Estudios experimentales en célulascultivadas del Linfoma de Burkitt *

INTRODUCCIONLa descripción de tumor de Bur-

kitt en el Africa,por Burkitten 1958'Y O'Conor en 1961' despertó granatención por su peculiar distribu-ción geográfica, ya qUe esta hizosospechar que la enfermedad fueradebida a un factor infeccioso trans-mitido posiblemente por un ortro-podo. La demostración hecho porEpstein y Borr, de partículas viralesen bropsios de casos africanos' y deNueva Guinea' en los años de 1964y 1967 respectivamente, contribuyóa que muchos estudios experimenta-les relacionados con el cáncer se fo.calizaran en este tumor. A partir delaño de 1964 estos virus se denomi-naron de Epstein y Barr 'o virus EB,en honor a los descubridores. En elmismo año Pulvertcít" consiguió es-tablecer cultivos celulares de biop-sias de un caso africano en las cua-les se descubrieron los mismosvirus.Los cultivos celulares sirvieron debase para diversos estudios inmuno-lógicos como los hechos por Henle ycolaboradores en 1966'quienescom-

• Trabajo hecho en el Laboratorio de Micros"copia Electr6nica y Cultivo de Tejidos, Sec-ci6n de Investigaci6n, Instituto Nacional deCancerolog!a, Bogotá.

•• Jele del Grupo de Microscopia Electr6nica,Instituto nacional. de Cancerolog!a. Profesorasistente de Patolog!a. Facultad de Medicina,Universidad Nacional.

Doctor JULIO ENRIQUE OSPINA"

probaron que los virus presentes enlas células inducían la formación deantígenos específicos, los cuales notenían reacciones cruzadas con nin-gún tipo conocido de virus Herpes,con los cuales fueron relacionadoslos virus EB.

En el año de 1967Klein y colobo-radares 1 demostraron la síntesis deotro antígeno dependiente de las cé-lulas tumorales y no de los virusformados en ella pero también es-pecífico de la enfermedad.

Otro importante hallazgo fue he-cho por Henle en el año de 196880:1descubrir la relación entre el virusEB y la mononucleosís infecciosa.Desde el establecimiento de 1'06 pri-meros cultivos celulares a 37°C, sevio que solcrnente del 0.5% al 10%de las células tenían virus. Para re-solver la dificultad que esto impli-caba en su purificación, Hinuma ysus colaboradores en el año de 1967·experimentaran sobre los electos dediversas temperaturas en la síntesisdel virus. Comprobaron que a 33°Cy bajo condiciones de desnutricióntotal se observaba síntesis viral enun 30% o 40% de células. La pre-sencia de los virus se estableció pormicroscopía electrónica 10 y técnicasinmunofluorescentes para el antíge-no descrito por los Henle.

REV. FAC. MED. U. N. COLOMBIA.VOL. 38, No 2. ABRIL-JUNIO1972

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La descripción de casos de tumorde Burkitt en Oolombia por Beltrány Correa 11 y 12 en el año de 1966 yen el Brasil por Fagundes en 196812

permitió iniciar estudios biológicostendientes a comprobar en pacientesLatinoamericanos con tumor de Bur.kitt, la presencia de virus similaresa los descritos en los casos africanos.

En el presente troboro se planteanlos siguientes interrogantes:

1. ¿Qué tipo de alteración me-tabólica sufren las célulos de estetumor cuando son cultivadas a 33°C?¿Serán sus características inmunoló-gicas iguales a las observadas enlos cultivos mantenidos a 37°C?

2. ¿Contienen los tumores de Bur-kitt colombianos virus EB y reaccio-nan sus cultivos celulares en formasimilar a los africanos, ante el cam-bio de temperatura?

MATERIAL Y METODOS

Células Africanas

Se usó la línea celular HRIK de-rivada por Hinumcr" de los cultivosestabLecidos por Pulvertaft". Comomedio de cultivo se empleó MEM(MinimunEsential Medium de Eagle)··suplementando con un 200!ode suerofetal de ternero y 20 ug de L-serina,IOO ug de piruvato de sodio, IDO ugde estreptomicina, IDO unidades depenicilina por mI. Esta mezcla sedenominó MMEM. Las células seincubaron en concentraciones de1.000.000por m!' a 37° y 33°C enuna incubadora marca NationaI. El

REVISTA DE LA FACULTAD DE MEDICINA

crecimiento celular se controló cada2 o 3 días por medio de recuentosy colorcción con azul de tripano. Sele administró en nuevo medio de cul-tivo los mismos intervalos de tiempo,a las céluLas a 37°. En lo referentea las técnicas inmunofluorescentes,los frotis celulares se prepararon enla siguiente forma:

1. Se lavaron las células con PBS(Tampón Fosfato Salino) a un pHde 7.2,

2. Se centrifugó el material a IODOrpm. por IO minutos y el sedimen-to se disolvió en el mismo tampón,en concentraciones de 500.000 y1.000.000de células en volúmenes de0.2 ml,

3. Se colocaron gotas del mismomaterial sobre láminas de vidrio yse fijaron en acetona durante ID mi-nutos después de haberlas secadoa tempeartura ambiente.

""¡,4. Las células se colorearon con

isotiocinato de fluoresceína combi-nado con suero específico (1;1O), pormedio del método directo. En algunosexperimentos se siguió el método in-directo para el estudio de la inmuno-globulinas G y M, por medio deluso de suero de carnero antihumanocomo segundo reactivo.

En cada lámina se contaron en-tre 500 y 700 células uséndoss, tan-to la luz ultravioleta como blan-ca. El porcentaje de células positivasse calculó dividiendo el número decélulas fluorescentes por el númerototal de células examinadas.

y.-.•.....'ESTUDIOS EXPERIMENTALES EN CELULAS CULTIVADAS DEL LINFOMA DE BURKITT 95

Células Colombianas

Casos clínicos.

Caso N9 1 En un niño de 4 años, natu-ral y procedente de Sogamoso, consultó auna Institución hospitalaria por presentaruna masa de 8 x 5 cms. en la región sub-maxilar izquierda. El tumor tenía 3 mesesde evolución y era de rápido crecimiento.Una biopsia del mismo se diagnosticó comolifoma de Burkittt. No se encontraron eelu-las inmaduras en sangre periférica. El pa-ciente fue tratado con radioterapia sobre lazona tumoral y metotrexate. Poco antesde su muerte presentó ictericia obstructiva.La auptosía reveló un tumor retroperito-neal de 20 x 15 x 15 cms. el cual reem-plazaba la casi totalidad del páncreas ycomprimía el hilio hepático. (Fot, 1>' Tam-bién se encontró infiltración tumoral enambos riñones.

Del tumor retroperitoneal se extrajo te-jido para cultivos celulares y estudios almicroscopio electrónico.

Caso N9 2. Una niña de. 6 años de edad,natural y procedente de Bogotá, consutó asu médico por presentar adenopatías cer-vicales de 2 meses de evolución. Le receta-ron antibióticos y drogas anti-inflamato-rias. Dos meses más tarde presentó unamasa en la región cervical derecha de 7x 5 cms. El examen físico reveló otra masaen la región pélvíca. Se le hizo una lapa-rotomia exploradora, encontrándosele untumor de 6 cms. en el ovario derecho ycompromiso tumoral del izquierdo. Se lepracticó ooforectomía bilateral y biopsia dela masa cervical. Del tumor ovárico dere-cho se extrajo tejido para cultivos celula-res y microscopía electrónica. El examenhístopatolégíco de los tejidos reveló un lin-foma de Burkitt. No se encontraron célulasinmaduras en sangre periférica.

La paciente fue tratada con radioterapiay ciclofosfamida sin éxito. Falleció en insu-ficiencia respiratoria y no se le practicóautopsia.

Establecimiento de los cultivos celu-lares.

Los tejidos extraídos bajo condicio-nes asépticas Se lavaron en CMF-PBS (Tampón Fosfato Salino libre deCalcio y Magnesio). Fueron reduci-dos a fragmentos de 1 mm. y digeri-dos con tripsina según la técnica deMerchant, Kahn y Murphy. ,.

Las células así obtenidas se incu-baron en frascos MA de Microbiolo-gioal Associates, en concentracionesque variaron entre 250.000 y 500.000por ml, de MEMEM, a 37°C. El creci-miento celular se controló en la for-ma ya mencionada y una vez esta-blecida la cepa celular, se procedióa cultivar parte de ella a 33°C.

Microscopia electrónica

Los cultivos se estudiaron con in-tervalos de 3 días. Biopsias y culti-vos se fijaron en glutaraldehido ,. di-suelto en solución salina de Hank 17

en una concentración del 30/0, a 4°Cy durante 5 horas. Se usó tetróxidode 'osmio 18 como post-fijador, en con-centración del 2% en la misma solu-ción salina y bajo condiciones simi-lares cr las del glutaraldehido. Los te-jidos fueron deshidratados según lastécnicas descritas para microscopiaelectrónica ,. e incluidos en Epon-Araldita según el método de MoHen-hauer '0. Los cortes se llevaron a ca-bo en un ultrarniCI'otomoMT2 Porter.Blum y el material obtenido, exten-dido sobre rejillas recubi:ertas de co-lodión, Se impregnó con acetato deuranilo 01 y citrato de plomo". Los

96 . REVISTA DE. LA FACULTAD DE MEDICINA

tejidos fueron examinados en un mi-croscopío electrónico JEM7A con unvoltaje de aceleración de 80 kilovol-tíos.

RESULTADOS

Células Africanas.

Un 8'% de las células incubadas a37°C presentaron inmunofluorescen-cia positiva para el antígeno deHenle (o sea la síntesis de Virus).

El 900/0de las células a esta tem-peratura. estaban vivas. Estas cifrasfueron consideradas como las deltiempo O, al inicio de los experimen-tos. Los cultivos a 33°C presentaronun continuo aumento del número decélulos fluorescentes, las cuales fue-ron un 38% del total al octavo día.Por el contrario, el porcentaje de cé-lulas vivas descendió hasta alcanzarniveles del 35% en el mismo día.

En esta .fase, la fluorescencia celu-lar era de tipo difuso, observándosetanto alrededor del núcleo como de]citoplasma de la célula. Los bordescelulares eran fácilmente identifica-bles sin que se observara un efectocitopático generalizado (Fotos 2 y 3).

Las células ínmunofluorescentes as-cendieron hasta el 400/0en el día 14del experimento, siendo las céLulasvivas apenas el 28% del total. Lainmunofluorescencia observada eramás del tipo puntiforme aunque nobien delimitada. Las células mostra-ron avanzado estado de citólisis, ca-racterizado por bordes nucleares ycitoplasmáticos borrosos y una altatransparencia celular (Fots. 4 y 5).

Los hallazgos de Hinuma' se con-firmaron en esta forma.

Con el propósito de determinar sialguna de estas células se adapta-ban a las nuevas condici'onesde cre-cimiento (33°C) y estudiar sus carac-terísticas inmunológicas, se inició lanueva fase del experimento. Las mis-mas células fueron centrifugadas abajas revoluciones (1000rpm. por 10minutos), los sedimentos celulares la-vados en lo forma descrita en mate-rial y métodos y los nuevos cultivosalimentados con MEMEM.Se mantu-vo la misma temperatura del cultivo(33°C) y su crecimiento y síntesis vi-ral se controlaron con intervalos de4 días, durante 130 días.

En el día 70 las células comenza-ron apresen tar evidencias de adap-tación a sus condiciones ambienta-les (33°C). El porcentaje de célulasvivas .fue deL80% y el de células m-munofluorescentes positivas del 8, enel día 97 del experimento. En el día106, la p'Ositividadpara inmunofluo-rescencia descendió al 10% y las cé-lulas vivas representaron el 88% deltotal. (Gráf. 1). Como Se trataba deuna cepa celular libre de virus (ne-gativa para las técnicas inmunofluo-rescentes que determinaron el ontí-gen·o de Henle' Se 1Iadenominó JOScon el propósito de diferenciarla dela cepa oríqincd HRlK de Hínumo."Se pensó entonces en invertir lascondiciones del experimento y culti-var parte de las nuevas células adap-tadas, a 37°C. Estas células se de-nominaron J-l16 (37°C) para dife-renciorlos de las de JOS (33°).

LINFOMA DE BURKITT - J PRODUCCION DE

UNA LINEA CELULAR LIBRE DE VI RUS.

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715

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0000 10 20 30 40 eo 60 70 lO 10 100 110 120 130 140 I!IO

DI AS. e o n·v.·n e ion e s :-4 Viobilidad_-/_ l. f. _

Gráfico 1Sobre el borde izquierdo se anotan los porcentajes de las células vivas (viables). Lalínea inferior marca los días de duración de· los cultivos. La línea continua indicael número de células vivas y la de rayas el número de células fluorescentes o seacon virus. Se nota que el nivel más alto de inmunofluorescencia corresponde a uno

de los porcentajes más bajos de células vivas.

98 REVISTA DE LA FACULTAD DE MEDICINA

DiveI'S'OSexperimentos tendientes ainducir síntesis de virus EBpor partede las nuevas células demostraronla incapacidad de éstas para hacer-lo.

En sus estudios, Hinuma' así comoHenle" comprobaron que las célulasHRIK producen solamente Inmune-globulina M (IgM).Pensando en unaposible relación entre la síntesis viraly la producción de ciertas inmune-globulinas, se estudió si las célulasJOS (33°C) así como las J-ll6 (37°C)continuaban presentando aquellascaracterísticas. Se iniciaron cultivosen idénticas condiciones, de todas lascélulas mencionadas, las cuales secontrolaron del día O al 10.

Las célukrs HRlK fueron negativaspara IgG y positivas para IgM lacual alcanzó su nivel máximo en eldía 3 (10.9%).

Las células JOS presentaron altosniveles de IgG desde el día O, con unmarcado aumento en el día 3 (64.3%)y descenso continuo a partir de dichodía hasta el día 10 (9.80/0).Los ni-veles de IgM fueron siempre más al-tos que en las células HRlK aunquetambién descendieron progresiva-mente durante todas las fases delexperimento (64.2%) en el día O y11.1% en el día 10).

Lo mismo se observó en las cé-lulas J-ll6 aunque los porcentajesde ambas inmunoglobulinas fueronsiempre más altos en las células in-cubadas a la temperatura más baja(JOS). (Gráf. 2).

L1amóla atención el continuo des-censo de las inmunoglobulinas du-rante los diversos días de la experi-mentación y aunque no se observa-ron virus, se pensó que podría seruna consecuencia de cambios sufri-dos por las células los cuales pre-cederían a la síntesis viral.

Con esto en mente, se experimen-tó sobre el efecto de la infección delvirus EB,a 37°C y 33°C, en las cé-lulas JOS y J-116.Se usó cómo con-trol la cepa celular 64-10establecidapor Iwakata y Grace en 1964" deuna leucemia mieloblástica. Estas cé-lulas se escogieron por su probadacapacidad de ser infectadas con elvirus EB."

Las células 64-10 con y sin virusEB, fueron negativas para IgG du-rante todo el experimento y en lasdos temperaturas. Sus niveles defluorescencia, indicativos de la in-fección de virus EB, fueron más al-tos a 33°C. Los datos recogidos tan-to de las células JOS como de lasJ-116demostraron claramente que latemperatura más baja (33°C) aumen-ta la síntesis de virus. De estos datostambién se pudo concluir que la sín-tesis de IgG ocurría en forma inver-sa a la síntesis viral. Las células sinvirus EB (sEB), presentaron siempreniveles de IgG sensiblemente más al-tos que los de las células infectadas.

A partir del día 7 no fue posibleestudiar la IgG por causa de sus ba-jos niveles (Gráf. 3).

ESTUDIOS EXPERIMENTALES EN CELULAS CULTIVADAS DEL L1NFOMA DI': BURKITT 99

PRODUCCION DE INMUNOGLOBULINAS EN VARIAS LINEAS CELtmARES

HRIX JOSR2X J. 118DlA IGG IGM IGG IGM IGG IGM

O 0% 3.7% 40.9% 64.2% 8.0% 10.6%3 0% 10.9% 64.3% 47.3% 28.7% 44.5%5 0% No Detect. 53.2% 20.4% 44.0% 25.8%7 0% 19.2% 23.9% 15.2'% 6.8%10 0% 9.8'% 11.1% 11.5% 26.2'%

NO? 2. Resume la producción de inmunoglobulinas en las diversas líneascelulares estudiadas.

HRlK: C10na de Hinumo derivada del linfoma de Burkitt.JOS: Línea celular derivada de la HRIK y mantenida a 33°C.J-116:Corresponde a la línea celular JOS cu1tivada a 37°C.

Se observa que tanto la JOS como la J-116 sintetizan IgG, hecho que lasdiferencia de las células que las 'originaron (HRIK). También sus nivelesde 1GMson sensiblemente más altos.

INFECTMDAD DE VIRUS DE BURKITT EN TEMPERATURAS DIVERSAS

37°C 33°C4 DlAS 7 DlAS 4 DIAS 7 DIAS

l. F. IGG l. F. IGG I.F. l. F. IGG l. F.

64-10 c EB 13.7% 0.0% 5.5% 17.0% 0.0'% 18.3%64-10 s EB 0.0% 0.0% 0.0'% 0.0% 0.0% 0.0%JOS e EB 13.0% 4.4% 13.6% 46.7% 10.4% 20.7%JOS s EB 0.0% 16.9% 0.0% 0.0% 30.9% 0.0%J-116 c EB 28.1% 7.8'% 22.5% 46.3% 8.7% 25.7%T-ll6 s EB 0.0% 24.1% 0.0% 0.0% 44.7% 0.0%

N9 3. Resume la infectividad del virus EB a 37°C y 33°C.

Las células 64-10 (leucemia mieloblástica) se usaron como control.

Los datos indican fenómenos de competencia entre la síntesis de IgG y lainfección por virus. También s'e puede observar que la temperaturamás baja aumenta la concentración de los virus.

1. F. 1nmunofluorescencia indicativa de infección viral.IgG. Porcentaje de inmunoglobulina G en las células infectadas.cEB. Células infectadas con virus EB.sEB. Células no infectadas.

100 REVISTA DE LA FACULTAD DE MEDICINA

Células colombianas

Los hallazgos morfológicos fueronsimilares en ambos cosos.

La microscopía de luz mostró elcuadro típico de liníomo de Burkitt.

Las células eran redondas, con nú-cleos ovoides y nucléolos prominen-tes. El citoplasma era moderadamen-te bosófilo. En medio de las célulastumorales se vieron numerosos hís-trocitos no neoplásicos. El conjuntopresentó el llamado cuadro del cieloestrellado (Foto 6).

Ah 'microscopio electrónico se en-contró que el tumor estaba com-puesto por células con núcleos re-dondos u ovales que presentabannucleolos en número de 2 o 3 y conabundante eucromatina. Los cito-plasmas mostraron mitocondrias alar-gadas o redondas, generalmente po-larizadas en un extremo de la cé-lula. El retículo endoplasmático eraescaso o ausente y se vieron abun-dantes poliribosomas libres en e~ ci-toplasma celular. En este último seobservaron también numerosas va-cuolas así como vesículas y túbuloscaracterísticos de aparatos de Golgi.

No se encontró retículo endoplas-mático liso. (Fotos 7, 8, 9). Estas cé-lulas se clasificaron como del tipolinforeticular indiferenciado. En losdos casos se encontraron virus deforma cúbica. Algunos con sus cap-sides vacías, otros con nucleoidesdensos impregnados con uranilo locual comprobó su composición por

DNA. Estos virus midieron en prome-dio 120 milimicras.

Se estudió el crecimiento de estosvirus en cultivos celulares. Los delcaso N<?1 se descartaron por conta-minación bacteriana. Los del casoN9 2 crecieron satisfactoriamente yfueron mantenidos vivos durante 95días. A 37°C se vio síntesis intra-nuclear de los virus y maduraciónposterior de los mismos en e1 cito-plasma celular. Allí se rodeoron demembranas sintetizadas por la célula,para ser posteriormente transporta-dos en el Interior de vesículas hastalos bordes citoplasmáticos para suposterior eliminación en el espacioexterior. Todo este proceso se pre-sentó entre los díos 6 y 10 del cul-tivo (Fotos 10, 11, 12).

A 33°C las cé1ulas reaccionaronen forma similar a sus homólogasafricanas. A partir del día 12 se notóaumento en el número de partículasvirales intracelulares. Este se correla-cionó con severos fenómenos dege-nerativos indicativos de muerte ce-lular. Tanto los núcleos como los ci-toplasmas se volvieron casi transpa-rentes notándose en los últimos de-generación mitocondria1, ausencia deribosomas y numerosas vesículas.Otras células mostraron disoluciónde las membranas nucleares y extra-vasación de material nuclear al cito-plasma. En la membrana celular sevieron digitaciones prominentes ca-racterísticas de fenómenos citopáti-cos (Fotos 13, 14, 15).

Fig. 2 - Células culti.vadas del tumo'/' estudiadaspor la técni.ca de anticuerpos fluorescentes es-peC'Íficos para el anHgeno de Henle (indicativode la síntesis de virus EB.J. La fluorescencia esdifusa y ocasionalmente puntiforme. Los bo'/'descelulares son nUidos. Be pueden ve'/' bandas bri-llantes en células pa'/'cialmente fluorescentes.Día 8 del cultivo a 339C de las células africanas.

x 400.

Fig. 1 - Caso Colombiano N9 1. Be puede ob-servar la cara inferior del Mgado sobre la parteizquierda. El duodeno está abierto y presentaun n6dulo tumoral. A la derecha de este se veel colédoco dilatado. El corte cOTresponde al tu-mor que infiltra la mayor parte del páncreas.

Fig. 3 - Día 8 del cultivo a 33.0 de la8 célulasotricamae. x 400.

Fig. 5 - Se ve una de las célula8 de la faseanterior con un mayor aumento. N6te8e 108 bor-de8 borr0808 tanto del citopla8ma como del nú-cleo. Día 14 del ouitioo" a 33.0 de las célula8

africa.na8. x 1000.

Fig. 4 - La [luorescencu» es difu8a. Llama laatenci6n que la8 célula8 tienen borde8 borr0808y en aiowna« dreas 80n casi tstmeparentes, pre-sentando avanzado estado citopdtico. Día 14 delcultiVo a 33.0 de la8 células africanas. le 400.

Fig. 6 - Fotografía a un bajo aumento del cortede la biopsia del ceso N. $. El aspecto -mortoto-gico del ceso N. 1 es similar a este. El cuadroes muy monom6rfico. Las células tumoralespresentan núcleos redondos. Entre ellas se venabundante8 histiocit08 no neopld8ic08. Bste as-pecto corresponde al llamado cielo estreltado quese ve en e8ta enfermedad aunque no es patog-

nom6nico de ella.

Foto 7

Fotografía al microscopio electrónico de la biopsia del caso colombiano N9 l. Seobserva una buena relación nucleo-citoplasmática. Los núcleos son ovales y com-puestos por eucromatina. Nótense 3 nucleolos en una célula. En el citoplasma no seobserva retículo-endoplasmático. Las zonas de síntesis proteica están representadaspor nu:merosos poliribosomas libres. Nótense mitocondrias localizadas sobre uno delos polos de la célula. También se ven las vesículas. x 4700. N: núcleo. C: citoplasma.

M: mitocondrias

Foto 8

Corresponde a las mismas células de la fotografía anterior. En la parte central seven los túbulos y vesículas característícos del sistema de Golgi. En la parte superiorse ven membranas citoplasmáticas libres de ribosomas. x 2100. C: Sistema de Golgi.

Foto 9Corresponde a las mismas células de las fotografías anteriores. A la izquierda se veel núcleo con sus membranas bien definidas, las cuales presentan ocasionales pro-yecciones hacia el citoplasma. Se ven diversos sistemas de Golgi y mitocondrias. Lospoliribosomas son abundantes. x 9500. C: Sistema de Golgi. M: mitocondrias. N: núcleo.

C: citoplasma.

Foto 10

Corresponde al caso colombiano NQ 2. a 37. C. En el nucleolo se notan diversaspartículas virales de forma cúbica. Algunas de ellas empiezan a formar nucleoidescentrales (DNA). Otras presentan bordes todavía borrosos. x 10500. N: núcleo. V: virus.

Foto 11

Caso colO'mbiano N' 2. 379 C. Se ve en el citoplasma un virus en proceso de ma-duración. Tanto su capside como el núcleo están totalmente formados. Alrededor deél hay membranas de origen celular que fácilmente llegQJrán a constituir la envolturaexterna del virus. Estas membranas pueden corresponder a la envoltura externa dela membrana nuclear rota. x 15000. N: núcleo. V: virus. LP: membrana tipoprotéicade origen celular. M: mitocondria en proceso degenerativo. R: ruptura (a la derecha).

Foto 12

Caso colombiano N' 2. 37' C. Se nota un virus ya maduro, rodeado por membranay en. el interior de una nueva vesicula. Los virus son transportados en esta formahastC1 los límites externos d3 la célula. Se ve también un virus inmaduro, sin nucleoide.

x 14000. C: citoplasma. V: virus. LP: envoltura lipoprotéica.

Foto 13Covo colombiano N? 2. Cultivo a 339 C. Día 12. La célula se muestra anormalmentet(ansparente lo cual indica el efecto citopático inducido por los virus. Estos sonmuy numerosos en el núcleo. La mayoria tienen nucleoproteínas ya formadas. Lacromatina se observa todavía hacia los bordes del núcleo pero la parte central deeste es más clara y parece corresponder al llamado viroplasma. El citoplasma pre-senta organelos degenerados y se ve un virus maduro. x 9000. N: núcleo. C: cito-

plasma. V: virus.

Foto 14

Corresponde a las mismas células de la fotografía 13. Nótese cómo ha desaparecidola membrana nuclear. Se ven abundantes virus y mitocondrias muy densas con

destrucción de las vrostas. x 10000. V: virus. N: núcleo. M: mitocondrias.

Foto 15

Corresponde a las mismas células de las fotografías 13 y 14. La flecha focaliza lapresencia de digitacio-nes en la membrana citoplasmática, las cuales son consecuenciade la necrosis celular. Las mitocondrias se muestran muy hinchadas. x 6000. N: núcleo.

C: citoplasma. M: mitocondrias.

112

DISCUSION

El aumento de la síntesis de virusconseguido por Hinuma y sus cola-borodores " en sus células HRIK, esde capital importancia ya que per-mite la obtención de mayores con-centraciones de virus para experi-mentos de purificación. Es muy posi-ble que a 33°C desaparezcan meca-nismos inhibidores de la síntesis delDNA viral, los cuales todavía estánpresentes a 37°C que es la tempera-tura normal para todos los cultivoscelulares.

En nuestros experimentos hemosconfirmado los hallazgos de Hinumatanto en las cepas celulares de ori-gen africano como en las origina-das de tejidos de pacientes colom-bianos. En ambas se obtiene un evi-dente aumento de la síntesis viralcuando la temperatura es de 33°C.

En lo re.ferente a las células africa-nas, la selección de una línea celularlibre de virus con la capacidad desintetizar IgG, al cabo de más de100 días de cultivo, plantea diversashipótesis.

Se puede pensar que las célulasobtenidas al cabo de este tiempohan sufrido una transformación ensu estructura genética. En la litera-tura se citan casos de mutantes vira-les sensibles a la temperatura." Nose puede sin embargo aceptar talplanteamiento para el presente casoya que eso significa que una mismatemperatura puede inducir tanto au-mento corno represión de la síntesisviral, fenómeno bastante ilógico.

REVISTA DE LA FACULTAD DE MEDICINA

Si se tiene en cuenta que normal-mente solo del 0,5% al 10% de estascélulas tienen virus' y que el 90%de las células restantes son biológi-camente activas, se podría concluirque el cambio de temperatura volvióa oquel 90% más receptivo a la in-fección por los virus que son forma-dos continuamente en el número me-nor de células. Con base en esto,se puede concluir que lo que se haobtenido al cabo de 106 días de cul-tivo, es la adaptación a nuevas con-diciones ambientales de algunas delas células que desde un principiocarecían de virus. La presencia deIgG en estas últimas parece corro-borar esta hipótesis ya que nuestrosexperimentos comprueban fenóme-rros de competencia entre la síntesisde virus y la síntesis de IgG en lamisma célula. Este podría ser unmecanismo de gran importancia enel control de multiplicación de estevirus y posiblemente de la enfer-medad.

La temperatura más baja podríainhibir mecanismos represores de lasíntesis IgG y en esta forma volvera las células más susceptibles a lainfección viral.

Otra posibilidad es que cultivosprovenientes de] mismo tumor ten-gan células con características bio-lógicas diferentes. En una publica-ción muy reciente (1971), Fialkow ysus colaboradores ae han observadocepas celulares de diversos tipos envarios tejidos cultivados del tumorde Burkitt. Sin embargo en la clonacelular HRIK desarrollada por Hinu-

ESTUDIOS EXPERIMENTALES EN CELULAS CULTIVADAS DEL LlNFOMA DE BURKITT 113

ma' se pudo demostrar desde unprincipio un solo tipo celular.

El problema de la histogénesis dellinfoma de Burkitt ha sido muy deba-tido. Desde 1961 hasta el presente,la célula tumoral ha sido considera-da como linfocito por O'Conor 2 yWriqth," linfoblasto por Dorfmann 28

y célula linforeticular indiferenciadapor Berard O'Conor y Torloni."

El examen ultraestructural de lostejidos tumorales provenientes de lospacientes colombkmos revela que lacélula tumoral es linforeticular indi-ferenciada. La presencia de eucro-matina en el núcleo indica la exis-tencia de RNA mensajero en el mis-mo, característica propia de célulascon altos índices de síntesis protei-ca." La baso.filia citoplasmática ob-servada al microscopio de luz corres-ponde a los abundantes poliriboso-mas vistos en el citoplasma al mi-croscopio electrónico.

Esto se relaciona con una síntesisproteica acelerada. El hecho de quelos poliribosomas se encuentren li-bres y de que no exista retículo en-doplasmático rugoso confirma el gra-do de indiferenciación celular.

Las células muestran sistema deGolgi, vesículas y polarización mito-condrial, característicos tanto del tu-mor como del tipo celular mencio-nado." Todo esto prueba que la ul-traestructura del tumor en nuestro

medio es igual a la de los casos deotras latitudes.

Un hallazgo importante es el devirus EB en biopsias y cultivos ce-lulares de los casos colombianos.Con base en su aspecto morfológico(forma poligonal y 120 milimicras)se puede concluir qUe se trata delmismo virus descrito por Epstein yBarr', 4 en el Africa y Nueva Guinea.

Las características de multiplica-ción, maduración e infección presen-tadas por este virus en nada difie-ren de los virus africanos. Esta po-dría ser una evidencia de tipo cír-custancial para su correlación etio-lógica con el tumor.

Se debe también anotar que losdos casos en discusión provienen deáreas por encima de 1.800 metrosde altitud, lo cual descartaría la po-sibilidad de un agente infecciosotransmitido por un vector. Sin em-bargo, la gran variedad de climasexistentes entre nosotros y la facilidad con que se puede cambiar deuno a otro mantiene esta hipótesislatente.

Recientemente se ha estudiado larelación entre la distribución de lamalaria endémica y la incidencia dellinfoma de Burkitt. Según olqunosautores." la infección de malaria ha-ría a las células más susceptibles ala infección viral. Este podría ser unnuevo tema de estudio en nuestromedio.

114 llEVISTA DE LA FACULTAD DE MEDICINA

RESUMEN

1 . Se confirman los hal1azgos deotros autores sobre los efectos de di-versas temperaturas de cultivo en lasíntesis del virus de Epstein y Barr.

2. Se obtuvo una línea celularlibre de virus de Epstein-Borr y lacual sintetizaba inmunoglobulinas detipo G, ausentes en la cepa celularafricana que las originó.

3 . Se cree que con los experi-mentos recdizcrdos se consiguió adap-tar a nuevas condiciones ambienta-les, a células del linfoma de Burkitt.

4. Se demuestra que existen fe-nómenos de competencia entre lasíntesis de inmunoqlobulinos G y lainfección por el virus mencionado.

SUMMARY

The ultrastructura1 pattern oí bíop-sies of two cases of Colombian Bur-kitt's lymphoma is studied. Epstein-Barr viruses were found in tissue cul-tures form one oí these two cosesand their morphology and biologicalbehaviour are compared with tissuecultures derived Irom an african case

5. Se comprueba de manera de-finitiva la presencia de enfermedadentre nosotros, estudiándose por pri-mera vez en nuestro medio a travésdel microscopio electrónico.

6. Se establece por primera VeZen cosos colombianos cultivos celu-lares del hnfoma de Burkitt.

7. Se demuestra por primera vezentre nosotros que tanto las biopsiascomo los cultivos celulares de linfomade Burkitt de pacientes colombianospresentan virus mor.fológicamenteidénticos al virus de EB.

8. Se comprueba que, en los cul-tivos celulares, dichos virus presen-tan características biológicas simi-lares a los virus EB africanos.

(JIYOYE cell line). Several experi-ments performed with the JIYOYE cellline, and based in the effect of dif-ferents temperatures on the synthesisd EB virus by the cultured cells, re-sulted in the obtention oí a cell linefree of virus and with high titorsof IgG.

AGRADECIMIENTOS:

El autor agradece a los Doctores el haber suministrado los tejidos deJosé Agustín Casas y Efrain Bonilla, uno de los casos colombianos.

EST\JDIOS EXPERIMENTALES EN CELULAS CULTIVADAS DEL LINFOMA DE BURKITT 115

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