EVALUACIÓN DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL (EMR) POR CITOMETRÍA DE

FLUJO EN ONCOHEMATOLOGÍA:

EMR en Leucemia Linfoblástica Aguda

Elisa Sajaroff

72° Congreso Argentino de Bioquímica,

Ciudad Autónoma de Buenos Aires, 2017

• Identificación y cuantificación de células

patológicas en mínimas cantidades.

• Métodos disponibles: Técnicas de biología

molecular y por Citometría de flujo (en base al

inmunofenotipo aberrante de las células)

Enfermedad Mínima Residual (EMR)

En LLA, el sólo hallazgo de células con inmunofenotipo inmaduro, es suficiente para

calificar una muestra de M.O. con EMR positiva?

NO Dependerá del linaje de LLA y del momento de

tratamiento en que se encuentre el paciente.

• LLA-T

• La ontogenia T ocurre exclusivamente en timo, no hay células T inmaduras normales en médula ósea en ningún momento del tratamiento.

• LLA-B

• Día 15: Sin hematogonias (precursores normales linaje B).

• Día 33 (fin inducción): Aún sin regeneración normal B. Sólo linfocitos B maduros con o sin células plasmáticas.

• Semana 12 (fin consolidación): Proporción variable de

hematogonias en los 3 estadíos con o sin LB maduros y/o células plasmáticas.

• Pre Tx: generalmente % muy bajo de CD19+, con cantidad

variable de hematogonias, LB maduros y células plasmáticas.

Reconstitución linfoide durante el tratamiento ALL IC-BFM

Las células patológicas se identifican en base a su inmunofenotipo

anormal

es indispensable conocer el perfil antigénico normal en médula ósea en pacientes con y

sin tratamiento, así como en distintos estadíos del mismo.

Perfil antigénico normal en M.O. Linaje B Gate en SSC-CD19

Más perfiles normales B Gate en CD19+

Estandarización en la determinación de EMR para LLA-B • Panel anticuerpos • Método marcación y lisis • Cantidad de eventos a adquirir • Mínima cantidad de eventos identificados para cuantificar

CAMBIOS INMUNOFENOTÍPICOS:

Casi el 50% de las LLA-B- al día 15 los presentan

IMF: <CD10 pérdida CD34 >CD20 >CD45

No buscar células con el mismo inmunofenotipo del diagnóstico sino células aberrantes!!!

• Directamente proporcional Cantidad de

eventos adquiridos y tamaño cluster

• Considerar la > cantidad posible de aberrancias

Modulación antigénica

• Indispensable conocer el bkgd celular en cada estadío de tto.

Background celular

Factores que afectan la sensibilidad para la detección de EMR en LLA

Por qué es importante la determinación de EMR en LLA pediátrica?

• Es el factor pronóstico independiente más importante

disponible al día 15.

• EMR día 15≥10% factor independiente de riesgo de recaída.

EMR por CF en el I-BFM

ALL IC-BFM 2009 Standard Operating Procedure

4 color Flow MRD detection in ALL

Amendment to ALL IC-BFM 2009 Standard Operating Procedure

≥6 color Flow MRD detection in ALL

Version June 2014 M.N. Dworzak / J. Kappelmayer

Asignación de grupo de riesgo en LLA pediátrica según el protocolo ALL IC-BFM 2009

Asignación de grupo de riesgo en ALL IC-BFM 2009

• Edad

• WBC en sangre periférica • Anormalidades citogenéticas

y/o moleculares.

Diagnóstico

• Respuesta a la prednisona: Mala respuesta si ≥1000 blastos/ul en sangre periférica por observación morfológica.

Día 8

Risk group stratification in ALL IC-BFM 2009

Diagnóstico y día 8

Edad 1 - 5 años y WBC < 20000/ul y

Blastos D8 1000/ul

Edad <1 y 6 años y WBC 20000/ul y

Blastos D8 1000/ul

Blasts D8 1000/ul

t (9;22) ó t(4;11) o hipodiploidía < 44Cr

EMR por CF al día 15 <0.1% 0.1 y <10% 10%

RIESGO ESTANDAR

<10% 10%

RIESGO INTERMEDIO

RIESGO ALTO

Cualquier valor

Dist. Estimada ptes 13% 66% 21% Dist estimada recaídas 5% 22% 45%

• ≥2% de las cél nucleadas (syto+) Eritroblastos

• Cél nucleadas ≥ 30% del total o adquirir solo células syto+

• Mínimo 300000 cél nucleadas para sensibilidad 0.01% (1x10-4)

Celularidad

• Mínimo 30 eventos Tamaño de

cluster

Criterios evaluabilidad ALLIC-BFM

Impacto de la EMR por CR al día 15 Resultados de SAHOP

RE % RI % RA %

pre day 15 25,7 53,2 21,2

post day15 9,5 59,8 30,7

0 10 20 30 40 50 60 70

pre day 15

post day15

ALL-IC BFM 2009 Julio 2011- aún abierto 651 pts ingresados, 556 elegibles

24% de los pacientes fueron reasignados a un grupo de mayor riesgo.

Impacto de la EMR por CR al día 15 Resultados de SAHOP

Intensificación de la quimio para evitar una posible recaída

Personalización del tratamiento según la respuesta individual del pte al tto.

P-value: <0.00001

LFS (SE) (SR: n= 39): 94 (6)%

LFS (SE) (IR: n= 289): 83 (3)%

EFS (SE) (HR: n= 124): 58 (5)%

pSLL según los grupos de riesgo ALL IC-BFM 2009 (n= 452, SAHOP)

Impacto de la EMR por CF al día 33 y 78

EMR Grupo1

EMR Grupo 2

EMR Grupo 3

EMR Día 33

<0.1%

1 punto ≥0.1%

≥0.1%

EMR Día 78

<0.1% ≥0.1%

P-value: <0.00001

LFS (SE) (Grupo 1 n= 352): 83(3)%

LFS (SE) (Grupo 2 n= 74): 69 (6)%

LFS (SE) (Grupo 3 n= 25): 33 (11)%

pSLL según los grupos de EMR: 77 (3)% (n= 451)

Conclusiones I

1. Es indispensable la estricta estandarización de Ac,

método de marcación, lisis y análisis para la correcta

interpretación y comparación de resultados.

2. Se necesita un alto nivel de entrenamiento y

conocimiento sobre el inmunofenotipo de las células

presentes en cada etapa del tto.

3. La incorporación de EMR por CF al día 15 permitió que ¼

de los pacientes recibieran adecuación del tratamiento

según su respuesta.

Conclusiones

4. La EMR del día 33 y 78 permitió la identificación de

subgrupos de pacientes con mayor riesgo de recaída aún

en los grupos de riesgo intermedio y alto.

5. La EMR también se utiliza como parámetro de decisión

clínica así como de seguimiento en pacientes con

trasplante de células precursoras hematopoyéticas.

Servicio de Inmunología y Reumatología Laboratorio Inmunología Celular Jorge Rossi Andrea Bernasconi Elisa Sajaroff Raquel Mitchell Georgina Roffé Marianela Sanz

Servicio de Hematología y Oncología Maria Sara Felice Myriam Guitter Elizabeth Alfaro Cristian Sanchez LaRosa Cristina Alonso Patricia Rubio Adriana Medina

Muchas gracias por su atención