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Tesis Doctoral

Estudio de las interacciones entreEstudio de las interacciones entrefosfolípidos y proteínas integrales defosfolípidos y proteínas integrales demembrana. Efectos sobre la actividadmembrana. Efectos sobre la actividad

enzimática de una ATPasaenzimática de una ATPasatransportadora de Ca2+transportadora de Ca2+

Dodes Traian, Martín Miguel

2014

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Cita tipo APA:

Dodes Traian, Martín Miguel. (2014). Estudio de las interacciones entre fosfolípidos y proteínasintegrales de membrana. Efectos sobre la actividad enzimática de una ATPasa transportadorade Ca2+. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

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Dodes Traian, Martín Miguel. "Estudio de las interacciones entre fosfolípidos y proteínasintegrales de membrana. Efectos sobre la actividad enzimática de una ATPasa transportadorade Ca2+". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2014.

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Departamento de Química Biológica

Estudio de las interacciones entre fosfolípidos y

proteínas integrales de membrana. Efectos sobre la

actividad enzimática de una ATPasa

transportadora de Ca2+

Tesis presentada para optar por el título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área Química Biológica

Martín Miguel Dodes Traian

Directores: Dr. Francisco Luis González Flecha Dra. Valeria Levi Consejero de Estudios: Dr. Juan Carlos Calvo Lugar de trabajo: Instituto de Química y Fisicoquímica Biológicas - Facultad de Farmacia y Bioquímica y Departamento de Química Biológica - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires Buenos aires, 2014

Resumen

Estudio de las interacciones entre fosfolípidos y

proteínas integrales de membrana.

Efectos sobre la actividad enzimática de una ATPasa

transportadora de Ca2+

Las membranas celulares son estructuras dinámicas complejas de

composición bioquímica muy diversa. Las interacciones específicas lípido-

lípido y lípido-proteína pueden generar dominios estables o transientes de

composición y función biológica diferenciales.

En este trabajo, abordamos el estudio de la regulación de la actividad

de una proteína integral de membrana, la bomba de calcio de membrana

plasmática (PMCA) por anfifilos que integran el sistema en el cual se la

reconstituye.

En micelas de lípidos y detergente, pudimos verificar que la

actividad depende de la proporción relativa de estas especies y postulamos

un modelo que explica esta dependencia en base al intercambio de anfifilos

a nivel del dominio transmembrana. El análisis realizado con diversos

métodos espectroscópicos mostró que los cambios estructurales asociados a

la activación por lípidos serían sutiles pero suficientes para transducir una

señal de activación al dominio citoplasmático de PMCA. Utilizando

espectroscopía de correlación de fluorescencia y la sonda fluorescente

Laurdan observamos que la actividad depende además de la fluidez del

entorno y del tamaño de las micelas. Para extender este estudio al entorno

natural de las proteínas -la membrana celular- evaluamos diversas sondas

fluorescentes y pudimos determinar que la sonda C-Laurdan permite

estudiar por microscopía confocal la organización de membranas

biológicas.

Palabras clave: PMCA – fosfolípidos – biomembranas - proteínas de

membrana– microscopía confocal – C-Laurdan – regulación actividad

enzimática

Abstract

Study of the interactions between phospholipids

and integral membrane proteins.

Effects on the enzymatic activity

of a Ca2+ transport ATPase

Cellular membranes are dynamic complex structures with a highly

diverse biochemical composition. Specific lipid-lipid and lipid-protein

interactions can generate transient or stable domains of particular

composition and biological function.

In this work, we study the regulation of the activity of an integral

membrane protein, the plasma membrane calcium pump (PMCA), by

phospholipids that make up the reconstitution system.

Working in a mixed micelles lipid/detergent system, we verify that

the activity depends on the relative proportion of these species and we

posited a model that explains this relationship by the exchange between

amphiphiles at the protein transmembrane domain. The analysis performed

by spectroscopic methods showed that the structural changes associated

with the activation by lipids are subtle but enough to transduce an

activation signal to the cytoplasmic domain of PMCA. Using fluorescence

correlation spectroscopy and the fluorescent probe Laurdan, we observed

that the activity is also related to micelle size and the fluidity of the protein

lipidic microenvironment. To extend this study to the natural environment

of the protein –the cellular membrane- we assayed the performance of

several fluorescent probes and we could determine that the probe C-

Laurdan allows studying the organization of biological membranes by

confocal microscopy.

Keywords: PMCA – phospholipids – biomembranes – confocal microscopy

– membrane proteins – C-Laurdan – enzymatic activity regulation

Agradecimientos

Una tarea que se vuelve inabarcable por la cantidad de buena gente que me he cruzado en estos años.

A Vale y a Luis, por haberme dado la oportunidad de hacer esta tesis doctoral bajo su dirección. Me pude dar el lujo de poder aprender de dos personas brillantes y, más importante aún, dos extraordinarias personas que con su ética personal y de trabajo me enseñaron mucho más que lo puramente científico. Dos personas con tónicas diferentes y complementarias que me permitieron ampliar enormemente el espectro de mi formación.

A la Universidad de Buenos Aires, a la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y a la Facultad de Farmacia y Bioquímica por darme el espacio para realizar esta tesis y por los años de formación recibida. Esto conlleva necesariamente el agradecimiento a todos los ciudadanos que con sus impuestos sostienen a la Universidad Pública de calidad, aún cuando los esfuerzos para que todos tengan oportunidades de acceso deberían ser mayores.

A mis viejos, por absolutamente todo. Por su apoyo fundamental en todos estos años y en los años de mi formación de grado, por su amor incondicional y por sus enseñanzas sobre el respeto y la libertad de los demás. La generosidad se predica con el ejemplo, como siempre me han mostrado.

A María, mi hermana, por su apoyo, su amor, por su necesaria y enriquecedora visión de las cosas. Por ayudarme a ser mejor persona.

A mi familia, a los que están y a los que ya han tenido que partir. Mis tíos: Roberto, Fernando, Carlos, Luis, Gerardo. Mis tías: Analía, Bibi, Susana, Claudia. Mis primos Juani, Andrés y Jorge. Mis primas Luli, Manu, Natu, Yuli, Sol, Andrea. Mis cuñados Seba y Rubén. Son un grupo de gente extraordinaria en los que siempre podré confiar y que siempre estuvieron presentes cuando necesite su ayuda y cariño.

A mi tía Blanca, deuda eterna tengo con vos y tus clases de inglés acompañadas de té y budín (de vino, o de banana y nuez).

A mis abuelos, que los fui despidiendo durante este largo proceso de educación universitaria y procuraron dejarme los mejores recuerdos. Los echo mucho de menos.

A mis compañeros de trabajo, que por el ir y venir entre facultades terminaron siendo muchísimos: Diego, Iona, Ernesto, Luisma, Gerardo, Noelia, Florencia, Santiago, Belén, Walter, Álvaro, Rama, Dardo, Michael, Juan, Elías, Lucas, Hernán, Ithu, Diana, Nacho, Lanza, Esteban, Carla, Ceci de Rossi, Luciana, Marcelo, Ceci Prudkin. Fue un gusto y un honor haber compartido trabajo y tan buenos momentos con ustedes. Mención especial a Fer Durán y la mini estadía en su laboratorio, un tipo generoso y buena gente como pocos, que me dio una pequeña muestra del mundo de la síntesis orgánica.

A la gente del IQUIFIB, que siempre fueron muy generosos y jamás negaron un consejo o una ayuda en cualquier situación. Crearon en esos pasillos un ambiente cálido donde

siempre me sentí cómodo. Sergio, Lolo, Jere, Irene, Pablo, Luciana, Pela, Jorgito, José, Gisela. Todos ellos hicieron que estos años de trabajo transcurran en un ambiente espectacular, de compañerismo, camaradería, y sobre todo: muchas risas.

A mis amigos de la profesión, compañeros federales de almuerzos, mates, cenas y bailes en los congresos. La Vane, El Fede, La Ceci, La Eli y El Pablo. A Eduardo y a Fernando. A Flor, Vale y Jorge. Sin olvidarme de mis amigas de la época FIL: Corita, Marin, Marian, Sole, Silvina, Irene y Tere.

Al núcleo duro de amigos de la facu, que me bancaron en todas por años. Axel, María Gracia, Diego, Caro, Gastón, Mica, Nico, Pau y Vicky. Un grupo humano fantástico, profundamente cálido y enriquecedor. Haberlos conocido es de lo mejor que me ha pasado. Menciono además a Marcos y a Alito, dos tipos increíbles con los que he vivido muchos de los momentos más interesantes y divertidos en los últimos años.

Al Zurdo, a Leo, a Mati, al Pollo, a Cristian, a Pablo, por lo que me han hecho reír todos estos años siempre que nos cruzamos y por las enriquecedoras conversaciones que hemos sabido tener.

A Barbi, Coni y Marina por su aguante sobre la recta final del doctorado.

A mis amigos de la camada, un grupo extraordinario de gente con el que todavía nos seguimos viendo y compartiendo buenos momentos: Agos, Charly, Guille, Rafa, Nico, Ceci, Chechu, Rasco, Belén, Ali, Mechi, Guille, Toti, Cristian. Y les puedo sumar a Jennifer, a Gonzalo, a Matías, a Eduardo. Al inefable Ramiro Vidal Figueredo. Increíble la gente que en distintas circunstancias conocí en estas aulas y laboratorios.

A los profesores del CEFIEC por la valiosísima visión sobre la educación y la generación del conocimiento que me brindaron.

A mis amigos del barrio, Durgui, Seba, Peje, Ale, Enanín, Gontru, Marce, Pato, Lipo, Loli y Pablito. Son mi historia, mi presente, el lugar de las risas y buenos momentos que siempre tengo que visitar.

A mis amigos del colegio secundario, Rusito, Adrián, Fefe, Guido, Esteban, Arielito, Fernando, Cebo, Gastón. Tremendas personas que si hace falta, van a estar siempre.

A Matías y Karina, me dejaron enseñanzas imborrables dejándome trabajar con ustedes desde tan joven.

A Augusto, por impulsarme siempre a ser mejor, a conocer y disfrutar de ignotos eventos culturales, a remar en los momentos bajos de la profesión. Y por ser un amigazo. A Anto y Mechi, diosas, guardia pretoriana. A Eushina, mi negra preciosa. A la Ratita y al Gordo, amigos desde siempre. Un punto de referencia.

Parte del trabajo descripto en esta Tesis ha dado lugar a las siguientes publicaciones: A two-stage model for lipid modulation of the activity of integral

membrane proteins - Martín M. Dodes Traian, Diego I. Cattoni, Valeria Levi, F. Luis González Flecha - PLoS ONE 7(6): e39255 – 2012

Imaging lipid lateral organization in membranes with C-Laurdan in a

confocal microscope - Martín M. Dodes Traian, F. Luis González Flecha, Valeria Levi - The Journal of Lipid Research, 53, 609-616 – 2012

Índice

Parte A. Introducción

Capítulo 1 Estructura y función de membranas biológicas

1.1 Estructura de la membrana celular 3

1.1.1 El modelo de mosaico fluido 4

1.1.2 Actualizando el modelo de mosaico fluido 6

1.2 Equilibrio de fases en bicapas lipídicas 7

1.2.1 Sistemas acuosos de un componente lipídico 7

1.2.2 Sistemas acuosos de dos o más componentes lipídicos 9

1.2.3 El rol del colesterol. Fases líquido-ordenadas 10

1.3 Dominios lipídicos en la membrana celular. Balsas lipídicas o “rafts” 12

1.3.1. Identificación y caracterización de dominios en membranas biológicas

12

1.3.2 Dominios de membrana y función biológica 15

1.3.3 Uso de técnicas de fluorescencia para el estudio de sistemas lipídicos complejos

17

1.3.4 Sistemas de membranas artificiales 18

1.4 Interacciones lípido-proteína 21

1.4.1 Tipos de interacción lípido-proteína 21

1.4.2 Ajuste hidrofóbico y perfiles de presión lateral 23

1.5 Referencias 27

Capítulo 2 La bomba de Ca2+ de la membrana plasmática

2.1 El rol del Ca2+ en la función celular 33

2.2 La bomba de Ca2+ de la membrana plasmática 35

2.2.1 Ciclo catalítico 35

2.2.2 Activadores e inhibidores 36

2.2.3 Estructura primaria y distribución tisular 37

2.2.4 Estructura secundaria y terciaria 38

2.3 Sistemas para el estudio de la actividad enzimática de PMCA 40

2.3.1 Membranas y fragmentos de membranas celulares 40

2.3.2 Sistemas micelares 41

2.3.3 Proteoliposomas 42

2.4 Características de los sistemas micelares 42

2.4.1 Autoorganización de los sistemas anfifilo-agua 42

2.4.2 Uso de detergentes para la purificación de proteínas de membrana 44

2.4.3 Micelas mixtas 45

2.4.4 Micelas mixtas conteniendo proteínas 46

2.5 Composición de las micelas y propiedades bioquímicas de PMCA 48

2.6 Referencias 50

Capítulo 3 Espectroscopía y microscopía de fluorescencia

3.1 El fenómeno de fluorescencia 55

3.2 Espectros de emisión y rendimiento cuántico de fluorescencia 57

3.2.1 Transferencia de energía por el mecanismo de Förster 59

3.2.2 Efectos del solvente sobre la emisión de fluorescencia 61

3.3 Sondas fluorescentes 63

3.3.1 Sondas utilizadas en espectroscopía de proteínas y sistemas biológicos

65

3.3.1.1 Sondas intrínsecas 66

3.3.1.2 Sondas para el estudio de biomembranas 69

3.3.1.3 Laurdan en el estudio de biomembranas 71

3.4 Microscopía de fluorescencia 74

3.4.1 Microscopía confocal 77

3.4.2 Microscopía de 2 fotones 81

3.5 Referencias 85

Capítulo 4. Hipótesis y objetivos

4.1 Introducción 89

4.2 Hipótesis 90

4.3 Objetivos 91

Parte B. Metodologías

Capítulo 5 Materiales y métodos

5.1 Aislamiento de membranas plasmáticas fragmentadas de eritrocitos, libres de calmodulina

95

5.2 Purificación de la bomba de Ca2+ 96

5.3 Preparación de micelas mixtas de fosfolípidos-detergente 97

5.4 Cuantificación de fosfolípidos y detergente 97

5.5 Medición de la actividad Ca2+-ATPasa 98

5.6 Cuantificación de proteínas 98

5.7 Unión de fluoresceína a albúmina sérica bovina 99

5.8 Preparación de LUVs por extrusión 99

5.9 Técnicas espectroscópicas 100

5.9.1 Absorción 100

5.9.2 Dicroísmo circular 100

5.9.3 Dispersión estática de luz 100

5.9.4 Fluorescencia 101

5.9.4.1 Espectrofluorómetros empleados 101

5.9.4.2 Espectros de fluorescencia 101

5.9.4.3 Transferencia de energía 102

5.9.4.4 Polarización Generalizada (GP) de Laurdan y C-Laurdan 103

5.9.4.5 Espectroscopía de Correlación de Fluorescencia (FCS) 103

5.10 Cálculo de la temperatura de un sistema lipídico por espectroscopía de GP de Laurdan

104

5.11 Calorimetría de Titulación Isotérmica (ITC) 104

5.12 Preparación de vesículas unilamelares gigantes (GUVs) 105

5.13 Observación de GUVs por microscopía confocal. GP de C-Laurdan 107

5.14 Tinción de células de melanóforos de Xenopus laevis 107

5.15 Tinción de eritrocitos humanos 108

5.16 Análisis de imágenes de GP 108

5.17 Tratamiento de los datos 109

5.18 Origen y calidad de las drogas utilizadas 109

5.19 Referencias 110

Parte C. Resultados y Discusión

Capítulo 6 Modulación de la actividad enzimática de PMCA por fosfolípidos en sistemas micelares

6.1 Introducción 115

6.2 La actividad ATPasa de PMCA es modulada por la composición de las micelas

115

6.3 La activación de PMCA por fosfolípidos induce pequeños cambios conformacionales

118

6.4 Un modelo de dos estapas permite describir la activación de PMCA 122

6.5 Un modelo mínimo para describir el efecto de los fosfolípidos sobre la actividad enzimática de proteínas integrales de membrana

130

6.6 Conclusiones 132

6.7 Referencias 134

Capítulo 7 Modulación de la actividad enzimática de PMCA por las propiedades biofísicas del sistema micelar

7.1 Introducción 137

7.2 La actividad ATPasa de PMCA disminuye en sistemas micelares enriquecidos en lípidos

137

7.3 Efectos de la transición micela-vesícula sobre la actividad ATPasa de PMCA

139

7.4 Caracterización de la transición micela-vesícula del sistema PC-C12E10 141

7.4.1 Dispersión estática de luz 142

7.4.2 Calorimetría de titulación isotérmica 143

7.4.3 Espectroscopía de Correlación de Fluorescencia 145

7.4.4 Análisis de la fluidez del sistema micelar 152

7.5 Conclusiones 154

7.6 Referencias 155

Capítulo 8 Análisis de fluidez de biomembranas utilizando microscopía confocal

8.1 Introducción 157

8.2 Análisis del rendimiento de la sonda di-4-ANEPPDHQ 158

8.3 Desempeño de una variante de la sonda fluorescente Laurdan: C-Laurdan

162

8.4 C-Laurdan permite sensar transiciones de fase de fosfolípidos 164

8.5 Observación de coexistencia de fases con C-Laurdan en microscopía confocal

168

8.5.1 El fenómeno de foto-selección en C-Laurdan 169

8.5.2 Detección de coexistencia de fases lipídicas 173

8.6 Análisis de la fluidez de membrana en células melanóforas de Xenopus

laevis 179

8.6.1 C-laurdan permite detectar variaciones en la fluidez de la membrana celular

182

8.6.2 Fluidez en eritrocitos humanos 184

8.7 Conclusiones 185

8.8 Referencias 187

Parte D. Conclusiones y perspectivas

Capítulo 9 Conclusiones y perspectivas

9.1 Introducción 193

9.2 Conclusiones 193

9.3 Perspectivas y líneas futuras 197

9.4 Referencias 201

Introducción

Capítulo 1

Estructura y función de

membranas biológicas

1.1 Estructura de la membrana celular

La membrana celular define el límite de una célula separando el

interior de la misma del exterior. Se encuentra constituida mayorita-

riamente por fosfolípidos y proteínas en una relación de masa que es

variable y dependiente del tipo celular. Los azúcares se incorporan a la

membrana como modificaciones post-traduccionales de proteínas de

membrana y en forma de glicolípidos.

Las especies lipídicas que componen las membranas biológicas

naturales presentan una gran variabilidad según el tipo celular. Genera-

lizando, se puede decir que los glicerofosfolípidos son la especie lipídica

más abundante (entre un 40-60 mol % de la fracción lipídica total). Las

siguientes tablas muestran la abundancia relativa de lípidos en membranas

de eritrocitos humanos (Luly 1989).

Tabla 1: Proporción de lípidos en eritrocitos humanos

Lípidos totales Colesterol Fosfolípidos Glicoesfingolípidos

Especie (mg / mL) 5.20 1.34 3.26 0.60

Tabla 2: Composición de fosfolípidos en eritrocitos humanos

PC PI PE PS SM LPC PA Otros

Proporción del total (%) 30.5 1.0 27.5 13.5 25.5 1.0 1.0 1.0

Abreviaturas: PC: fosfatidilcolina. PI: fosfatidilinositol. PE: fosfatidiletanolamina. PS: fosfatidilserina.

SM: esfingomielina. LPC. lisofosfatidilcolina. PA: ácido fosfatídico.

3

Los esteroles como el colesterol (o く-sitoesterol en plantas) pueden

constituir un 20-50 % del contenido lipídico total de la membrana, aunque

su presencia es más escasa en membranas internas: menos del 5% en

membranas mitocondriales y entre un 8 y 10 % en retículo endoplasmático

y Golgi (Mouritsen 2008).

Los fosfolípidos presentes en membranas biológicas suelen tener el

ácido graso saturado en la posición sn-1 mientras que en la posición sn-2 es

frecuente encontrar ácidos grasos con una o más insaturaciones (dobles

enlaces en configuración cis) (Bou Khalil et al. 2010) (figura 1.1).

Figura 1.1 Estructura de los lípidos de la membrana celular. Los glicerofosfolípidos, presentan un esqueleto de glicerol con dos cadenas de ácidos grasos unidas en posición sn-1 y sn-2 y el grupo fosfato unido al grupo polar en sn-3. La fosfatidilcolina es el grupo polar más frecuente. Las esfingomielinas presentan generalmente cadenas saturadas y su característica cadena unida por un enlace amida. El colesterol es el esterol predominante en membranas eucariotas.

1.1.1 El modelo de mosaico fluido

En 1972, Singer y Nicolson publicaron un trabajo donde lograron

condensar en una estupenda síntesis conceptual el conocimiento que se

tenía hasta el momento de estructura y termodinámica de lípidos y

membranas, con la información obtenida sobre proteínas asociadas a la

4

membrana celular (Singer y Nicolson 1972). En este trabajo, propusieron

lo que llamaron el “modelo de mosaico fluido” (figura 1.2) que considera la

membrana como una solución bidimensional viscosa de fosfolípidos en la

cual se hayan insertas las proteínas. A diferencia de un cristal periódico, no

se aprecia orden a largas distancias por lo que la distribución de las

proteínas en la membrana sería espacialmente aleatoria. De acuerdo a este

modelo algunas proteínas presentes en la membrana denominadas proteínas

integrales atraviesan la bicapa con sus dominios hidrofílicos interactuando

con la fase acuosa y sus regiones hidrofóbicas ancladas en la membrana.

Otras proteínas, en cambio, no atraviesan la membrana y se encuentran

asociadas a la misma por superficies hidrofóbicas presentes en su estructura

tridimensional (proteínas periféricas). A su vez, este modelo indicaba que

las proteínas podían difundir libremente por la solución lipídica, lo cual no

impedía la existencia de asociaciones entre ellas que pudiesen formar

agrupamientos, o interacciones específicas entre proteínas o entre proteínas

y alguna especie lipídica en particular.

Figura 1.2 Modelo de mosaico fluido de Singer y Nicolson. Esquemas del trabajo original. (A) Inserción de proteínas periféricas e integrales en la bicapa. Interacciones hidrofóbicas estabilizan la inserción en la membrana e interacciones hidrofílicas orientan los dominios intra o extracelulares. (B) Matriz bidimensional de lípidos en la que las proteínas difunden lateralmente. De Singer y Nicolson 1972.

5

1.1.2 Actualizando el modelo de mosaico fluido

El modelo de mosaico fluido permitió generar un potente armazón

conceptual que rápidamente comenzó a ser complementado y ajustado con

nueva evidencia experimental. El estudio fisicoquímico de lípidos por

medio de técnicas experimentales novedosas, y por otro lado, la

exploración biofísica de proteínas de membrana in vitro e in situ hicieron

grandes aportes para dilucidar aspectos relevantes de la estructura y

función de las biomembranas.

Un ajuste necesario al modelo de mosaico fluido provino de

observar la alta riqueza y variedad en la composición química de los

fosfolípidos y proteínas presentes en la membrana celular. Para el caso de

las proteínas de membrana, se estima que el genoma de E. coli presenta

más de mil secuencias que codifican para proteínas de membrana (Liu et al.

2002). En el genoma humano, se estiman en más de 5500 las regiones

codificantes para proteínas de membrana, esto representa un 26% del total

de genes codificantes para proteínas (Fagerberg et al. 2010) remarcando la

gran relevancia de estas proteínas para entender la fisiología celular normal

y patológica. De hecho, casi el 50% de los blancos terapéuticos de los

fármacos actuales son proteínas de membrana (Arinaminpathy et al. 2009).

Para que la distribución de los componentes en la membrana celular

sea completamente azarosa, todas las energías de interacción entre los

pares de interacción posibles deberían ser similares a kT (Engelman 2005).

Si bien no hay medidas precisas de estas energías de interacción, diversos

fenómenos señalarían que las interacciones involucrarían mayor energía

que la energía térmica y que la distribución de los componentes no sería

azarosa. Por ejemplo, se han observado multímeros de proteínas que

forman plataformas de señalización (Wong y Scott 2004), se determinaron

interacciones preferenciales de proteínas con determinados tipos de

fosfolípidos (Marsh 2008), se demostró la existencia de dominios lipídicos

de distinta fluidez (balsas lipídicas o “lípid rafts”, (Jacobson et al. 2007)), y

se comprobó una interacción entre la membrana y el citoesqueleto

subyacente (Kusumi et al. 2012).

Para dar cuenta de estas observaciones es necesario aumentar la

complejidad del modelo de mosaico fluido. La figura 1.3 representa el

6

modelo moderno de la membrana celular que incluye toda esta riqueza

estructural y muestra que componentes lipídicos y proteicos interactúan

entre sí de diversas maneras (Nicolson 2014). Estas interacciones pueden

llevar a la agrupación de componentes lipídicos y proteicos para formar

estructuras dinámicas, en un rango de tamaños entre 10-10000 nm y

tiempos de vida que pueden ir desde los milisegundos hasta minutos. La

función biológica surgiría como una propiedad emergente de estas

asociaciones (Lingwood y Simons 2010).

Figura 1.3 Modelo de mosaico fluido actualizado. (A) La visión de Escriba (2008) donde se resaltan la heterogeneidad lipídica, dominios lipídicos y el rol del citoesqueleto bajo la membrana. (B) La visión de Engelman (2005) donde se aprecia la alta densidad de proteínas en la membrana plasmática y las ligeras irregularidades en el empaquetamiento lipídico las cuales dicutiremos más adelante

1.2 Equilibrio de fases en bicapas lipídicas

1.2.1 Sistemas acuosos de un componente lipídico

Un enfoque clásico para el estudio de sistemas tan complejos, es

comenzar a dilucidar las propiedades de sus componentes aislados. El

estudio de las propiedades de bicapas lipídicas de un componente en agua

permite posteriormente ir sumando componentes a estos sistemas, de forma

tal de analizar las propiedades colectivas o emergentes que puedan surgir

de la interacción entre ellos.

El orden de la bicapa depende de la composición de la misma y de la

temperatura y presión a la cual se encuentra el sistema. La figura 1.4

7

muestra un diagrama de fases para dimiristoil-fosfatilcolina (DPPC, 16:0)

donde se muestran las transiciones de fases principales.

Figura 1.4 Transiciones de fase

de DPPC en agua. Se muestra la dependencia de las temperaturas de transición entre distintos estados con la presión y la temperatura del sistema. Abreviaturas: Lc (Lく'): cristal hidratado o subgel. Lく: fase gel Pく': fase gel ondulada o “rippled”. Lα: líquido cristalina. Adaptado de Matsuki (2013)

Este esquema muestra que aumentando la temperatura a presión

constante, se puede inducir una transición de fase en la bicapa lipídica.

Para biomembranas de compuestos lipídicos puros, se puede verificar que

la temperatura característica de las transiciones depende de la presencia de

instauraciones, el largo de la cadena hidrocarbonada y la naturaleza de su

cabeza polar.

En la fase gel las cadenas presentan un alto orden conformacional, es

decir, presentan fundamentalmente una conformación extendida en trans

que produce un mayor empaquetamiento (Figura 1.5A). Además, la

movilidad lateral de los fosfolípidos se encuentra muy disminuida (Figura

1.5B). La fase gel es entonces un estado de movilidad altamente

restringida para los fosfolípidos.

Las fases líquido cristalinas por el contrario presentan menor orden

conformacional, ya que entre 4 y 5 enlaces se encontrarían en configu-

ración gauche por cadena (Lewis y McElhaney 2004). Esto disminuye el

empaquetamiento de la bicapa haciendo que los lípidos, u otras moléculas

incluidas en la bicapa, puedan desplazarse lateralmente con mayor

facilidad.

8

La transición entre la fase gel (tanto Lく' como Pく') a líquido cristalina

(Lα) se denomina transición principal y se caracteriza por un gran cambio

en el orden que presenta la membrana a nivel conformacional y

traslacional. La temperatura a la cual ocurre esta transición se denomina

Tm (por melting, en inglés). Durante esta transición, la bicapa pasa de un

cuasi-cristal ordenado bidimensional a un cuasi-líquido bidimensional

(Simons y Vaz 2004).

Es común utilizar una nomenclatura que se refiere al estado de

agregación y al orden de estas bicapas, denominándose so a las fases gel

(por solid ordered, en inglés) y ld a las fases líquido cristalinas (por liquid

disordered, en inglés).

Algunas especies lipídicas puras, como DPPC, presentan también

una fase gel con características particulares. Esta fase (Pく') se caracteriza

por la inclinación de las cadenas hidrocarbonadas respecto a la dirección

normal a la membrana detectada por RMN, lo que permite una mayor

hidratación y genera un menor empaquetamiento. Esta fase es

denominada “rippled” u ondulada por su característica estructura observada

en microscopía de fuerza atómica (Kaasgaard et al. 2003).

Figura 1.5 Orden confor-

macional y traslacional.

(A) Las isomerizaciones trans-gauche se producen en las fases líquido crista-linas. (B) En fases líquido cristalinas se incrementan también los coeficientes de difusión rotacional y tras-lacional de los fosfolí-pidos.

1.2.2 Sistemas acuosos de dos o más componentes lipídicos

El agregado de otra especie fosfolipídica aumenta la complejidad de

los diagramas de fases. La figura 1.6 muestra un diagrama de fases en

función de la presión, temperatura y composición para una muestra binaria.

Se puede apreciar en esta representación la presencia de superficies que se

pueden asociar a la coexistencia de fases.

9

Figura 1.6 Diagrama de fases para mezclas lipídicas de dos componentes. Mezclas binarias de DMPC/DPPC y DMPC/DSPC. Las mezclas presentan una región de coexistencia de fases gel (so) y líquido cristalina (ld) (superficie rayada). Adaptado de Winter (2009)

Como muestra la figura 1.6A, en lípidos muy similares

estructuralmente como DPPC y DMPC, la región de coexistencia es más

reducida porque se produce una mezcla casi ideal entre los componentes.

Al producirse interacciones más desfavorables por las diferencias

estructurales entre los lípidos, sumadas a diferentes temperaturas de

transición, estos diagramas pueden presentar regiones de coexistencia de

fases más amplias (figura 1.6B).

1.2.3 El rol del colesterol. Fases líquido-ordenadas

Un avance importante en el estudio de las propiedades de las

membranas biológicas fue el descubrimiento de que el colesterol y los

fosfolípidos podían formar las denominadas fases líquido-ordenadas (lo)

que podían coexistir con fases líquido desordenadas pobres en colesterol

(figura 1.7). Este descubrimiento implicaba que distintas fases podían

coexistir en membranas completamente líquidas (Hjort Ipsen et al. 1987).

10

Figura 1.7 Transiciones princi-

pales en bicapas lipídicas hidra-

tadas y efectos del colesterol. El aumento de temperatura induce la transición desde la fase gel orde-nada hacia la fase fluida desor-denada. La presencia de colesterol permite la existencia de fases fluidas en cuanto a orden trasla-cional, pero con mayor orden conformacional: las fases líquido-ordenadas (lo). Adaptado de Eeman y Deleu (2010).

Estos dominios líquido ordenados presentan propiedades

fisicoquímicas intermedias entre las fases gel y líquido cristalinas. Por un

lado, la movilidad lateral de las moléculas en una fase lo es del orden del

correspondiente a una fase ld, reduciéndose a lo sumo a la mitad o a un

tercio (Almeida et al. 1993). Por otro lado, el orden conformacional de la

fase lo es similar al de la fase so (tabla 3).

Tabla 3 Características de las distintas fases lipídicas (adaptado de Almeida et al.

1993)

Fase Coeficiente de difusión

traslacional (D)

Orden Conformacional

Gel (Lく o so) 0.001 µm2 s-1 Alto

Líquido ordenado (Lo) ~1 µm2 s-1 Alto

Líquido cristalino (Lα o Ld) ~1 µm2 s-1 Bajo

Las fases presentes en membranas biológicas dependen íntimamente

de la composición de la membrana. En particular las regiones ricas en

esfingomielinas –las cuales presentan cadenas largas y saturadas- tienen

una gran tendencia a formar fases so o formar parte de fases lo. Por otro

11

lado, los glicerofosfolípidos generalmente presentan una cadena insaturada,

por lo que suelen enriquecer las fases fluidas ld (van Meer et al. 2008).

Los diagramas de fases para mezclas ternarias con colesterol

frecuentemente se representan en coordenadas triangulares. Para una dada

temperatura, estos diagramas permiten analizar qué fases coexisten según

la composición de la mezcla (figura 1.8)

Figura 1.8 Diagrama en

coordenadas triangulares de una

mezcla lípidica ternaria. A modo

de ejemplo, se representa el

diagrama correspon-diente a la mezcla de POPC, esfingo-mielina y colesterol. A partir de Marsh (2009)

1.3 Dominios lipídicos en la membrana celular. Balsas lipídicas o “lipid rafts”

1.3.1 Identificación y caracterización de dominios en membranas biológicas

Si bien el modelo de mosaico fluido contemplaba la posibilidad de

asociaciones temporales entre fosfolípidos en la membrana, no fue hasta

1982 que Karnovsky y colaboradores (1982) demostraron la existencia de

heterogeneidad lateral en membranas biológicas y denominaron dominios

lipídicos a estos agrupamientos.

