V. de los A. Páez et al.: Estudios meióticos en Agalinis fiebrigi i y A. genistifol ia154

Páez, Valeria de los A.; Aldo R. Andrada; Graciela E. Ruiz de BigliardoFundación Miguel Lillo. Miguel Lillo 251, (4000) San Miguel de Tucumán, Argentina.Autor corresponsal: paezvaleria@hotmail.com

Recibido: 13/10/15 – Aceptado: 30/11/15

Estudios meióticos en Agalinis fiebrigii y Agalinisgenistifolia (Orobanchaceae)

Resumen — Páez, Valeria de los A.; Aldo R. Andrada; Graciela E. Ruiz de Bigliardo.2015. “Estudios meióticos en Agalinis fiebrigii y Agalinis genistifolia (Orobanchaceae)”. Lilloa52 (2). Agalinis es un género americano y sus escasos antecedentes citogenéticos coincidenen que las especies de Norteamérica presentan números básicos x = 13, 14 mientras quelas especies sudamericanas x = 16. En este trabajo se analiza la meiosis y se estima laviabilidad del polen de A. fiebrigii y A. genistifolia, las únicas dos especies que se distribuyenen el Noroeste Argentino. El número gametofítico observado en ambas especies de n = 16es consistente con el número básico x = 16 presente en los taxones de Sudamérica. Duran-te la meiosis se observaron irregularidades y cuerpos extranucleares, que son reportados porprimera vez en Agalinis.

Palabras clave: Agalinis, cuerpos extranucleares, meiosis, viabilidad del polen.

Abstract — Páez, Valeria de los A.; Aldo R. Andrada; Graciela E. Ruiz de Bigliardo.2015. “Meiotic studies in Agalinis fiebrigii and Agalinis genistifolia (Orobanchaceae)”. Lilloa 52(2). Agalinis is an American genus and their few cytogenetic backgrounds agree that NorthAmerican species exhibit basic chromosome numbers x = 13, 14 and the species of SouthAmerica x = 16. In this work, meiosis and the pollen viability are analyzed in A. fiebrigii andA. genistifolia are estimated, the two unique taxa who grow in the Northwest of Argentina.The gametophytic number n = 16 present in both species is consistent with the previous re-port and agreed whit the basic number proposed for South American taxa. During meiosisnumerous irregularities are observed in ones specie and extra-nuclears bodies are reportedfor the first time in Agalinis.

Keywords: Agalinis, extra-nuclear bodies, meiosis, pollen viability.

INTRODUCCIÓN

En la familia Orobanchaceae, el géneroAgalinis Raf. es americano, compuesto porplantas herbáceas, sufruticosas propias deambientes húmedos como secos y en un am-plio rango altitudinal (Canne-Hilliker,1988). El género ha sido sometido a una ex-tensa revisión taxonómica avalada por estu-dios moleculares que reubicaron al géneroAgalinis en la familia Orobanchaceae, de suubicación anterior en Scrophulariaceae (de-Pamphilis et al., 1997; Wolfe y dePamphilis,1998; Yoder, 1999 y Stevens, 2001). Incluyeaproximadamente 70 especies y habita desdeel este de Estados Unidos, México, AméricaCentral hasta Sudamérica (Neel y Cum-mings, 2004). En América del Sur aunque se

encuentra en Brasil, Uruguay y Paraguay, lamayoría de las especies ocupan la regiónandina de Perú y Bolivia, mientras que enArgentina y Chile, están muy poco represen-tadas (Canne-Hilliker, 1988). En Argentina,Castro Souza (2008) cita tres especies Agali-nis fiebrigii (Diels) D’Arcy y A. genistifolia(Cham. & Schltdl.) D’Arcy en el Noroesteargentino (NOA), mientras que Agalinis com-munis (Cham. & Schltdl.) D’Arcy se distribu-ye más extensamente alcanzando el noreste,centro, parte de Cuyo hasta el norte de laPatagonia. Las especies del NOA son nativas,así A. fiebrigii es un subarbusto que habitadesde los 2000 a 4500 msnm y A. genistifo-lia también es un subarbusto pero hemipará-sito, que se ubica entre 0 y 3000 msnm (Cas-tro Souza, 2008).

