Evangelina Agriello

Bahía Blanca

Enfermedad residual mínima por Citometría de Flujo

Multiparamétrica en Leucemia Linfocítica Crónica

72º CONGRESO ARGENTINO DE BIOQUÍMICA, ABA

22 al 25 de agosto de 2017, CABA,

UTILIDAD DE LA EMR EN LLC

• Evaluar la respuesta a la terapia

• Identificar la cinética de la depleción tumoral

• Identificar la recaída

• Surrogate en ensayos clínicos y post transplante alogénico

Objetivo ACTUAL alcanzado por los Métodos de análisis de la EMR

Erradicación completa

de la LLC

Erradicación completa

de la LLC

Remisión clínica con ausencia de

EMR

en sp y mo

Erradicación completa

de la LLC

Remisión clínica con ausencia de

EMR

en sp y mo

<1 célula de LLC en 10000

leucocitos normales

Requerimientos actuales de los Métodos

PARA LA DETERMINACION de la EMR

ESTANDARIZABLE

Alta

específicidad

Alta

sensibilidad

Alta reproducibilidad

interlaboratorio

Independiente del tratamiento

Métodos actuales de análisis de EMR

ASO IGH RQ-PCR

Citometría de flujo

Análisis comparativo de Citometría de flujo vs ASO IGH RQ PCR gcllsg cll8 TRIAL

CF & PCR demuestran ser comparables para la cuantificación de EMR

con una sensibilidad de 10-4

PCR alcanza menores valores de EMR (<10-4 )

Bottcher et al .,Leukemia, 2009

ASO IGH RQ-PCR

Diseño paciente específico

Muy laborioso

Alto costo

Análisis de cada paciente

al diagnóstico

APLICABILIDAD TECNICA DE EMR

Técnica ASO IGH RQ-PCR

Citometría de

Flujo

Multiparamétrica

Sensibilidad

analítica

10-4

– 10-5

10-4

Aplicabilidad ~80%

>90%

Experiencia ++

++

Costo ++

+

Tiempo de proceso semanas 1 o 2 días

APLICABILIDAD TECNICA DE EMR

It is an independent scientific consortium that aims at innovation and standardization of flow cytometric immunophenotyping to

further improve and progress diagnostic patient care

JJM Van Dongen and A Orfao . Leukemia (2012) 26, 1899-1907

Citometría de Flujo Multicolor (8 colores) con Estandarización técnica completa

Seteo del instrumento Protocolos de Inmunofenotipificación (SOPs) Paneles que definen diagnósticos precisos

Desarrollo de nuevo software: Combinación de multiples tubos: cálculo y vista APS Mapeo de muestras de leucemias de diagnóstico y follow-up contra

templados de muestras “normales/control”

Desarrollo de protocolos a 8-colores para diagnóstico, clasificación y monitoreo de enfermedades hematológicas

Paneles diseñados para contester una pregunta clínica específica

JJM Van Dongen and A Orfao . Leukemia (2012) 26, 1899-1907

INSTRUMENT CONFIGURATION FACSCANTO II,

3 LASERS (4-2-2), BECTON DICKINSON

VIOLET LASER 425/50 525/50

405 nm Pacific Blue Pacific Orange

BD Horizon V450 BD Horizon V500

BLUE LASER 530/30 576/26 695/40 780/60

488nm FITC PE PerCP-Cy5.5 Pe-Cy7

RED LASER 660/20 780/60

633nm APC APC H7

Standard Operating Protocol SOP PARA EL

SETEO DEL INSTRUMENTO

Umbral: fijo a 10.000

Ajustar el voltaje para lograr el valor target medio para la ventana de la población linfoide

FSC:55000

(rango: 50000-60000)

SSC: 13000

(rango: 11000 – 15000)

50ul SP+2ml FACS Lysing + lavado con PBS – BSA

Seteo de FSC y SSC (FACSDiVa software)

APS Automatic Population Separator

LT CD8

LT CD4

Monocitos

Linfocitos T CD4+

Linfocitos T CD8+

Linfocitos B CD19+

Monocitos

•FSC •SSC

•FL1 •FL2 •FL3 •FL4

•FL3 •FL6 •FL7 •FL8

M5 M4 M3 M2

M1

M6

12 archivos fusionados de 2 centros

CD20+4/CD45/L+CD8/K+CD56/CD5/CD19/CD3/CD38

MFI (CV < 15%)

Centro A Centro B

Results of the Euroflow QA programme 6th round, on May 2015

CD5 CD19 CD8 T cell CD4 T cell B cell

CD5 CD19 CD8 T cell CD4 T cell B cell

Panel

standard International

4 colores consumen tiempoLeukemia (2007) 21, 956–964

κ λ CD19 CD5

CD20 CD38 CD19 CD5

CD81 CD22 CD19 CD5

CD43 CD79b CD19 CD5

CD45 CD14 CD19 CD3

Rawstron et al., Leukemia, 2007

Diseño de combinaciones de

marcadores dirigidos contra el

fenotipo aberrante de las

células patológicas

Control de contamination: LT y Mo

Determina el límite de detección

La menor variabilidad

interlaboratorio entre las

combinaciones testeados

Marcadores troncales

4 colores

κ λ CD19 CD5

CD20 CD38 CD19 CD5

CD81 CD22 CD19 CD5

CD43 CD79b CD19 CD5

CD45 CD14 CD19 CD3

6 colores

CD19/CD5/CD20/CD3/CD38/CD79b

CD19/CD5/CD20/CD81/CD22/CD43

8 colores

CD19/CD5/CD20/CD3/CD81/CD79b/CD22/CD43

ericll.org/projects

discriminación de

LLC de linfocitos B

normales

Leukemia (2013) 27, 142–149

4 colores

κ λ CD19 CD5

CD20 CD38 CD19 CD5

CD81 CD22 CD19 CD5

CD43 CD79b CD19 CD5

CD45 CD14 CD19 CD3

6 colores

CD19/CD5/CD20/CD3/CD38/CD79b

CD19/CD5/CD20/CD81/CD22/CD43

8 colores

CD19/CD5/CD20/CD3/CD81/CD79b/CD22/CD43

TUBE BV421 BV510 FITC PE PerCP-Cy5.5

PECy7 APC APC-C750

v7-1 CD27 CD3 CD79b CD5 CD22 CD19 CD200 CD81

v7-2 CD27 CD3 CD79b CD5 CD20 CD19 ROR1 CD81

ERICLL

discriminación

de LLC de

linfocitos B

normales

Conclusión

Aunque ASO IGH RQ- PCR logra mayor sensibilidad de detección (hasta1cel tumoral en 10

6 leucocitos), requiere mas tiempo, muestra al diagnóstico y

ensayo paciente específico

CFM es la técnica recomendada para EMR por las sgtes razones:

bajo costo

menor tiempo de procesamiento

un marcador de entidad, NO paciente específico

Mas colores, menos células, menos reactivos,

. . .analisis más simple con

Técnicas estandarizadas

Gracias !!