En dicho trabajo, obtuvieron evidencias a partir de tiempos de vida

fluorescencia y experimentos de partición de ácidos grasos en membranas

celulares que indicaban la coexistencia de fases en sistemas de vesículas y

12

en líneas celulares. Mostraron también que estos fenómenos podían

asociarse a la disrupción de funciones celulares. Sus observaciones fueron

interpretadas con un modelo en el cual se postulaba la coexistencia de

dominios lipídicos en distinto estado de agregación en membranas

biológicas. El trabajo ya postulaba los interrogantes que guiarían estudios

en los 30 años posteriores: ¿cómo se generan estos dominios? ¿existe

partición diferencial? ¿cómo afectan a la estructura y función de proteínas?

Paralelamente, distintos trabajos orientados al estudio de la función

biológica de membranas celulares demostraron que las membranas apical y

basolateral de células epiteliales poseen distinta composición lipídica

(Simons y Van Meer 1988) (figura 1.9) y estudiaron los posibles

mecanismos que generaban ese envío selectivo de lípidos. Los autores

detectaron que la membrana apical tenía una composición lipídica

altamente enriquecida en esfingolípidos (fig 1.9) y excluía fosfolípidos

como fosfatidilcolina respecto a la membrana basolateral. Como las

moléculas de esfingomielina pueden formar fuertes puentes de hidrógeno

entre sí, se las propuso como una plataforma de tráfico a través del Golgi,

en la cual podrían ir asociadas proteínas específicas de la membrana apical.

Figura 1.9 Composición

diferencial en membra-

na apical de células

epiteliales. Los dominios de composición diferen-cial se forman desde el Golgi y actúan como una plataforma de transporte de proteínas asociadas y de los propios lípidos que dan la composición dife-rencial a la membrana apical. Adaptado de Simons 1988

En esos mismos años, se descubría que las proteínas de membrana

ancladas por un residuo glicosil-fosfatidil-inositol (GPI) se encontraban

preferencialmente en la membrana apical de células epiteliales (Lisanti et

al. 1988). Trabajos posteriores unieron estas evidencias y se pudo

13

descubrir que las fracciones subcelulares enriquecidas en estas proteínas

ancladas por GPI eran insolubles en 5.9 mM del detergente Tritón X-100 a

4 ºC (Brown y Rose 1992). El análisis de la composición lipídica de estas

fracciones insolubles arrojaba una proporción molar aproximada 1:1:1 de

glicerofosfolípidos, esfingomielinas (SM) y colesterol (Col).

Sosteniéndose el rol fundamental de las esfingomielinas y el

colesterol en estas estructuras, se formularon dos definiciones operativas de

lo que inicialmente se denominaron microdominios, para luego comenzar a

denominarse “lipid rafts” (Simons y Ikonen 1997). El primer criterio

experimental utilizado fue la insolubilidad de dichos dominios en presencia

de Tritón X-100 al 1% a bajas temperaturas (4 ºC). Se denominó

"Detergent Resistant Membranes" (DRMs) a los dominios que resistían

dicho tratamiento. El segundo fue la disrupción de los fenómenos celulares

aparentemente asociados a rafts por la depleción de colesterol.

Esta definición inicial fue modificándose y actualmente definimos

como “membrane rafts” a aquellos “dominios pequeños (10-200 nm),

heterogéneos en composición, altamente dinámicos, enriquecidos en

esteroles y esfingolípidos que compartimentalizan procesos celulares.

Pequeños rafts pueden, en algunas situaciones, estabilizarse y formar

plataformas aún mayores a través de interacciones proteína-proteína y

lípido-proteína” (Pike 2006). Se busca imponer el término más amplio

“membrane raft” en vez de “lipid raft” por considerarse que las propiedades

de estas estructuras no surgen simplemente de interacciones entre lípidos, si

no también de las proteínas de membrana y estructuras celulares como el

citoesqueleto (figura 1.10). De todas maneras su uso en la literatura actual

es indistinto.

14

Figura 1.10 Dominios en membranas biológicas (A) Los ensambles a nanoescala de proteínas y lípidos constituyentes de rafts serían las estructuras más dinámicas. (B) En respuesta a estímulos externos o el inicio de eventos de tráfico en membrana, los rafts comenzarían a formarse a partir de interacciones lípido-lípido, lípido-proteína y proteína-proteína. (C) Dominios de tamaño micrométrico pueden inducirse en vesículas gigantes o esferas de membrana plasmática liberadas por la célula. Adaptado de Simons y Gerl (2010).

1.3.2 Dominios de membrana y función biológica

Trabajos recientes muestran que un gran número de procesos

biológicos que involucran a la membrana celular requieren de dominios

enriquecidos en ciertos componentes. Las membranas biológicas

presentarían como mecanismo para coordinar su función biológica, la

capacidad de separar lateralmente sus constituyentes.

15

El mencionado rol de los dominios en tráfico intracelular de lípidos

en células epiteliales, sería parte de un mecanismo general de tráfico

selectivo en el trans-Golgi (Klemm et al. 2009).

Por otra parte, los rafts estarían relacionados con la entrada (figura

1.11A), ensamblado y liberación de partículas virales en HIV-1, Ebola,

RSV e influenza (Suomalainen 2002; Chang et al. 2012). La generación de

regiones con una composición diferencial favorecería la concentración

espacial de proteínas virales y colesterol para la liberación de las partículas

infecciosas. Como sostiene Pelkmans (2005), los virus logran secuestrar

determinadas vías endocíticas para poder luego navegar las complejas vías

de tráfico intracelular. Muchas de estas vías dependen de la formación de

microdominios de composición definida.

Los lipid rafts son también de gran importancia para la sinapsis

inmunológica (figura 1.11B). Los receptores TCR en las células T,

responsables de transmitir la señal de activación fundamental tras el

reconocimiento de péptidos en células presentadoras de antígeno, formarían

grandes dominios de activación cuya composición lipídica es característica

de rafts (Zech et al. 2009; Miguel et al. 2011). También en células B, al

reconocerse el antígeno por receptores BCR, el reclutamiento de los

mismos en rafts sería necesario para la activación y expansión clonal

(Pierce 2002).

16

Figura 1.11 Formación de dominios de membrana en células (A) Tres modos de entrada de partículas virales a la célula. El primero de los mecanismos no depende de proteínas y sólo es impulsado por la formación de un lípid raft. Los otros mecanismos conllevan la intervención de proteínas como caveolinas cuyo agrupamiento también es inducido por la partícula viral. (B) Redistribución y formación de una plataforma de composición diferencial en células B. El contacto con el antígeno induce el agrupamiento de los receptores BCR y determina la formación posterior de un dominio de composición lípido-proteica definida. Adaptado de Pierce (2002) y Pelkmans (2005).

1.3.3 Uso de técnicas de fluorescencia para el estudio de sistemas lipídicos complejos

Como hemos mencionado previamente, se postuló la existencia de

los rafts a partir del aislamiento de membranas resistentes a la

solubilización por detergente. Sin embargo, la extracción con detergente

modifica la estructura de la membrana por lo que la composición de las

muestras resultantes puede no ser representativa de los rafts. Lichtenberg y

colaboradores (2005) demostraron que la técnica de extracción con

detergentes puede presentar gran variedad de artificios tanto en la

solubilidad de membranas como en la partición diferencial de proteínas.

Concluyen con estas evidencias que no toda DRM es un raft ni todos los

rafts serán detectables como DRMs.

17

La microscopía y espectroscopía de fluorescencia (cuyos

fundamentos desarrollaremos en el capítulo 3) ha jugado un rol

fundamental en los estudios de coexistencia de fases lipídicas. Su ventaja

principal respecto a otras técnicas radica en que puede ser utilizada tanto en

sistemas artificiales de membranas como en células vivas. Está técnica

requiere, además de instrumentación adecuada, la selección de sondas

fluorescentes de características espectroscópicas apropiadas al sistema en

estudio. En los últimos 15 años ha comenzado a ganar cada vez más

importancia la microscopía de fluorescencia. Esto estuvo dado por la

capacidad de localizar espacialmente los fenómenos de interés y el

desarrollo de técnicas donde la sensibilidad detección llega al límite de

molécula única en dimensiones temporales del orden de 10 µs.

1.3.4 Sistemas de membranas artificiales.

Un sistema muy utilizado para el estudio de las propiedades de

membranas artificiales son las bicapas soportadas. Consisten básicamente

en la dispersión de pequeñas vesículas lipídicas sobre un soporte

hidrofílico, lo cual genera una bicapa plana, extendida bidimensionalmente

sobre este sustrato (Richter et al. 2006). La ventaja de estas bicapas planas

soportadas es que pueden obtenerse imágenes tanto de microscopía de

fluorescencia como de microscopía de fuerza atómica, lo que permite

revelar la estructura lateral de las membranas en el orden de nanometros a

micrometros. Una de sus desventajas radica en que pueden presentar

interacciones con el soporte en que se encuentran, lo que puede alterar su

organización lateral y propiedades termodinámicas (Mouritsen 2011).

En 1986, Angelova y Dimitrov (Angelova y Dimitrov 1986)

publicaron un protocolo de electroformación de vesículas lipídicas

unilamelares de grandes dimensiones (entre 10 y 100 µm) que se

denominaron vesículas unilamelares gigantes (GUVs, del inglés Giant

Unilamellar Vesicles). El tamaño de estas vesículas es del orden del de una

célula eucariota por lo que los radios de curvatura se vuelven también

similares. Además, su gran tamaño hace accesible el uso de técnicas

ópticas de campo lejano para su estudio (figura 1.11A) Este sistema junto

18

con las bicapas soportadas permitieron la visualización de coexistencia de

fases en mezclas lipídicas preparadas con distintas composiciones. Las

GUVs presentan la ventaja de ser un sistema que se mantiene libre en

suspensión acuosa definiendo -como toda vesícula- una superficie que

separa exterior de interior formando un compartimento. Esto da acceso a

estudios de fenómenos vectoriales de transporte a través de la membrana.

Pueden además manipularse con dispositivos micromecánicos. La figura

1.12 muestra ejemplos de imágenes obtenidas en microscopía de

fluorescencia, de GUVs presentando distintos dominios lipídicos generados

por interacciones preferenciales entre lípidos.

Figura 1.12 Vesículas Unilamelares Gigantes en microscopía de fluorescencia. (A) Comparación de tamaño respecto a un liposoma. (B-G) GUVs de distintas composiciones teñidas con sondas fluorescentes: (B) DMPE:DMPC 7:3 marcada con Rodamina-DPPE (C) DPPE:DPPC 7:3 con Rho-DPPE (D) DOPC:SM:Chol 1:1:1 con DiI-C18 (rojo) y Alexa-Cholera Toxin B (verde) contra GM1 (E) POPC:SM 1:1 Con DiIC-18 (rojo) y Bodypy-PC (verde) (F) DMPC:DAPC 1:1 con Laurdan (G) DOPC:DPPC:Colesterol 1:1:1 con DiI-C18 (rojo) y Bodypy-PC (verde). Adaptado de Bagatolli (2000 y 2006), Kahya (2003) y Juhasz (2010).

La observación por microscopía de estos macrodominios lipídicos en

mezclas binarias o ternarias de lípidos, dieron aún más sustento a la idea de

la coexistencia de fases lipídicas en membranas (Bagatolli y Gratton 1999).

19

Si pensamos la membrana como un líquido bidimensional, la

heterogeneidad lateral es una forma de inmiscibilidad líquido-líquido

(Simons y Vaz 2004).

Durante la última década se desarrollaron protocolos para integrar en

estas vesículas péptidos o incluso proteínas de membrana (Girard et al.

2004; Varnier et al. 2010; Aimon et al. 2011; Dezi et al. 2013). Estos

protocolos suelen desnaturalizar irreversiblemente las proteínas dado que

requieren pasos que pueden incluir desecar la muestra, calentar por encima

de 50ºC o el uso de buffers de concentración no fisiológica. Es común el

agregado de sustancias como sacarosa (Doeven et al. 2005) que permitan

estabilizar a las proteínas al desecarse y poder luego recuperar la actividad

biológica. En definitiva, se debe ser más cuidadoso con las condiciones de

trabajo para conservar la actividad biológica de las proteínas y obtener un

rendimiento de producción de GUVs.

Por otro lado, se han sintetizado vesículas gigantes a partir de

extractos de membranas naturales (Montes et al. 2007) y en condiciones

fisiológicas de fuerza iónica. Esto permite conservar la composición

lipídica y características de asimetría típicas de membranas naturales y

además conservar proteínas de membrana.

Al sintetizarse GUVs con la composición lipídica particular de las

primeras DRMs aisladas: 1:1:1 glicerofosfolípidos, esfingomielina y

colesterol se pudieron observar macrodominios de distinta fluidez

característicos de la coexistencia de fases. Sin embargo, no se pudieron

detectar macrodominios de esas dimensiones en un sistema de la

complejidad y heterogeneidad de componentes como es la propia

membrana celular. Los rafts en las membranas celulares son en principio

estructuras dinámicas de menor tamaño que la resolución de un

microscopio confocal de fluorescencia (200 nm ). El tamaño de los rafts,

su dinámica, la alta complejidad en la composición de la membrana e

incluso la variabilidad entre tipos celulares vuelve más difícil su genuina

identificación en membranas celulares (figura 1.13). Sin embargo, se han

podido identificar regiones de menor fluidez, como adhesiones focales y

filopodios (Gaus et al. 2003).

20

Figura 1.13 GUVs de composición raft y células. (A) GUVs compuestas de DOPC:SM:COL 2:2:1. Se aprecia claramente la coexistencia de fases. (B) Fibroblastos. En rojo regiones de menor fluidez asociadas a la morfología celular. (C) Saccharomyces cerevisiae. Regiones de mayor orden. Las imágenes en células combinan regiones de membrana celular con sistemas de endomembranas. Adaptado de Gaus (2003), Learmonth (2002).

1.4 Interacciones lípido-proteína

En esta visión actualizada de las membranas biológicas donde los

lípidos presentan mayor complejidad que la de un mero fluido

bidimensional en el que flotan las proteínas de membrana, las interacciones

particulares entre éstos y las proteínas de membrana cobran gran

relevancia. La función biológica de muchas proteínas de membrana es

sensible al tipo de lípidos presente en las preparaciones utilizadas para su

estudio. Los mecanismos responsables de estos cambios en actividad y

cómo se translucen a partir de los cambios en las propiedades

fisicoquímicas de la membrana es un área muy activa de estudio y

lentamente emergen algunos principios generales (Contreras et al. 2011).

1.4.1 Tipos de interacción lípido proteína

Se pueden definir 3 tipos de interacciones entre proteínas de

membrana y moléculas lipídicas (figura 1.14) de acuerdo al tiempo de

residencia relativa de un lípido particular en la interfase proteína-lípido

(Lee 2003). Esta clasificación proviene fundamentalmente de resultados

obtenidos con la técnica de espectroscopía de resonancia de espín

electrónico. Brevemente, ésta técnica consiste en introducir lípidos con

21

una marca de espín y obtener señales características de aquellos lípidos que

difunden libremente en la bicapa y de los que presentan un movimiento

restringido. A partir de esta información permite conocer las tasas de

intercambio y amplitud de movimiento de las cadenas hidrocarbonadas en

distintas subpoblaciones lipídicas (Horváth 1994).

Por una lado, se denominan lipidos co-solvente (“bulk” en inglés,

refiriéndose a los que se encuentran en el seno de una fase) a aquellos

lípidos que muestran interacciones débiles con la proteína por lo cual

presentan una rápida tasa de intercambio respecto a otros lípidos cercanos y

por lo tanto bajos tiempos de residencia.

Por otro lado, las proteínas pueden interactuar específicamente con

la cabeza polar hidrofílica de ciertos lípidos, presentar fuertes interacciones

hidrofóbicas con los lípidos de acuerdo al largo y/o estado de saturación de

la cadena hidrocarbonada. Estos lípidos presentan mayores tiempos de

residencia y por lo tanto su tasa de intercambio respecto al resto de la

membrana (bulk) es menor. Estos lípidos se denominan anulares ya que los

mismos rodearán preferencialmente a la proteína conformando un anillo

compuesto por 50-100 moléculas (figura 1.14). La composición de las

capas anulares es variable y depende del conjunto de interacciones

particulares que se produzcan en esta región y la composición global de la

membrana (Poveda et al. 2008). Las interacciones que forman estas capas

anulares pueden presentar selectividad tanto por el largo de cadena como

por la naturaleza de la cabeza polar (Hite et al. 2010).

Los lípidos anulares constituyen un micro-entorno que afecta

directamente a la actividad de la proteína a partir de interacciones

transientes con la región transmembrana.

Finalmente, se definen los lípidos estructurales. Éstos se

caracterizan por presentar una gran afinidad por la proteína y es común que

co-cristalicen junto con la proteína como se verifica al resolver su

estructura por cristalografía y difracción de rayos X. Esto hace que sea

común encontrar correspondencia entre las superficies de unión en el

segmento transmembrana y estos fosfolípidos (Qin et al. 2006). También

se los encuentra residiendo en sitios específicos en la interfase entre

proteínas integrantes de multímeros o grandes complejos proteicos

(Contreras et al. 2011).

22

Figura 1.14 Interacciones lípido

proteína. Tipos de interacción lípido-proteína de acuerdo al tiempo de residencia de las molé-culas en la región transmembrana de las proteínas. Adaptado de Contreras 2011.

También se han identificado sitios específicos de unión de

fosfolípidos de identidad química definida en algunas proteínas, lo que

vuelve a esta interacción similar a la unión específica de un cofactor

(Adamian et al. 2011). En algunos casos, la presencia de una determinada

especie lipídica se vuelve indispensable para el funcionamiento de la

proteína (Hoffmann et al. 1994).

1.4.2 Ajuste hidrofóbico y perfiles de presión lateral

La exposición total o parcial al medio acuoso de una porción

hidrofóbica de una proteína o de las cadenas hidrocarbonadas de los

fosfolípidos es energéticamente desfavorable. Por este motivo, cuando el

grosor del dominio transmembrana es distinto al espesor de la bicapa, los

fosfolípidos y la proteína se reorganizan de modo de disminuir dicha

exposición, fenómeno que se denomina ajuste hidrofóbico (Mouritsen y

Bloom 1993). En este tipo de interacciones es posible que las proteínas

seleccionen un ambiente lipídico particular que satisfaga el recubrimiento

del segmento transmembrana al mismo tiempo que su estructura se adapta

conformacionalmente a su entorno (figura 1.15).

23

Figura 1.15 Ajuste hidrofóbico (A) La diferencia entre el grosor del dominio transmembrana (dp) y de la bicapa lipídica circundante (dL) promueven una reorganización local de la membrana para minimizar la energía del sistema (B) Representación tridimensional del fenómeno, donde una proteína selecciona su entorno hidrofóbico circundante. Adaptado de Jensen y Mouritsen 2004.

Una proteína integral de membrana sensa un perfil de presión lateral

π(z) que se establece a través de la bicapa dada la naturaleza anisotrópica

de la membrana comparada a un solvente tridimensional (figura 1.16)

(Marsh 2007). La presión que afecta a la proteína proviene de las

contribuciones principalmente de 3 fuerzas. Por un lado, se observan

fuerzas repulsivas entre las cabezas polares debido a interacciones

electrostáticas e impedimentos estéricos (πcp) y fuerzas repulsivas

producidas por los límites conformacionales al empaquetamiento de las

cadenas hidrocarbonadas (πch). Opuesta a esta tendencia se encuentra la

tensión en la interfase entre las cadenas hidrocarbonadas y la región polar

hidratada, que al buscar minimizar el área de la membrana genera una

presión negativa (けhfob) (Marsh 2007).

24

Figura 1.16 Perfil de presión lateral (z) Representado a partir de una distancia z desde el plano medio de la bicapa. Ap(z) es una unidad de sección cruzada de una proteína inserta en la membrana, que, en este caso, se representa con dos conformaciones de distinta geometría. Las fuerzas que sensa la proteína provenientes de la bicapa lipídica son: πcp que representa las fuerzas repulsivas entre las cabezas polares de los fosfolípidos, πch que representa la repulsión de las cadenas al empaquetamiento y けhfob es la tensión interfacial hidrofóbica que produce la exposición de las cadenas hidrocarbonadas al agua; esto genera una presión negativa al intentar reducir la superficie expuesta. Adaptado de Marsh (2007).

Si se producen cambios en la composición de fosfolípidos o en la

geometría de la membrana y se altera este perfil de presión lateral, la

membrana puede inducir un cambio conformacional en la proteína que

module su actividad biológica (suponiendo que la proteína no sea

perfectamente cilíndrica y absorba esa variación en el perfil) (Cantor 1999;

Jensen y Mouritsen 2004).

El ajuste hidrofóbico y el cambio en los perfiles de presión lateral no

son mecanismos completamente independientes. De hecho, la pérdida de

ajuste hidrofóbico produce un cambio en la tensión interfacial que puede

modificar el perfil de presión lateral. Un modelo muy estudiado en este

aspecto ha sido el canal MscL de Escherichia coli (Perozo et al. 2002). Su

función biológica es la mecanotransducción: el canal sensa cambios en

tensiones en la membrana y dispara una señal que en este caso es un

aumento en la conductancia. Lípidos con distintos largos de cadena y

distinta tendencia a generar curvaturas en la membrana inducen distintas

intensidades de activación. Esto ha sido interpretado como perfiles de

fuerzas laterales que estabilizan distintas conformaciones de estos canales y

dan como resultado los diferentes niveles de apertura (Figura 1.17).

25

Figura 1.17 Canales mecanotransductores MscL. Distintos perfiles de curvatura generan distintas tensiones laterales que estabilizan distintas conformaciones del canal. (A) Análisis del canal reconstituido en distintas preparaciones lipídicas. (B) Distintas conformaciones del canal estabilizadas por la composición del medio de reconstitución. Adaptado de Perozo 2002.

26

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Capítulo 2

La bomba de Ca2+ de la membrana plasmática

2.1 El rol del Ca2+ en la función celular

El ión Ca2+ interviene en una gran variedad de procesos celulares y

fisiológicos que son modulados en una amplia escala temporal (figura 2.1).

Los niveles de calcio citoplasmático en mamíferos son mantenidos

homeostáticamente en el orden de 0.1 µM, cuatro órdenes de magnitud por

debajo de la concentración extracelular e intravesicular que es del orden de

1-2 mM. El aumento en la concentración de Ca2+ actúa como una señal que

dispara fenómenos que abarcan desde la secreción de neurotransmisores y

hormonas que ocurre en el orden de microsegundos, pasando por la

contracción muscular y fenómenos metabólicos, hasta fenómenos

asociados a la fertilización y división celular que ocurren en el rango de

minutos y horas (Berridge et al. 2003). Las variaciones en la concentración

intracelular de Ca2+ constituyen un sistema de señalización celular que es

todo un campo de estudio en sí mismo dado que presentan complejos

patrones temporales y espaciales (Raveh et al. 2012) y pueden ser

disparadas por una gran variedad de estímulos (Friel y Chiel 2008). Un

amplio repertorio de proteínas participa en estos procesos de transporte. Por

citar algunos ejemplos se pueden mencionar los canales de Ca2+ que

permiten su entrada desde el medio extracelular (Dolphin 2009), la vía de

señalización de fosfolipasa C que genera IP3 que río abajo libera Ca2+ del

retículo endoplasmático, o CD38 que sintetiza los nucleótidos cADPR y

NAADP formando un sistema que actúa como un sensor metabólico que

también estimula la liberación de Ca2+ del retículo endoplasmático

(Churchill et al. 2002).

33

Figura 2.1 Principales mecanismos de señalización por Ca2+

y de r

de los niveles de Ca2+

en reposo. Los niveles de Ca2+ citoplasmáticos son través de distintos sistemas; entre ellos el intercambiador Na+/Ca2+ y la bomde la membrana plasmática (PMCA) que expulsan Ca2+ al medio extracelular, mientras que la bomba de calcio del retículo endoplasmático liso (SERCA) lo almacena denéste sistema de endomembranas. Adaptado de Berridge 2003.

eestablecimiento

regulados a ba de calcio

tro de

Tras el disparo de estas señales de Ca2+, los niveles del catión suben

pero luego vuelven a reestablecerse a los niveles de reposo previos a través

de cuatro sistemas de transporte: el intercambiador Na+/Ca2+, el

transportador unidireccional mitocondrial, la bomba de calcio del retículo

34

endoplasmático liso (SERCA) y la bomba de calcio de la membrana

plasmática (PMCA).

2.2 La bomba de calcio de la membrana

plasmática

2.2.1 Ciclo catalítico

La bomba de calcio de la membrana plasmática (PMCA) es una

proteína integral de membrana presente en todas las células eucariotas y

perteneciente a la familia de proteínas denominada ATPasas de tipo P.

Estas proteínas se caracterizan por la formación de un intermediario

fosforilado de alta energía durante el ciclo de reacción como resultado de la

transferencia del fosfato け del ATP a un residuo de ácido aspártico

invariante en una secuencia DKTG altamente conservada (Brini y Carafoli

2009).

El modelo cinético propuesto para el mecanismo de hidrólisis de

ATP por la bomba de calcio (Rega y Garrahan 1986) se representa

esquemáticamente en la figura 2.2. En cada ciclo de reacción, por cada

mol de ATP hidrolizado se intercambian electrogénicamente un mol de

Ca2+ por un mol de H+ (Hao et al. 1994).

Figura 2.2 Modelo cinético de la hidrólisis de ATP por la bomba de calcio. La conformación E1 posee mayor afinidad por calcio que E2. La unión de ATP a E1·Ca2+ fosforila a la enzima e induce el cambio conformacional hacia E2.P.Ca2+

. Esta conformación presenta menor afinidad por el calcio y al quedar expuesta al espacio extracelular, libera al Ca2+ y E2·P se desfosforila regenerando E2. Adaptado de Di Leva 2008

35

En ausencia de ATP, la enzima se encuentra en equilibrio entre las

conformaciones denominadas E1 y E2. Este equilibrio se desplaza a E1 en

presencia de Ca2+, Mg2+, calmodulina o fosfolípidos ácidos (Adamo et al.

1990). La unión del ATP al intermediario E1-Ca2+ es seguida por la

fosforilación de la enzima generándose E1P-Ca2+ (Garrahan y Rega 1978).

A continuación se produce un cambio en la conformación de la enzima a

E2P-Ca2+, que es acelerado por el ión Mg2+. Este último intermediario

presenta baja afinidad por Ca2+; como el sitio de unión a este ión se

encuentra expuesto al exterior, finalmente el Ca2+ se libera al medio

externo y E2P se desfosforila regenerando E2.

2.2.2 Activadores e inhibidores

Para el funcionamiento de la bomba de Ca2+ es esencial la presencia

del ión Mg2+. En ausencia de este ión, la bomba no presenta actividad

(Rega y Garrahan 1986).

Cuando la enzima se encuentra purificada y reconstituida en micelas

de detergente puro, es posible medir una actividad ATPasa muy baja, que

se incrementa con el agregado de fosfolípidos neutros como fosfatidilcolina

(Filomatori y Rega 2003). Los fosfolípidos ácidos, tales como la

fosfatidilserina y el fosfatidilinositol, producen una activación aún mayor

de la bomba. Los ácidos grasos insaturados como el oleico y el linoleico

también producen un efecto de activación (Niggli et al. 1981).

La mayor actividad específica de PMCA se obtiene con la proteína

calmodulina (CaM) que en presencia de Ca2+ interactúa con un dominio

cercano al C-terminal de PMCA. El mencionado dominio es

autoinhibitorio y por lo tanto calmodulina, al evitar esta inhibición,

aumenta fuertemente la actividad de PMCA. La interacción entre estas

proteínas requiere concentraciones de calcio en el orden de 1-10 µM (Foder

y Scharff 1981) y aumenta 2 a 9 veces la velocidad de transporte.

Las proteínas-quinasas dependientes de AMP cíclico (Caroni y

Carafoli 1981) y la proteína quinasa C (Wang et al. 1991) pueden fosforilar

la bomba de calcio y promover su activación.

36

Como el resto de los P-ATPasas, PMCA es inhibida por el

ortovanadato (VO3(OH)2-) y el lantano (La3+).

2.2.3 Estructura primaria y distribución tisular

En humanos, la PMCA se encuentra codificada en 4 genes que por

splicing alternativo producen hasta 30 isoformas diferentes de la proteína

(Strehler y Zacharias 2001). La isoforma 2 se expresa principalmente en

células del sistema nervioso central. La isoforma 3 se expresa en células

excitables y páncreas (García et al. 2002). Las isoformas 1 y 4 se expresan

en forma ubicua (Guerini et al. 2005). Según la nomenclatura propuesta la

letra antes de PMCA designa las variantes de rata “r” o de humano “h”.

Luego las isoformas se designan con letras (a-h) después del número que

indica el gen.

En particular, en eritrocitos humanos, La isoforma hPMCA4b

constituye el 80% del total de bomba de calcio; el 20% restante

corresponde a la isoforma hPMCA1b. La isoforma hPMCA4b está

constituida por una única cadena polipeptídica de masa molecular

aproximada 134 kDa y cuya secuencia (Strehler et al. 1990) se muestra en

la figura 2.3.

37

1 11 21 31 41

MTNPSDRVLP ANSMAESREG DFGCTVMELR KLMELRSRDA LTQINVHYGG

VQNLCSRLKT SPVEGLSGNP ADLEKRRQVF GHNVIPPKKP KTFLELV EW A

LQDVTLIILE IAAIISLVL FYS RPAGEENE LCGQVATTPE DENEAQAGWI EGAAILFSVI IVVLVTAFND WSKEKQFRGL QCRIEQEQKF SIIRNGQLIQ LPVAEIVVGD IAQVKYGDLL PADGILIQGN DLKIDESSLT GESDHVKKSL

DKDPMLLSGT HVMEGSGRMV VTAVGVNSQT GIILTLLGVN EDDEGEKKKK

GKKQGVPENR NKAKTQDGVA LEIQPLNSQE GIDNEEKDKK AVKVPKKEKS

VLQGKL M SALTVFILIL YFVIDNFVIN RRPWTRLA VQIGKAGLL LPECTP

IYIQYFVKFF IIGITVLVVA VPEGLPLAVT ISLAYSVKKM MKDNNLVRHL

DACETMGNAT AICSDKTGTL TMNRMTVVQA YIGGIHYRQI PSPDVFLPKV

LDLIVNGISI NSAYTSKILP PEKEGGLPRQ VGNKTECALL GFVTDLKQDY

QAVRNEVPEE KLYKVYTFNS VRKSMSTVIR NPNGGFRMYS KGASEIILRK

CNRILDRKGE AVPFKNKDRD DMVRTVIEPM ACDGLRTICI AYRDFDDTEP

SWDNENEILT ELTCIAVVGI EDPVRPEVPD AIAKCKQAGI TVRMVTGDNI NTARAIATKC GILTPGDDFL CLEGKEFNRL IRNEKGEVEQ EKLDKIWPKL RVLARSSPTD KHTLVKGIID STVGEHRQVV AVTGDGTNDG PALKKADVGF

AMGIAGTDVA KEASDIILTD DNFTSIVKAV M GRNVYDW SI SKFLQFQLTV

NVVAVIVAFT GAC PL KAVQMLWVNL IMDTFASLAL AITQDS TEPPTESLL

KRRPYGRNKP LISRTMMKNI LGHAFYQLIV IFILVFAGEK FFDIDSGRKA

PLHSPPSQHY TIVFNTFVLM QLFNE SG IYRNIIFCSVINSRK IHGEKNVF

VLGTFICQIF IVEFGGKPFS CTSLSLSQWL WCLFIGIGEL LW QFG ISAIP

TRSLKFLKEA GHGTTKEEIT KDAEGLDEID HAEMELRRGQ ILWFRGLNRI QTQIKVVKAF HSSLHESIQK PYNQKSIHSF MTHPEFAIEE ELPRTPLLDE

EEEENPDKAS KFGTRVLLLD GEVTPYANTN NNAVDCNQVQ LPQSDSSLQS

LETSV

Figura 2.3 Secuencia aminoacídica de la isoforma hPMCA4b de la bomba de

calcio. En verde se subrayan los segmentos transmembrana y en rojo se marcan los residuos triptófano.