Las especies sudamericanas de Agalinis,han sido muy poco estudiadas, son escasos

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los antecedentes de la variabilidad morfoló-gica, el comportamiento reproductivo, o losestudios citológicos, puesto que la mayorparte de la información proviene de las espe-cies norteamericanas. Así, para las especiesnorteamericanas de Agalinis y algunos géne-ros afines, Canne (1981, 1984) estableciódos números básicos x = 13 y x = 14. Sinembargo, Canne-Hilliker (1988) sugirió enlas especies Sudamericanas uniformidad enel número cromosómico gametofítico de n= 16 de modo que disiente con los antece-dentes de las especies de Norteamérica quemorfológicamente son menos diversas. Losantecedentes de las especies sudamericanaslas señalan diploides con n = 16 y 2n = 32cromosomas.

El objetivo del presente estudio es dar aconocer los números cromosómicos, gameto-fíticos, analizar el comportamiento del com-plemento cromosómico durante la meiosis yestimar por último, la viabilidad de los gra-nos de polen de Agalinis fiebrigii y A. genis-tifolia en poblaciones naturales de la provin-cia de Tucumán (Argentina).

MATERIALES Y MÉTODOS

Las muestras se recolectaron en regionesmontañosas de la provincia de Tucumán, de-positando el material de referencia en el her-bario de la Fundación Miguel Lillo (LIL).

Agalinis fiebrigii. ARGENTINA. Prov. Tu-cumán, Dpto. Tafí, El Rincón, 1850 m, 27/XII/2007, Andrada-Páez (610750 A-B LIL)(Fig. 1A).

Agalinis genistifolia. ARGENTINA. Prov.Tucumán, Dpto. Burruyacú, Sierra de Medi-na, 04/III/2009. Andrada-Páez (610032 LIL)(Fig. 1B).

Los botones florales jóvenes se fijaron enuna solución de alcohol etílico – ácido acé-tico en proporción 3:1 (Farmer); luego de 24horas se transfirieron a alcohol 70º y se con-servaron a -4ºC.

Se tomó como criterio para el análisis,la observación de un mínimo de 50 célulaspor cada estadio meiótico y se emplearontres técnicas de coloración que se detallan acontinuación:

Tinción con orceína acética: el materialse sometió a hidrólisis ácida con HCl 1N a

Fig. 1 A) Agalinis fiebrigii. B) Agalinis genistifolia.

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60ºC durante 15 minutos, luego los restosácidos fueron eliminados con agua destilada.La coloración y montaje de las preparacionesmicroscópicas se realizaron con solución deorceína acética al 45%.

Tinción con AgNO3: Las anteras fuerontratadas durante 1 hora con una solución en-zimática combinada (celulasa-pectinasa al2%), cumplido el tiempo se lavaron en aguadestilada. La preparación microscópica seobtuvo por aplastamiento con una gota deácido acético al 45%. Luego de 3 (tres) díasse procedió a la coloración con una mezclade AgNO3 50% en solución acuosa combina-da con dos gotas de solución reveladora co-loidal (2g gelatina + 100 ml agua destilada+ 1 ml acido fórmico) durante 20 minutos(Howell y Black, 1980). Los restos de la tin-ción argéntica se eliminaron por un lavadoen agua corriente durante 15 minutos. Elmontaje de la preparación microscópicapara la observación se realizó con una gotade agua glicerinada 10%.

Tinción con DAPI: el tratamiento previodel material destinado a esta tinción fueidéntico al de la tinción precedente. Despuésde 3 (tres) días se procedió a la coloracióncon DAPI propuesta por Schweizer (1976).

En la estimación de la viabilidad de losgranos de polen se empleó la solución deMüntzig de glicerina-carmín acético al 1%en la relación 1:1 (Sharma y Sharma, 1965).Se consideraron viables aquellos granos depolen que adquirieron coloración intensa.Para esta estimación se contaron 1500 gra-nos de polen por especie.

Las microfotografías se tomaron con unacámara Moticam 1000 adosada a un mi-croscopio óptico Nikon Eclipse E200. Lasmicrofotografías con fluorescencia se obtu-vieron con una cámara Olympus Qcolor5 deun microscopio Olympus BX43.

RESULTADOS

Los resultados de las observaciones sepresentan según las técnicas de coloraciónempleadas en cada una de las especies estu-diadas.

