el PRP tiene efectos más favorables que el suero autólogo para la
reparación de la córnea. Así, la principal diferencia entre el suero autólogo y el PRP
es la presencia de plaquetas, que contribuyen a la liberación de factores de
crecimiento en mayor número que el suero y por un tiempo de liberación más
prolongado, proporcionando así una curación más rápida (Alió et al., 2012; Panda
et al., 2012; Kim et al., 2012). [25]
De acuerdo con nuestro trabajo o nuestros resultados no concuerdan con lo dicho
por Acosta y colaboradores donde se considera que el uso de hemoderivados como
el suero sanguíneo es otra alternativa para el tratamiento de ojo seco severo
(síndrome de Sjögren, queratoconjuntivitis sicca), variedad de defectos epiteliales
persistentes y queratopatía neurotrófica. Aunque, otros estudios realizados en
pacientes con ojo seco no demostraron mejoría sintomatológica con el uso de suero
autógeno en comparación con el uso de lágrimas artificiales. Igualmente, Malavazzi
y colaboradores no evidenciaron que el suero autógeno fuera más efectivo que el
tratamiento con solución fisiológica en úlceras en ojo. [20]
Dentro de estas terapias regenerativas se encuentran el plasma rico en plaquetas
(PRP) y las células madre (CM). El PRP ha sido utilizado en el manejo de diferentes
patologías, ya que brinda beneficios en cuanto al crecimiento y maduración ósea,
estabilización de injertos e implantes, hemostasia y sellado y cicatrización de
heridas. Esta preparación tiene como objetivo incrementar las probabilidades de
una eficiente recuperación de un tejido después de sufrir una lesión o una cirugía,
promoviendo la regeneración tisular, previniendo o tratando infecciones y
restaurando la función del tejido afectado. Por su parte, las CM también han sido
ampliamente utilizadas en el tratamiento de diferentes enfermedades, gracias a que
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contribuyen a la reparación estructural y funcional de los tejidos puesto que cuentan
con propiedades antiinflamatorias, regenerativas, inmunomoduladoras,
antioxidantes y estimulantes de la angiogénesis. Teniendo en cuenta que las ulceras
corneales son una de las patologías oculares más frecuentes en la práctica de la
medicina veterinaria y que la falla en el tratamiento puede desencadenar en un daño
que comprometa la visión del paciente, el conocimiento de terapias alternativas en
el área de la oftalmología veterinaria es necesario, puesto que en muchas ocasiones
los tratamientos convencionales no son suficientes para la resolución de estas
lesiones. [26]
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