2.2.4 Estructura secundaria y terciaria

Esta única cadena polipeptídica presenta 10 dominios

transmembrana y 4 dominios citoplasmáticos. Los dominios

citoplasmáticos constituyen aproximadamente el 80% de la masa de la

proteína (Di Leva et al. 2008). La figura 2.4 muestra un esquema de

PMCA donde se ubican estos dominios. El bucle intracelular entre los

dominios transmembrana 2 y 3 (TM2 y TM3) forman el dominio activador

(A) y contiene residuos básicos donde se encuentra una de las regiones de

activación por fosfolípidos ácidos. El loop intracelular entre TM4 y TM5

contiene el dominio catalítico. Éste contiene el subdominio P, que contiene

el residuo aspartato fosforilable (secuencia DKTG) y el subdominio N de

unión al ATP. La región C-terminal es más larga que en otras Ca2+

38

ATPasas y contiene el mencionado sitio de unión a calmodulina (CaM-

BD). En ausencia de calmodulina, esta región se une a sectores de la

proteína ubicados en los dos primeros dominios intracelulares (figura 2.4).

Al unirse CaM al CaM-BD, los sitios de unión se vuelven accesibles y la

afinidad de PMCA por Ca2+ aumenta, lo que genera que la constante de

disociación del Ca2+ (Kd) disminuya de 10-20 µM a valores inferiores a 1

µM. De este modo se produce una retroalimentación negativa en la cual el

Ca2+ celular alto produce la unión de CaM a PMCA, y ésta incrementa su

actividad para reestablecer los valores citoplasmáticos basales.

Figura 2.4 Esquema de la topología de PMCA. Los 10 segmentos transmembrana se representan como cilindros. Se indican los 3 dominios principales. Se muestran las posiciones aproximadas de los sitios de fosforilación, unión a ATP y unión del dominio autoinhibitorio a los sitios en los dos primeros bucles citoplasmáticos. Adaptado de Lopreiato (2014)

39

2.3 Sistemas para el estudio de la actividad

enzimática de PMCA

La regulación de la actividad enzimática de PMCA se ha estudiado

utilizando principalmente tres tipos de sistemas: fragmentos de membranas

celulares (Quist y Roufogalis 1975), proteína purificada reconstituida en

liposomas (Hao et al. 1994) o proteína purificada reconstituida en un

sistema de micelas mixtas (Levi et al. 2000).

2.3.1 Membranas y fragmentos de membranas celulares

Los primeros trabajos que demostraron la existencia de transporte de

iones y actividad ATPasa dependiente de Ca2+ datan de 1966 (Schatzmann

1966). Desde ese momento muchos estudios bioquímicos en los que se

determinaba fundamentalmente la actividad catalítica de la enzima se

realizaron utilizando membranas o fragmentos de membranas libres de

CaM (figura 2.5). A partir de estos estudios, se determinó el ciclo

catalítico de PMCA presentado previamente (figura 2.2) formulando

modelos cinéticos que ajustasen a los datos experimentales obtenidos.

Si bien las membranas presentan una alta cantidad de proteínas (sólo

un 0.1 % corresponde a PMCA) toda la actividad ATPasa dependiente de

Ca2+ en estas membranas proviene de PMCA. En membranas de glóbulos

rojos, el 50% de la actividad ATPasa es Ca2+ dependiente.

Para el estudio del transporte de Ca2+ se utilizan vesículas invertidas

–esto es, con la cara intracelular hacia el exterior- preparadas directamente

a partir de membranas de eritrocitos. Esto permite que las vesículas

incorporen iones Ca2+ en presencia de ATP por acción de PMCA.

40

Figura 2.5 Preparación de

membranas fragmentadas

de eritrocitos observadas

por microscopía confocal.

Las proteínas de la mem-brana celular se marcaron extensivamente con la sonda fluorescente FITC. Barra: 5 µm.

2.3.2 Sistemas micelares

Los primeros protocolos de purificación de PMCA datan de finales

de la década de 1970 (Jarrett y Penniston 1978) y permitieron contar con

preparaciones homogéneas y con alta concentración de proteína,

contribuyendo a la sensibilidad de las caracterizaciones bioquímicas

posteriores.

El proceso de purificación de PMCA requiere como paso previo la

solubilización de membranas biológicas con detergentes. Luego mediante

columnas de afinidad de CaM se separa la bomba de calcio del resto de las

proteínas de membrana. En este paso, la proteína se mantiene en solución

mediante el uso de buffers con detergente puro y algún agente estabilizante

como glicerol o también se usan preparaciones con detergentes y lípidos

sintéticos o naturales como fosfolípidos de soja.

La posibilidad de obtener muestras de la proteína purificada con muy

buen rendimiento y alto grado pureza permitió hacer una caracterización

bioquímica y biofísica más precisa del funcionamiento de PMCA. Fueron

por ello muy importantes los trabajos de Kosk-Kosicka y Carafoli (Kosk-

Kosicka 1990; Carafoli 1994) que mostraron que las características

bioquímicas de PMCA eran preservadas en sistemas de proteína purificada

en micelas mixtas lo que validó el uso de estas preparaciones para estudios

funcionales y estructurales.

De hecho, gran cantidad de las proteínas de membrana cuya

estructura tridimensional ha sido resuelta, han partido de preparaciones

solubilizadas en detergente (Linke 2009),

41

2.3.3 Proteoliposomas

A partir de la proteína purificada en detergente y tras el agregado de

fosfolípidos se puede inducir la formación de liposomas mediante la

remoción de detergente por diálisis o empleando esferas de poliestireno que

unen compuestos hidrofóbicos (BioBeads™) (Rigaud et al. 1998). De este

modo se obtienen las preparaciones de PMCA en liposomas

(proteoliposomas) que tienen la ventaja de presentar una separación entre

interior y exterior lo cual es muy útil para ensayo de transporte neto y

estudio de potenciales transmembrana (Salvador et al. 1998).

2.4 Características de los sistemas micelares

2.4.1 Autoorganización de los sistemas anfifilo-agua

Dado que en esta tesis trabajaremos con la PMCA solubilizada en

micelas, profundizaremos la descripción de este sistema.

Se denominan anfifilos a los compuestos cuya estructura molecular

incluye una parte hidrofílica y otra hidrofóbica. Por lo general se habla de

una “cabeza” polar y una “cola” no polar. Tanto los detergentes como los

fosfolípidos pertenecen a esta familia de compuestos (figura 2.6). La

solubilidad en soluciones acuosas de los anfifilos está determinada por el

balance entre la polaridad de la cabeza polar que puede tener interacciones

favorables con las moléculas de agua y el efecto hidrofóbico, un fenómeno

de base entrópica cuya tendencia es evitar el contacto del agua con las

cadenas hidrocarbonadas (Tanford 1980). A muy bajas concentraciones,

las moléculas de anfifilo pueden encontrarse libres en solución, pero al

aumentar la concentración se autoorganizan formando estructuras denomi-

nadas micelas.

Los aspectos termodinámicos de la formación de estas estructuras

fueron estudiados por Tanford (Tanford 1980) en sistemas en los cuales se

considera un número de agregación micelar (número de anfifilos que

integran la micela) mayor a 50, temperatura ambiente y el potencial

químico de los anfifilos en la micela (µanf,mic) similar al potencial químico

42

de referencia correspondiente a la situación hipotética en la que el sistema

está formado únicamente por micelas. En estas condiciones las micelas

pueden ser tratadas como una fase pura separada de la solución. El sistema

se puede tratar termodinámicamente como un sistema de dos fases con dos

componentes: una fase acuosa y una micelar.

Figura 2.6 Estructura de detergentes y lípidos de uso común en bioquímica de

proteínas. La estructura de una molécula de DPPC comparada con detergentes de uso común en purificación de proteínas. Se indica aproximadamente la región hidrofóbica e hidrofílica de estas moléculas.

La estructura de las micelas se puede predecir a partir de un análisis

de tipo geométrico de la forma de los anfifilos y consiste en estudiar cómo

“empaquetar” las moléculas de anfifilo dentro de una determinada forma

geométrica (Gennis 1989).

Este cálculo requiere conocer el volumen de la parte hidrofóbica de

la molécula (v), la longitud de la cadena no polar (l), y la fracción del área

de la micela ocupada por cada cabeza polar (S) (tabla 2.1). Este último

parámetro depende del tamaño y carga del grupo polar ya que la repulsión

entre los grupos polares de anfifilos vecinos determina el espacio que

ocupará cada cabeza polar. Como consecuencia, S también depende de las

43

propiedades de la solución y de los contraiones presentes ya que ambos

determinan la carga neta y el tamaño de la cabeza polar. El valor máximo

de la relación v/lS para que el anfifilo pueda empaquetarse correctamente

se determina para otras formas geométricas realizando cálculos similares.

Tabla 2.1 Modelo geométrico de forma de micelas

Forma de la micela Forma

geométrica del anfifilo

v/l·S Ejemplos

globular

< 1/3 (esfera) 1/3 – 1/2 (formas elipsoideas)

detergentes lisofofoslípidos

bicapa

1/2 - 1

fosfatidilcolina fosfatidilinositol

cilindro (hexagonal HII)

>1 ácido fosfatidico (pH<3)

monogalactosil diglicérido

Las micelas pueden tener un número de moléculas por micela

(número de agregación), en el orden de 50-500 según la especie química en

cuestión. Para una determinada temperatura, la menor concentración de

anfifilos a la que pueden encontrarse micelas se denomina concentración

micelar crítica (CMC). Debajo de esta concentración solo se encuentran

monómeros en solución, mientras que por encima de esta concentración los

monómeros se encuentran en equilibrio con las micelas manteniéndose una

concentración constante de monómero libre.

2.4.2 Uso de detergentes para la purificación de

proteínas de membrana

La puesta a punto de un protocolo de purificación en general

comienza por elegir un detergente adecuado que solubilice a la proteína

pero sin desnaturalizarla. Esta elección suele tener mucho de prueba y

44

error. Sin embargo es posible establecer algunos criterios generales como

por ejemplo, evitar inicialmente el uso de detergentes iónicos que suelen

ser desnaturalizantes para la mayoría de las proteínas (ej.: SDS o CTAB).

A su vez, suele ser recomendable el uso de detergentes con cabezas polares

grandes y cadenas hidrofóbicas largas dado que son menos disruptivos de

la estructura proteica y presentan concentraciones micelares críticas más

bajas (Linke 2009). Los detergentes más comunes para la purificación de

proteínas de membrana son Tritón X-100, colato de sodio, CHAPS, los

dodecilmaltósidos (DDM) y la familia de los polioxi-etilen-glicoles (CxEx o

serie de los Brij). Por otra parte, los detergentes desnaturalizantes como el

SDS resultan de gran utilidad para el estudio del plegamiento de proteínas

de membrana, dado que los desnaturalizantes comúnmente empleados en

proteínas solubles (urea y cloruro de guanidinio) no son en general capaces

de desorganizar la estructura de dominios transmembrana de tipo alfa-

hélice (Roman y González Flecha 2014).

Como mencionamos, las micelas se forman por efecto hidrofóbico y

por repulsión de las propias cabezas polares. Los estudios hechos sobre

micelas de detergentes de la familia de los polioxi-etilen-glicoles, como los

que usaremos en este trabajo, muestran que la forma puede fluctuar

considerablemente pasando de globular a cilíndrica o a discoidal, y es

sensible a condiciones como temperatura, fuerza iónica o naturaleza del

solvente (Tanford et al. 1977; Gapiński et al. 2010) .

2.4.3 Micelas mixtas

Una mezcla de anfifilos como puede ser detergente y fosfolípidos en

agua puede formar, de acuerdo a su proporción, micelas que presenten

ambos compuestos dada la similar naturaleza de las interacciones.

Como mencionamos en la sección 2.4.1, al tratar a las micelas como

una fase pura, la composición de las mismas se puede expresar como la

fracción molar de fosfolípidos respecto al total de anfifilos (fosfolípidos +

detergente).

Estos sistemas formados por una solución acuosa, fosfolípidos y

detergente presentan complejos diagramas de fase y también transiciones

entre la presencia de micelas y la formación de liposomas.

45

Figura 2.7 Transiciones vesícula (liposomas) a micela en la solubilización de

membranas lipídicas por detergentes. (A) Solubilización de liposomas. El incremento de detergente en los liposomas entre 1 y 2 forma vesiculas mayores saturadas de detergente.; a partir de 2 los liposomas se rompen y solubilizan en micelas mixtas. (B) La concentración de C12E8 requerida para iniciar la solubilización de liposomas de fosfatidilcolina (símbolos negros) y para disolverlos completamente(símbolos blancos) se representan en función de la concentración de lípidos en el sistema. Adaptados de (

Levy et al. 1990; Seddon et al. 2004).

2.4.4 Micelas mixtas conteniendo proteínas

Robinson y Tanford (1975) consideraron que cuando una proteína de

membrana se inserta en una micela de detergente, la forma y el número de

agregación de la micela permanecen inalterados. Según este modelo las

proteínas actuaban solamente como un núcleo hidrofóbico para la

formación de micelas. Møller y le Maire (1993) mostraron que en el caso

de proteínas cuya región transmembrana presentase un gran tamaño, como

por ejemplo la ATPasa de Ca2+ de retículo endoplasmático (SERCA) esta

hipótesis podría no ser válida dado que se requeriría un mayor número de

moléculas para cubrir la superficie hidrofóbica de la proteína produciendo

cambios tanto en el número de agregación como en la forma de las micelas.

De hecho, se postulan varios modelos estructurales para la unión de

detergentes no desnaturalizantes a proteínas de membrana, siendo los tres

más relevantes los que se muestran en la figura 2.8 (le Maire et al. 2000) .

46

La unión puede ser del tipo micelar (2.8A), donde la proteína se encuentra

inserta en una micela de forma esférica o cilíndrica, en la cual los

detergentes en contacto directo con la proteína cubren la región

transmembrana. Puede ser una unión tipo monocapa (2.8B), en la cual el

detergente cubre el segmento transmembrana en una disposición de

orientación perpendicular al eje axial de la proteína. El tercer modelo es la

unión tipo anillo prolado (2.8C), en la cual las moléculas de detergente

forman una estructura esférica mínima de modo de cubrir tanto la región

transmembrana de la proteína como sus propias cadenas hidrocarbonadas

del contacto con el solvente. Es posible que para cada par proteína-

detergente exista una determinada configuración favorable, pero en general

se busca inicialmente una descripción general a partir de combinar la

información relacionada con el tamaño de las moléculas de detergente y del

sector hidrofóbico transmembrana de las proteínas. Luego, a partir de

consideraciones geométricas y resultados experimentales tales como radios

hidrodinámicos y análisis de número de moléculas efectivamente unidas se

pueden llegar a postular modelos mas refinados.

Figura 2.7 Modelos de unión de detergentes no desnaturalizantes a proteínas

integrales de membrana. A partir de resultados experimentales y consideraciones geométricas las estructuras resultantes de unión de un detergente no desnaturalizante a proteínas integrales de membrana. Adaptado de Le Maire et al. 2000.

El agregado de fosfolípidos para formar micelas mixtas puede

cuantificarse considerando la fracción molar de fosfolípidos en la fase

micelar (XFL). Como mencionamos en la sección 2.4.3, esta relación de

fosfolípidos a detergente puede modificar propiedades biofísicas del

sistema, como forma, tamaño o incluso producirse transiciones micela a

47

vesícula. Esta configuración final puede determinar propiedades

funcionales de las proteínas en estudio que se encuentren reconstituidas en

estos sistemas.

2.5 Composición de las micelas y propiedades

bioquímicas de PMCA

Como mencionamos en la sección 2.2.2, existe amplia evidencia de

cómo los fosfolípidos ejercen un efecto activador sobre la actividad

ATPasa de PMCA al ser adicionados a la proteína purificada reconstituida

en micelas de detergente. Por ejemplo, los fosfolípidos neutros parecen ser

los encargados de facilitar una activación basal de PMCA.

En trabajos previos de nuestro grupo de trabajo se demostró quela

estabilidad de PMCA frente a la desnaturalización térmica, era dependiente

de la composición del sistema micelar en que se encontraba reconstituida la

proteína (Levi et al. 2000). Es decir, el sistema de anfifilos que recubren el

sector transmembrana de la proteína muestra tener un rol preponderante en

el mantenimiento de la conformación nativa de la proteína, y no como un

mero artificio técnico para mantener solubilizada a PMCA. En particular,

estos trabajos (Levi et al. 2000; Levi et al. 2003) también proponían como

cuantificar las interacciones entre los anfifilos y el sector transmembrana

de la proteína.

Estos resultados, empiezan a ofrecer evidencia directa de cómo el

entorno lipídico de una proteína de membrana puede tener efectos sobre su

actividad biológica. Como mencionamos en el capítulo 1, la

heterogeneidad en la membrana celular actualmente se considera un factor

clave en las descripciones sobre su dinámica, y conocer como diferentes

fosfolípidos pueden modular alterar propiedades funcionales de las

proteínas agrega una nueva dimensión a la representación y relevancia de

estos procesos.

Trabajos de mediados de la década de 1990 mostraron una aparente

preferencia de PMCA por localizarse en microdominios lipídicos ricos en

caveolina (Fujimoto 1993; Schnitzer et al. 1995). Pang (2005) utilizando

proteoliposomas de composición símil raft (PC:SM:Col) con PCMA

48

mostró una caída en la actividad enzimática al incrementar la proporción de

SM y Col, aumentando el orden de la membrana. La conclusión inicial

sería que de ocurrir esta partición preferencial a rafts, el entorno resultante

no sería particularmente favorable para la actividad biológica de la

proteína. Sin embargo, la complejidad de la membrana es tal que otros

factores como presencia de fosfolípidos ácidos (fosfatidilserina) o el

aumento en la concentración de CaM en estructuras caveolares podría

compensar esta menor actividad. Una caracterización cuantitativa de los

efectos de los lípidos sobre la actividad de PMCA es necesaria para poder

mejorar estas descripciones.

49

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Capítulo 3

Espectroscopía y Microscopía

de Fluorescencia

3.1 El fenómeno de fluorescencia

Se denomina luminiscencia a la emisión de fotones ultravioleta,

visibles o infrarrojos a partir de una especie química en estado electrónico

excitado. La fluorescencia y la fosforescencia son casos particulares de

luminiscencia. En estos casos, la especie química se excita por la

absorción de un fotón y como consecuencia la lleva a un estado electrónico

excitado (Valeur 2002). Esta molécula excitada emite el exceso de energía

en forma de fotones, proceso que denominamos fluorescencia o

fosforescencia según si la emisión involucra o no un cambio en el spin total

de la molécula.

En la figura 3.1 se muestra un diagrama de Perrin-Jablonski; estos

diagramas son de suma utilidad para representar las transiciones fotofísicas

probables desde la absorción de un fotón por la especie química hasta la

Figura 3.1: Diagrama de Perrin-Jablonski. Los fenómenos de absorción y emisión de un fotón se representan con flechas rectas. Las flechas onduladas representan relajación opasaje a un subnivel energético sin emisión de luz. S: singulete T: triplete.

55

relajación de este estado excitado. En el caso representado en la figura

anterior, la absorción se produce desde el estado fundamental singulete (S0)

hasta distintos subestados vibracionales de un singulete excitado (por

ejemplo, S1 o S2, en la figura).

Se puede definir el tiempo de vida de fluorescencia como el tiempo

medio que permanece la molécula en el estado excitado antes de retornar a

S0 . Este parámetro está dado por:

1

r nk kτ = + r

(3.1)

donde kr y knr representan las constantes cinéticas de los procesos radiativos

(que involucran la emisión de fluorescencia) y los no radiativos (aquellos

en los que la molécula vuelve al estado fundamental sin emitir

fluorescencia).

La tabla 1 muestra los tiempos de vida característicos de diversos

procesos esquematizados en la figura anterior (Valeur 2002). Como

veremos en detalle más adelante, estas magnitudes son de gran importancia

cuando se utiliza la fluorescencia como herramienta para el estudio de

sistemas biológicos.

Tabla 1: Tiempos de vida característicos en el proceso de excitación – relajación

Absorción 10-15 seg Relajación Vibracional 10-12 – 10-10 seg Conversión interna 10-11 – 10-9 seg Tiempo de vida del estado excitado S1 10-10 – 10-7 seg Fluorescencia

Cruce intersistemas 10-10 – 10-8 seg Tiempo de vida del estado excitado T1 10-6 – 1 seg Fosforescencia

El proceso de absorción se produce de manera casi instantánea en

comparación con el resto de los procesos, por lo cual, generalmente se

puede considerar que durante la absorción cambia la distribución

electrónica pero no la geometría nuclear (principio de Frank-Condon)

(Turro 1991). Los procesos de relajación vibracional y conversión interna

también ocurren en promedio dos órdenes de magnitud más rápido que el

tiempo característico de la emisión de fluorescencia. Esto implica que la

emisión de fluorescencia se produce desde el subnivel energético más bajo

del estado excitado S1 (Kasha 1950).

56

¿Por qué éste énfasis en los tiempos de vida? Porque precisamente

uno de los factores que dan tanta potencia a la técnica de espectroscopía de

fluorescencia es la capacidad de sensar distintos fenómenos que ocurran en

escalas temporales en el orden del tiempo de vida del estado excitado.

Como mencionan Ross y Jameson (Ross y Jameson 2008), el fenómeno de

fluorescencia actuaría como un cronómetro molecular para estudiar

procesos dinámicos que ocurren en el orden de nanosegundos: se enciende

cuando se absorbe el fotón de luz y se detiene cuando la luz es emitida.

Escoger el cronómetro adecuado será entonces escoger la sonda

fluorescente adecuada para el fenómeno a estudiar y su compatibilidad con

las herramientas que utilicemos.

En las siguientes secciones describiremos características y

fundamentos de las herramientas espectroscópicas que utilizaremos en la

presente tesis.

3.2 Espectros de emisión y rendimiento cuántico de fluorescencia

La figura 3.2 muestra como ejemplo, los espectros de absorción y

emisión normalizados de una molécula fluorescente, Rodamina B. El

espectro de emisión de fluorescencia de una sustancia es una medida de la

intensidad de luz emitida a distintas longitudes de onda al producirse la

transición del estado excitado al fundamental utilizando una longitud de

onda de excitación determinada. La intensidad, forma y la ubicación de

estos espectros puede brindar información de su entorno molecular

inmediato.

57

Figura 3.2 Espectros de absorción y fluorescencia de Rodamina B

Como mostramos en la figura 3.1, la emisión de fluorescencia de

una molécula puede verse afectada si la relajación desde el estado excitado

se produce por otras vías. Para describir esta propiedad, se puede definir el

rendimiento cuántico de fluorescencia (Φf) el cual es la fracción de

moléculas excitadas que retornan al estado S0 con emisión de fotones de

fluorescencia. En otras palabras, es la relación entre los fotones emitidos

respecto de los fotones absorbidos (Lakowicz 2006). Se puede demostrar

que:

rf

r n

k

k kΦ = + r

(3.2)

De acuerdo a esta ecuación, el rendimiento cuántico se relaciona con

la probabilidad de que la molécula se relaje por la vía radiativa frente a los

procesos no radiativos. Procesos no radiativos como mencionamos

anteriormente, son todos aquellos por los cuales la molécula retorna al

estado fundamental sin emitir fluorescencia e incluyen diversos fenómenos

de “quenching” (desactivación) bimolecular, cruce intersistemas, trans-

ferencia de energía a otra molécula, etc.

58

3.2.1 Transferencia de energía por el mecanismo de Förster (FRET)

Una de las herramientas que utilizaremos en esta tesis está basada en

el fenómeno de transferencia de energía por el mecanismo de Forster

(FRET). En este fenómeno, un fluoróforo excitado transfiere la energía en

exceso a otra molécula aceptora. Este proceso ocurre por resonancia entre

los momentos de emisión del donor y de absorción del aceptor y no

involucra la emisión y reabsorción de fotones Este fenómeno es

ampliamente utilizado ya que la eficiencia de transferencia (EFRET) varía

inversamente con la sexta potencia de la distancia donor-aceptor:

6

0

1

1FRETE

r

R

⎛ ⎞⎜ ⎟⎜ ⎟⎝ ⎠=

+ (3.3)

La distancia de Förster (R0) es una constante característica para cada

par de interacción y se encuentra en el rango de Å. La figura 3.3A muestra

la dependencia de EFRET con la distancia. Se puede observar que este

parámetro cambia abruptamente en un rango cercano a Ro, por lo que

fenómenos que promuevan el acercamiento o alejamiento del par donor-

aceptor pueden ser sensados midiendo EFRET. Si donor y aceptor se

encuentran a distancias mayores a 2 R0, no se produce FRET. Esto último

puede utilizarse para evaluar si dos moléculas interactúan entre sí

directamente por la presencia o ausencia de FRET.

59

Figura 3.3 Fenómeno de FRET. (A) Dependencia de la eficiencia de FRET (EFRET) con la distancia entre fluoróforos. (B) Superposición entre el espectro de emisión(donor) y absorción (aceptor).

El parámetro R0 depende fundamentalmente del solapamiento entre

los espectros de emisión del donor y el de absorción del aceptor (figura

3.3B y ecuación 3.4), de la orientación relativa donor-aceptor y del

rendimiento cuántico del donor (QD):

4

0

( ) ( ) ( )D AJ F dλ λ ε λ λ λ∞= ∫ (3.4)

(3.5) ( )1/62 4

0 0.211 ( ) (en Å)DR n Q Jκ λ−=donde κ2 es un factor de orientación y n es el índice de refracción.

En experimentos en solución suele considerarse que el factor de

orientación es 2/3, valor que se obtiene al asumir que tanto las moléculas

de donor como las de aceptor se encuentran orientadas al azar. Sin

embargo, ésta aproximación no es válida para fluoróforos que presenten

anisotropías en su movimiento rotacional. Por ejemplo, si dos moléculas de

fluoróforo se encuentran unidas entre sí por un polímero de corta longitud,

o se encuentran insertas en una estructura repetitiva (por ejemplo algunas

sondas para ADN) no se explorarían todas las orientaciones espaciales y

tendrían una orientación preferencial entre sí (Iqbal et al. 2008). Otros

autores consideran que, para el caso de macromoléculas como proteínas,

las fuentes de error de la técnica y la amplitud conformacional del sistema

son de una magnitud mayor que las desviaciones posibles de este valor y

60

por eso consideran que 2/3 es un valor apropiado para un ensayo típico y

que los cambios en la eficiencia de FRET (y no el valor absoluto) deberían

el parámetro principal a tomar en cuenta en un experimento (dos Remedios

y Moens 1995).

Una forma muy sencilla para cuantificar la eficiencia de FRET es

medir la diferencia en la intensidad de fluorescencia del donor en ausencia

(FD) o en presencia del aceptor (FDA). Se puede demostrar que la eficiencia

de FRET es (Lakowicz 2006) :

1 DAFRET

D

FE

F= − (3.6)

La desventaja de este método sencillo es que requiere que las

concentraciones de donor en las muestras correspondientes a las condi-

ciones en ausencia y presencia del aceptor deben ser idénticas. Muchas

veces, es complicado experimentalmente aseverar que éste es el caso.

Otro método para cuantificar la eficiencia de FRET es a través de la

determinación del tiempo de vida, ya que se puede demostrar (Lakowicz

2006):

1 DAFRET

D

Eττ= − (3.7)

La gran ventaja de este método es que no se requiere tener idénticas

concentraciones de donor en las muestras. Sin embargo, la medición de

tiempo de vida requiere de instrumentación más sofisticada.

3.2.2 Efectos del solvente sobre la emisión de fluorescencia

En la figura 3.4 mostramos, a modo de ejemplo, los espectros de una

sonda fluorescente, 4-dimetilamino-4'-nitroestilbeno (DNS) disuelta en

solventes de distinta polaridad. Se puede apreciar que a medida que se

incrementa la polaridad del medio, el espectro de fluorescencia se desplaza

a mayores longitudes de onda (i.e. menores energías). Este fenómeno, que

describiremos en detalle a continuación, es de muchísima utilidad en

biología estructural y fisicoquímica ya que permite sensar la polaridad del

entorno inmediato a la sonda.

61

Figura 3.4 Efecto de relajación

del solvente: Fotografía y espectros de emisión de la sonda DNS, altamente sensible a la polaridad del entorno, en H (hexano), CH (ciclohexano), T (tolueno), EA (etil-acetato) y BU (n-butanol), se puede apreciar el drástico corrimiento al rojo del espectro de emisión. Adaptado de Lakowicz (2006)

Las moléculas de solvente rodeando inicialmente al fluoróforo en

estado fundamental se disponen de forma tal de minimizar la energía del

sistema (figura 3.5). Durante una transición electrónica, un electrón es

promovido a otro orbital y por lo tanto se altera el momento dipolar (µ) de

la molécula, el cual está definido como la separación parcial de cargas

dentro de la misma multiplicado por la distancia (Atkins y Paula 2006):

q dμ = ⋅ ff (3.8)

El momento dipolar es una magnitud vectorial y por ende se puede

representar su orientación espacial con una flecha que apunta hacia la

distribución de carga positiva (figura 3.5).

62

Figura 3.5 Diagrama de Jablon-

ski representando el efecto de

relajación por solvente. La tran-sición al estado excitado del fluo-róforo induce un cambio en el momento dipolar de la molécula. Este cambio de orientación genera repulsiones entre el fluoróforo y las moléculas de solvente. A mayor polaridad del solvente, mayor es la relajación que aconte-ce tras realinearse las moléculas de solvente a la configuración de menor energía. Adaptado de http://www.olympusmicro.com/primer/java/jablonski/solventeffects/

Como consecuencia de este cambio en el momento dipolar, el

solvente rápidamente (10-10 s) se reorganiza de modo de disminuir las

repulsiones generadas con el fluoróforo excitado por lo que disminuye la

energía del sistema. Este fenómeno ocurre en un lapso temporal menor al

tiempo de vida del estado excitado e involucra un cambio de energía mayor

cuanto mayor es la polaridad del solvente. El fluoróforo excitado emite un

fotón y el solvente se vuelve a reordenar para adquirir la configuración del

estado inicial De este modo y como consecuencia del reordenamiento del

solvente, la emisión de fluorescencia se produce con un salto energético

menor que el esperado para la situación en la cual no se produce este

reordenamiento.

3.3 Sondas fluorescentes

En la figura 3.6 se muestran determinadas propiedades

fisicoquímicas del medio que pueden afectar al estado excitado de la sonda

y producir cambios tanto en rendimiento cuántico como en la forma del

espectro de emisión.

63

Figura 3.6 Propiedades fisicoquímicas que afectan la fluorescencia. Pueden alterar el tiempo de vida de fluorescencia, rendimiento cuántico, anisotropía o losespectros de excitación y emisión

Todos estos fenómenos pueden ser potencialmente estudiados con la

combinación adecuada de una sonda fluorescente cuyas propiedades

fotofísicas sean sensibles al fenómeno de interés y con el instrumental

adecuado que pueda adaptarse a las propiedades específicas de la sonda.

En la figura 3.7 brindamos algunos ejemplos de cómo determinadas

propiedades de la emisión de la sonda pueden ser explotadas para estudios

de biología celular y estructural.

64

Figura 3.7 Ejemplos de aplicaciones de sondas fluorescentes. (A) TN-XL un sensor de calcio codificado genéticamente que presenta FRET en presencia de Ca2+ (B) HyPer, un sensor de peróxido de hidrógeno codificado en células de mamífero que presenta unarespuesta a la concentración a partir de la intensidad registrada en 2 canales. (C)Laurdan, una sonda de fluidez celular aplicada a músculo de pez cebra observada pormicroscopía de 2 fotones. (D) Tpy-Cy, una sonda que puede medir variaciones de pH enel rango fisiológico. Adaptado de Belousov 2006, Owen 2010, Mank 2006 y Valeur2002.

3.3.1 Sondas utilizadas en espectroscopía de proteínas y sistemas biológicos

Las sondas fluorescentes pueden clasificarse arbitrariamente en

sondas intrínsecas y extrínsecas (Lakowicz 2006).

Las sondas intrínsecas son grupos funcionales fluorescentes

naturalmente presentes en la/s molécula/s en estudio. Ejemplo de éstas son,

citando casos relevantes en química biológica, los aminoácidos aromáticos,

las flavinas, el NADH, la clorofila, etc. También se consideran como

sonda intrínseca proteínas fluorescentes tales como eGFP, mCherry, etc.

las cuales son incorporadas por ingeniería genética a proteínas de interés.

En la actualidad, se ha desarrollado una gran variedad de proteínas

65

fluorescentes con distintas propiedades espectrales las cuales fueron

derivadas de GFP y RFP (Tsien 2009). Esta “paleta de colores” permite

marcar moléculas distintas de interés en una misma muestra permitiendo

ensayos de colocalización, FRET, y técnicas de correlación como FCS,

RICS y Número y Brillo (N&B) (Digman y Gratton 2011)

Las sondas extrínsecas, son todas aquellas que se adicionan a la

muestra. Esto se puede llevar a cabo mediante una modificación covalente

directa sobre una molécula de interés o agregando a la muestra una sonda

fluorescente que interactúa no covalentemente con las especies en estudio.

Un ejemplo de modificación covalente es la reacción entre

isotiocianato de fluoresceína (FITC) con residuos amino de una proteína.

El uso de anticuerpos marcados fluorescentemente (o de anticuerpos

secundarios fluorescentes) son un ejemplo de sondas no covalentes que

permiten identificar moléculas de interés en una muestra. Otro ejemplo de

sondas no covalentes son las sondas ANS y Laurdan (Daniel y Weber

1966; Weber y Farris 1979) que se intercalan en la muestra, en bolsillos

hidrofóbicos y membranas respectivamente, y permiten estudiar su

microentorno. En la seccion 3.3.1.2 profundizaremos en la descripción de

sondas extrínsecas para el estudio de biomembranas ya que éstas serán

objeto de estudio en esta tesis.

Las espectroscopías y microscopías de fluorescencia se vuelven tan

potentes como funcionales sean las sondas disponibles. Es por eso que el

desarrollo y evaluación de sondas fluorescentes es un campo de intensa

actividad que acompaña el desarrollo de técnicas instrumentales cada vez

más sensibles (Liu et al. 2012; Yuan et al. 2013).

3.3.1.1 Sondas intrínsecas

En el caso de espectroscopía de fluorescencia aplicada a proteínas es

muy frecuente aprovechar las propiedades de los aminoácidos fluorescentes

naturalmente presentes en las mismas de modo tal de no perturbar el

sistema a estudiar. La tabla 3.2 muestra las características espectroscópicas

de los residuos aromáticos fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr) y triptófano

(Trp), mientras que la figura 3.8 muestra sus respectivos espectros de

absorción y emisión. La frecuencia relativa de estos residuos en proteínas

66

es baja; en particular, el Trp es el aminoácido encontrado con menor

frecuencia en secuencias proteicas (Moura et al. 2013).

Tabla 3.2: Características espectrales de aminoácidos aromáticos en agua a pH 7

Especie λex (nm) λem (nm) Rendimiento cuántico Tiempo de vida (ns)

Fenilalanina 260 282 0.02 6.8

Tirosina 275 304 0.14 3.6

Triptofano 295 353 0.13 3.1

Figura 3.8 Aminoácidos fluorescentes y propiedades espectrales. En A se muestran los espectros de absorción característicos y en B los espectros de emisión defluorescencia normalizados de los aminoácidos fluorescentes presentes naturalmente enproteínas. Inferior: estructura molecular de estos aminoácidos. Adaptado de Lakowicz(Lacowicz 2006).

Si bien la tabla sugiere por los valores de rendimiento cuántico que

tirosina y triptófano podrían emitir fluorescencia comparable, en la práctica

esto no es así. En su estado nativo, los residuos tirosina en general se

desexcitan por vías no radiativas como pueden ser la interacción con

residuos cargados de la cadena peptídica o incluso transferencia de energía

(ver sección 3.2.1) hacia residuos triptófano (Lakowicz 2006). En casos

como el mencionado, no es raro que la desnaturalización de la proteína

aumente la fluorescencia emitida por residuos tirosina al aumentar la

67

distancia entre Tyr y Trp y reducir la interacción con el resto de la cadena.

Por otra parte, la emisión de fluorescencia de los residuos fenilalanina es

muy baja normalmente en proteínas ya que este residuo posee baja

absortividad molar y rendimiento cuántico. En algunos casos se ha

verificado que además la energía del estado excitado suele ser transferida a

otros residuos tirosina o triptofanos presentes en la proteína; como

consecuencia, el análisis de fluorescencia de fenilalanina se utiliza

únicamente en proteínas que carezcan de residuos Trp o Tyr (VanScyoc y

Shea 2

brindan información sobre la estructura terciaria de las

proteínas.

001).

Como puede verse en la figura 3.8, es posible excitar selectivamente

los residuos triptófano trabajando con longitudes de onda de excitación de

~295 nm. La emisión de los residuos Trp es la más intensa y el máximo de

emisión de su espectro presenta muy alta sensibilidad a la polaridad de su

microentorno a diferencia de los residuos Tyr. Esta sensibilidad local

permite utilizarlos como un excelente reportero de procesos tales como

unión de ligandos, interacción proteína-proteína o cambios

conformacionales (Christiaens et al. 2002) El grupo indol del triptófano

presenta sensibilidad a la polaridad de su entorno molecular (sección 3.2.2)

como muestra la figura 3.9. Por lo tanto al producirse interacciones puente

de hidrógeno entre el indol y solventes polares, como puede ser la

exposición al agua superficial en el caso de un residuo Trp en una proteína,

se genera un importante corrimiento al rojo del espectro de emisión. Estos

corrimientos

Figura 3.9 Fluorescencia del

grupo indol. El grupo indol es el fluorórofo de los residuos triptófano en proteínas. Se puede apreciar que el incremento de la polaridad del entorno produce un corrimiento al rojo del espectro de emisión. Adaptado de Lakowicz (2006)

68

A su vez, la intensidad de fluorescencia emitida por los triptofanos

presentes en la muestra puede ser afectada por la colisión de los fluoróforos

con moléculas desactivadoras que disminuyan el rendimiento cuántico de

fluorescencia. (Vázquez-Ibar et al. 2003). Dado que el fenómeno de

desactivación (“quenching”) colisional depende de la interacción entre el

fluoróforo y el desactivador, se ha utilizado en el campo de la Biofísica

para estudiar procesos que involucren cambios en la exposición relativa de

los residuos Trp al solvente. Este fenómeno fue utilizado por ejemplo, para

estudiar cambios conformacionales asociados a la función biológica,

interacciones entre biomoléculas, etc.

La fluorescencia de Trp es también utilizada para sensar el

plegamiento proteico. Tanto en proteínas que presenten nativamente

residuos triptófano, o en casos donde se los inserta en distintos puntos de su

secuencia mediante ingeniería de proteínas (Vallée-Bélisle y Michnick

2012), la sensibilidad del Trp a su microentorno permiten el estudio de las

transiciones entre estados nativo y desplegado y el análisis de

intermediarios de plegamiento (Laptenok et al. 2011). Interacciones

nativas que pueden producir quenching y transferencia de energía desde el

triptófano a otros residuos, y la exposición al solvente que suele

caracterizar los estados desplegados pueden ser analizadas determinando la

intensidad de fluorescencia, corrimientos espectrales, tiempos de vida de

fluorescencia y anisotropía.

3.3.1.2 Sondas para el estudio de biomembranas

Es muy frecuente encontrar que las biomoléculas de interés no

presentan fluorescencia. Por ejemplo, los fosfolípidos y el ADN no

presentan fluorescencia alguna y para su estudio se los puede modificar

covalentemente o agregar sondas fluorescentes que se intercalan en ellos y

de esta manera reportar características biofísicas del sistema. En la Figura

3.10 se muestra por ejemplo, la sonda Rodamina-DPPE la cual es

esencialmente el fosfolípido DPPE con el agregado en su cabeza polar de

un grupo Rodamina. Los grupos NBD y Texas Red son otros grupos

frecuentemente utilizados para generar fosfatidiletanolaminas modificadas.

69

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3.10

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rno

(fig

ura

3.10

B).

Figura 3.10 Estructura de sondas fluorescentes. (A) Sondas fluorescentes que particionan diferencialmente en membranas biológicas. Se muestra como ejemplo una doble tinción de una GUV de DOPC:DPPC:Colesterol 1:1:1 con naftopireno y DPPE unido a Texas Red. Naftopireno particiona a dominios líquido ordenados mientras que TR-DPPE lo hace a dominios líquido cristalinos. (B) Sondas que particionan en todos los dominios pero presentan cambios espectrales. Se muestra como ejemplo una GUV de composición DOPC:Esfingomielina:Colesterol 2:1:1 teñida con Laurdan. La GP de Laurdan como profundizaremos en la sección 3.3.3 se utiliza para obtener información sobre la microfluidez de la membrana. Adaptado de Gaus et al. 2003, Juhasz et al. 2010 y Stock y Brewer 2012.

70

3.3.1.3 Laurdan en el estudio de biomembranas

La sonda 6-lauroil-2-dimetilamino naftaleno (Laurdan) (figuras 3.11

y 3.12) fue desarrollada por Gregorio Weber para estudiar el fenómeno de

relajación dipolar. El fluoróforo de esta molécula es el grupo naftaleno que

presenta momento dipolar permanente debido a la separación parcial de

cargas entre el 2-dimetilamino y el 6-carbonilo (Parasassi et al. 1998).

Figura 3.11 Estructura de Laurdan y orientación en su inserción en membranas.

El grupo naftaleno se ubica en la interfase lípido agua a la altura del esqueleto deglicerol de los fosfolípidos.

En el estado excitado, el momento dipolar molecular se incrementa

por un proceso de transferencia de carga intramolecular (ICT) (Rowe y

Neal 2006); como vimos en la sección 3.2.2, moléculas que presentan

cambios en el momento dipolar del estado fundamental al excitado son

sensibles a la polaridad del entorno. Por otra parte, Laurdan posee una

cadena de 12 carbonos que hace que en solución acuosa sea prácticamente

insoluble y particione en membranas insertándose en una orientación tal

que el fluoróforo queda localizado preferencialmente en la interfase lípido-

agua vecina a los gliceroles de los fosfolípidos (figura 3.11).

Estudios realizados a principios de los años 90, mostraron que la

fluorescencia de Laurdan en membranas no presentaba sensibilidad al pH o

a la naturaleza química de la cabeza polar de los fosfolípidos (Parasassi et

al. 1991). Sin embargo, se podía detectar un notable corrimiento de su

71

emisión hacia el rojo sensible al estado de agregación de la fase lipídica. En

el esquema siguiente se esquematiza la disminución del empaquetamiento

de la membrana lipídica durante la transición de fases gel → líquido

cristalina, (figura 3.12). Estos cambios en el empaquetamiento determinan

que las moléculas de agua puedan interpenetrar mejor la membrana en la

fase líquido cristalina. De esta forma, la polaridad en el microentorno del

Laurdan aumenta, produciendo el corrimiento del espectro de emisión

hacia el rojo. Por lo tanto se establece una relación directa entre la

polaridad del microentorno de la sonda y el estado de agregación de la

membrana lipídica.

Figura 3.12 Penetración de agua en membranas según el estado de agregación. La transición de fases en membranas cambia el contenido de agua en la interfase lípido-acuosa. Estas moléculas de agua producen un cambio en la polaridad del microentorno del grupo naftaleno de Laurdan, produciendo un corrimiento al rojo del espectro de emisión.

Utilizando lípidos con distintas Tm y variando la temperatura se pudo

caracterizar con precisión este corrimiento al rojo y se formuló el concepto

de GP (proveniente de Generalized Polarization, por el isoformismo en la

expresión matemática con las funciones de polarización) para poder

cuantificar el grado de fluidez en la membrana (Parasassi et al. 1991):

72

440 490

440 490

I IGP

I I

−= + (3.9)

La figura 3.13A muestra espectros característicos de una fase gel

(en azul) y de una fase líquido cristalina (en rojo) obtenidos a una longitud

de onda de excitación de 356 nm. De este modo, la GP de Laurdan es,

cualitativamente, una manera de pesar las contribuciones espectrales obte-

nidas de las moléculas en la muestra y toma valores teóricos entre 1 y -1.

La figura 3.13B muestra la transición de fase del fosfolípido DPPC

inducida por temperatura y monitoreada utilizando GP de Laurdan.

Inicialmente, la membrana se encuentra en una fase gel, más ordenada y

compacta, y por ende la sonda emite hacia el azul por lo que el valor de GP

es alta. Al aumentar la temperatura, se produce la transición de fases en las

vesículas lipídicas lo que genera un aumento de la fluidez, con el

consiguiente incremento en la cantidad de agua en la membrana (figura

3.12). Esto produce un corrimiento al rojo en la emisión de las moléculas

de Laurdan disminuyendo el valor de GP. Idealmente, se puede deducir de

la expresión que valores de GP cercanos a 1 representarían fases gel y

valores cercanos a -1 representan fases fluidas. En la práctica, GP toma

valores en el rango entre 0.8 y -0.6.

Figura 3.13 (A) Espectros de Laurdan a 25ºC en DPPC (azul, fase gel) y POPC (rojo, fase líquido cristalina). (B) Transición de fase en DPPC inducida por temperatura monitoreada por C-Laurdan.

73

3.4 Microscopía de fluorescencia

Al comienzo de este capítulo mencionamos las ventajas de la

fluorescencia como técnica de detección de moléculas y describimos

distintos aspectos de la fluorescencia para el estudio de biomoléculas

aisladas en ensayos efectuados in vitro en un espectrofluorímetro. La

capacidad de responder la pregunta “¿dónde ocurren estos fenómenos?”

nos la ofrece la microscopía de fluorescencia al sumar resolución espacial a

los fenómenos estudiados.

La figura 3.14 muestra un diagrama óptico de un microscopio en el

cual se representa en términos de óptica geométrica, el trazado de rayos

proveniente de un punto en la imagen. Actualmente está muy difundido el

uso de microscopios con sistemas ópticos “corregidos al infinito”. Esto

quiere decir que los rayos provenientes de la muestra al atravesar el

objetivo salen paralelos entre sí, lo cual genera un espacio “infinito” entre

el objetivo y el lente del tubo. Una gran ventaja es que permite introducir

componentes ópticos como filtros y polarizadores sin introducir ningún tipo

de aberración en la imagen obtenida.

Figura 3.14 Formación de imagen en un microscopio con ópticas corregidas a

infinito. (A) Se describen los componentes ópticos principales y las distancias focalesen la observación a través de un ocular. Los rayos de luz provenientes de un punto en laimagen al atravesar el objetivo salen paralelos, enfocados al infinito como seesquematiza en (B). Adaptado de http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/components.html

Algunos de los componentes de un microscopio de fluorescencia

son, en esencia, los mismos que aquellos utilizados para espectroscopía de

fluorescencia (fuentes de luz, filtros, detectores) pero con el agregado

74

fundamental de un objetivo, una lente, que permite enfocar la luz de

excitación sobre un plano de la muestra y al mismo tiempo colectar los

fotones de emisión provenientes de la misma. Este esquema de excitación

y colección con el mismo objetivo se denomina epifluorescencia (Wolf

2007) (figura 3.15).

Figura 3.15 Esquema básico

de un microscopio de fluo-

rescencia con epi-ilumi-

nación: Utilizando un filtro óptico se selecciona la luz de excitación que se enfoca sobre la muestra a través del objetivo. La luz de fluores-cencia proveniente de la muestra se colecta con el objetivo, es transmitida por el dicroico y puede ser sele-ccionada con filtros sobre todo en aplicaciones con múltiples sondas fluorescentes en la misma muestra. La luz de excitación es reflejada por el espejo dicroico.

La descripción mencionada anteriormente se sustenta en la óptica

geométrica, pero en la práctica, la naturaleza ondulatoria de la luz introduce

en estos sistemas ópticos límites en la capacidad de resolver la imagen de

un objeto microscópico.

El límite de resolución de un microscopio se define como la menor

distancia entre dos puntos tal que éstos puedan ser distinguidos como dos

puntos separados en la imagen (Wayne 2009). Como vemos en la Fig. 3.16,

la imagen de un objeto puntual (es decir.de dimensiones mucho menores

que la longitud de onda de la luz incidente) no es un punto tal como predice

la óptica geométrica sino es una figura denominada disco de Airy. Esto se

debe al fenómeno de difracción, una consecuencia de la naturaleza

ondulatoria de la luz. Al atravesar la luz una apertura circular, el patrón de

75

mínimos y máximos de interferencia generado produce la figura

mencionada (figura 3.16A). De este modo, se define la función de

dispersión de punto (PSF, del inglés Point Spread Function) como la

respuesta de un sistema de imagen a una fuente de emisión u objeto

puntual. La imagen a obtener puede pensarse como un conjunto de puntos,

de modo que puede ser descripta como la suma de las correspondientes

PSF (Heintzmann y Ficz 2013).

Figura 3.16 Discos de Airy, resolución y PSF. En A, un punto de luz limitado por difracción. B y C muestran discos de Airy a distinta distancia entre sí, al acercarse cada vez más pueden volverse indistinguibles. D. Representación de los puntos que formanuna imagen y la función tridimensional de la intensidad observado en función del plano.(Adaptado de Wayne 2009 y Davidson y Abramowitz 2000)

76

A medida que la distancia entre dos puntos decrece, los discos de

Airy se solapan cada vez más. Rayleigh definió un criterio arbitrario para

definir resolución: el contraste será suficiente para distinguir dos puntos si

el máximo de intensidad de un punto coincide con el primer mínimo del

otro. El radio del disco de Airy para microscopía de fluorescencia por epi-

iluminación está dado por:

0.61airyr

NA

λ= (3.10)

El límite teórico de resolución implica que distancias menores a rairy

vuelven dos puntos indistinguibles entre sí.

Por ejemplo, en el caso de un objetivo típico de microscopía, con una

apertura numérica de 1.35 trabajando con luz en el rango visible de 500

nm, la máxima resolución esperada es de 220 nm.

3.4.1 Microscopía confocal

Un problema que surge al observar imágenes de microscopía de

fluorescencia convencionales es que el objetivo ilumina una región de

espesor apreciable de la muestra y colecta luz proveniente de distintos

planos focales de la muestra. Como consecuencia, se produce una pérdida

de resolución en el eje Z (i.e. el eje óptico del microscopio) y una menor

nitidez en las imágenes debido a la pérdida de contraste producida por luz

proveniente de otros planos (figuras 3.17 y 3.18).

En 1958, Marvin Minsky patentó el diseño de un microscopio en el

que para mejorar el contraste de las imágenes obtenidas proponía el uso de

una pequeña apertura o “pinhole”, que podía utilizarse para enfocar luz en

un área muy pequeña de la muestra y al mismo tiempo recoger la luz

emitida descartando los rayos provenientes de los planos no focales de la

muestra.

Esta metodología permitía colectar la fluorescencia de un volumen

muy pequeño de la muestra (de dimensiones aproximadas de 0.25 µm x

0.25 µm x 1,25 µm) pero no permite registrar una imagen de la misma. Con

este fin, Minsky propuso escanear la muestra moviendo el soporte de la

misma para que, a partir de este barrido, se genere la imagen

bidimensional.

77

Lo fascinante de la visión de Minsky es que ya proyectaba las

ventajas y la esencia del microscopio confocal moderno.

En la actualidad, la luz de excitación de un microscopio confocal

proviene de un láser, por lo que no es necesario el uso de un pinhole en la

excitación (figura 3.18). Gracias a su capacidad de minimizar la colección

de luz de planos distintos al plano focal (plano confocal), el microscopio

confocal ofrece la oportunidad de eliminar la luz fuera de foco de modo tal

de generar un seccionamiento óptico de la muestra, con la posibilidad de

luego integrar estos planos y reconstruir una imagen tridimensional.

Figura 3.17 Microscopio confocal.. El pinhole ubicado previo al detector permite rechazar los rayos de luz provenientes de otros planos y posibilitando la adquisición de secciones ópticas en el orden de 1 µm de profundidad. Luego esas secciones puedenunirse computacionalmente generando una imagen completa obtenida por superposicióno incluso un modelo tridimensional

La figura 3.19 muestra una comparación entre imágenes tomadas

con un microscopio de fluorescencia convencional y un microscopio

confocal de barrido. El aumento de contraste obtenido por la posibilidad

78

de descartar luz espúrea de la muestra permite obtener imágenes más

definidas.

Figura 3.18 Comparación de imágenes de microscopía de fluorescencia en campo

amplio (fila superior) y microscopía confocal de barrido (fila inferior). (a) y (b) Corte de hipocampo murino teñido con anticuerpos primarios contra proteína GFAP (rojo), neurofilamentos (verde) y luego teñido con Hoescht 33342 para resaltar los núcleos. (c) y (d) músculo liso de rata con faloidina conjugada a Alexa Fluor 568 (actina, rojo) aglutinina del germén de trigo conjugada a Oregon Green 488 (glicoproteínas, verde) y núcleos teñidos con DRAQ5 (azul). (e) y (f) autofluorescencia de grano de polen de girasol. Adaptado de Claxton 2006.

Dado que el barrido del soporte es muy lento, en la actualidad, la

mayoría de los microscopios confocales comerciales utilizan 2 espejos

manejados por motores acoplados a galvanómetros. La luz del láser de

excitación se refleja en ambos espejos que a su vez se mueven

determinando un patrón de barrido del láser como el que se muestra en la

figura 3.19. De esta forma, la imagen en un microscopio confocal consiste

en una imagen digitalizada punto a punto (figura 3.19A). En cada uno de

estos puntos, el detector integra la señal en tiempos que pueden ir desde 1

µs a 1 ms. Variando la posición vertical (eje Z) del plano confocal, se

puede registrar una sucesión de imágenes que luego pueden analizarse para

obtener una representación tridimensional de la muestra en estudio.

79

D

Figura 3.19 Formación de imágenes por barrido en microscopía confocal. (A) Escaneo punto a punto para formar una imagen de 512x512 pixeles. (B) Desplazandoel foco en la dirección vertical (“Z-scan”) se pueden obtener imágenes que luego reconstruyen tridimensionalmente la muestra. (C) Reconstrucción tridimensional dered de osteocitos de gallina. (D) Células ganglionares de retina de rata. En estos casosla técnica permite reconstruir en el espacio la morfología celular completa. Barra en C,10 µm. Adaptado de Sugawara 2006.

Un microscopio confocal comercial consiste básicamente en uno o

varios láseres que ofrecen diferentes longitudes de onda de excitación, un

sistema que escanea la muestra en intervalos regulares de tiempo, un

“pinhole” encargado de rechazar la luz proveniente de otros planos, el

objetivo, y fotodetectores de alta sensibilidad como fotomultiplicadores o

fotodiodos de avalancha. Estos equipos se acoplan a una computadora que

mediante un software lleva a cabo la tarea de digitalización y formación de

las imágenes.

La capacidad de generar volúmenes pequeños de excitación y

observación permite la aplicación de técnicas de estudio de molécula única

como FCS (del inglés, Fluorescente Correlation Spectroscopy) (Haustein y

80

Schwille 2007) la cual será empleada en la presente tesis y será descripta en

mayor detalle en la sección 7.4.3.

3.4.2 Microscopía de 2 fotones

Como mencionamos en la sección anterior, la microscopía confocal

permite colectar la fluorescencia del plano focal de la muestra. Sin

embargo, regiones del sistema en estudio por encima y por debajo del plano

focal también son irradiadas por el láser, convergiendo y divergiendo a

partir del punto de foco (figura 3.20). A pesar de no ser detectadas en el

microscopio confocal, las moléculas de fluoróforo en estas regiones son

excitadas y por consiguiente pueden ser fotoblanqueadas Por lo tanto, la

microscopía confocal tiende a producir un importante fotoblanqueo de las

moléculas fluorescentes de la muestra a pesar de que la luz que emiten no

esté siendo colectada.

El concepto de las transiciones cuánticas de 2 fotones fue

desarrollado en la tesis doctoral de la Premio Nobel de Física Maria

Goeppert-Mayer (Göppert-Mayer 1931) pero hasta el desarrollo del láser

no pudieron ser llevadas a la práctica. Cómo muestra la figura 3.20, una

dada transición electrónica puede producirse por la absorción cuasi

simultánea de 2 fotones que portan la mitad de la energía. La probabilidad

de que esto ocurra es muy baja y por lo tanto se requiere concentrar

espacio-temporalmente una altísima intensidad de fotones. Hasta el

desarrollo del láser en la década de 1960 y la consiguiente capacidad de

satisfacer el requerimiento de altas intensidades de excitación, no pudieron

probarse estos fenómenos (Diaspro et al. 2006). La microscopía de 2

fotones fue desarrollada por Winfried Denk, James Strickler y Watt Webb

en 1990 (Denk et al. 1990). En esta técnica se utiliza un láser pulsado de

muy alta frecuencia y de aproximadamente el doble de longitud de onda

(mitad de la frecuencia, mitad de la energía) que el láser convencional de

excitación. Es exactamente en ese foco donde la densidad de fotones es tan

alta, que puede producirse la excitación de los fluoróforos por absorción

cuasi-simultánea de dos fotones.

81

Como se puede ver en la figura 3.20, esta microscopía permite

obtener un seccionamiento óptico inherente al propio volumen de

excitación y de hecho vuelve innecesario un pinhole para descartar la luz

fuera de foco: basta con un detector que colecte los fotones emitidos

mientras se escanea la muestra. Dado que no hay excitación de moléculas

fuera del volumen focal, el fotoblanqueo global de la muestra es por

consiguiente mucho menor (en el volumen focal es mayor).

Figura 3.20 Microscopía de 2 fotones. A la izquierda se muestra el perfil de excitación típico de un láser enfocado sobre una muestra de fluoresceína. Un láser pulsado emitiendo fotones infrarrojos genera un pequeño volumen de excitación en el punto del espacio donde la intensidad es lo suficientemente alta como para producir el fenómeno de absorción de 2 fotones.

Esta microscopía presenta grandes ventajas en el análisis de

especímenes biológicos dado que los fotones infrarrojos pueden penetrar

cientos de micrones dentro muestras biológicas turbias, y especímenes o

preparados gruesos. Además, las características fotofísicas particulares del

fenómeno de 2 fotones permiten simultáneamente la excitación de muchas

sondas diferentes reduciendo artefactos en ensayos de colocalización

(Diaspro et al. 2006). También esta técnica permite la excitación de sondas

con espectro de absorción en el UV sin necesidad de utilizar costosas lentes

y filtros para trabajar con luz ultravioleta. de las muestras. Incluso se

pueden producir reacciones fotoquímicas en regiones localizadas con

precisión dentro una muestra.

82

La principal desventaja de esta microscopía es su altísimo costo. Un

microscopio comercial de 2 fotones puede costar más del cuádruple que un

microscopio confocal comercial. Además, el láser pulsado asociado a estos

equipos requiere un cuidadoso mantenimiento comparado con un conjunto

de láseres de diodos típicos de un confocal comercial. Por estos motivos,

este tipo de microscopios son muy poco frecuentes en países con

economías menos desarrolladas en los que ya un microscopio confocal

comercial es un equipo por lo general compartido entre muchos grupos de

investigación.

En la sección 3.3.1.3 hemos explicado algunas características

espectrales de la sonda Laurdan. Inicialmente, esta sonda fue utilizada en

estudios de espectroscopía de fluorescencia para dilucidar características de

la organización de membranas sintéticas y naturales. El primer trabajo en

membranas donde se obtuvo información espacial sobre los valores de GP

de membranas biológicas fue en 1997 (Parasassi et al. 1997).

Aprovechando la capacidad de la técnica de microscopía de 2 fotones para

excitar sondas fluorescentes en el ultravioleta, se obtuvieron imágenes de

vesículas lipídicas y células y pudieron apreciarse heterogeneidades y un

amplio espectro de GP en estas muestras. En los siguientes 15 años, la

microscopía de 2 fotones con Laurdan se transformó en una técnica muy

común en el estudio de biomembranas tanto en sistemas naturales como

artificiales (figura 3.21). Sin embargo, siempre se vio limitada al uso de

microscopía de 2 fotones, dado que la excitación producida por el láser de

un microscopio confocal de barrido resultaba insuficiente para obtener

imágenes sin producir un fuerte fotoblanqueo de la muestra (Bagatolli y

Gratton 2001). La excitación en el violeta (alrededor de 400 nm) produce

una baja intensidad de fluorescencia (el máximo de absorción de Laurdan

está en 356 nm) y el perfil de iluminación provoca fotoblanqueo en

moléculas fuera de foco.

83

Figura 3.21 Uso de Laurdan con microscopía de 2 fotones. (A) Sección ecuatorial de GUVs de DPPE:DPPC 7:3 a distintas temperaturas. Se puede apreciar el cambio en la fluidez reportado por GP y la coexistencia de fases lipídicas a 54ºC. (B) Macrófago de la línea celular RAW264.7. Las proyecciones de la membrana celular presentan altos valores de GP. Adaptado de Bagatolli (2000) y Gaus (2003).

84

3.5 Referencias

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Capítulo 4

Hipótesis y Objetivos

4.1 Introducción

El estudio de las proteínas de membrana ha mostrado un importante

crecimiento en las últimas décadas a partir de la confluencia de distintas

áreas del conocimiento y la superación de algunas de las dificultades

experimentales que caracterizan el desarrollo de este campo del

conocimiento. Por un lado, el estudio de la fisicoquímica de membranas

reveló la existencia de separación de fases en bicapas fluidas y el rol del

colesterol en estos procesos. A eso se suma el estudio de la función y

estabilidad de proteínas de membrana que hizo posible una mejor

descripción de estos fenómenos, lo cual permite comenzar a integrar

resultados funcionales y estructurales de proteínas con los resultados

obtenidos en biofísica de membranas. Todos estos desarrollos fueron de la

mano de técnicas que permitieron abordar preguntas formuladas décadas

atrás y que también brindaron la posibilidad de formular nuevas hipótesis y

desarrollar marcos conceptuales más complejos para integrar éstas áreas del

conocimiento.

En el capítulo 1 mencionamos que la membrana celular presenta una

estructura compleja en la que las interacciones entre fosfolípidos y

proteínas juegan un papel fundamental. Las teorías de lipid rafts proponen

la existencia de ensamblados estructurales que pueden actuar como

plataformas dinámicas en las que puede producirse una modulación local

de la actividad biológica: ya sea por un fenómeno de concentración local de

especies proteicas determinadas, como por la modulación que pueden

ejercer la composición lipídica sobre la actividad de proteínas de

membrana.

89

Entender estos fenómenos mecanísticamente presenta el desafío de

conjugar el conocimiento proveniente de la biofísica de membranas junto

con el de proteínas de membrana.

En el capítulo 2 señalamos que la bomba de calcio de la membrana

plasmática (PMCA) es una proteína integral de membrana, de bioquímica

bien caracterizada y presentamos las particularidades que conlleva el

estudio de las proteínas de membrana respecto a una proteína soluble: la

necesidad de encontrar un sistema adecuado para reconstituir la proteína

que originalmente se hallaba inserta en una membrana biológica en un

sistema de anfifilos que le permita estabilizar una conformación nativa y

conservar su actividad enzimática.

En el capítulo 3 mostramos que la espectroscopía y microscopía de

fluorescencia, técnicas que por su sensibilidad, resolución espacial y

posibilidad de ser utilizadas en sistemas artificiales y naturales, se han

vuelto herramientas clave en el estudio de proteínas y biomembranas.

Permiten indagar en detalle la estructura y dinámica de esos sistemas con

límites de sensibilidad que llegan hasta la molécula única. El uso de estas

sondas en muchos casos se ha limitado a la muy costosa microscopía de

dos fotones y de poder extenderse su uso a microscopía confocal de un

fotón, la oportunidad de un mayor número de grupos investigando estos

temas sin duda acelerará el número de aportes en el área.

4.2 Hipótesis

La hipótesis que sostiene nuestro trabajo es que el entorno lipídico

modula la función biológica de las proteínas integrales de membrana en

aspectos aún no develados. A su vez, las proteínas modifican y definen la

organización lipídica de la membrana. Por este motivo consideramos

fundamental comprender dicha relación y extender este estudio al entorno

natural de estas proteínas: las membranas celulares.

Por un lado, el estudio de la modulación de la actividad de la bomba

de calcio de la membrana plasmática puede ayudar a dilucidar mecanismos

macro y microscópicos de interacción lípido-proteína y buscar su relación

con la actividad de proteínas de membrana. A su vez permitirá conocer las

potencialidades y limitaciones de los sistemas de reconstitución habitual-

mente utilizados para el estudio de actividad de estas proteínas.

90

91

Por otro lado, creemos que la posibilidad de acceder al uso de sondas

de alta sensibilidad para sensar el estado de agregación de membranas

lipídicas contribuirá a entender in situ la organización de membranas

celulares y la interacción entre lípidos y proteínas.

4.3 Objetivos

El objetivo de este trabajo de tesis es caracterizar la modulación de la

actividad de la bomba de calcio de la membrana plasmática por la

composición del sistema en que se encuentra reconstituida. La

composición de este sistema también altera propiedades biofísicas que

también pueden afectar su actividad. A su vez, conocer mejor la estructura

de estos sistemas lipídicos nos llevará a evaluar el desempeño de la sonda

fluorescente C-Laurdan en espectroscopía y microscopía confocal.

Para el desarrollo de este trabajo planteamos los siguientes objetivos

específicos:

Estudiar el efecto de la composición de la fase micelar sobre la

actividad de PMCA

Analizar los cambios conformacionales de PMCA asociados a su

activación

Estudiar el intercambio entre anfifilos y el dominio transmembrana de

PMCA

Proponer ecuaciones empíricas que puedan describir los resultados

obtenidos

Estudiar la actividad de PMCA en relación con las transiciones micela-

vesícula del sistema de reconstitución

Investigar cómo se relaciona la fluidez del sistema de reconstitución con

la actividad de PMCA

Caracterizar el rendimiento de la sonda C-Laurdan para el estudio de

transiciones de fase en sistemas lipídicos

Evaluar el desempeño de C-Laurdan en microscopía confocal de un

fotón en vesículas unilamelares gigantes

Analizar el uso de C-Laurdan en sistemas celulares

Metodologías

Capítulo 5

Materiales y Métodos

5.1 Aislamiento de membranas plasmáticas fragmentadas de eritrocitos, libres de calmodulina

Las membranas plasmáticas se aislaron a partir de eritrocitos

humanos realizando una hemólisis hipotónica siguiendo la técnica descripta

por González flecha y colaboradores (1999).

Los glóbulos rojos se separaron por centrifugación a 1000 g durante

10 min, y se lavaron con una solución isotónica 150 mM NaCl.

La hemólisis de los eritrocitos se realizó adicionando una solución

hipotónica compuesta por: 15 mM de MOPS-K (pH 7.8 a 4 C), 20 mM de

EGTA-K y 0.1 mM PMSF (fluoruro de p-metilsulfonilo). Como el

complejo calmodulina-bomba de calcio no es estable en ausencia de Ca2+,

la inclusión del quelante de este ión en la solución hipotónica permite

eliminar la calmodulina endógena. Las membranas de los eritrocitos se

separaron por centrifugación a 20000 g durante 25 min.

Las membranas se lavaron 5 veces repitiendo el procedimiento

descripto previamente. Antes de la última centrifugación, las membranas

fragmentadas suspendidas en la solución hipotónica se incubaron a 37 °C

durante 10 min, procedimiento que facilita la eliminación de las cantidades

residuales de hemoglobina y calmodulina unida a las membranas.

El último lavado se realizó en presencia de 15 mM MOPS-K (pH 7.8

a 4 C), 5 M CaCl2 y 0.1 mM PMSF.

Las membranas se congelaron a -80 oC hasta su posterior utilización.

95

5.2 Purificación de la bomba de Ca2+

La bomba de Ca2+ se aisló a partir de membranas fragmentadas de

eritrocitos humanos mediante cromatografía de afinidad en una columna de

agarosa-calmodulina de acuerdo a la técnica descripta por Castello y

colaboradores (1994), con algunas modificaciones.

Se tomaron 250 ml de una suspensión de membranas fragmentadas

(aproximadamente 500 mg de proteínas totales) y se las centrifugó 20 min

a 20000 g.

Para extraer la bomba de calcio de la membrana, el sedimento se

resuspendió en 5 veces su volumen de una solución 300 mM KCl, 1 mM

MgCl2, 100 M CaCl2, 2 mM ditiotreitol, 7.8 mM C12E10 (Mr promedio =

627, Ganong y Lu, 1989), 10 mM MOPS-K (pH 7.4 a 4 °C) y 20 % v/v de

glicerol. El detergente permite la extracción de la bomba de calcio y otras

proteínas de la membrana que, como consecuencia, quedan incluidas en las

micelas. Los componentes de las membranas no solubilizados se separaron

por centrifugación durante 20 minutos a 20000 g.

El sobrenadante así tratado, se sembró en una columna de agarosa-

calmodulina. Posteriormente, se pasó a través de la columna una solución

de lavado compuesta por: 300 mM KCl, 1 mM MgCl2, 100 M CaCl2, 800

M C12E10, 2 mM ditiotreitol (DTT), 10 mM MOPS-K (pH 7.4 a 4 °C) y 20

% v/v de glicerol. El volumen de esta solución fue 20 veces el volumen de

la columna. Durante la etapa de lavado, la bomba de Ca2+ -cuya afinidad

por la calmodulina en presencia de Ca2+ es muy alta- es retenida a

diferencia del resto de las proteínas presentes las cuales son removidas.

Para separar la bomba de calcio de la columna se pasó a través de la misma

una solución compuesta por: 130 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM EDTA, 80

M C12E10, 2 mM DTT, 20 mM MOPS-K (pH 7.4 a 4 °C) y 20% v/v de

glicerol. El quelante de Ca2+, disminuye la concentración del ión en la

columna por lo que el complejo calmodulina-bomba de calcio se disocia.

Al utilizar exclusivamente detergente en los pasos de extracción,

lavado y elución, se produce una remoción casi completa de los

fosfolípidos provenientes de las membranas de eritrocitos. Sin embargo,

no podemos descartar que una muy baja cantidad de fosfolípidos asociados

fuertemente a PMCA (fosfolípidos estructurales) se encuentren presentes.

96

Las fracciones que presentaron mayor actividad Ca2+-ATPasa se

homogeneizaron, se les adicionó CaCl2 hasta 2 mM ([Ca2+]libre = 69 M), y

se almacenaron en nitrógeno líquido. La concentración de Ca2+ libre se

midió mediante un electrodo Orion 9320 (Beverly, MA) el cual es sensible

a este ion. La concentración de la enzima purificada fue 200-700 nM.

El rendimiento aproximado de la purificación fue 1 g de enzima

purificada por cada mg de proteínas presentes en las membranas aisladas de

glóbulos rojos.

5.3 Preparación de micelas mixtas de fosfolípidos-detergente

Los fosfolípidos se solubilizaron en una solución 1% de C12E10

agitando exhaustivamente con un agitador mecánico las mezclas por

encima de la temperatura de transición de los fosfolípidos (DMPC 23ºC,

DPPC, 41ºC, etc.) seguido de sonicación y sedimentación del material no

solubilizado por centrifugación (10 minutos a 12000x g). A partir de éstas

soluciones stock enriquecidas en fosfolípidos (fracción molar micelar =

0.7) se prepararon soluciones con diferentes relaciones molares

fosfolípido/detergente mezclando en proporciones adecuadas la solución

stock de C12E10 con soluciones stock de los fosfolípidos solubilizados en

detergente.

5.4 Cuantificación de fosfolípidos y detergente

La medición de la concentración de fosfolípidos se realizó de

acuerdo al procedimiento descripto por Zhou X y Arthur G (1992) con

algunas modificaciones. Las muestras y los patrones conteniendo 10-100

nmol de fosfato fueron calentados a 100 °C hasta la sequedad. Se adicionó

posteriormente 1 ml de HClO4 y se incubaron a 190 °C durante 30 min.

En estas condiciones altamente oxidantes, los componentes de la

muestra se mineralizan y se libera el fosfato de los fosfolípidos. La masa de

este compuesto en las muestras y en los patrones se determinó de acuerdo

al procedimiento de Lanzetta y col. (1979), descripto en la sección 5.5.

97

La concentración de detergente de la solución stock fue determinado

midiendo el índice de refracción de la solución considerando dn/dc = 0.11

ml / g para el C12E10 (Strop y Brunger 2005).

5.5 Medición de la actividad Ca2+-ATPasa

La actividad Ca2+-ATPasa de la enzima purificada, se determinó de

acuerdo al procedimiento descripto por Garben Cohen y col. (2010) con

algunas modificaciones. La enzima fue incubada a 37 °C durante 30 min

en 500 l de un medio conteniendo: 120 mM KCl; 30 mM MOPS-K

(pH 7.4); 4 mM MgCl2; 1 mM EGTA; 1.1 mM CaCl2 ([Ca2+]libre = 140

M); y la proporción específica para cada ensayo de C12E10 y fosfolípidos.

Para las mediciones de actividad de la enzima purificada, se utilizó en el

orden de 7 nM de proteína.

La cantidad de fosfato liberado por la hidrólisis del ATP se

determinó mediante una modificación del método colorimétrico de verde

de Malaquita con ligeras modificaciones (Lanzetta et al. 1979). Este

método se basa en la transformación cuantitativa de fosfato en

fosfomolibdato y éste, en óxidos de molibdeno, que se cuantifican por su

absorbancia a 630 nm.

La cantidad de fosfato en las muestras se determinó por interpolación

en una curva de calibración realizada con patrones conteniendo una masa

de fosfato conocida a los cuales se adicionó 1 ml de la solución

mencionada previamente. Las muestras y los patrones fueron incubados

durante 30 min a 25 °C y se registró la absorbancia a 630 nm.

5.6 Cuantificación de proteínas

La determinación de la masa de bomba de Ca2+ purificada se efectuó

de acuerdo al procedimiento descripto por Castello (1997) (1998), con las

modificaciones señaladas por Echarte y col. (2001). Se realizó la

electroforesis de las muestras y de patrones conteniendo 0.5-10 g

albúmina bovina.

98

Una vez coloreado el gel, se obtuvo una imagen utilizando un

scanner Umax Vista S12. La imagen se analizó utilizando el programa

Sigma Gel (SPSS Inc., Chicago), con el cual se cuantificó la intensidad de

las bandas correspondientes a las proteínas teñidas.

La masa de proteínas en las muestras se determinó por interpolación

en la curva de calibración construida a partir de los valores de intensidad de

los patrones.

5.7 Unión de fluoresceína a albúmina sérica bovina

Se marcó la proteína albúmina sérica bovina (BSA) a con

isotiocianato 5´ de fluoresceína (FITC) como se describió previamente

(Levi y González Flecha 2002). Se incubó una solución compuesta por:

MOPS-K 10 mM (pH 8.4), BSA 100 µM y FITC 100 µM a 25 ºC por 2.5

horas en la oscuridad. La reacción se detuvo con el agregado de 10 mM de

buffer Tris-HCl pH 8.4 a 4ºC. A continuación se dializó la muestra contra

buffer MOPS-K 10 mM a pH 5.8 para remover la sonda libre. La

estequiometría de marcado se determinó espectrofotométricamente a pH 9.

Para el cálculo de la concentración de la sonda FITC unida a BSA se utilizó

ε494 nm= 77000 cm-1 M-1. Para el cálculo de la concentración de BSA tras la

marca se utilizó ε278 nm= 44890 cm-1 M-1 previa corrección por la absorción

de FITC a 278 nm.

5.8 Preparación de LUVs por extrusión

Para la preparación de vesículas unilamelares grandes (LUVs)

utilizamos un extrusor de AvantiLipids con filtros de policarbonato de 0.1

µm siguiendo las indicaciones del fabricante con ligeras modificaciones.

Se disuelven por completo los fosfolípidos en CH2Cl2 en un tubo de vidrio

y luego se llevan a sequedad con nitrógeno hasta generar una fina película

en las paredes del tubo. Esta película se rehidrata con buffer de medición

de actividad ATPasa, se agita fuertemente con vortex por 5 min, se sonica

por otros 5 min y se congela y descongela 3 veces de manera de obtener

una solución translúcida sin agregados macroscópicos visibles. Esta

solución se pasa aproximadamente 21 veces por el extrusor trabajando por

99

encima de la temperatura de transición principal del fosfolípido. Este

método permite obtener una población de vesículas unilamelares de un

diámetro de 100-120 µm (MacDonald et al. 1991).

5.9 Técnicas espectroscópicas

5.9.1 Absorción

Los espectros de absorción fueron determinados a 25 °C, en un

espectrofotómetro Shimadzu UV-160A utilizando una cubeta de 1 cm de

paso óptico.

5.9.2 Dicroísmo Circular

Las mediciones de dicroísmo circular (CD) se realizaron utilizando

un espectropolarímetro Jasco J-810 (JASCO Inc. Easton, MD, EEUU). Los

espectros se registraron en una cubeta de cuarzo de 1 mm de paso a 25 °C,

en el rango de longitudes de onda comprendido entre 200–250 nm.

La velocidad de escaneo fue de 20 nm/min con una constante de

tiempo de 1 s. El promedio de tres espectros independientes se utilizó para

calcular la elipticidad molar promedio ([θ]) como:

( 100 )[ ]( )

r

A

M

c l N

(5.1)

donde [θ] está expresada en deg cm2.dmol-1, θ es la elipticidad medida

experimentalmente en milideg, Mr es la masa molecular de la proteína, c es

la concentración de proteína en mg/ml, l es el paso óptico de la cubeta, y

NA es el número total de aminoácidos de la proteína.

5.9.3 Dispersión estática de luz

Las mediciones de dispersión estática de luz (SLS) se realizaron

utilizando un espectrofluorómetro JASCO FP-6500 (JASCO Tokyo,

100

Japón). Los espectros se registraron a 25 ºC en una cubeta de cuarzo de 3

mm de paso óptico utilizando con luz incidente a 470 nm y registrando en

una orientación relativa de 90º también a 470 nm.

5.9.4 Fluorescencia

5.9.4.1 Espectrofluorómetros empleados

Las mediciones de fluorescencia a presión atmosférica fueron

realizadas utilizando un espectrofluorómetro JASCO FP-6500 (Jasco,

Tokyo, Japón). Los espectros fueron registrados en una cubeta de cuarzo de

3 x 3 mm.

5.9.4.2 Espectros de fluorescencia

Los espectros de emisión de fluorescencia se determinaron en las

condiciones descriptas en la siguiente tabla:

Tabla 5.1. Determinaciones de espectros de fluorescencia

Fluoróforo ex (nm)

em (nm) ranura de

excitación (nm) ranura de

emisión (nm)PMCA 290 300-400 3 3

FITC-BSA 490 500-600 3 3

1,8-ANS 385 490 3 3

Laurdan 356 420-550 3 3

C-Laurdan 405 420-550 3 3

di-4-ANEPPDHQ 488 500-710 3 3

La temperatura fue de 25 °C, a excepción de los experimentos donde

se indique expresamente. El control de temperatura se llevo a cabo con un

peltier incorporado al espectrofluorómetro que permite controlar la

temperatura con un error de ± 0.1 ºC

La intensidad total de fluorescencia se determinó de acuerdo a:

( ) ( )i

i

I I d I (5.2)

101

donde I(そi) representa la intensidad de fluorescencia a la longitud de onda そi

La longitud de onda del centro de masa (そCM) del espectro de emisión

se calculó utilizando la siguiente ecuación:

11 ( )

( )1

( )( )

i

i

i

i

CM

II d

II d

(5.3)

5.9.4.3 Transferencia de energía

La transferencia de energía se calculó a partir de la determinación de

la disminución de la fluorescencia del donor cuando el aceptor es

incorporado al medio (ecuación 3.6).

La distancia donor-aceptor en las condiciones experimentales se

calculó utilizando la ecuación 3.3. El valor de Ro, distancia a la cual la

eficiencia de la transferencia es 50 %, se determinó de acuerdo a la

ecuación 3.5 en la que la integral de solapamiento J se calculó empleando

la siguiente ecuación:

4( )

( )i

i

ida i

d

IJ

I (5.4)

donde Id es la intensidad total de fluorescencia del dador. Id(i) es la

intensidad de fluorescencia del dador en ausencia del aceptor y a(i) es el

coeficiente de absortividad molar del aceptor, ambos a la longitud de onda

i.

Para determinar el rendimiento cuántico de fluorescencia del donor

(d) empleamos un compuesto patrón, cuyo rendimiento cuántico es

conocido. El rendimiento se calculó de acuerdo a la siguiente ecuación:

p pdd

p d

I A

I A

(5.5)

donde A es la absorbancia e I es la intensidad de fluorescencia total, ambas

medidas a la longitud de onda de excitación del dador. Los subíndices d y p

refieren al donor y a un compuesto patrón, respectivamente.

La intensidad de fluorescencia total para los compuestos, se calculó

utilizando la ecuación 5.2.

102

5.9.4.4 Polarización Generalizada (GP) de Laurdan y C-Laurdan

Los espectros de Laurdan y C-Laurdan se tomaron excitando la

muestra a 356 nm y a 405 nm respectivamente. La polarización

generalizada (GP, del inglés Generalized Polarization) fue calculada como:

440 490

440 490

I IGP

I I

(5.6)

Siendo I440 e I490 las intensidades de emisión a 440 y a 490 nm

respectivamente (Parasassi et al. 1998).

5.9.4.5 Espectroscopía de Correlación de Fluorescencia (FCS)

Las medidas de FCS se realizaron con un microscopio confocal

Olympus FV-1000 (Olympus, Japón) utilizando un objetivo Olympus

UPLSAPO 60X de inmersión en aceite de 1.35 de apertura numérica y 0.15

mm de distancia de trabajo. Aproximadamente 70 µL de cada muestra se

colocaron sobre un cubreobjetos limpio en una platina adecuada para la

observación. Se utilizaron para la excitación las líneas de 473 nm (FITC)

y de 559 nm (Rhodamina) del láser de estado sólido incluido en el equipo.

Se enfocó el láser sobre un punto de la muestra y se registró la intensidad

de fluorescencia durante 3 minutos en el modo de conteo híbrido (o

pseudo-conteo) de fotones que provee el equipo. Las mediciones se

efectuaron a 25 ºC. Las curvas experimentales de autocorrelación y el

ajuste del modelo de difusión a las mismas fue realizado con el programa

SimFCS (LFD, UCI, Irvine, EEUU).

103

5.10 Cálculo de la temperatura de transición de un sistema lipídico por espectroscopía de GP de Laurdan

Para calcular la temperatura de transición de un sistema lipídico se

efectuaron rampas de temperatura modificando la temperatura de la

muestra con el peltier (JASCO ETC-273) incorporado al espectro-

fluorómetro. El protocolo consistió en ir aumentando la temperatura en

pasos de 2 ºC y luego, cuando se detectó el comienzo de la transición, el

aumento se hizo en pasos de 0.2 ºC. En ambos casos se dejó equilibrar el

sistema 2 minutos una vez alcanzada la temperatura para luego tomar un

espectro completo. A cada uno de estos espectros se les calculó la GP con

la ecuación 5.6 para confeccionar un gráfico de GP en función de la

temperatura. La temperatura de transición se obtuvo como el punto de

máxima derivada en dicho gráfico.

5.11 Calorimetría de Titulación Isotérmica

Las medidas de ITC se realizaron en un calorímetro MicroCal VP-

ITC (MicroCal, Massachussets, EEUU). Las medidas se efectuaron a una

temperatura de 28 ºC. En las celdas de titulación se introdujeron 3 mM de

DMPC o 0.5 mM de C12E10 y se realizaron inyecciones de volumen

creciente del titulante correspondiente (35 mM de C12E10 o 5mM de

vesículas de DMPC, según el experimento) siguiendo el protocolo

propuesto por Heerklotz y colaboradores (2009). La integración de las

trazas calorimétricas se hizo con el programa Microcal Origin 7.0 para

obtener el calor total liberado o absorbido luego de cada inyección.

104

5.12 Preparación de vesículas unilamelares gigantes (GUVs)

Las GUVs se prepararon siguiendo el protocolo de electroformación

(Angelova et al. 1992) en una cámara diseñada para tal fin (Bagatolli y

Gratton 1999) (figuras 5.1 y 5.2).

Las preparaciones de fosfolípidos y sonda fluorescente en

proporciones adecuadas para cada experimento se mezclaron previamente

en CH2Cl2 en un vial de vidrio. Luego, utilizando una jeringa Hamilton, se

aplicó homogéneamente sobre los electrodos aproximadamente 20 µl de la

mezcla y se colocaron -ya montados en la cámara de electroformación y

observación- en un desecador bajo vacío por media hora para evaporar por

completo el solvente orgánico. Finalmente, se agregó agua bidestilada y se

llevó la solución a una temperatura 10 ºC por encima de la temperatura de

transición más alta de los lípidos presentes en la mezcla. La temperatura en

la cámara de observación se monitoreó con el uso de un termistor calibrado

entre 10ºC y 90ºC. Al llegar a temperatura requerida, se aplicó con un

generador de función una función sinusoidal de 3 V de amplitud pico a pico

a una frecuencia de 10 hz por 2 horas.

105

Figura 5.1. Sistema para preparación y visualización de GUVs por microscopía

confocal.

Figura 5.2. Cámara para generación y observación de GUVs. Esta configuración suministra control de temperatura y medición de la misma in situ.

106

5.13 Observación de GUVs por microscopía confocal. Polarización Generalizada de C-Laurdan.

Las observaciones de GUVs y de células se efectuaron en un

microscopio confocal Olympus FV-1000. La fuente de excitación fue un

diodo láser de estado sólido a 405 nm (intensidad promedio sobre la

muestra 5 µW) (Laurdan y C-Laurdan), 473 nm (FITC) y 559 nm (Rho-

DPPE). La luz del láser se reflejó en un espejo dicroico (DM405/473/559)

y se enfocó sobre la muestra a través de un objetivo Olympus UPlanSApo

60X de inmersión en aceite (apertura númerica = 1.35). La fluorescencia

de C-Laurdan se colectó a través del mismo objetivo, pasó a través del

pinhole, y se dividió con un espejo dicroico hacia dos detectores

espectrales independientes configurados para detectar simultáneamente la

fluorescencia en el rango 415-455 nm y 490-530 nm (canales 1 y 2

respectivamente). Para medidas en 3 canales, se utilizó un tercer detector

configurado para colectar fluorescencia en el rango 575-675 nm. Los

fotomultiplicadores se configuraron en el modo de conteo híbrido de

fotones.

Para evitar artefactos en el cálculo de la GP por el efecto de

fotoselección observable cuando se excita la sonda con un láser linealmente

polarizado, insertamos debajo del objetivo el prisma Nomarski incluido en

la ranura de contraste diferencial de interferencia (DIC, del inglés

Differential Interference Contrast). Esta configuración genera dos volúme-

nes de excitación superpuestos con polarizaciones ortogonales (Korlann et

al. 2008); disminuye levemente la resolución de la imagen (Amos et al.

2003) pero remueve los artefactos inducidos por fotoselección que pueden

afectar el cálculo de la GP.

5.14 Tinción de células de melanóforos de Xenopus laevis

Las células de melanóforos de Xenopus laevis provienen de una línea

inmortalizada descripta anteriormente (Rogers et al. 1997). Para las

107

observaciones, se cultivaron células durante 2 días sobre cubreobjetos

circulares. Para la tinción, se incubaron las células con 5 µM de Laurdan o

C-Laurdan por 30 minutos. Previo a la observación en el microscopio, las

células se lavaron con PBS y se montaron en una cámara de observación.

5.15 Tinción de eritrocitos humanos

Se extrajeron 5 mL de sangre de un voluntario a un tubo conteniendo

EDTA como anticoagulante (concentración final 4.5 mM). Se efectuaron 3

lavados con buffer RBC (Montalbetti et al. 2011), y se resuspendieron las

células en este buffer con 0.1 % de BSA. A continuación se incubaron las

células media hora a temperatura ambiente con 10 µM de C-Laurdan. Para

la observación se bloquearon previamente los vidrios incubándolos 20

minutos en solución 2% m/m de BSA para prevenir la formación de

equinocitos al producirse el contacto de los eritrocitos con el vidrio.

5.16 Análisis de imágenes de GP

Se obtuvieron imágenes de GP a partir de las imágenes de

microscopía confocal, calculando para cada píxel de la imagen:

415 455 490 530

415 455 490 530

I G IGP

I G I

(5.5)

donde I415-455 y I490-530 corresponden a la fluorescencia colectada en los

canales 1 y 2 respectivamente. El factor G para estas medidas fue

determinado utilizando una solución 10 µM de la sonda en DMSO fresco

utilizando un procedimiento como el descripto en Kim y col (2007).

Los valores de GP en membranas celulares fueron calculados

utilizando una rutina de Matlab que convierte las imágenes de GP en una

imagen binaria a partir de un valor umbral que permite discriminar los

bordes de las células del ruido de fondo. La rutina luego crea una máscara

de un ancho de dos píxeles alrededor del borde las células en la imagen

binaria. Esta máscara finalmente se aplica sobre la imagen de GP original

108

para identificar los píxeles correspondientes a la membrana celular y se

extrae el valor de GP de los mismos.

5.17 Tratamiento de los datos

Todas las mediciones fueron realizadas por duplicado o triplicado.

Las ecuaciones fueron ajustadas a los datos experimentales utilizando un

procedimiento de regresión no lineal basado en el algoritmo de Gauss-

Newton (Kemmer y Keller 2010). La variable dependiente fue considerada

como homoscedástica (varianza constante), y el error de la variable

independiente fue considerado despreciable. Los parámetros son

expresados como la media ± error estándar.

5.18 Origen y calidad de las drogas utilizadas

Los reactivos utilizados en este trabajo son de calidad analítica

(ACS) provenientes de Merck, Baker, Sigma, Fluka o Anedra.

Las sondas fluorescentes 6-Dodecanoil-2-Dimetilaminonaftaleno

(Laurdan), 1-hexadecanoil-2-(1 piréndecanoil)-sn-glicero-3-fosfocolina

(HPPC) y 1-anilinonaftalén-8-sulfónico (1,8-ANS) fueron provistas por

Molecular Probes (Eugene, OR). La sonda fluorescente 6-dodecanoil-2-

[N-metil-N-(carboximetil)amino]naftaleno (C-laurdan) fue un generoso

obsequio del profesor Bong Rae Cho (Universidad de Corea, Seúl, Corea

de Sur). La sonda 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-

(lissamina rhodamina B sulfonil) (sal de amonio) (Rho-DPPE) fue provista

por Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Los fosfolípidos de soja, y el

detergente C12E10 fueron comprados en Sigma Chemical Co. (St. Louis,

Missouri, USA), al igual que las drogas que componen las soluciones

empleadas, las cuales fueron todas de grado pro-análisis.

Los fosfolípidos 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC),

1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) y el colesterol

fueron provistos por Avanti Polar Lipids.

La sangre humana recientemente extraída fue cedida por la Sección

Hematología del Hospital de Clínicas General San Martín.

109

5.19 Referencias Amos, W. B., S. Reichelt, D. M. Cattermole y J. Laufer (2003). "Re-evaluation of differential phase contrast (DPC) in a scanning laser microscope using a split detector as an alternative to differential interference contrast (DIC) optics." Journal of Microscopy 210(2): 166-175.

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Resultados y

Discusión

Capítulo 6

Modulación de la actividad

enzimática de PMCA por

fosfolípidos en sistemas

micelares

6.1 Introducción

En el capítulo 1 mencionamos que la naturaleza del entorno lipídico

de una proteína de membrana puede modular su actividad enzimática.

En el presente capítulo estudiaremos la regulación de la actividad

basal de PMCA por fosfolípidos neutros y detergentes empleando como

modelo un sistema que consiste en PMCA purificada y reconstituida en

micelas del detergente polioxietilen-10-lauril éter (C12E10). Posteriormente,

el agregado de cantidades controladas del fosfolípido dipalmitoil-

fosfatidilcolina (DPPC) la transforma en una preparación funcionalmente

activa. Mediante técnicas espectroscópicas intentaremos obtener

información estructural de PMCA que pudiese sugerir cambios

conformacionales asociados a los cambios de actividad enzimática.

115

6.2 La actividad ATPasa de PMCA es modulada por la composición de las micelas

Con el fin de evaluar la regulación de la actividad enzimática de

PMCA purificada, utilizamos dos protocolos diferentes.

El primer protocolo consistió en mantener la concentración de

detergente C12E10 constante e incrementar la concentración del fosfolípido

dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) (Figura 6.1A) mientras que en el

segundo, evaluamos los efectos del incremento en la concentración de

C12E10 manteniendo constante la concentración de DPPC (Figura. 6.1B).

Figura 6.1 Efecto de la concentración de DPPC y C12E10 en la actividad ATPasa

de PMCA (A) PMCA purificada reconstituida en (○) 1.20, (□) 2.75 y (∆) 7.5 mM de C12E10

fue suplementada con concentraciones crecientes de DPPC antes de la medición de actividad ATPasa. (B) Alternativamente, se agregó C12E10 a PMCA purificada que ya se encontraba suplementada con (●) 0.06, (■) 0.22 y (▲) 0.53 mM DPPC antes de la medición de actividad ATPasa. Las líneas sólidas son una guía visual.

La actividad ATPasa de PMCA deslipidizada en la purificación y

reconstituida en micelas de C12E10 fue de 2.3 ± 0.2 µmol Pi mg PMCA-1

min-1 al ser incubada en el medio de medición de actividad sin agregado de

DPPC. Es decir, la proteína reconstituida sólo con detergente presenta un

valor mínimo de actividad ATPasa. En estas condiciones sólo pueden estar

presentes lípidos estructurales que resisten el proceso de purificación y

116

serían responsables de este nivel de actividad basal (sección 1.4.1). La

figura 6.1A muestra que al agregar DPPC, la actividad ATPasa aumenta

para cada una de las concentraciones de C12E10 ensayadas, pudiendo

describirse diferentes isotermas de activación dependientes de la

concentración total de detergente C12E10. En sentido opuesto, la figura 6.1B

muestra que a concentraciones fijas de DPPC, la actividad de PMCA

decrece con el incremento en la concentración de C12E10; siendo este efecto

de inactivación más pronunciado a menores concentraciones de

fosfolípidos. Es importante destacar que la enzima purificada con C12E10

recupera su actividad ATPasa tras el agregado de fosfolípidos alcanzando

niveles comparables a los de la enzima purificada en presencia de micelas

mixtas de fosfolípidos y detergente (Garber Cohen et al. 2010). Estos

resultados sugieren que la modulación de la actividad enzimática por

fosfolípidos y detergentes no desnaturalizantes es completamente

reversible.

Como mencionamos en el capítulo 2, existen antecedentes que

sugieren que ciertas propiedades de la PMCA, en particular la estabilidad

térmica, dependerían de la composición relativa de las micelas y no de la

concentración total de cada uno de los componentes de las mismas (Levi et

al. 2000). Por este motivo, representamos los datos de las figuras 6.1A y

6.1B como una función de la fracción molar de fosfolípidos en la fase

micelar (figura 6.2). Dada la baja concentración micelar crítica de estas

especies (~0.5 nM para DPPC (Tanford 1980) y ~10 µM para C12E10

(Sharma y Rakshit 2004)) podemos considerar que en las concentraciones

de trabajo estas moléculas se encuentran formando mayoritariamente

micelas (la concentración de los monómeros libres es entre 2 y 3 órdenes

de magnitud menor). La figura 6.2 muestra que el conjunto de

experimentos realizados siguiendo uno u otro de los protocolos, puede ser

descripto mediante una única función. Esto nos indicaría que el

comportamiento observado está directamente relacionado con la

composición de la fase micelar y no con la concentración total de anfifilos

individuales.

117

Figura 6.2 Activación de

PMCA por DPPC. Los datos de la figura 6.1 se representan en función de la fracción molar de fosfolípidos (DPPC) en la fase micelar. La línea continua corresponde al ajuste de la ecuación 6.8 a los datos experimentales.

6.3 La activación de PMCA por fosfolípidos induce pequeños cambios estructurales

En la sección anterior presentamos resultados que indican que en un

sistema micelar cuya fracción molar en DPPC es 0.3, la actividad alcanzada

por PMCA es máxima. Supusimos entonces que en estas condiciones la

proteína se encuentra mayormente en su conformación nativa, y que por lo

tanto el aumento de actividad podría deberse a cambios conformacionales

asociados al cambio en la composición del entorno del dominio

transmembrana.

Para analizar los posibles cambios conformacionales de PMCA

asociados a la activación inducida por fosfolípidos, exploramos su

organización estructural utilizando distintas técnicas espectroscópicas.

La estructura secundaria de las proteínas puede ser explorada

utilizando espectroscopía de dicroísmo circular en el UV lejano. Esta

técnica está basada en la absorción diferencial de luz circularmente

polarizada en un determinado sentido. Este fenómeno es producido por

moléculas con centros quirales o regiones que presenten asimetrías por su

propia complejidad estructural (como en el caso de las proteínas) (Kelly et

al. 2005). El enlace peptídico presenta absorción en el UV lejano por lo

que esta técnica permite al analizar esta región del espectro obtener señales

118

características de los motivos de estructura secundaria típicos de proteínas.

La figura 6.3A muestra que el espectro obtenido para la PMCA libre de

fosfolípidos es el característico de una proteína de membrana con

predominio de estructura de alfa-hélice (Ladokhin et al. 2010). El

agregado de DPPC no produjo cambios significativos en el espectro de CD

lo que sugiere que la activación por fosfolípidos no induciría grandes

cambios en la estructura secundaria de la proteína.

Para obtener información sobre el estado de las regiones hidrofóbicas

de la proteína utilizamos dos sondas fluorescentes: los residuos triptófano

intrínsecos de la proteína y la sonda extrínseca 1-anilino-8-

naftalensulfonato (ANS). Los residuos triptófano en proteínas de

membrana se encuentran preferencialmente en la interfase agua/membrana

(Yau et al. 1998), lo que permitiría detectar cambios en la estructura

terciaria de la proteína que afecten esta región. El espectro de

fluorescencia de la PMCA sin lípidos se encuentra centrado alrededor de

335 nm tal como se espera para proteínas de membrana plegadas

(Kozachkov y Padan 2011) y no presentó cambios significativos después

del agregado de DPPC (figura 6.3B). Esto indicaría que no se producen

cambios importantes en el entorno de los triptófanos incluidos en el

dominio transmembrana después del agregado de fosfolípidos. En estos

ensayos se mantuvo constante la concentración C12E10 en las muestras

siendo la única diferencia el agregado de DPPC.

Figura 6.3 Análisis espectroscópico de la activación de PMCA por fosfolípidos. PMCA purificada fue suplementada con C12E10 1.2 mM (línea naranja cortada) o con 1.7 mM DPPC/C12E10 de modo de obtener una fracción molar final de DPPC de 0.3 (conservando [C12E10] = 1.2 mM) (línea verde continua). Luego de 10 minutos de incubación a 25ºC se registraron los espectros de (A) dicroísmo circular y (B) fluorescencia intrínseca de triptofanos.

119

Para seguir explorando posibles cambios en los dominios hidro-

fóbicos de la proteína, decidimos utilizar fluorescencia de ANS. La sonda

fluorescente ANS ha sido ampliamente utilizada para el estudio de

transiciones conformacionales que involucren cavidades hidrofóbicas en

proteínas (Daniel y Weber 1966). No todas las proteínas en su estado

nativo tienen la capacidad de unir ANS (Cardamone y Puri 1992). Para el

caso de las proteínas de membrana, está reportado que esta sonda presenta

afinidad por los dominios transmembrana (Cattoni et al. 2008).

Espectroscópicamente, ANS presenta un marcado incremento en su

rendimiento cuántico y un corrimiento al azul al localizarse en un

microambiente hidrofóbico mientras que expuesto a solvente acuoso su

fluorescencia es muy baja. Estas características han hecho que la sonda

haya sido utilizada en estudios de plegamiento y desnaturalización de

proteínas como un reportero de motivos hidrofóbicos conservados en la

estructura (Roman et al. 2010) y para detectar los estados de glóbulo

fundido por los cuales la sonda tiene gran afinidad (Semisotnov et al. 1991;

Park et al. 2011).

Los parámetros que utilizamos para analizar posibles cambios

conformacionales en la proteína fueron la intensidad de fluorescencia

emitida por ANS y la transferencia de energía (FRET) entre triptofanos y

ANS.

La figura 6.4A muestra que la fluorescencia de ANS aumenta al

agregar DPPC a PMCA libre de lípidos. Sin embargo, ANS es una sonda

hidrofóbica que también aumenta su rendimiento cuántico de fluorescencia

al insertarse en el núcleo hidrofóbico de las micelas. En este caso, el

aumento de fluorescencia observado en la figura 6.4A podría estar

relacionado tanto con cambios conformacionales de la proteína como con

la inserción de la sonda en las micelas.

Para descartar esta segunda hipótesis, hicimos ensayos control en los

cuales registramos la fluorescencia de ANS en sistemas micelares de

idéntica composición a los utilizados previamente pero sin PMCA. Estos

controles mostraron que la intensidad de ANS no cambia

significativamente al variar la composición de las micelas y por lo tanto, el

aumento de la intensidad de ANS en presencia de la proteína reportaría

cambios conformacionales en la misma.

120

Figura 6.4 Fluorescencia de ANS en la activación de PMCA por fosfolípidos. Se prepararon 2 alícuotas de PMCA purificada. Una fue suplementada sólo con C12E10 1.2 mM (línea naranja cortada) y la otra con 1.7 mM de DPPC/C12E10 obteniéndose una fracción molar final de DPPC de 0.3 (conservando [C12E10] = 1.2 mM) (línea verde continua). Luego del agregado de 3 µM de ANS a ambas muestras, se incubaron por 10 minutos y se tomaron espectros de fluorescencia excitando a 380 nm (ANS, A) y a 295 nm (PMCA-ANS , B). El espectro de PMCA obtenido en ausencia de ANS se muestra como la línea azul cortada con puntos. Las eficiencias aparentes de transferencia de energía fueron 0.14 en presencia de lípidos y 0.07 en ausencia de lípidos. El volumen final y la concentración de proteína en todas las muestras fueron idénticos para evitar correcciones por dilución.

Otra herramienta espectroscópica de gran utilidad para el análisis

estructural de proteínas es la transferencia resonante de energía (FRET,

sección 3.2.1) entre triptofano y ANS (Daniel y Weber 1966).

Este enfoque adicional es particularmente útil para estudiar proteínas

de membrana insertas en micelas ya que las micelas libres conteniendo

moléculas de ANS pero no de proteína no presentan fluorescencia al excitar

a 295 nm. De este modo, es posible analizar espectroscópicamente un

fenómeno que sólo ocurre entre residuos triptófano de PMCA y moléculas

de ANS a una distancia del orden de los 24 nm (Togashi y Ryder 2008).

La figura 6.4B muestra el espectro de emisión de fluorescencia

obtenida para PMCA solubilizada en micelas de detergente en ausencia y

presencia de ANS. Se puede observar que el agregado de ANS produjo

una disminución en la fluorescencia de Trp por la existencia de FRET.

Posteriormente, el agregado de DPPC hasta una fracción molar de

0.3 que induce una máxima activación de PMCA (figura 6.2), produjo un

121

incremento en la fluorescencia máxima de ANS (pico a 475 nm)

concomitantemente con un descenso en la fluorescencia de triptófano (pico

a 335 nm) indicando una mayor eficiencia de FRET respecto a la proteína

solubilizada en micelas de detergente.

Este resultado indicaría que la distancia media entre los bolsillos

hidrofóbicos que unen ANS y los residuos Trp localizados en la interfase

agua/lípido disminuye tras el agregado de fosfolípidos. Además, la

presencia de DPPC induciría una conformación más compacta del dominio

transmembrana. Resultados en esta dirección fueron también reportados

mediante el uso de la sonda fotoactivable [125]TID-PC/16 (Mangialavori et

al. 2011) donde la activación de PMCA por ácido fosfatídico provocaría

una mayor compactación del dominio transmembrana.

6.4 Un modelo de dos etapas permite describir la activación de PMCA

En la sección 6.2, mostramos que el agregado de DPPC a PMCA

purificada y reconstituida en micelas de detergente produce un incremento

significativo en la actividad ATPasa. A continuación en la sección 6.3,

mostramos que, con el uso de diversas técnicas espectroscópicas, pudimos

detectar un cambio conformacional asociado al agregado de fosfolípidos.

El cambio detectado fue pequeño, lo que posiblemente se deba a que la

conformación de muy baja actividad en detergente presente muy alta

similitud estructural con la conformación nativa activada.

En la sección 1.4.1, mencionamos evidencias que apuntan a la

existencia de una población de anfifilos de movimiento restringido

rodeando la región transmembrana en proteínas de membrana (Marsh

2008). Teniendo en cuenta estos datos, postulamos un modelo en dos

etapas para explicar la activación de la proteína (figura 6.5).

Consideramos inicialmente la PMCA reconstituida en micelas de

detergente; al agregar fosfolípidos, éstos particionan hacia la fase micelar y

entran en contacto con la proteína al producirse el intercambio dinámico

entre las moléculas que se encuentran en la región transmembrana y las del

resto de la fase micelar. La primera etapa de nuestro modelo involucra

entonces esta reorganización de anfifilos en las micelas y el enriqueci-

122

miento de la región anular en fosfolípidos. La segunda etapa comprende el

cambio conformacional inducido en la región transmembrana que

posteriormente se transduce hacia el dominio catalítico de PMCA.

Para lograr una descripción cuantitativa de este modelo, decidimos

utilizar un modelo de adsorción de Langmuir (Atkins y Paula 2006).

Inicialmente definimos θDPPC como la fracción de superficie transmembrana

cubierta por DPPC.

Figura 6.5 Representación esquemática del modelo de activación de PMCA en dos

etapas. El esquema muestra la transición entre estados de baja y alta actividad de PMCA. En la primera etapa la enzima selecciona un microentorno lipídico particular entre los anfifilos disponibles a partir de su afinidad relativa. La interacción de la proteína con fosfolípidos específicos induce, en una segunda etapa, un cambio conformacional en la región transmembrana que posteriormente se propaga hacia el dominio catalítico.

DPPCnúmero total de sitios ocupados por DPPCθ

número total de sitios de contacto para fosfolípidos (6.1)

En la figura 6.2, mostramos que expresar los resultados de las

medidas de actividad ATPasa de PMCA en función de la fracción molar,

permite integrar los resultados de experimentos hechos a diferentes

concentraciones de fosfolípidos y detergente. Se puede demostrar que θDPPC

se relaciona con la fracción molar de DPPC (XDPPC,mic) (Levi et al. 2003)

como muestra la ecuación 6.2:

, ,DPPC

, , ,

Xθ

X 1 X

ex DPPC DPPC mic

ex DPPC DPPC mic DPPC mic

K

K

(6.2)

123

En esta expresión se introduce la constante de intercambio Kex,DPPC

que resulta de la combinación de los coeficientes de adsorción y desorción

de los anfifilos a la región transmembrana (kad y kd respectivamente,

ecuación 6.3):

12 10

12 10

, ,,

, ,

ad DPPC d C E

ex DPPC

d DPPC ad C E

k kK

k k

(6.3)

Por lo tanto, Kex,DPPC da una medida de la afinidad relativa de DPPC

respecto a un anfifilo de referencia (en este caso C12E10), por la superficie

hidrofóbica transmembrana de la proteína.

La constante く es un coeficiente estequiométrico para el intercambio

fosfolípidos/detergente que toma un valor de 2 para los anfifilos empleados

en este estudio (Levi et al. 2003).

Es posible medir con precisión la constante de intercambio KEX entre

fosfolípidos y detergentes. Se puede utilizar un ensayo basado en FRET

con una sonda fluorescente de fosfatidilcolina marcada con pireno (1-

hexadecanoil-2-(1-pirenodecanoil)-sn-glicero-3-fosfocolina, HPPC) que

permite monitorear indirectamente el intercambio entre fosfolípidos no

marcados y detergente. Esto requiere trabajar en condiciones tales que la

sonda se encuentre en trazas de modo tal de no contar con más de 1

molécula de HPPC por micela (Levi et al. 2003; Loura et al. 2010). La

figura 6.6A muestra espectros de fluorescencia de PMCA obtenidos en

ausencia y presencia de HPPC.

124

Figura 6.6 Determinación de la constante de intercambio entre DPPC y C12E10.

(A) Espectros de fluorescencia por excitación a 295 nm de PMCA purificada sin lípidos (línea azul a trazos), PMCA con HPPC (línea naranja a trazos) y PMCA-HPPC con DPPC/C12E10 en una fracción molar de 0.3 (línea verde continua). (B) Muestras de PMCA fueron suplementadas con DPPC hasta una fracción molar de: 0.34 (∆), 0.36 (●), 0.41 (■), 0.44 (□) y 0.48 (○). La intensidad de emisión de PMCA se registró luego de agregar cantidades crecientes de HPPC y mezclar por 1 minuto. Los valores de intensidad total se corrigieron por la dilución (<7%) causada por el agregado de la sonda. La proyección en dos dimensiones de la superficie de ajuste es la representación gráfica de la ecuación 6.4 con los parámetros de ajustes mostrados en la tabla 6.1

Se puede observar que el agregado de HPPC produce una

disminución significativa en la fluorescencia de triptofanos, indicando la

presencia de moléculas de HPPC a una distancia de los residuos triptofano

que permite la transferencia de energía. El subsiguiente agregado de DPPC

hasta una fracción molar que produce máxima activación de PMCA induce

un pequeño incremento en la fluorescencia de PMCA indicando una menor

eficiencia de FRET en esta última condición (figura 6.6A, línea verde).

La eficiencia de transferencia de energía aparente (Eap) medida en

distintas condiciones (figura 6.6B) está relacionada con la fracción molar

de HPPC (XHPPC,mic) y la de los fosfolípidos sin marcar (XDPPC,mic) como

(Levi 2003):

,

, , ,

1 XX 1 X

DA

D

FRET HPPC mic

ex DPPC DPPC mic DPPC mic

F

F KE

(6.4)

125

donde FD y FDA representan la intensidad de fluorescencia de Trp en

ausencia o presencia de la sonda HPPC respectivamente, y ξ representa un

parámetro específico del par proteína/sonda.

La constante de intercambio entre DPPC y C12E10 puede

determinarse ajustando la ecuación 6.4 a los datos experimentales de la

figura 6.6B. El valor obtenido (1.4 ± 0.4) indica que la afinidad de DPPC

por la superficie transmembrana es aproximadamente un 50% mayor que la

del detergente.

Como consecuencia de la afinidad preferencial de la región

transmembrana por un tipo de anfifilo, la composición de la monocapa que

la rodea adquiere una composición distinta a la de las micelas. La

composición de este microentorno efectivo sensado por la proteína, puede

ser caracterizada para un dado valor de la constante de intercambio Kex

utilizando la ecuación 6.2, que vincula éstos parámetros físicos con la

proporción cubierta por fosfolípidos. La figura 6.7 muestra la dependencia

de la cobertura fraccional de la superficie transmembrana en función de la

fracción molar de fosfolípidos para distintos valores posibles de afinidad

relativa (Kex). Esta figura muestra que existe una relación sigmoidal entre

la composición de la monocapa y la composición micelar. Esto podría

Figura 6.7 Dependencia de la cobertura fraccional de la superficie hidrofóbica

transmembrana de PMCA de la fracción molar de fosfolípidos. Valores simulados de cobertura fraccional de la superficie transmembrana por fosfolípidos (θPL) que se obtuvieron para todo el rango de composición micelar usando la ecuación 6.2 y los valores de Kex indicados en la figura. El coeficiente estequiométrico se asumió con un valor de 2. La línea naranja corresponde al valor de Kex determinado en este trabajo para el intercambio DPPC/C12E10.

126

explicar el efecto cooperativo que se observa en la figura 6.2. Sin

embargo, se puede notar que el carácter sigmoidal de la activación por

fosfolípidos se mantiene presente aún cuando la actividad se representa

como una función de la cobertura fraccional de la superficie

transmembrana de PMCA por fosfolípidos (figura 6.8), indicando que ésta

sería una propiedad intrínseca del efecto de activación por fosfolípidos.

Figura 6.8 Actividad ATPasa y su dependencia con la cobertura fraccional del

segmento transmembrana. Los datos de la figura 6.2 se representan en función de la composición de la monocapa lipídica obtenida de la figura 6.6. La línea continua es la representación del ajuste de la ecuación 6.7 a los datos experimentales.

Una de las ecuaciones empíricas posibles para describir

fenomenológicamente este tipo de comportamiento es una ecuación

logística diferencial (Reed y Berkson 1928):

0 11 0

cdAA A A A

d A A (6.5)

En esta ecuación A representa la actividad catalítica medida para

PMCA mientras que A0 y A1 son las asíntotas mínimas y máximas

respectivamente. El parámetro cθ representa un coeficiente empírico de

cooperatividad relacionado con el cambio relativo más pronunciado en la

actividad enzimática. La pendiente máxima se alcanza cuando A = (A1-

127

A0)/2, es decir a la mitad de la máxima activación. La composición de la

monocapa en este punto la expresamos como θ0.5.

Se puede deducir a partir de la ecuación 5 que:

0.5

1 0

4 d Ac

d A A

(6.6)

En los términos de nuestro modelo, este parámetro da una medida de

la eficiencia del paso de transducción involucrado entre el sensado del

ambiente fosfolipídico por la PMCA y la catálisis enzimática.

Integrando la ecuación 6.5 se obtiene:

0.5

1 00

1c

A AA A

e (6.7)

Esta ecuación nos permite describir la actividad ATPasa obtenida

experimentalmente con el grado de cobertura del segmento transmembrana

inferido a partir de la medición de Kex,DPPC mediante el ensayo de FRET. Si

reemplazamos la ecuación 6.2 en la ecuación 6.7:

, ,0.52

, , ,

1 00

X

X 1 X1

ex DPPC DPPC mic

ex DPPC DPPC mic DPPC mic

Kc

K

A AA A

e

(6.8)

La ecuación 6.8 describe directamente la relación entre la actividad

catalítica de PMCA y la composición de la fase micelar donde la enzima ha

sido reconstituida. El parámetro Kex,DPPC juega un rol importante en este

modelo porque permite vincular los experimentos de actividad ATPasa

mostrados en las figuras 6.2 con la afinidad relativa de los lípidos por el

segmento de transmembrana (Figura 6.6B).

El modelo propuesto nos permite explicar la actividad medida a

partir del intercambio DPPC/C12E10 que se produce a nivel microscópico.

Para tener una buena estimación de los parámetros del modelo

realizamos un ajuste global de las ecuaciones 6.4 y 6.8 usando el conjunto

completo de datos experimentales presentados en el estudio (Tabla 6.1).

128

La línea continua de la figura 6.2, y la proyección bidimensional de

la fígura 6.6B muestran que el modelo describe con precisión el conjunto

de experimentos independientes realizados. Además, los residuales del

ajuste fueron pequeños y aleatoriamente distribuidos (figura 6.10)

confirmando que el modelo propuesto se ajusta satisfactoriamente a los

datos experimentales.

Tabla 6.1: Parámetros del modelo estimados por ajuste global

Parámetro Valor

A0 1.1 ± 0.9 たmol Pi · mg prot-1 · min-1

A1 12.8 ± 0.8 たmol Pi · mg prot-1 · min-1

し0.5 0.16 ± 0.02 たmol Pi · mg prot-1 · min-1

cし 15 ± 4

Kex,DPPC 1.4 ± 0.5

ξ 51 ± 10

Figura 6.10 Distribución de residuales luego del ajuste global del modelo de dos

etapas. Las diferencias entre los datos experimentales y los valores ajustados secalcularon para (A) la actividad ATPasa, (Fig. 6.2) y (B) para la eficiencia aparente de transferencia de energía (Fig. 66B).

Los resultados obtenidos por el ajuste del modelo muestran que

DPPC aumenta aproximadamente en un orden de magnitud la actividad

ATPasa registrada en micelas de detergente. A su vez, cuando el 16% de la

superficie transmembrana se encuentra cubierta por DPPC, la actividad ya

ha alcanzado la mitad de la máxima activación posible (figura 6.8). El

coeficiente empírico de cooperatividad indica que el incremento de un 4%

en la cobertura de DPPC se traduce en un incremento del 15% de la

actividad ATPasa.

129

6.5. Un modelo mínimo para describir el efecto de los fosfolípidos sobre la actividad enzimática de proteínas integrales de membrana

Uno de los objetivos del modelo presentado en la sección anterior, es

poder obtener una herramienta de análisis de la activación de proteínas de

membrana por fosfolípidos. Es necesario entonces que este análisis pueda

extenderse al uso de otros fosfolípidos y a otras proteínas de membrana.

Sin embargo, no siempre se tiene la posibilidad de efectuar mediciones de

la afinidad relativa de fosfolípidos por el dominio transmembrana de una

proteína. Es por eso que en esta sección planteamos un modelo que no

incluya parámetros microscópicos como KEX, pero que permita de todas

maneras hacer un análisis comparativo a partir de medidas de actividad.

Por lo tanto, para este modelo mínimo, podemos encarar el análisis

de la modulación de la actividad enzimática de PMCA u otras proteínas de

membrana a través de un modelo de activación concertado: una única etapa

que relacione la fracción molar de las micelas en que está reconstituida la

proteína y la actividad biológica medida. De este modo se puede tener un

modelo alternativo y simplificado para estudiar simplemente el efecto de

activación por fosfolípidos.

Este modelo debería incluir la misma información que el modelo de

dos etapas, pero en un nuevo conjunto de parámetros. En este caso,

podemos utilizar nuevamente una función logística para describir el efecto

de activación observado (ecuación 6.9) pero ahora siendo la actividad una

función de XDPPC:

0.5

1 00X X

1 DPPCxc

A AA A

e

(6.9)

donde X0.5 representa la fracción molar de fosfolípidos que produce la mitad

de la máxima activación, y cx el coeficiente empírico de cooperatividad

relacionado con la máxima pendiente en el gráfico de la figura 6.2. Ajustar

130

la ecuación 6.9 a los datos experimentales permite obtener los valores de

estos nuevos parámetros (Tabla 6.2).

Tabla 6.2: Parámetros obtenidos del ajuste del modelo mínimo a los datos

experimentales

Parámetro Valor

A0 1.6 ± 0.6 たmol Pi · mg prot-1 · min-1

A1 13 ± 1 たmol Pi · mg prot-1 · min-1

X0.5 0.12 ± 0.01

Cx 26 ± 6

Para explorar la relación entre los parámetros del modelo mínimo y

los del modelo de dos etapas, se efectuaron una serie de simulaciones de

datos de actividad usando la ecuación 6.8 mientras se variaba el valor de

uno de los parámetros cada vez. Luego, la ecuación 6.9 se ajustaba a cada

serie de datos simulados y se obtenían los valores del modelo mínimo.

Finalmente, estos parámetros del modelo mínimo se graficaron en función

del parámetro del modelo de dos etapas que estaba siendo evaluado (figura

6.11).

Se puede observar que cuando se mantienen constantes los

parámetros correspondientes a la segunda etapa (cし y θ0.5) tanto cx como X0.5

son dependientes del valor de Kex,DPPC (figuras 6.11 A y B). Es interesante

observar que cx muestra una dependencia lineal con Kex,DPPC indicando que

en esta situación la pendiente máxima de la curva de activación da una

medida de la afinidad de los fosfolípidos por la superficie transmembrana

de la proteína. Por otro lado, cuando el parámetro que caracteriza la

primera etapa (Kex,DPPC) se mantiene constante, cx muestra una dependencia

cuasi-lineal respecto a cθ (figura 6.11 F) y X0.5 respecto a θ0.5 (figura 6.11C).

Las dependencias cruzadas (figura 6.11 D y E) fueron de pequeña

magnitud.

131

Figura 6.11: Relación

entre los parámetros del

modelo mínimo y del de

dos etapas. Los datos de actividad fueron simula-dos numéricamente para fracciones molares de fosfolípidos en el rango 0-1 usando la ecuación 6.8 y diferentes valores de parámetros comenzando por los indicados en la tabla 1. Solo un pará-metro se modificó en cada rueda de simulación: Kex

(A y B), θ0.5 (C y D) y cθ (E y F). Luego se ajustó la ecuación 6.9 a los valores simulados y los valores que dieron mejor ajuste de X0.5 (A, C y E) y cx (B, D y F) fueron graficados en función del parámetro del modelo de dos etapas explorado en cada serie.

6.6 Conclusiones

Hemos podido ver que el agregado de fosfolípidos, en este caso

particular DPPC, a una preparación de PMCA solubilizada en micelas de

detergente C12E10 produce un incremento en la actividad enzimática de la

proteína. Mediante técnicas espectroscópicas, pudimos detectar un sutil

cambio conformacional en las regiones hidrofóbicas de la proteína asociado

con esta activación. A partir del conocimiento de la existencia de una

monocapa de anfifilos de movilidad restringida en contacto con la proteína,

postulamos un modelo de 2 pasos.

132

En el primer paso, los anfifilos que componen las micelas se

redistribuyen de acuerdo a su afinidad diferencial por la región transmem-

brana. Este proceso genera un microentorno lipídico específico con una

composición diferente a la del resto de la fase micelar. El modelo

contempla como parámetro clave en esta primera etapa la afinidad relativa

de los fosfolípidos respecto al detergente por el segmento transmembrana

de la proteína. Ésta afinidad pudo estimarse utilizando una técnica basada

en FRET lo cual permitió unir la interpretación microscópica con la

macroscópica del modelo.

En el segundo paso del modelo, la interacción de estos fosfolípidos

con la proteína produce un sutil cambio conformacional en la región

transmembrana que se propaga hacia el dominio catalítico y produce la

activación.

También postulamos un modelo simplificado, concertado, que puede

explicar los datos experimentales sin tener en cuenta de manera directa la

afinidad relativa de los fosfolípidos.

133

6.7 Referencias Atkins, P. y J. d. Paula (2006). Physical Chemistry. New York, WH Freeman and Company.

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135

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Capítulo 7

Modulación de la actividad

enzimática de PMCA por las

propiedades biofísicas del

sistema micelar

7.1 Introducción

En el capítulo 1 mencionamos que la naturaleza del entorno lipídico

de una proteína de membrana puede modular su actividad enzimática.

En el capítulo anterior demostramos que la actividad de PMCA es

dependiente de la composición del sistema micelar. Postulamos un modelo

de dos etapas a partir de las observaciones realizadas en los ensayos de

actividad enzimática, de la información estructural obtenida por técnicas

espectroscópicas y de la afinidad relativa cuantificada de DPPC por el

entorno transmembrana respecto al detergente C12E10.

El presente capítulo abordará la relación entre las propiedades

biofísicas características del sistema micelar y la actividad de PMCA.

7.2 La actividad ATPasa de PMCA disminuye en sistemas micelares enriquecidos en lípidos

En el capítulo anterior analizamos la relación entre la actividad

ATPasa de PMCA y la composición de las micelas en las que se encuentra

reconstituida y describimos su comportamiento con un modelo empírico

137

basado en una ecuación logística (figura 6.2). En dichos ensayos

exploramos un rango limitado de concentraciones relativas de lípido/de-

tergente ya que este rango es el que frecuentemente se utiliza en los

ensayos biológicos.

Junto con la Bioq. María Florencia Pignataro del grupo del Dr. Juan

Pablo Rossi, decidimos explorar la variación de la actividad ATPasa de

PMCA en un rango más amplio de fracción molar de DPPC. Además,

ensayamos los efectos de un segundo lípido DMPC una fosfatidilcolina con

14 carbonos de largo de cadena en vez de los 16 de DPPC. Estos ensayos

se efectuaron incubando la PMCA reconstituida en micelas de C12E10,

forma en la que se obtiene tras el proceso de purificación, con soluciones

de micelas mixtas de fosfolípidos y detergente de una fracción molar

determinada. Estas soluciones se preparan a partir del agregado de C12E10 a

una solución stock compuesta por 560 µM de lípidos y 240 µM de

detergente (XFL = 0.7), de modo tal de disminuir su fracción molar de

fosfolípidos hasta el valor deseado.

La figura 7.1 muestra la dependencia de la actividad ATPasa con la

fracción molar de fosfolípidos (XFL) para ambos fosfolípidos.

Parámetro DMPC DPPC

A0 (µmol Pi mg prot-1 min-1) 0.3 ± 1.3 1.8 ± 1.1

A1 (µmol Pi mg prot-1 min-1) 34 ± 2 21.7 ± 1.3

X0.5 0.08 ± 0.01 0.07 ± 0.01

Cx 32 ± 3 40 ± 6

Figura 7.1 Actividad ATPasa en

función de la fracción molar de

fosfolípidos en la fase micelar.

PMCA purificada reconstituida en 7.5 mM de C12E10 fue suplementada con micelas mixtas de fosfolípido y C12E10 hasta alcanzar fracciones molares entre 0 y 0.6 para DPPC () y entre 0 y 0.7 para DMPC () antes de la medición de actividad ATPasa. Las curvas muestran el ajuste al modelo mínimo propuesto en la sección 6.5. La tabla indica los valores obtenidos para los parámetros.

138

En estos experimentos ampliamos el rango de fracción molar de

fosfolípidos hasta 0.7. En la figura se muestra el ajuste del modelo

mínimo propuesto en la sección 6.5 a los datos experimentales obtenidos en

presencia de DPPC o DMPC correspondientes a fracciones molares de

fosfolípidos menores que 0.3. En ambos casos pudimos verificar que a

partir de XFL ~ 0.3-0-35, la actividad ATPasa comienza a disminuir

mientras que el modelo matemático ajustado en la región rica en

detergentes predice que debería permanecer constante (línea de trazos en la

figura 7.1).

Dado que al variar XFL entre 0 y 1 en un sistema binario de

fosfatidilcolina y detergente C12E10, el comportamiento del sistema presenta

una transición desde micelas puras de detergente hasta liposomas de

fosfatidilcolina (Heerklotz et al. 1995), postulamos como primera hipótesis

que dicha transición estaría involucrada en la pérdida de actividad

observada a altas XFL.

Por lo tanto decidimos estudiar las propiedades biofísicas del sistema

micelar utilizado. Como primera aproximación, realizamos estos ensayos

utilizando el lípido DMPC ya que la PMCA mostró un comportamiento

similar en los dos sistemas micelares ensayados.

7.3 Efectos de la transición micela-vesícula sobre la actividad ATPasa de PMCA

Una posible hipótesis para explicar la menor actividad observada a

altos valores de XFL, es que ésta sea consecuencia de la formación de

vesículas. Si la proteína queda inserta en una vesícula, puede presentar el

dominio catalítico expuesto hacia la solución o hacia el lumen de la

vesícula (figura 7.2). En principio, consideramos estas opciones como

equiprobables ya que no existen datos bibliográficos para postular una

orientación preferencial.

139

Figura 7.2 Esquema de las orientaciones posibles de una molécula de PMCA

inserta en una vesícula lipídica. La PMCA se representa con el dominio citoplasmático (ovalo) orientado hacia el lumen (izquierda) o exterior de la vesícula (derecha).

En el caso en que el dominio catalítico se encuentra orientado hacia

la solución, la ATPasa transporta a los iones Ca2+ hacia el interior de la

vesícula hasta que el potencial electroquímico generado impida que

continúe el ciclo catalítico. Por otro lado, si el dominio catalítico se

encuentra orientado hacia el lumen, la PMCA no puede tener acceso a este

sustrato y por ende no presentar actividad ATPasa

Como consecuencia de ambas situaciones, la actividad observada

sería menor a la esperada en el caso de micelas, condición en la cual no

hay acumulación posible de iones Ca2+ ni limitaciones en la fuente de ATP.

Para evaluar esta hipótesis, realizamos un ensayo de actividad en

presencia del ionóforo de Ca2+ A23187. Este ionóforo aumenta la

permeabilidad al Ca2+ de las vesículas (Reed y Lardy 1972) por lo cual

evitaría la inactivación de la enzima causada por la acumulación de Ca2+.

La figura 7.3 muestra que el ionóforo no logró revertir la caída de actividad

registrada a alta fracción molar de fosfolípidos (incluso utilizando altas

concentraciones del mismo) sugiriendo que la pérdida de actividad no es

producto de la inserción de la PMCA en vesículas.

140

Figura 7.3. Actividad ATPasa de PMCA en presencia del ionóforo de Ca2+

A23187. Se midió actividad ATPasa de PMCA en un sistema DMPC/C12E10 a fracciones molares de 0.2 y 0.7 en presencia de las concentraciones indicadas de ionóforo de Ca2+.

Además, el agregado del ionóforo mostró un leve efecto de

inactivación dependiente de la concentración a XDMPC = 0.2 lo que daría una

diferente relación de actividad entre estas fracciones molares.

7.4 Caracterización de la transición micela-vesícula del sistema PC-C12E10

Para poder obtener información sobre las especies presentes en

nuestro sistema usamos las técnicas de dispersión estática de luz (SLS),

calorimetría de titulación isotérmica (ITC) y espectroscopía de correlación

de fluorescencia (FCS). SLS y FCS proveen datos sobre el tamaño de las

partículas en el sistema mientras que ITC informa sobre el calor

intercambiado al cambiar la composición del sistema micelar.

141

7.4.1 Dispersión estática de luz

La dispersión de luz a una determinada longitud de onda es

directamente proporcional al tamaño de las partículas presentes en la

solución (Xu 2002). Dado que al producirse la transición micelavesícula

es de esperar que se produzca un incremento en la dispersión de luz,

decidimos estudiar dicho proceso midiendo la dispersión de luz al variar

la composición del sistema. Lamentablemente, no nos es posible utilizar la

técnica de dispersión dinámica de luz (DLS) en nuestras condiciones de

trabajo por las bajas concentraciones de anfifilos que utilizamos (Schärtl

2007).

Con el fin de detectar el rango de XFL en el cual se produce dicha

transición, preparamos soluciones micelares de lípidos y detergentes en

idénticas condiciones a las utilizadas en los ensayos de actividad

enzimática pero en ausencia de PMCA. Determinamos la dispersión

estática de luz en cada una de las muestras utilizadas como se describe en

la sección 5.9.3. La figura 7.4 muestra un incremento leve de la dispersión

de luz a partir de XFL del orden de 0.25-0.3 y que este efecto se vuelve más

pronunciado a partir de XFL ~ 0.6. La región entre 0.8 y 1 no fue explorada

en este ensayo dado que en los ensayos enzimáticos, las mezclas de distinta

fracción molar se preparan a partir de una solución stock de XFL = 0.7 y

luego se agrega el detergente necesario para llegar a la XFL deseada.

Figura 7.4 Dispersión estáti-

ca de luz del sistema micelar

PC-C12E10. Se prepararon sis-temas micelares de DPPC () y DMPC () como se des-cribió en la sección 7.1 pero omitiendo el agregado de PMCA y se midió la dispersión estática de luz de las mismas a 470 nm.

142

Este resultado cualitativo nos llevó a buscar una mejor

caracterización del sistema micelar.

Mediante el uso de ITC medimos el calor liberado o absorbido por el

sistema en la transición. Por otro lado, aplicando FCS, analizamos la

variación del radio hidrodinámico promedio (Rh) de las partículas que

componen el sistema.

7.4.2 Calorimetría de titulación isotérmica

La calorimetría de titulación isotérmica (ITC) es una técnica de

referencia para el estudio de interacciones entre moléculas o agregados

moleculares (Freire et al. 1990). Permite conocer el calor liberado o

absorbido por el sistema (celda) tras el agregado de una cantidad conocida

de solución (inyectante).

Para profundizar nuestra caracterización del sistema micelar,

preparamos un sistema de vesículas unilamelares grandes (LUVs) de

DMPC siguiendo el protocolo descripto en Materiales y Métodos (sección

5.8) que provee una población homogénea de vesículas esféricas de ~100

nm de radio. Esto nos permite titular vesículas con detergente de modo de

explorar la transición en el sentido vesícula micela. Para poder cubrir el

rango completo de relaciones molares lípido:detergente, titulamos LUVs de

DMPC con detergente C12E10 y recíprocamente titulamos micelas de C12E10

con LUVs de DMPC. Dado que la temperatura de transición gel-líquido

cristalino de DMPC es 23ºC, este ensayo se realizó a 28ºC con vesículas en

fase líquido cristalina.

Las figuras 7.5A y B muestran las trazas calorimétricas obtenidas en

las titulaciones, indicando la relación molar de C12E10 respecto a DMPC y

viceversa. El eje de las ordenadas muestra la potencia aplicada por el

calorímetro para mantener la temperatura constante. La integración de esas

trazas permite obtener el calor absorbido o liberado en cada inyección de

titulante (figuras 7.5C y D) (Heerklotz et al. 2009)

143

La figura 7.5C muestra en las primeras inyecciones de C12E10 una

primera etapa endotérmica asociada a la incorporación de detergente a las

LUVs (I). A continuación se observa un abrupto cambio en el calor

intercambiado por el sistema al disminuir XFL hasta 0.9. Esta caída abrupta

en el calor de titulación es típica del comienzo de la solubilización de las

vesículas (Heerklotz et al. 2009) (II) . Entre fracciones molares de 0.85 y

0.65 aproximadamente, el sistema presenta una etapa exotérmica

característica de la creciente solubilización de las vesículas por el

detergente. En este rango, coexisten en equilibrio vesículas mixtas, micelas

Figura 7.5 Interacciones entre DMPC y C12E10 exploradas por calorimetría de

titulación isométrica (ITC) a 28ºC. (A) Trazas calorimétricas de la titulación de vesículas de DMPC 3mM (celda) con 35 mM de detergente C12E10 (inyección) (B) Trazas de la titulación de 0.5 mM C12E10 con vesículas de DMPC 5 mM (C y D) Calor intercambiado determinado para los experimentos descriptos en A(C) y B(D) en función de la fracción molar de DMPC. Las líneas punteadas indican las regiones descriptas en el texto.

144

mixtas y monómeros de detergente (III). Finalmente, a partir de XFL =

0.65 la variación en la cantidad de calor absorbida por el sistema se vuelve

más pequeña y constante, correspondiendo esto a la mezcla de micelas

mixtas (celda) con micelas de detergente (IV).

Este comportamiento nos permite definir los rangos de fracción

micelar en que el sistema presenta principalmente vesículas, la fase de

coexistencia y la fase micelar donde las vesículas se han solubilizado por

completo por efecto del C12E10. La figura 7.5D muestra que al titular el

detergente con vesículas se produce un intercambio de calor asociado a la

solubilización de las vesículas al ponerse en contacto con una solución rica

en detergente. Sin embargo no se observan cambios abruptos de pendiente,

indicando que el sistema conserva su estructura micelar en este intervalo.

7.4.3 Espectroscopía de Correlación de Fluorescencia

Para estudiar los cambios en el radio hidrodinámico de la población

de vesículas y micelas mixtas durante las transiciones definidas en la

sección anterior, utilizamos la técnica de FCS (revisada en Digman y

Gratton (2011)). Cómo mencionamos en la introducción, esta técnica se

basa en el análisis de correlación de las fluctuaciones en la intensidad de

fluorescencia producida por las partículas fluorescentes que atraviesan un

pequeño volumen de observación (en el orden de pocos femtolitros)

generado mediante microscopía confocal o de excitación multifotónica.

En este caso utilizamos la técnica de point-FCS en la que se enfoca un

punto de la muestra y se registran las fluctuaciones (figura 7.6).

145

Figura 7.6 Espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS). (A) Represen-tación esquemática de un microscopio confocal. Se observa un corte del volumen de observación y partículas fluorescentes que lo atraviesan por difusión (B) Ejemplo de traza de intensidad en función del tiempo registrada en un experimento de correlación. El tránsito de las moléculas a través del volumen confocal produce fluctuaciones en esta traza. (C) Curva de autocorrelación obtenida a partir de las fluctuaciones. kDrepresenta el tiempo medio de residencia en el volumen confocal Adaptado de Chiantia et al. (2009).

Estas fluctuaciones son analizadas calculando la función de

autocorrelación la cual se define como:

2

F t F tG

F t

(7.1)

Donde ( )F t F t F t representa la fluctuación a tiempo t y τ

un intervalo de tiempo.

Para el caso de difusión pasiva, se ha demostrado que la curva de

correlación sigue la siguiente función:

1

21 2

0

0

1 1D D

wG

N z

(7.2)

Donde N corresponde al número promedio de moléculas en el

volumen de observación y w0 y z0 son la cintura radial y axial de dicho

volumen, respectivamente. Al ajustar esta ecuación puede obtenerse el

tiempo medio de permanencia (kD) de una partícula en el volumen de

observación. El tiempo de residencia medio se relaciona con el radio del

146

volumen de observación y el coeficiente de difusión (D) de las partículas

fluorescentes como:

2

0

4D

w

D (7.3)

De esta forma, ajustando los datos experimentales con la ecuación

7.2 es posible obtener el valor del coeficiente de difusión de las especies

presentes en la muestra. Además, considerando partículas esféricas, se

puede relacionar el coeficiente de difusión con el radio hidrodinámico (Rh)

a través de la ecuación de Stokes-Einstein:

6h

kTR

D (7.4)

donde T la temperatura absoluta y さ la viscosidad.

Para realizar determinaciones por FCS es necesario calibrar

previamente el tamaño del volumen confocal. Para ello, generalmente se

realiza un experimento de FCS utilizando una solución de una molécula

patrón fluorescente de coeficiente de difusión traslacional conocido.

Efectuamos esta calibración utilizando dos sondas de distinto

coeficiente de difusión: Alexa 488 (435 µm2 s-1) y la proteína seroalbúmina

bovina marcada con isotiocianato de fluoresceína (BSA-FITC) (63 µm2 s-1)

para obtener una estimación más confiable del w0. Para ello, colocamos

una gota de la muestra sobre un cubreobjeto, enfocamos la misma,

seleccionamos un punto en la solución utilizando el programa del

microscopio confocal (Olympus FluoView 1.7a, Olympus, Japón) y

colectamos la intensidad en ese punto con una frecuencia de 125 kHz para

el caso de Alexa 488 y a 50 kHz para BSA-FITC. Los datos obtenidos se

procesaron con el programa SimFCS (Laboratory for Fluorescence

Dynamics, Irvine, EEUU). Las figuras 7.7A y 7.7B muestran un ejemplo

de una traza de intensidad obtenida en estos experimentos y las curvas

experimentales de autocorrelación. Los datos se ajustaron a un modelo de

difusión libre en 3 dimensiones (ecuación 7.2)

Como muestra la figura 7.7C, en el caso de Alexa 488 la difusión es

tan veloz, que es necesario utilizar una alta frecuencia de adquisición (>

200 kHz). Esto no es posible en nuestro equipo y por lo tanto, no llegamos

a observar el plateau inicial en la curva de correlación lo cual nos hace

dudar de la exactitud del ajuste. BSA al presentar una difusión más lenta,

permite obtener curvas de autocorrelación mejor definidas (figura 7.7D).

147

Para la caracterización del sistema de anfifilos, preparamos muestras

de distinta fracción molar de DMPC mezclando LUVs con la cantidad

adecuada de C12E10 y las incubamos en presencia de 10 nM de la sonda

Rodamina-DPPE. Como mencionamos en la sección 3.3.1.2, esta sonda

particiona fuertemente a las micelas o vesículas y por lo tanto actúa como

un marcador fluorescente de estas partículas de anfifilos. A continuación

efectuamos experimentos de point-FCS en estas muestras como

describimos anteriormente para las soluciones patrón. En este caso, las

frecuencias de adquisición de datos fueron de 25 y 10 kHz acorde a los

tiempos de difusión más lentos que caracterizaron a las micelas y vesículas,

respectivamente.

Figura 7.7 Calibración del radio (ω0) del volumen de observación. Se registraron durante 3 minutos las fluctuaciones en la fluorescencia de Alexa 488 (A) y BSA-FITC (B) y luego se obtuvieron las curvas de autocorrelación correspondientes para la sonda Alexa 488 (C) y para BSA-FITC (D).. Considerando un coeficiente de difusión de Alexa 488 en H2O a 25ºC de 435 µm2 s-1 (Petrášek y Schwille 2008) y de BSA en H2O a 25 ºC de 63 µm2 s-1 (Culbertson et al. 2002) , el ajuste a los datos permite obtener un valor de ω0 de 0.23 ± 0.01 µm.

148

La figura 7.8 muestra los resultados obtenidos para el sistema de

LUVs y C12E10 junto con gráficos de autocorrelación característicos de

distintos puntos de la curva.

A

B

Los resultados mostrados en la figura 7.8 muestran un incremento

del tamaño de las vesículas al disminuir XDMPC de 1 a 0.9. Esta población

de vesículas de mayor radio hidrodinámico que la preparación original

posiblemente se deba a la inserción de moléculas de detergente en las

vesículas, produciendo un incremento de tamaño en las mismas, pero sin

Figura 7.8 Transición de vesículas de DMPC a micelas mixtas. (A) Curvas de autocorrelación de FCS obtenidas para las fracciones molares de DMPC indicadas. (B) Radio hidrodinámico obtenido por FCS en función de la fracción molar de la muestra.

149

llegar a una concentración que las solubilice. Fenómenos de este tipo ya

han sido descriptos para este tipo de sistemas en los cuales vesículas puras

de fosfolípidos incrementan su tamaño en respuesta al agregado de

detergente hasta alcanzarse una concentración de saturación (Lichtenberg

et al. 2000). Posteriormente, se produce una disminución abrupta en el

tamaño de las partículas de 150 nm a 20 nm en el rango de fracción molar

de 0.9 a 0.7 que puede estar asociado a la solubilización de las vesículas y a

la generación de una población heterogénea de vesículas y micelas mixtas

coincidente con la fase de coexistencia micela-vesícula identificada por

ITC (figura 7.5C). Entre XDMPC de 0.65 y 0, el radio hidrodinámico se

mantiene prácticamente constante sugiriendo la solubilización total de las

vesículas. Como mencionamos previamente, estos resultados tienen muy

buena correspondencia con los obtenidos por ITC, en donde se detectaba

una transición abrupta en la titulación de DMPC con C12E10 a partir de una

XDMPC de 0.9, una fase de coexistencia y solubilización creciente y un

sistema sin transiciones abruptas a partir de XDMPC = 0.65.

Para reproducir las condiciones en las cuales realizamos los

experimentos de medición de actividad, realizamos medidas de FCS

siguiendo los mismos procedimientos utilizados para cambiar la relación

lípido/detergente en los ensayos de actividad descriptos en la figura 7.1.

Mediante FCS estudiamos el radio hidrodinámico de las especies

presentes en cada una de las soluciones en función de la fracción molar de

DMPC (Figura 7.9). La figura muestra que el comportamiento del sistema

en este experimento fue diferente al verificado en la Figura 7.8, dado que

observamos un incremento más gradual del radio hidrodinámico promedio

con la fracción de fosfolípidos.

150

Figura 7.9 Radio hidrodinámico de partículas en el sistema micelar utilizado para

mediciones de actividad. Se prepararon soluciones en las mismas condiciones en que se efectuaron los experimentos de actividad de las figuras 6.2 y 7.1 y se estimaron los radios hidrodinámicos por FCS.

Estos resultados pueden ser explicados considerando que la

preparación en este segundo experimento es posiblemente polidispersa en

comparación a la obtenida por el agregado de detergente a una población

homogénea de vesículas.

En la figura 7.10 presentamos los resultados mostrados en las figuras

7.1 y 7.9 para facilitar su comparación. La figura muestra que la actividad

llega a un plateau a XFL cercanas a 0.2-0.3. Aproximadamente en este

rango de fracciones molares se encontraría el punto de inflexión a partir del

cual se observa un crecimiento del tamaño de las especies micelares en el

sistema.

151

Figura 7.10 Actividad ATPasa de PMCA en DMPC y radio hidrodinámico de las

partículas del sistema micelar. La actividad ATPasa en micelas de DMPC y C12E10 y el radio hidrodinámico obtenido por FCS representados en un mismo eje horizontal. Las líneas son ajustes lineales a los datos para destacar el punto de inflexión de la curva de radio hidrodinámico.

7.4.4 Análisis de la fluidez del sistema micelar

Se ha reportado para la ATPasa de Ca2+ del retículo endoplasmático

(SERCA) que lípidos en fase gel disminuyen su actividad (Starling et al.

1995). Una posible hipótesis que podría explicar nuestros resultados

experimentales es que el plateau y consiguiente pérdida de actividad

verificada a altos XFL podrían ser explicados por una disminución brusca de

la fluidez de la membrana.

En la sección 3.3.3 describimos que se puede sensar el orden y

fluidez de membrana con el uso de la sonda Laurdan. Esta sonda puede

utilizarse en sistemas micelares para reportar la fluidez de las micelas y/o

vesículas. Los detergentes presentan por lo general una mayor fluidez y

por lo tanto el incremento de la fracción molar de fosfolípidos del sistema

puede disminuir esta fluidez en el entorno lipídico de la proteína.

152

Para evaluar esta hipótesis adicionamos la sonda fluorescente

Laurdan a soluciones micelares de composición similar a las utilizadas en

los experimentos de actividad descriptos en la sección 7.1. Como

mencionamos en el capítulo 3, esta sonda permite sensar la fluidez del

sistema de anfifilos en el cual se encuentra inserta a partir del análisis de la

posición del espectro de emisión utilizando para ello la función GP

(sección 3.3.3, ecuación 3.7). La figura 7.11 muestra los resultados

obtenidos para DMPC.

Figura 7.11 GP de Laurdan en sistemas micelares. Se prepararon mezclas de DMPC () con detergente C12E10 en las mismas condiciones que aquellas utilizadas para los ensayos de actividad y se agregó la sonda fluorescente Laurdan en una proporción sonda:lípido 1:800. La GP se calculó a partir de los espectros de emisión de Laurdan como indica la ecuación 3.7 Se incluye gráfico de actividad ATPasa en DMPC con fines comparativos.

Tal como esperábamos, la GP de Laurdan aumenta con la XDMPC

indicando una menor fluidez de las micelas a medida que se enriquecen en

fosfolípidos.

Se puede observar en la figura que, de manera similar a lo ocurrido

con la actividad ATPasa, el agregado de DMPC produce inicialmente una

disminución importante en la fluidez de las micelas pero a partir de una

XDMPC de 0.2-0.3 este cambio se vuelve menos pronunciado. Este resultado

153

combinado con la información obtenida por FCS e ITC, sugiere que la

actividad empieza a disminuir en un rango donde no habría transiciones

micela-vesícula (ITC) pero sí un aumento del radio hidrodinámico (FCS).

Esto nos lleva a formular la siguiente hipótesis: las micelas podrían estar

aumentando su tamaño formando una estructura que puede actuar como

una plataforma de menor fluidez donde se insertan las proteínas de

membrana. Los mecanismos asociados a esta disminución de actividad

podrían estar entonces asociados a las características estructurales de este

entorno, como puede ser la menor curvatura y un cambio en los perfiles de

presión lateral (sección 1.4.2).

Al evaluar la fluidez en membranas de eritrocitos preparadas como

se indica en la sección 5.1, obtuvimos un valor de GP de 0.45. Este es un

valor de orden en la membrana alto, pero son valores promedio de todas las

membranas en la muestra y no permiten resolver heterogeneidades que

puedan estar presentes. Es por esto que para poder obtener información en

sistemas de biomembranas que presenten coexistencia de fases, es

necesario utilizar técnicas de microscopía de fluorescencia y sistemas

modelo de biomembranas

7.5 Conclusiones

En este capítulo estudiamos la actividad ATPasa de PMCA en un

rango más amplio de fracción molar. Se pudo observar que la actividad

ATPasa presenta un valor máximo y luego comienza a disminuir a partir de

una cierta proporción entre fosfolípidos y detergentes. Utilizando diversas

técnicas biofísicas buscamos correlacionar la pérdida de actividad con

respecto a la transición micela-vesícula producida en el sistema DMPC-

C12E10 y elaboramos hipótesis acerca de cómo puede ese cambio en la

estructura del entorno lipídico afectar negativamente la actividad ATPasa

de PMCA. Los ensayos con ionóforo de Ca2+ mostraron que este

fenómeno no estaría relacionado con el llenado de vesículas y la

orientación de la inserción de la bomba en liposomas.

Estudiamos el sistema micelar en detalle y verificamos que la caída

de actividad correlacionaría con cambios en el tamaño de las micelas pero

no necesariamente con la disminución en la fluidez de las mismas.

154

7.6 Referencias Culbertson, C. T., S. C. Jacobson y J. Michael Ramsey (2002). "Diffusion coefficient measurements in microfluidic devices." Talanta 56(2): 365-373.

Chiantia, S., J. Ries y P. Schwille (2009). "Fluorescence correlation spectroscopy in membrane structure elucidation." Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 1788(1): 225-233.

Digman, M. A. y E. Gratton (2011). "Lessons in Fluctuation Correlation Spectroscopy." Annual Reviews of Physical Chemistry 62.

Freire, E., O. L. Mayorga y M. Straume (1990). "Isothermal titration calorimetry." Analytical Chemistry 62(18): 950A-959A.

Heerklotz, H., G. Lantzsch, H. Binder, G. Klose y A. Blume (1995). "Application of isothermal titration calorimetry for detecting lipid membrane solubilization." Chemical Physics Letters 235(5–6): 517-520.

Heerklotz, H., A. D. Tsamaloukas y S. Keller (2009). "Monitoring detergent-mediated solubilization and reconstitution of lipid membranes by isothermal titration calorimetry." Nature Protocols 4(5): 686-697.

Lichtenberg, D., E. Opatowski y M. M. Kozlov (2000). "Phase boundaries in mixtures of membrane-forming amphiphiles and micelle-forming amphiphiles." Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 1508(1–2): 1-19.

Petrášek, Z. y P. Schwille (2008). "Precise Measurement of Diffusion Coefficients using Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy." Biophysical Journal 94(4): 1437-1448.

Reed, P. W. y H. A. Lardy (1972). "A23187: A Divalent Cation Ionophore." Journal of Biological Chemistry 247(21): 6970-6977.

Starling, A. P., J. M. East y A. G. Lee (1995). "Effects of Gel Phase Phospholipid on the Ca2+-ATPase." Biochemistry 34(9): 3084-3091.

Xu, R. (2002). Particle Characterization: Light Scattering Methods, Kluwer Academic Publishers.

155

156

Capítulo 8

Análisis de fluidez de

biomembranas utilizando

microscopía confocal

8.1 Introducción

Uno de los objetivos de este trabajo de tesis es caracterizar las

interacciones de proteínas de membrana con su entorno lipídico, por lo que

decidimos abordar este estudio utilizando herramientas de espectroscopía y

microscopía que nos pudiesen brindar información adicional sobre el

entorno lipídico.

Cómo hemos mencionado en el capítulo 3, Laurdan es una sonda

fluorescente de elección para estudiar la organización dinámica de

biomembranas. Sin embargo, su máximo de excitación en el UV cercano y

su reducida fotoestabilidad, han hecho que su uso se haya visto restringido

a experimentos de espectroscopía de fluorescencia tanto en estado

estacionario como resueltos en el tiempo (Parasassi et al. 1998) con la

consiguiente pérdida de resolución espacial de los procesos en estudio o a

estudios de microscopía de fluorescencia por excitación por 2 fotones,

técnica extremadamente costosa e inaccesible para muchos laboratorios.

En este capítulo, evaluamos el desempeño de distintas sondas

fluorescentes sintetizadas más recientemente para ser empleadas en

experimentos de microscopía confocal.

157

8.2 Análisis del rendimiento de la sonda fluorescente di-4-ANEPPDHQ

En una primera instancia, decidimos probar el desempeño de la

sonda di-4-ANEPPDHQ (ANEP) la cual fue sintetizada recientemente por

(Jin et al. 2006) y que presenta un solvatocromismo del tipo del de Laurdan

pero con un espectro de excitación centrado a ~ 488 nm, lo cual la hace

atractiva para su uso en microscopía confocal.

Para estudiar la potencialidad de ANEP como sensor de cambios en

la organización lipídica, comparamos espectroscópicamente la capacidad

de dicha sonda en relación a la de Laurdan para sensar la transición de

fases de vesículas unilamelares pequeñas (SUVs, del inglés Small

Unilamellar Vesicles) de DPPC. Utilizamos este sistema lipídico sencillo

ya que las transiciones de fase inducidas por temperatura ya fueron

exhaustivamente caracterizadas por distintas técnicas (Koynova y Caffrey

1998).

El ensayo consistió en mezclar la sonda fluorescente con SUVs de

DPPC en una relación sonda:lípido de ~1:800 (0.4 mM de fosfolípidos y

0.5 µM de sonda) y luego incubar la muestra durante 40 min para

garantizar la completa partición de la sonda en las vesículas.

Posteriormente, la muestra se calienta y se registran espectros de

fluorescencia a intervalos regulares de temperatura. En este caso, se

tomaron espectros excitando la muestra a 356 nm (Laurdan) y a 488 nm

(ANEP), sus correspondientes máximos de absorción. La figura 8.1

muestra los resultados obtenidos para Laurdan. Como era de esperar, la

fluorescencia de la sonda presentó un marcado corrimiento al rojo con el

aumento de fluidez de las vesículas de DPPC inducido por el incremento de

temperatura. También se calculó y graficó la GP de Laurdan (sección

3.3.3) para cuantificar este corrimiento. Como mencionamos en el capítulo

3, GP es un parámetro ampliamente utilizado para cuantificar el

comportamiento espectral de Laurdan en membranas artificiales y naturales

Además hemos mencionado que GP da cualitativamente, una medida de la

contribución relativa de la emisión de las moléculas de sonda localizadas

en la fase más ordenada (centrada a 440 nm) y aquellas ubicadas en la

líquido cristalina (centrada a 490 nm).

158

La figura 8.1 muestra que la transición cooperativa de fase gel a

líquido cristalina de DPPC es claramente observable utilizando este

parámetro. De este modo pudimos comprobar que Laurdan presenta una

alta sensibilidad a los cambios en la solvatación en las cabezas polares de

los fosfolípidos durante la transición de fases gel a líquido cristalino tal

como se ha descripto en bibliografía.

Longitud de onda (nm)

420 440 460 480 500 520

Fluo

resc

enci

a L

aurd

an (

u.a.

)

0

200

400

600

800

1000

Temperatura (ºC)

30 40 50 60 70

GP

Lau

rdan

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

Longitud de onda (nm)

420 440 460 480 500 520

Fluo

resc

enci

a L

aurd

an (

u.a.

)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.025 ºC30 ºC35 ºC39 ºC40 ºC41 ºC42 ºC43 ºC50 ºC55 ºC60 ºC70 ºC

Temperatura (ºC)

30 40 50 60 70

Cen

tro

de m

asa

espe

ctra

l

452

456

460

464

468

472

476

La figura 8.2 muestra los resultados para un ensayo similar pero

realizado con la sonda ANEP en lugar de Laurdan. Lo primero que puede

apreciarse es que, en comparación con Laurdan, el corrimiento al rojo del

espectro de emisión fue despreciable.

Figura 8.1 Transición de fases en DPPC seguida por fluorescencia de Laurdan.

(A) y (B) Espectros obtenidos en función de la temperatura y espectros normalizados respectivamente. (C) Centro de masa espectral de Laurdan. Este parámetro se calculó como se indica en la sección 5.9.4.2 (D) GP de Laurdan. Es clara la magnitud del corrimiento espectral y la sensibilidad del parámetro GP para detectar la transición de fases.

159

Temperatura (ºC)

30 40 50 60 70

GP

(65

0/55

0)

0.64

0.66

0.68

0.70

0.72

0.74

0.76

Temperatura (ºC)

30 40 50 60 70

Cen

tro

de M

asa

Esp

ectr

al (

nm)

573.0

573.5

574.0

574.5

575.0

575.5

576.0

576.5

Temperatura (ºC)

30 40 50 60 70

Rel

ació

n fl

uore

scen

cia

650

nm /5

50 n

m (

u.a.

)

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

Longitud de onda (nm)

500 550 600 650 700

Fluo

resc

enci

a A

NE

P (

u.a.

)

0

100

200

300

40025 ºC30 ºC35 ºC39 ºC40 ºC41 ºC42 ºC43 ºC50 ºC55 ºC60 ºC70 ºC

Longitud de onda (nm)

500 550 600 650 700

Fluo

resc

enci

a A

NE

Pno

rmal

izad

a

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 25 ºC30 ºC35 ºC39 ºC40 ºC41 ºC42 ºC43 ºC50 ºC55 ºC60 ºC70 ºC

A B

C D

E

F

F

Figura 8.2 Transición de fases en DPPC seguida por fluorescencia de ANEP. (A) y (B) Espectros obtenidos en función de la temperatura y espectros normalizados respectivamente. (C) Centro de masa espectral de ANEP. (D) Relación entre las intensidades de fluorescencia determinadas a 650 y 550 nm. (E) Símil función de GP calculada para ANEP. (F) Resultados obtenidos en el trabajo original para vesículas de DPPC y colesterol. No pudimos reproducirlos en un sistema sencillo de referencia.

160

Para tratar de extraer mayor información de los espectros

calculamos los centros de masa espectrales, y la relación de intensidades

650/550 nm (Figura 8.2C y D). Ésta última relación es un parámetro

utilizado en la publicación original que, similarmente a GP, muestra la

relación entre la emisión detectada hacia el rojo con la detectada en la

región del verde; i.e una mayor relación 650/550 nm implicaría una mayor

fluidez en la membrana. También usamos un parámetro similar a GP de

Laurdan pero utilizando los valores de intensidad a 650 y 550 nm en lugar

de 440 y 490 nm ya que éstos son los máximos de emisión esperados para

ANEP en fase fluida o gel (Figura 8.2F).

La figura 8.2 muestra que no fue posible sensar la transición de fases

utilizando la sonda ANEP. Sorprendentemente, nuestros resultados

difieren de aquellos reportados en el trabajo original (Figura 8.2G) por

motivos que desconocemos.

A pesar de este resultado desalentador, decidimos ensayar si la sonda

podía ser utilizada como sensor de microfluidez lipídica en experimentos

de microscopía confocal. Con este fin, incubamos células de melanóforos

de Xenopus laevis en presencia de 5 µm de ANEP y las observamos en el

microscopio confocal en las condiciones descriptas en Materiales y

Métodos. Pudimos verificar que la fluorescencia de las células marcadas

con ANEP fue significativamente superior a la autofluorescencia de las

mismas (no mostrada).

Para evaluar si la sonda era capaz de sensar cambios en la fluidez,

agregamos cantidades crecientes del detergente Tritón X-100 al medio ya

que los detergentes incrementan la fluidez de las membranas biológicas. La

figura 8.3 muestra que desafortunadamente y tal como describimos para los

experimentos espectroscópicos, no pudimos detectar cambios apreciables

en la fluorescencia de la sonda utilizando bajas concentraciones de

detergentes. Sólo observamos un cambio espectral apreciable en presencia

de concentraciones de detergente que alteraron completamente la

morfología de las células evidenciando desprendimiento de vesículas y

desintegración de la membrana plasmática.

Estos ensayos muestran que no pudimos reproducir los resultados

publicados para la sonda di-4-ANEPPDHQ. Desconocemos cuales pueden

haber sido los motivos dado que los experimentos fueron muy básicos y

funcionaron a la perfección con la sonda Laurdan.

161

Figura 8.3 Tinción de células melanóforas de Xenopus con ANEP. Células melanóforas de Xenopus Laevis fueron teñidas con 5 µM de ANEP y posteriormente se adicionó el detergente Tritón X-100 al medio de incubación hasta las concentraciones indicadas en cada imagen. Para analizar el cambio en fluidez, se procesaron las imágenes tomadas en el canal centrado en 650 nm y las del canal centrado en 550 nm y se procesaron pixel a pixel con una ecuación similar a la de GP (sección 3.3.1.3). Cuando comenzaron a apreciarse cambios con 0.21 % de Tritón X-100, las células comenzaban a despegarse del sustrato y se verificaron cambios drásticos en la morfología celular.

8.3 Desempeño de una variante de la sonda fluorescente Laurdan: C-Laurdan.

En 2007, el grupo del profesor Bong Rae Cho, especialista en el

desarrollo de sondas para microscopía de 2 fotones publicó un trabajo (Kim

et al. 2007) donde describen la síntesis de una nueva sonda derivada de

Laurdan, denominada C-Laurdan.

Como se observa en la figura 8.4, la única diferencia entre esta nueva

sonda y Laurdan es un grupo carboxilo adicionado a uno de los metilos de

la amina del policiclo aromático naftaleno fluorescente. Este grupo fue

introducido en la molécula con la finalidad de otorgarle a la sonda una

162

mayor solubilidad en solventes acuosos con respecto a Laurdan y mejorar

la eficiencia de marcación de células y tejidos, proceso en el cual la sonda

se agrega directamente al medio de cultivo y requiere por lo tanto cierta

solubilidad en el mismo.

Figura 8.4 Laurdan y C-Laurdan. Estructura de las sondas fluorescentes Laurdan (arriba) y C-Laurdan (abajo). El grupo carboxilo adicionado brinda a la sonda mayor solubilidad y puede establecer interacciones adicionales en la interfase lípido – agua.

Estos autores demostraron que la solubilidad de C-laurdan es 30

veces mayor que la de Laurdan y que no tiene tendencia a formar

agregados en solución acuosa. Además, la cinética de partición en

liposomas o células sería más rápida que la de Laurdan.

Sorprendentemente, los autores verificaron que además de la mayor

solubilidad de la nueva sonda en solventes acuosos, C-Laurdan poseería

propiedades espectroscópicas mejoradas respecto a Laurdan. Los autores

caracterizaron esta sonda espectroscópicamente de manera exhaustiva y,

entre otros resultados, reportaron espectros de excitación con un

corrimiento al rojo respecto a Laurdan (max C-Laurdan = 380 nm, y max,

Laurdan = 356 nm). Los autores también verificaron que la sonda puede

ser utilizada en microscopía por excitación por 2 fotones y reportaron que

poseería mayor fotoestabilidad que Laurdan. También la sonda presentó

mayor sensibilidad a cambios de fluidez en sistemas lipídicos a través del

análisis de GP. Es decir, que C-laurdan presenta mayor diferencia entre los

espectros de emisión característicos de fases gel o líquido-ordenadas y

fases líquido cristalinas.

163

La mayor fotoestabilidad de la sonda y el corrimiento espectral de

su excitación al rojo sugieren que C-laurdan podría ser utilizado en

microscopios confocales utilizando como fuente de excitación un láser de

estado sólido de 405 nm, el cual es ampliamente utilizado en la mayoría de

los microscopios confocales comerciales.

8.4 C-Laurdan permite sensar transiciones de fase de fosfolípidos

Como primer paso para caracterizar el rendimiento de C-Laurdan,

decidimos utilizar la sonda para sensar cambios en el empaquetamiento

lipídico en un sistema simple y conocido. Con este fin, utilizamos el ya

mencionado sistema de vesículas de DPPC cuyas transiciones se

encuentran bien caracterizadas (Koynova y Caffrey 1998).

Realizamos experimentos similares a los descriptos en la sección 8.2,

pero incorporando en esta ocasión Laurdan o C-Laurdan en SUVs de DPPC

en una relación sonda:lípido de ~1:800 (0.4 mM de fosfolípidos y 0.5 µM

de sonda) y luego incubamos las muestras durante 40 min para garantizar la

completa partición de las sondas en las vesículas. Utilizando un

espectrofluorómetro con control de temperatura, tomamos espectros de

emisión excitando a 356 nm (Laurdan) y 405 nm (C-Laurdan) y fuimos

aumentando la temperatura en intervalos de 2 ºC; en el rango de

temperaturas en el cual se espera observar la transición de fases,

incrementamos la temperatura en intervalos de 0.2 ºC para obtener mejor

resolución. La Figura 8.5 muestra ejemplos representativos de los

espectros obtenidos para C-Laurdan a temperaturas menores y mayores que

la esperada para la transición gelliquido-cristalino (Tm = 41.3 ± 2.5 ºC

(Koynova y Caffrey 1998)). Se puede verificar un claro corrimiento al rojo

en el espectro de la sonda luego de la transición. Esto ocurre porque en la

fase líquido cristalina, las moléculas de agua penetran con mayor facilidad

dentro de la membrana lo que a su vez disminuye la energía del estado

excitado de la sonda (Capítulo 3). Pudimos verificar además que la

intensidad emitida disminuye con la temperatura (figura 8.5A),

comportamiento ya visto en Laurdan (figura 8.1A). Además, la figura

muestra que a temperaturas similares a la esperada para la transición de

164

fases, el espectro posee características intermedias a las correspondientes a

las fases gel y líquido-cristalina.

Figura 8.5 Espectros de emisión de C-Laurdan en vesículas de DPPC a distintas

temperaturas. En azul, 25ºC representativo de fase gel. En naranja, 41.5 ºC, en el punto medio de la transición de fases gel-líquido cristalino. En verde, 55ºC, representativo de fase líquido cristalina. La figura A muestra los espectros de emisión obtenidos, donde se puede apreciar la caída del rendimiento cuántico de fluorescencia con el aumento de la temperatura. La figura B muestra los mismos espectros con la intensidad de fluorescencia normalizada para facilitar la observación del corrimiento espectral producido. Los espectros se registraron siguiendo los protocolos descriptos en 5.9.4.2.

La figura 8.5B muestra ejemplos de espectros normalizados de

fluorescencia obtenidos a temperaturas menores o mayores a la temperatura

característica de transición de DPPC al estado líquido cristalino.

Para analizar cuantitativamente este comportamiento, utilizamos

como parámetro la GP. Similarmente a lo verificado para Laurdan (figura

8.1D), la figura 8.6 muestra que la GP de C-Laurdan (círculos blancos)

disminuyó levemente con la temperatura hasta llegar a temperaturas

cercanas a la correspondiente a la transición entre las fases gel y líquido-

cristalina. En este rango de temperaturas, GP disminuyó abruptamente y

continuó disminuyendo con una menor pendiente luego de la transición.

La Tm calculada a partir de los datos experimentales fue de 41.7 ± 0.8 ºC,

un valor que no difiere significativamente de los obtenidos con otras

técnicas.

165

Figura 8.6 Comportamiento termotrópico de vesículas de DPPC analizado con Polarización Generalizada (GP) de Laurdan (círculos llenos) y C-Laurdan (círculos abiertos). Las muestras se calentaron en intervalos de 0.2 ºC y se dejaron equilibrar por 120 segundos a cada temperatura antes de adquirir cada espectro de fluorescencia. La GP en cada punto se calculó utilizando la ecuación 8.1. La línea punteada muestra la temperatura aproximada de la pretransición de DPPC.

A modo comparativo, la figura 8.6 muestra también los resultados

obtenidos utilizando la sonda Laurdan en lugar de C-Laurdan. Pudimos

verificar que los valores de GP en la fase gel fueron mayores para Laurdan

con respecto a C-Laurdan. Como explicaremos más adelante, dichos

cambios podrían estar relacionados con la distinta posición que adquiere la

sonda C-Laurdan respecto a Laurdan en la bicapa lipídica.

Por otra parte, la figura 8.6 muestra que a 32.8 ºC ± 1.0 ºC el valor

de GP de C-laurdan disminuye con una mayor pendiente a la esperada para

T < Tm lo cual sugiere que la sonda estaría detectando una pretransición en

el sistema lipídico estudiado. En contraste, la GP de Laurdan no mostró

variaciones abruptas en este rango de temperaturas.

Koynova y Caffrey (Koynova y Caffrey 1998), describieron para

DPPC una pre-transición a 34.4 ± 2.5 ºC correspondiente a la transición del

estado gel a una fase denominada “rippled” por el particular patrón regular

de ondas que aparece en las imágenes de microscopía electrónica de esta

fase (Kaasgaard et al. 2003) . Dicha pretransición ha sido estudiada en

166

detalle utilizando técnicas de muy alta sensibilidad como calorimetría

diferencial de barrido (DSC) (Koynova et al. 1996).

Dado que la pre-transición involucraría el reacomodamiento de las

cabezas polares de los fosfolípidos, los cambios espectrales de C-laurdan

observados durante este reacomodamiento sugieren que la sonda se localiza

preferentemente cerca de las cabezas polares de DPPC probablemente vía

una interacción del carboxilato de C-Laurdan con las moléculas de agua.

En esta dirección, trabajos previos mostraron que la pretransición también

puede observarse utilizando la sonda fluorescente Prodan, la cual se

localizaría preferentemente en la interfase lípido-agua (Parasassi et al.

1998). Esta ubicación del grupo naftaleno más expuesto al agua

posiblemente explique los menores valores de GP de C-Laurdan respecto a

Laurdan en la fase gel, es decir, la sonda estaría reportando un

microentorno más polar que el de Laurdan.

Para probar esta hipótesis, analizamos el comportamiento de C-

Laurdan en liposomas de DPPC en un buffer a pH 5.6. Este valor de pH es

menor al pKa esperado para el grupo carboxilo de la sonda (pKa = 6.4,

(Kim et al. 2007)) por lo cual la sonda se encontraría protonada y podría

penetrar más profundamente en el núcleo hidrofóbico de la bicapa lipídica.

Es importante mencionar que el comportamiento termotrópico de DPPC

no se modifica en el rango de pH ensayado (Koynova y Caffrey 1998).

La figura 8.7 muestra que a este pH es posible observar la transición

de fases gel-líquido cristalino pero no la pretransición. Estos resultados

sugieren que la protonación de la sonda inducida por el cambio de pH

promueve que la sonda se inserte más profundamente en la membrana y

similarmente a lo observado con Laurdan, no se vea afectada por el sutil

cambio en la organización de las cabezas polares de los lípidos durante la

pretransición. Por el contrario, a pH mayores que el pKa el grupo carboxilo

desprotonado de la sonda se localizaría preferentemente en la interfaz

interactuando eficientemente con las moléculas de agua.

Además, la figura muestra que los valores de GP registrados a un pH

de 5.6 para la fase gel fueron mayores que los observados a un mayor pH y

similares a los de Laurdan (Figura 8.6), constituyendo otra evidencia que

apoya la hipótesis de una localización del fluoróforo de C-laurdan cercana

a la interfaz lípido-agua a valores de pH superiores al pKa de la sonda.

167

Figura 8.7 Comportamiento termotrópico de vesículas de DPPC a distinto pH.

El análisis se realizó por Polarización Generalizada (GP) de C-Laurdan a pH 5.6 (círculos llenos) y 7.4 (círculos abiertos). Las muestras se calentaron en intervalos de 0.2 ºC y se dejaron equilibrar por 120 segundos a cada temperatura antes de adquirir cada espectro de fluorescencia. La línea punteada muestra la temperatura aproximada de la pretransición de DPPC.

8.5 Observación de coexistencia de fases con C-Laurdan en microscopía confocal

Hemos mencionado en el capítulo 3, que Laurdan es una sonda

utilizada extensivamente en visualización de sistemas naturales y

artificiales de membrana con microscopía de dos fotones. En la

introducción de este capítulo, comentamos que Kim y col (2007) mostraron

que C-Laurdan tiene una mayor absortividad molar con respecto a Laurdan

además de presentar mayor fotoestabilidad en microscopía por excitación

de dos fotones. Por estos motivos, decidimos estudiar si C-Laurdan puede

ser utilizado en microscopía por excitación con un fotón.

168

8.5.1 El fenómeno de fotoselección en C-Laurdan

Comenzamos por generar GUVs de DPPC utilizando un protocolo

de electroformación (Angelova et al. 1992). Estás vesículas se prepararon

en agua bidestilada a 50ºC y luego se las dejó enfriar a 25ºC, temperatura a

la cual se espera que las mismas presenten únicamente fase gel (Matsuki et

al. 2013). La sonda C-Laurdan disuelta en DMSO se agregó directamente

en la solución contenida en la cámara de electroformación dando una

concentración final de entre 2 y 5 µM (relación aproximada sonda:DPPC

1:300). La siguiente figura muestra que la fluorescencia de la sonda en las

GUVs es claramente detectable en nuestro microscopio confocal .

Figura 8.8 GUVs teñidas

con C-Laurdan en micro-

scopía confocal. (A) Ima-gen de transmisión de una GUV en el centro del cam-po. (B) Imagen de fluo-rescencia obtenida en el campo anterior donde se enfoca la región polar de la vesícula: se observa que la intensidad de fluorescencia es muy leve comparada con el plano ecuatorial (C) Distribución de intensidad inhomogenea en la sección ecuatorial. Barra: 5 µm

169

Se puede observar además que la distribución de intensidad no es

homogénea en la sección ecuatorial (figura 8.8B) y existe una disminución

notable de intensidad de fluorescencia en los polos de la vesícula (figura

8.8C).

Las observaciones realizadas previamente son probablemente

causadas por el efecto de fotoselección. La figura 8.9 muestra esquemáti-

camente la organización de Laurdan y C-Laurdan en membranas en fase

gel y liquido cristalina. En fase gel, las cadenas lipídicas se encuentran más

ordenadas y los lípidos dispuestos geométricamente sobre la matriz

bidimensional de la membrana con movilidad rotacional muy reducida. Al

excitar esta muestra con una fuente de luz linealmente polarizada (como los

láseres utilizados como fuente de excitación en microscopía confocal y de

dos fotones), la probabilidad de excitación de aquellas moléculas cuyo

momento de excitación sea perpendicular al eje de polarización del láser

incidente será nula (Bagatolli y Gratton 2000) mientras que aquellas cuyo

momento de excitación sea paralelo al plano de polarización de la luz de

excitación serán excitadas óptimamente. De esta forma, la intensidad

emitida por las moléculas de sonda en la vesícula representada en la figura

8.9 no es homogénea. Por el contrario, en fase líquido cristalina, las

moléculas de fosfolípidos tienen más grados de libertad rotacional y por lo

tanto pueden presentar un componente del momento de excitación paralelo

al plano de polarización de la luz de excitación por lo cual el efecto de

fotoselección es menor.

.

Figura 8.9 El efecto de

fotoselección en Laurdan

y C-Laurdan. La orienta-ción del momento de exci-tación del grupo naftaleno respecto a la membrana es más rígida en fases gel lo que genera una distribución desigual de intensidad de fluorescencia si se excita la muestra con luz lineal-mente polarizada. Adaptado de Bagatolli & Gratton 2000

170

Para evitar estos gradientes de intensidad por fotoselección,

normalmente se incluye en el camino óptico de excitación una lámina de

cuarto de onda que convierte la luz linealmente polarizada del láser en luz

circularmente polarizada de modo de suministrar una excitación con

polarización homogénea a la muestra (Bagatolli y Gratton 2001). La figura

8.10A muestra que, en vesículas de DPPC:POPC en fase fluida, el efecto

de fotoselección puede generar la detección de regiones que parecen de

distinta fluidez por su valor de GP. Una lámina de cuarto de onda corrige

este efecto como se muestra en la figura 8.10B.

Figura 8.10 Artefactos causados por el efecto de fotoselección en determinaciones

de GP. Vesículas de DPPC:DOPC 1:1 a 55 ºC (fase fluída). (A) Se muestra un incremento aparente de la GP en el plano de polarización del láser (ΔGP=0.135) . La luz circularmente polarizada permite la detección de una GP homogénea en toda la vesícula, como es de esperar por su fluidez (ΔGP=0.017).

Desafortunadamente, es muy difícil incorporar dicha lámina en

nuestro microscopio confocal comercial por lo cual decidimos ensayar si

podíamos lograr un efecto similar utilizando un prisma de Nomarski

comúnmente empleado para la técnica de contraste diferencial de

interferencia (DIC). Este prisma permite generar 2 volúmenes de

excitación separados en ~0.5 µm con polarizaciones perpendiculares entre

sí (Korlann et al. 2008). La intensidad detectada en estos volúmenes es

171

posteriormente recombinada en la vía de la detección por el mismo prisma

obteniéndose de esta forma una imagen similar a la que se obtendría

utilizando una lámina de cuarto de onda pero con resolución espacial

levemente inferior (Amos et al. 2003).

La figura 8.12 muestra la imagen de una vesícula de DPPC en fase

gel obtenida sin (A) y con (B) el prisma de Nomarski. Se puede apreciar

que la intensidad de fluorescencia de la sonda fue homogénea en toda la

sección circular así como la GP (figura 8.10C y D).

Figura 8.11 Esquema del uso de un prisma de Nomarski para excitación de la

muestra. La luz linealmente polarizada del láser es dividida en dos haces de polarización ortogonal y perpendiculares al eje óptico que excitan la muestra generando dos volúmenes de excitación muy cercanos entre sí. La luz emitida es eventualmente recombinada en el camino óptico hacia los detectores, de modo que el efecto final detectado es una excitación homogénea del campo con una ligera pérdida de resolución lateral. Adaptado de Maffre (2011).

De esta manera mostramos que el uso de un prisma de Nomarski

permite evitar artefactos que puedan surgir por la excitación con luz

linealmente polarizada.

172

Figura 8.12 Uso de un prisma de Nomarski para obtener un perfil homogéneo de

excitación. Vesículas de DPPC a 25 ºC (fase gel). (A) Sin el prisma en el camino óptico se puede apreciar claramente el plano de polarización del láser. (B) Con el prisma de Nomarski se puede homogeneizar la intensidad de excitación. (C) y (D) Gráficos de GP de C-Laurdan, donde se aprecia la distribución homogénea de GP cercana a 0.5, característica de una fase gel.

8.5.2 Detección de coexistencia de fases lipídicas

Para seguir evaluando los posibles usos de C-Laurdan en

microscopía confocal, preparamos, utilizando el protocolo de electro-

formación, GUVs de DPPC:POPC en una proporción 1:1 con C-Laurdan

en una proporción sonda:lípido ~1:300 las cuales fueron observadas a

diferentes temperaturas por microscopía confocal en las condiciones

descriptas en la sección 5.15. Utilizamos este sistema porque en el rango

de temperaturas de trabajo presenta una transición de fases (figura 8.13) y

sus componentes son muy similares al sistema DPPC:DOPC que ya fue

descripto con Laurdan utilizando microscopía de 2 fotones.

173

Figura 8.13 Comportamiento

termotrópico de vesículas de

DPPC-POPC sensado por

Polarización Generalizada (GP)

de C-Laurdan. Se prepararon vesículas de DPPC:POPC 1:1 mezcladas con C-Laurdan en proporción 1:500 sonda-lípidos y se registraron espectros de fluorescencia en función de la temperatura de la muestra. Luego se efectuó el cálculo de GP para cada espectro.

La figura 8.14 muestra que la fluorescencia de la sonda incorporada

en GUVs puede ser detectada perfectamente en nuestro microscopio

confocal, utilizando potencias del láser y otras condiciones de adquisición

de rutina. Se registraron simultáneamente imágenes de las GUVs

utilizando dos detectores espectrales seteados en el rango 415-455 nm y

490-530 nm (canales 1 y 2 respectivamente) y se calcularon imágenes de

GP a partir de estas mediciones utilizando el programa SimFCS. La figura

8.14C,D muestra que los valores de GP en toda la vesícula son

homogéneos por encima de la temperatura de transición de fases de este

sistema lipídico (34 ± 2 ºC figura 8.13). En contraste, las imágenes de GP a

temperaturas cercanas a Tm claramente muestran la coexistencia de

dominios lipídicos con diferentes valores promedio de GP.

174

Figura 8.14 Observación de transiciones de fase en GUVs con C-Laurdan en un microscopio confocal. Se electroformaron GUVs de DPPC-POPC 1:1 a 55ºC en presencia de C-Laurdan y se enfriaron lentamente. Imágenes tomadas a 51.3 ºC (A-C) y a 35.7 ºC (E-G) registrando la fluorescencia de la sonda en el canal 1 (A, E) y 2 (B, F) del microscopio. La fluorescencia registrada enambos canales fue utilizada para calcular imágenes de GP (C y G). D y H muestran las distribuciones de GP obtenida en toda lavesícula, o en las regiones indicadas con rectángulos blancos en la imagen G, correspondientes a distintas fases en equilibrio. Barras =10 µm.

175

Para relacionar las medidas de GP de C-Laurdan con las propiedades

de las fases lipídicas, generamos GUVs de DPPC-POPC 1:1 incluyendo en

la preparación las sondas C-Laurdan y Rodamina-DPPE (Ro-DPPE). Esta

última sonda ha sido ampliamente utilizada en microscopía para el estudio

de dominios lipídicos (Bagatolli y Gratton 2000; Sanchez et al. 2002;

Bagatolli 2006) y se ha mostrado que particiona preferencialmente en la

fase fluida en sistemas binarios de similar composición (DPPC-DOPC 1:1)

(Li y Cheng 2006).

La figura 8.15 muestra que Rho-DPPE es claramente excluida de los

dominios que presentan altos valores de GP de C-Laurdan, indicando que

estas regiones se tratan posiblemente de dominios en fase gel. De acuerdo

con esta hipótesis, Shoemaker y Vanderlick mostraron que las propiedades

mecánicas de dominios no fluorescentes obtenidos en GUVs compuestas

por DPPC-POPC 6:4 y marcados con la sonda lisamina-Rodamina B

DOPE (Ro-DOPE) son las esperadas para dominios en fase gel (Shoemaker

y Kyle Vanderlick 2003).

176

Figura 8.15 Caracterización de fases lipídicas con C-Laurdan y Ro-DPPE. Se electroformaron GUVs de DPPC-POPC 1:1 a 55ºC en presencia de C-Laurdan y de Ro-DPPE. Las imágenes se tomaron a 27ºC, registrando simultáneamente la intensidad de fluorescencia de C-Laurdan en el rango 415-455 nm (A) y 490-530 nm (B) y también la intensidad de fluorescencia de Ro-DPPE (C). La imagen de GP se calculó a partir de las imágenes de C-Laurdan (D). La flecha indica una región correspondiente a un dominio de alta GP que colocaliza con una región de fluorescencia despreciable de Ro-DPPE por partición diferencial. Barra = 10 µM.

Hemos mencionado en la Introducción que una de las motivaciones

principales en biología celular para el estudio de sistemas lipídicos de

complejidad creciente es comprender en mayor detalle la estructura y

función de las membranas biológicas. En particular, describimos que existe

un gran interés en dilucidar la estructura, dinámica y función de los rafts.

Como comentamos en el capítulo 1, la definición actual de rafts

sostiene que éstos consisten en dominios dinámicos y heterogéneos

principalmente enriquecidos en esteroles y esfingolípidos. A partir del

177

trabajo de Dietrich (Dietrich et al. 2001) se definió una mezcla lipídica con

la menor cantidad de componentes como modelo de estudio de coexistencia

de fases: la denominada mezcla canónica de rafts (Veatch y Keller 2003).

Este sistema es una mezcla ternaria de Di-oleil-fosfatidilcolina (DOPC),

esfingomielina (SM) y colesterol (chol). Conceptualmente se piensa como

un sistema que presenta una fase líquido cristalina compuesta

principalmente por DOPC (TM -20 ºC) y una fase líquido-ordenada de

menor fluidez enriquecida en SM y Chol.

Para determinar si C-laurdan es capaz de sensar la presencia de rafts,

generamos vesículas gigantes compuestas por DOPC-SPM-Chol 2:2:1 y se

las marcó con C-Laurdan y Ro-DPPE. La figura 8.16 muestra imágenes de

dichas GUVs obtenidas en el microscopio confocal en las condiciones

descriptas previamente. Se puede observar que las regiones que presentan

una alta intensidad de fluorescencia de Ro-DPPE colocalizan con dominios

de baja GP de C-laurdan, mostrando que esta última sonda sensa

eficientemente la coexistencia entre las fases líquido-ordenadas y líquido-

desordenadas. Es importante mencionar que la sonda Ro-DPPE utilizada

en estos ensayos se comporta como Ro-DOPE y particiona

preferencialmente en fases líquido desordenadas o cristalinas (Baumgart et

al. 2007).

Figura 8.16 Caracterización de fases lipídicas con C-Laurdan y Rho-DPPE en un

sistema de composición canónica de rafts. Se electroformaron GUVs de DOPC-SPM-Chol 2:2:1 a 62ºC en presencia de C-Laurdan y de Ro-DPPE. Las imágenes se tomaron a 27ºC, registrando simultáneamente la fluorescencia de C-Laurdan (ambos canales superpuestos en (A, en verde el canal 415-455 y naranja 490-530) y de Ro-DPPE (B). La imagen de GP se calculó a partir de las imágenes de C-Laurdan (C). Barra = 10 µM.

178

8.6 Análisis de la fluidez de membrana en células melanóforas de Xenopus laevis

En la sección anterior mostramos que la sonda C-Laurdan es capaz

de sensar el estado de agregación de membranas y la coexistencia de

dominios en sistemas artificiales. Por este motivo, decidimos probar su

eficacia en el estudio de la organización de membranas celulares.

En este caso, adquirimos imágenes de melanocitos de Xenopus laevis

previamente incubados con Laurdan o C-Laurdan utilizando el protocolo

descripto en Materiales y Métodos (sección 5.14). La figura 8.17 muestra

que la intensidad de fluorescencia obtenida con células marcadas con C-

Laurdan es significativamente mayor a la obtenida en células teñidas con

Laurdan. Es importante destacar que la concentración de la sonda utilizada

y el tiempo de incubación fueron idénticos en ambos ensayos y que

utilizamos la misma potencia efectiva (2µW) de láser de 405 nm para

excitar las muestras. Se puede observar que la intensidad obtenida para el

caso de Laurdan fue muy baja y no significativamente distinta a la

autofluorescencia registrada en células sin tratar. En cambio, las células

marcadas con C-Laurdan presentaron una intensidad apreciable

pudiéndose incluso observar características de la morfología celular tales

como los filopodios.

179

Figura 8.17 Rendimiento de C-Laurdan y Laurdan en microscopía confocal.

Imágenes de melanóforos de Xenopus laevis teñidos en idénticas condiciones y adquiridas con la misma configuración del microscopio con C-Laurdan (A y B) y con Laurdan (C y D). Se registró simultáneamente la fluorescencia (B-D) y la luz transmitida (A-C). La intensidad con Laurdan resultó tan baja como la ausencia de sonda (autofluorescencia). Las flechas indican los filopodios. Se utilizó la misma tabla de asignación de color (LUT) en ambas imágenes de fluorescencia. Barra = 10 µm

La figura 8.18 muestra diferentes planos ópticos correspondientes a

un escaneo confocal en Z de imágenes de GP y la reconstrucción en tres

dimensiones de una célula melanófora teñida con C-Laurdan. La célula

presenta regiones con valores de GP significativamente diferentes y por lo

tanto con diferente fluidez lipídica, como ya ha sido reportado en líneas

celulares teñidas con Laurdan en microscopía de dos fotones (Gaus et al.

2003).

Mientras que en células teñidas con C-Laurdan el interior celular

presentó valores de GP en el rango -0.15 – 0, la GP promedio en la

membrana plasmática fue de 0.16. Además, los filopodios, señalados con

180

flechas en la imagen, presentaron valores de GP comparativamente altos

del orden de 0.26. Estos resultados coinciden con las observaciones de

Gaus y col. (2003) quienes sugieren que estas regiones celulares presentan

un alto orden lipídico cuyo origen no estaría relacionado con una alta

curvatura de la membrana celular si no con una mayor condensación de los

fosfolípidos tal vez favorecida por otras estructuras celulares como

proteínas de anclaje asociadas a la membrana. Por otro lado, pudimos

observar dominios de alta GP en la membrana basal de las células en

contacto directo con el sustrato. Estos dominios podrían tratarse de

adhesiones focales dado que estas regiones presentan altos valores de GP

(Gaus et al. 2006).

Figura 8.18 Observación de

orden lipídico en membranas

celulares con C-Laurdan.

Se obtuvieron imágenes de GP de las células a la altura de la membrana basal de la célula (A) y 2.8 µm sobre el soporte de vidrio (C). La distribución global de GP en los dos planos (B y D, respecti-vamente) se ajustó como la suma de dos gaussianas obteniéndose los siguientes valores para los paráme-tros: GP1 = -0.028 ± 0.009; j1 = 0.107 ± 0.008; GP2 = 0.260 ± 0.009; j2 = 0.109 ± 0.008 (B), y GP1 = -0.157 ± 0.002; j1 = 0.072 ± 0.002; GP 2 = 0.161 ± 0.009; j2 = 0.158 ± 0.009 (D). Barra = 10 µm. (E) Construcción tridimensional de la célula obtenida a partir de una compuesta por 21 imágenes adquiridas en un intervalo de 0.4 µm. La imagen fue creada con el ImageJ 3D viewer plugin

181

Es importante destacar que luego de completar el escaneo en el eje Z

a partir del cual hicimos la reconstrucción 3D que se muestra en la figura,

tomamos nuevamente imágenes de la misma célula (figura 8.18C) y

comprobamos que la intensidad era ~ 90% del valor previo al escaneo en z,

mostrando un nivel de fotoestabilidad adecuado para aplicaciones donde

pueda ser requerido tomar imágenes repetidamente de la muestra.

8.6.1 C-laurdan permite detectar variaciones en la fluidez de la membrana celular

En la figura 8.3, hemos observado que la sonda ANEP sólo permite

sensar cambios drásticos en la organización de la membrana.

Para explorar si C-Laurdan puede -además de detectar regiones con

distinta organización lipídica en células- sensar cambios en la fluidez de la

membrana celular frente a determinados estímulos, estudiamos los efectos

de metil-く-ciclodextrina (MくCD) en las propiedades de la membrana de los

melanóforos de Xenopus laevis midiendo la GP de C-Laurdan.

Las ciclodextrinas son muy utilizadas para remover colesterol tanto

de sistemas de membranas artificiales como naturales y sus efectos en la

membrana ya han sido estudiados utilizando Laurdan (Sanchez et al. 2011).

En particular, se observó que la MくCD incrementa la fluidez de las

membranas biológicas como lo reporta la significativa reducción en la GP

de Laurdan (Sanchez et al. 2007). La figura 8.19 muestra imágenes

adquiridas de melanóforos control o tratados con MくCD. En colaboración

con Carla Pallavicini, desarrollamos una rutina de MatLab de

reconocimiento de bordes para poder seleccionar en una imagen con varias

células, sólo los pixeles correspondientes a las membranas celulares. La

rutina consiste básicamente en la creación de una máscara basada en

considerar la imagen como una combinación de topologías cerradas, es

decir, como superficies encerradas entre líneas de frontera. Éstos pixeles

de frontera son precisamente los correspondientes al borde celular en la

imagen, o sea, a la membrana celular. De esto modo pudimos procesar los

píxeles correspondientes a la membrana celular y comparamos el valor de

GP a nivel de la membrana antes y después del tratamiento con MくCD.

Los valores de GP promedio obtenidos antes y después del tratamiento

182

fueron 0.18 ± 0.05 (N = 13 células) y -0.06 ± 0.08 (N = 13 células),

respectivamente. Estos resultados muestran que la sonda fue capaz de

sensar cambios en la fluidez de membrana en células vivas. En

concordancia con nuestros datos, Kim y col (2007) verificaron que la GP

de C-Laurdan medida en células A431 se redujo significativamente después

del tratamiento con MくCD en condiciones de excitación con dos fotones.

Figura 8.19 Efectos de metil-β-ciclodextrina sobre la fluidez de la membrana

celular de Xenopus laevis. Las células de melanóforos se incubaron con 10 mM MくCD durante 15 minutos. Las células control y las tratadas con MくCD fueron luego fijadas

por incubación con paraformaldehído al 4%, lavadas y teñidas con C-laurdan. Imágenes de las células obtenidas en el canal 1 (A, C) e imágenes de GP (B, D) de células control (A, B) y tratadas con MくCD (C, D). Barra = 30 µm. . (E) Histogramas representativos de la GP en la membrana celular obtenidas para células control (■) y tratadas con MくCD (○) . N = 13 células por grupo.

183

8.6.2 Fluidez en eritrocitos humanos

A continuación, decidimos explorar por GP de C-Laurdan, el entorno

natural de la PMCA: eritrocitos humanos. Estos estudios proveen

información relevante complementaria para comprender en mayor detalle

los fenómenos observados en los capítulos 6 y 7. Para eso, a partir de

sangre fresca, realizamos lavados con solución isotónica y luego teñimos

los eritrocitos dejándolos incubar 30 minutos con 10 µM de C-Laurdan.

Utilizando la ya mencionada rutina de Matlab, analizamos el valor de

GP de los píxeles correspondientes a la membrana celular (figura 8.20).

Figura 8.20 Análisis de eri-

trocitos humanos por GP de C-

Laurdan (A) Imagen de DIC de eritrocitos humanos. (B) Imagen de GP de C-Laurdan. El valor promedio de GP fue de 0.22 ± 0.04. N = 53 células Barra 10 µm.

La figura 8.20 muestra que la población de eritrocitos es homogénea

con respecto a su fluidez y que el valor promedio de GP de 0.22 ± 0.04, o

representativo de una fase ordenada. Este valor es algo menor a lo

184

esperado a partir de las mediciones efectuadas en membranas lavadas

(sección 7.4.4); sin embargo la mayor GP en los ensayos de cubeta puede

explicarse por la turbidez de las soluciones de membranas fragmentadas

que ocasionan gran dispersión de luz en estos ensayos espectrofluo-

rométricos.

Por otra parte, las imágenes muestran cierta heterogeneidad en los

valores de GP por pixel, sin embargo no pudimos detectar dominios con

GP diferenciales que se sostengan en el tiempo.

El análisis de fluctuación de GP es una técnica que combina FCS con

el uso de espectroscopía de Laurdan propuesta por Celli y Gratton (2008).

Esta técnica permite estudiar la existencia de dominios bajo el límite de

difracción del microscopio de fluorescencia al analizar las fluctuaciones en

el valor de GP producidas por –en caso de haber coexistencia de fases- la

sonda Laurdan al difundir dentro y fuera de estos microdominios. Esta

técnica fue utilizada recientemente por Sánchez y colaboradores (2012)

para detectar microdominios en eritrocitos por debajo del límite de

resolución. Lamentablemente, cuando intentamos aplicar esta técnica, no

pudimos obtener buenas curvas de autocorrelación por el alto fotoblanqueo

de C-Laurdan en nuestras condiciones de adquisición y el daño celular que

producía el escaneo del láser.

8.7 Conclusiones

En este capítulo evaluamos el desempeño de dos sondas

fluorescentes en la búsqueda de una sonda que nos permita estudiar

estructura de membrana en sistemas artificiales y naturales. El primer caso

fue la sonda di-4-ANEPPHQ con la cual no obtuvimos resultados

sastisfactorios ya que no pudimos obtener información sobre fluidez de

membranas ni siquiera en ensayos muy simples tomando a la sonda

Laurdan como referencia. A continuación mostramos que una variante de

Laurdan, C-Laurdan, permite obtener información similar a aquella

obtenida con Laurdan, en ensayos de fluorescencia en cubeta. C-Laurdan

además reportó una pretransición presente en DPPC que nos llevó a

postular una diferencia respecto a la profundidad con la que ésta sonda se

inserta en membranas respecto a Laurdan. Modificando el pH para

185

neutralizar las cargas negativas del grupo carboxilo adicional de C-

Laurdan, pudimos comprobar que la sonda pasa a tener un comportamiento

espectroscópico más parecido al de Laurdan y pierde la capacidad de

detectar la pre-transición.

Ese resultado positivo y las propiedades fotofísicas reportadas de C-

Laurdan, como un espectro de excitación más cercano al visible y su mayor

fotoestabilidad, nos llevaron a evaluar la sonda utilizando un microscopio

confocal comercial con un láser de estado sólido de 405 nm en lugar del

costoso e inaccesible sistema de 2 fotones reportado en literatura. Para ello

trabajamos con sistemas lipídicos artificiales (GUVs) y membranas

celulares. C-Laurdan pudo reportar perfectamente la coexistencia de

dominios en GUVs y validamos los resultados en experimentos junto con la

sonda Rodamina-DPPE, una sonda que reporta coexistencia de dominios

mediante partición diferencial en los mismos. En células, C-Laurdan

marcó las membranas y características morfológicas de las células como

los filopodios con los que las células se adhieren fuertemente al sustrato.

Además, resistió al fotoblanqueo producido por un escaneo en Z de la

célula para una reconstrucción tridimensional.

Una ventaja que presenta C-Laurdan para el trabajo en microscopía

es que si bien requiere de utilizar dos detectores para poder hacer estudios

de GP, al excitarse en el violeta y emitir hasta aproximadamente 530 nm,

habilita el uso de por lo menos 2 sondas más en una misma preparación,

tales como EGFP u otras proteínas fluorescentes. