UNIVERSIDAD DE PUERTO RICO

RECINTO UNIVERSITARIO DE MAYAGÜEZ

FACULTAD DE ARTES Y CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA

Estudio microsatelital de Ipomoea batatas para entender su información y

variabilidad genética realizado en el laboratorio de Genética del Departamento

de Biología de la Universidad de Puerto Rico - Recinto de Mayagüez

Jorge L. Fernández De Jesús

Isamar Flores Rodríguez

Stefanny Santana Rivera

BIOL3300-066L

Inst. Stephanie Cosme Reyes

30 de abril de 2012

Estudio microsatelital de Ipomoea batatas para entender su información y

variabilidad genética realizado en el laboratorio de Genética del Departamento

de Biología de la Universidad de Puerto Rico - Recinto de Mayagüez

JORGE L. FERNÁNDEZ DE JESÚS

ISAMAR FLORES RODRÍGUEZ

STEFANNY SANTANA RIVERA

Departamento de Biología, Universidad de Puerto Rico – Recinto

de Mayagüez, P.O. Box 9000, Mayagüez, Puerto Rico, 00681-9000

jorge.fernandez2@upr.edu

isamar.flores@upr.edu

stefanny.santana@upr.edu

INTRODUCCIÓN

La batata (Ipomoea batatas) es uno

de los alimentos cosechados más importantes

del mundo. Son versátiles y sin explotar (CIP,

1999). La batata también está clasificada

como el séptimo cultivo alimenticio más

importante del mundo después del trigo, el

arroz, el maíz, la papa, cebada y la yuca

(FAOSTAT, 2007). Más del 95% de la

producción de la batata se produce en países

en desarrollo, donde es el quinto cultivo

alimenticio más importante en términos de

peso fresco. En el 2004 aproximadamente

129,536,275 millones de toneladas fueron

producidas en más de 100 países (CGIAR,

2004). La raíz de este almidón crece mejor en

climas templados pero es cultivada en la

mayoría de los países tropicales. La batata es

alta en carbohidratos y vitamina A y puede

producir más energía comestible por hectárea

por día que el trigo, el arroz o la yuca (CIP,

2010). Para el año 2050, el 90% de la

humanidad vivirá en países en desarrollo,

donde la agricultura sigue siendo la actividad

económica más importante (Raven et al.,

2006). Por los contenidos nutricionales de la

batata, en África se han utilizado para

combatir la deficiencia de vitamina A que

puede conducir a la ceguera y la muerte de

más de 300,000 niños africanos en un año.

En genética, un marcador molecular o

marcador genético es un fragmento de la

secuencia de ADN que está asociado a una

parte del genoma. Los marcadores

moleculares se utilizan en experimentos de

biología molecular y biotecnología para

identificar una secuencia particular de ADN.

Como las secuencias de ADN son altamente

especificas, pueden ser identificadas con las

ayuda de marcadores moleculares conocidos.

Marcadores moleculares basados en ADN,

como los polimorfismos de longitud de

restricción (RFLP) por sus siglas en ingles,

amplificación de azarosa de ADN

polimórfico (RAPD) por sus siglas en ingles

y repeticiones de secuencia simple (SSR) por

sus siglas en ingles fueron utilizadas en el

desarrollo del mapa genético de la batata

(Fregene et al., 1997). Estos marcadores

moleculares y otros has sido utilizados para

evaluar la variabilidad genética de los

pequeños grupos de batata germoplasma y

para establecer relaciones entre la batata y sus

parientes silvestres. Por lo general, en un

cultivo donde cultivares han sido

seleccionados y distribuidos por los mismos

agricultores y a menudo los diferentes

cultivares pueden poseer el mismo nombre

(además de la misma variedad teniendo más

de un nombre), obtener un método de

identificación, clasificación y medición de la

diversidad genética que sea objetivo es

requisito (Beeching et al.,1993; Chavarriaga-

Aguirre et al., 1998, 1999; Haysom et al.,

1994). Para lograr este objetivo, la evaluación

de la variabilidad genética de las colecciones

de germoplasma requiere marcadores

altamente polimórficos, así como de alto

rendimiento de genotipificación de los

sistemas. Los marcadores de SSR son

particularmente atractivos para estudiar la

variabilidad genética, ya que son abundantes

y ampliamente distribuidos en los genomas

de las plantas. Marcadores SSR muestran

altos niveles de polimorfismo basado en

número de unidades repetidas halladas para

cada locus en una población determinada, lo

que los hace adaptable a la automatización

(Morgante & Olivieri, 1993; Fregene et al.,

2003).

Los genomas eucariotas están

densamente intercalados con secuencias

simples que consisten en tramos de

nucleótidos repetidos tándem que pueden ser

de 1 a 10 nucleótidos (pero típicamente de 2 a

3 nucleótidos). El numero de las unidades

repetidas varia ampliamente entre los

organismos hasta un máximo de 50 copias.

Cuando estas regiones son amplificadas

individualmente por medio del “Polymerase

Chain Reaction”(PCR), utilizando un par de

oligonucleótidos de flanqueo único como

cebadores, casi siempre muestran

polimorfismos amplios debido a la variación

en longitud del sitio-especifico, que es

producido como consecuencia de diferentes

números de unidades de repetición (Morgante

y Olivieri, 1993). En eucariotas se puede

esperar encontrar al menos una secuencia

simple estirada cada 10kb de secuencia de

ADN. Los loci SSR son muy variables a

cuenta del número de unidades de repetición

encontrado para cada locus en cualquier

población dada (Morgante y Olivieri, 1993).

Los altos niveles de heterocigosidad, la

naturaleza basada en el PCR de repetición de

estos loci y su naturaleza codominante han

hecho a los marcadores moleculares SSR la

elección para la cartografía genética y los

estudios de diversidad (Tautz, 1989; Mba et

al, 2001). Actualmente, los microsatélites has

sido evaluados para muchas plantas de

cultivo incluyendo la remolacha azucarera,

melón, tomate, pimiento, algodón, sorgo,

maíz, arroz, soja y manzana. Por otra parte,

los marcadores genéticos de SSR están siendo

aplicados para plantar proyectos de

cartografía en muchas especies para saturar

los mapas genéticos existentes, por ejemplo,

en el trigo, avena, frijol, arroz, cebada,

centeno, maíz, sorgo, caña de azúcar thaliana,

Arabidopsis, tomate, papa, trigo hexaploide,

soja, entre otros (Kumar, 1999).

Esta experimentación es basada en un

módulo de laboratorio basado en la

investigación del Dr. Dimuth Siritunga

(Departamento de Biología, RUM) que va a

estudiar la diversidad genética presenta en la

batata de Puerto Rico. Para lograr esto, ellos

recogerán muestras de toda la isla, extraerán

su ADN y utilizarán la técnica molecular

conocida como marcadores SSR (repeticiones

de secuencia simple) para el análisis de

diversidad. Los marcadores de SSR, también

conocidos como microsatélites, son

marcadores codominantes que han ganado

popularidad en los últimos años debido a la

facilidad de su uso. Este módulo de

laboratorio será un ejercicio de varias

semanas y su objetivo es contribuir al

conocimiento de los estudiantes. Los

miembros del laboratorio del Dr. Siritunga

han utilizado marcadores polimórficos SSR

para evaluar la diversidad alélica dentro y las

relaciones entre las accesiones de esta batata

germoplasma de Puerto Rico. En este estudio,

ocho marcadores de SSR polimórficos fueron

utilizados con éxito. Al final de este proyecto

el estudiante habrá aprendido técnicas

moleculares avanzadas de un cultivo

alimentario muy importante del mundo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para comenzar la extracción de

ADN de batata, primero se tuvo que

recolectar sus hojas. Luego de esto, en el

laboratorio se llenó un formulario con la

información de las hojas de batata. Se

comenzó cortando un pedazo de la hoja (2

cm x 2 cm) y colocándolo en un

microtubo de 1.5 ml con un poco de arena

para macerar la hoja. Se maceró por tres

minutos. Luego se volvió a macerar por

un minuto después de agregarle 800 µl de

amortiguador con un micropipetador. Se

incubó a 65°C por 30 minutos en baño de

maría y después se centrifugó a 13,000

rpm por tres minutos más. Entonces, se

transfirió 500 µl del sobrenadante a un

nuevo microtubo de 1.5ml y se le añadió

350 µl de isopropanol frío para mezclar

por inversión. Después de mezclado, se

centrifugó a 13,000 rpm por 3 minutos.

Al terminar, se descartó el sobrenadante,

se dejó secar el pellet por cinco minutos y

se le añadió 700 µl de etanol al 70% para

volver a mezclar por inversión. Entonces,

se centrifugó a 13,000 rpm por tres

minutos, nuevamente, y se descartó el

sobrenadante. Luego de que se secara el

pellet por cinco minutos a temperatura

ambiente, se le añadió 200 µl de TE

(10:1) y 4.0 µl de polimerasa RNA

(RNAase). Se incubó a 65°C por cinco

minutos en baño de maría y, por último,

se colocó el tubo a 4°C hasta el próximo

paso: añadir la muestra al gel de agarosa.

Para esto, se preparó una gel de agarosa al

1% (0.5 g de agarosa + 50 mL Tris-Boret

1X), al cual se le añadió 3 µl de bromuro

de etidio y se colocó en la cámara de

electroforesis. Se mezcló 15 µl del ADN

con 3 µl de buffer loading dye y 2 µl de

dos marcadores (Lambda Hind) y fue

añadido al gel de agarosa.

Ya para el PCR (Polymerase Chain

Reaction) se obtuvo cinco microtubos por

cada mesa. Estos microtubos contenían 2

µl de ADN de batata y un primer por

mesa de los cinco que se utilizaron (entre

ellos, primer F, primer R y primer M13).

A cada tubo se le añadió 12.5 µl del Mix

1 y 10.5 µl del Mix 2 con un

micropietador de 2-20 µl. El Mix 1 estaba

compuesto por: PCR Master Mix (agua

doblemente destilada –ddH2O- con el

cofactor dicloruro de magnesio (MgCl2) y

dinucleótidos trifosfataos), 0.05 u/µl de

polimerasa Taq, Buffer (50 mM de

cloruro de potasio con 10 mM de Tris.Cl

–ph 8.3 a temperatura ambiente-) y por

último 400 uM de nucleótidos

trifosfatados. El Mix 2 contenía 4 mM de

dicloruro de magnesio, primer F, primer

R y primer M13. Luego de añadir ambas

mezclas, se colocaron los tubos en el

termociclador el cual calentará y enfriará

tiempos y temperaturas específicas.

Primero estará a 94°C por siete minutos.

Luego a la misma temperatura por 30

segundos para entonces bajar a 50°C por

1.5 minutos. El cuarto paso es a 72°C por

1 minuto. Entonces, volverá a los pasos 2,

3 y 4 por 35 ciclos, luego volverá a los

72°C por 10 minutos y para finalizar se

estará estabilizando la reacción a 4°C. De

éste producto transferimos 15 µl a un gel

de agarosa al 3%.

Por último, se corrió el gel de

poliacrilamida (siempre con guantes) en

el cual se utilizó el equipo de ADN

analizador. Para la preparación del gel se

utiliza acrilamida, persulfato de amonio y

TEMED. Se preparan, además, varias

soluciones: Stop (Cianol de xileno,

EDTA, azul de bromofenol, agua

deionizada) y de tinción con nitrato de

plata entre otras. El gel se sumerge a una

solución fijadora que utiliza ácido acético,

luego se escurre y se lava con agua

bidestilada o deionizada hasta que no

hayan restos del ácido. Después se

sumerge a la solución de tinción a oscuras

o tapado ya que el nitrato de plata es

sensible a la luz. Se vuelve a lavar con

agua deionizada y después de ser bien

escurrida se sumerge a una solución que

revela las bandas de ADN. Se escurre y se

introduce a la solución de parada (ácido

acético) y por último se vuelve a lavar

con agua deionizada hasta eliminar los

rastros del ácido. Éstos pasos siempre

deben ser llevados a cabo con guantes.

RESULTADOS

Por medio de la gel de agarosa se

confirmó la presencia del ADN genómico

de la batata al ver, en cada columna o

carril, las bandas del ADN (enzimas de

restricción). En el PCR los cinco

marcadores se observaron y se vio las

diferentes regiones donde se amplificó,

por ejemplo, IBR-03 se encuentra un

poco más arriba de IB-R19. En cuanto a

las bandas del gel de poliacrilamida, se

pudo apreciar que el producto (cebador 2)

obtuvo menos variabilidad versus el

cebador 1 y 4, pero mayor variabilidad

versus el cebador 3 y 5. A continuación

una tabla con las diferentes variabilidades

genéticas entre los cebadores.

Cebadores Primer 1 Primer 2 Primer 3 Primer 4 Primer 5

Primer 1 - √ √ √

Primer 2 - √ √

Primer 3 -

Primer 4 √ √ √ - √

Primer 5 √ -

√= mayor variabilidad

DISCUSIÓN

Quizá por una contaminación con

saliva o ADN externo a la muestra,

mucha exposición al aire, instrumentos

no-esterilizados suficientemente,

desnaturalizan del ADN, demasiada

exposición a la luz u otros factores que

pudieron haber dañado la muestra y

provocar que en la corrida del gel de

agarosa no pudiera apreciarse en el

laboratorio y hubo que recurrir a los

resultados de otra sección del laboratorio.

Imagen 1. Corrida electroforética del ADN de

batata: se muestra la migración de cada muestra

al cátodo indicando variabilidad en pesos moleculares.

33

20

3

2

2

1

1

110

579

33

20

3

2

2

1

1

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33

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1

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579

33

20

3

2

2

1

1

110

579

Pri Pri Pri Pri Pri

Imagen 3.. Corrida de PCR de Ipomoea batatas: refleja una

escalera de pares bases no tan pronunciada pero que también

confirma la variación alélica entre los microsátelites de los

cebadores utilizados, siendo el Cebador 1 el más diferente a los otros cuatro.

Imagen 2. PCR de los cebadores.

Precisamente, con estos resultados, se

pudo probar que sí existe variabilidad

genética dentro de la especie Ipomoea

batatas en Puerto Rico. Esto puede ser

explicado con que la variabilidad genética es

producto de las diferentes adaptaciones que

una misma especie puede tener e ir

acumulándose y dentro de un tiempo

indeterminado producirse la evolución de una

nueva especie. Al observarse la corrida

electroforética en agarosa de la muestra de

ADN de batata (Imagen 1) puede notarse que

algunas muestras migraron más que otras

hacia el cátodo, lo que es indicativo que el

peso molecular entre éstas fue levemente

distinto. Por otra parte, el PCR hecho a las

muestras (Imagen 2 y 3) refleja una escalera

de pares bases no tan pronunciada pero que

también confirma la variación alélica entre

los microsátelites de los cebadores utilizados,

siendo el Cebador 1 el más diferente a los

otros cuatro. Como las hojas utilizadas

procedían de diferentes regiones de la isla,

cada una tenía diferentes adaptaciones a sus

zonas de cultivo, las cuales pueden ser unas

más calurosas u otras más lluviosas u otras

más expuestas a patógenos, en fin, las plantas

están adaptadas a sus respectivos entornos.

CONCLUSIÓN

La batata es el séptimo cultivo más

importante en la economía mundial por su

gran capacidad de ser utilizado para la

fabricación de distintos productos

derivados, por lo tanto, es muy

importante estudiar su información

genética para así poder aprovechar más

esa eficiencia alimenticia que provee esta

especie. Su adaptabilidad es crucial que

sea conocida para así tener mayor

producción, ya que de esta forma podría

atacarse la hambruna que tanta gente en el

mundo sufre especialmente en países

poco desarrollados. Con este laboratorio

se pretendió tener una idea de la

variabilidad genética de la batata en

Puerto Rico y quizá así aprovechar esa

versatilidad que ofrece este cultivo para el

beneficio no sólo de los puertorriqueños

sino que también de otras poblaciones.

Una vez entendida mejor la genética de la

batata puede conllevarse a experimentos

futuros en la agricultura en los cuales

poner a prueba ese dinamismo como

cultivo que posee la batata para que sea

aun más alternativo que lo que es

actualmente frente a otros cultivos.

LITERATURA CITADA

Beeching et al.,1993;

Chavarriaga-Aguirre et al., 1998, 1999;

Haysom et al., 1994. Assessment of

genetic diversity among African

cassava Manihot esculentaGrantz

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Springer Link. Web.

http://www.springerlink.com/content/p50

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http://cipotato.org/publications/annual_re

ports/1999spa/112. 27 Abril 2012.

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abril 2012

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http://www.angelfire.com/rnb/rkv/A12_T

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Morgante & Olivieri, 1993;

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molecular genetic map of cassava.

Springer Link. Web.

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles

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Tautz, 1989, Mba et al, 2001.

Aislamiento y caracterización de

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partir de la construcción de librerias

genomicas enriquecidas de

camote(Ipomoen batatas (L) Lam). Web.

http://sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtual/tesi

s/basic/ya%C3%B1ez_a_v/antecedentes.h

tm. 28 Abril 2012.

AGRADECIMIENTOS

Se le agradece a la instructora del

Laboratorio de Genética del Recinto

Universitario de Mayagüez, Stephanie

M. Cosme Reyes, por su

profesionalismo al ayudarnos a hacer este

experimento. Además, el mérito va al

personal encargado de brindar todos los

materiales requeridos y las guías

necesarias para poder realizar el mismo, y

a la coordinadora de los laboratorios, Sra.

Gladys Toro Labrador. Por último, se

reconoce la cooperación de todos los

compañeros del laboratorio de la Sección

066L por su colaboración y orden.