Agalinis fiebrigiiEn las células madres de polen (CMP)

analizadas con la tinción convencional, seidentificó el número gametofítico n=16 (Fig.2A). En profase y prometafase I se observaun único nucléolo. La diacinesis regular con16 bivalentes (16 II) es la más frecuente(89%), mientras que el porcentaje restantese distribuye entre las células con cromoso-mas homólogos sin aparear o apareados for-mando trivalentes en diferentes configura-ciones (Fig. 2B-C). Aunque se observaron ca-denas de cromosomas homólogos en prome-tafase, su frecuencia fue despreciable. Lametafase I (MI) fue regular, sólo en el 7% deellas, un cromosoma se muestra fuera de laplaca medial (Fig. 2D). El comportamientode los cromosomas fue normal en anafase I(AI) al igual que en la telofase I (TI). Lametafase II (MII), no mostró diferencias conla MI (Fig. 2E), pero en anafase II (AII) seregistró sólo un 3% de cromosomas rezaga-dos. La telofase II (TII) fue regular (Fig. 2F).

En el 45% de las células analizadas conigual técnica de coloración, se ha observadodesde MI hasta TII uno o más cuerpos ex-tranucleares de aspecto redondeado, simila-res al nucléolo. Este tratamiento ha puesto enevidencia una tinción diferencial de los mis-mos. La débil tinción de los cuerpos se dife-rencia claramente de los cromosomas homó-logos con fuerte heteropicnosis positiva enestas etapas (Figs. 2F). Asimismo como re-sultado de la meiosis se evidenció la forma-ción de tétradas, como así también móna-das y héxadas (Fig. 2G).

En las células meióticas de Agalinis fie-brigii cuando fueron sometidas a las técnicasde impregnación argéntica, los cuerpos ex-tranucleares adquirieron una coloración in-tensa, positiva mientras que los cromosomasmostraron un color claro, ligeramente ama-rillo (Fig. 2H-I). La utilización del marcadorfluorescente DAPI no arrojó resultados posi-tivos. Los cromosomas presentaron un aspec-to homogéneo ante la excitación con la luzultravioleta, mientras que los cuerpos ex-tranucleares se observaron de color gris,opaco, claramente diferente al que presenta-ron los cromosomas (Fig. 2J).

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Fig. 2. A-J) Agalinis fiebrigii: A) Diacinesis n = 16II. B-C) trivalente en diferentes configura-ciones. D) MI con cromosoma fuera de placa. E) MII con cromosoma fuera de placa. F) TIIregular con cuerpos extranucleares (flechas). G) Tétrada y mónada. H-I) MI y TI respectiva-mente con cuerpos extranucleares teñidos con AgNO3 (flechas). J) TI con cuerpos extranu-cleares con tinción DAPI (-) (flechas). K) Granos de polen viables con coloración intensa ygrano estéril no coloreado. 2A-J Escala = 6 µm, 2K Escala = 15 µm.

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La viabilidad de los granos de polen enAgalinis fiebrigii alcanzó el 97%, los viablesse mostraron intensamente coloreados,mientras que los inviables fueron de menortamaño y coloración tenue (Fig. 2K).

Agalinis genistifoliaEl número gametofítico observado en

esta especie fue n = 16 (Fig. 3A). Un úniconucleolo se presenta en profase I y prometa-fase I. La diacinesis mostró los 16 II. Asimis-mo el 37.5% de las células en MI mostraronsegregación temprana de un par de cromoso-mas (Fig. 3B) y en AI se detectó la formaciónde puentes de cromatina y cromosomas reza-gados (Fig. 3C). Fue algo mayor el porcenta-je (40%) de células en MII que exhibieroncromosomas fuera de la placa ecuatorial(Fig. 3D). El 37.5 % de las células en TIImostraron cromosomas rezagados. No seobservaron cuerpos extranucleares y la for-mación de tétradas fue regular.

En esta especie al igual que en Agalinisfiebrigii en las células tratadas con DAPI los

cromosomas se presentaron con tinción uni-forme sin identificación de bandas.

En A. genistifolia la viabilidad de losgranos de polen estimada llegó al 98%, losinviables, estériles, se tiñen débilmente y sereconocen también por su menor tamaño(Fig. 3E).

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

La familia Orobanchaceae contieneaproximadamente 2000 especies distribuidasen 89 géneros donde la mayor parte de elloslo componen plantas heterótrofas. Agalinis esun género americano con especies hemipará-sitas que habitan principalmente en Américadel Norte y por ello son las más estudiadas.Las características morfológicas, anatómicasy formas de vida entre otras, pone en eviden-cia menor variabilidad en las especies norte-americanas, que las poco investigadas deAmérica del Sur. Agalinis representa a ungrupo taxonómicamente difícil, sujeto a di-versas revisiones por las que se sitúa al gé-

Fig. 3. A-E) Agalinis genistifolia: A) Diacinesis n = 16II. B) MI con cromosomas adelantados.C) AI con cromosomas rezagados. D) MII con cromosomas fuera de placa. E) Grano depolen coloreado viable y estéril sin tinción. 3A-D Escala = 6 µm. 3D Escala = 15 µm.

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nero en la familia que actualmente lo inclu-ye y que asimismo brinda las evidencias dela monofilia de la misma (Pamphilis et al.,1997; Wolfe y dePamphilis, 1998; Yoder,1999; Stevens, 2001). Los análisis de ADNcloroplastídico establecieron claramente lasrelaciones filogenéticas en el género y entregéneros estrechamente relacionados (Bennetty Mathews, 2006).

Aunque no se pone en duda la monofiliade Agalinis como género, existe una claradicotomía de las características citológicasde estas plantas. Los recuentos cromosómi-cos efectuados para las especies de Nortea-mérica revelan dos números básicos x = 13y 14 (Canne, 1981, 1984; Canne-Hilliker,1988). Los análisis de secuencias de ADN degenes cloroplastídicos determinaron que unúnico evento evolutivo ocasionó la reduc-ción del número cromosómico n=14 an=13 (Neel y Cummings, 2004). Los pocosestudios que generan los antecedentes de es-pecies sudamericanas indican un númerobásico diferente x = 16 para Agalinis de Ar-gentina (citada para Buenos Aires), Uru-guay, Perú y Bolivia (Hunziker et al.,1985;Canne-Hilliker, 1988).

Nuestros resultados de los recuentos obte-nidos de Agalinis fiebrigii y A. genistifoliacoinciden con los antecedentes bibliográficosdel género en Sudamérica. Asimismo indicanla naturaleza diploide de estas especies y lamarcada estabilidad de los números cromo-sómicos x = n= 16 en contraste con las es-pecies del hemisferio norte donde habríanocurrido procesos que condujeron a la poli-ploidía y aneuploidía inter o intraespecífica.La poliploidía se puso en evidencia en losnúmeros cromosómicos gametofíticos deAgalinis linifolia (Nutt.) Britton de n = 28(Canne, 1984) y los recuentos 2n = 28 reali-zados por Kondo et al. (1981). Asimismo, laaneuploidía intraespecífica se pone de mani-fiesto con los recuentos esporofíticos de A.obtusifolia Raf. de 2n = 26 y 2n = 28, asícomo los de A. purpurea (L.) Pennell de 2n =28 y 2n = 30 (Kondo et al., 1981)

La estabilidad en el número cromosómi-co en el género n = 16 demostrado por lospocos antecedentes que se dispone de las es-

pecies de Agalinis, impide afirmar que estesea el único número cromosómico haploideya que aun falta conocer los complementoscromosómicos de otras especies de Américadel Sur.

La interpretación de los cuerpos redon-deados extranucleares con tinción diferencialrespecto al resto de cromosomas, que se pre-sentan en el citoplasma cuando el núcleo yla membrana nuclear pierden identidad du-rante la división es poco clara. Folgerberg(1938) los ha observado en especies del gé-nero Cuscuta y Ross (1981) en Cactaceae,quien intentó por intermedio del reactivo deSchiff conocer químicamente su naturaleza.Los resultados de esta reacción y la tincióncon DAPI en nuestras investigaciones dieronnegativa, indicando ausencia de ADN. Sinembargo demuestra presencia de proteínasposiblemente similares a las que se encuen-tran asociadas al ADN ribosómico al ser po-sitivo el tratamiento con impregnación ar-géntica de Howell y Black (1980).

La falta de señales con DAPI indica au-sencia de heterocromatina rica AT (adenina-timina). Los números cromosómicos encon-trados en Agalinis fiebrigii y A. genistifoliaestudiadas en la región montañosa de Tucu-mán y el análisis del comportamiento meió-tico representan las primeras investigacionesdel género en la región. La observación decromosomas rezagados o fuera de la placamedial indica que podrían ser los responsa-bles de la formación de mónadas y héxadasal final de la división con posible desarrollode gametas genéticamente desbalanceadas.Sin embargo la baja frecuencia de las ano-malías consignadas en los resultados noafectaría significativamente la viabilidad delos granos de polen; viabilidad que alcanzaen A. fiebrigii y A. genistifolia el 97% y 98%respectivamente.

Las dos especies estudiada Agalinis fiebri-gii y A. genistifolia tienen el complementohaploide n = 16 e irregularidades meióticasen muy baja frecuencia que no afectan sig-nificativamente la viabilidad del polen, locual asegura en parte el éxito reproductivode estos taxones.

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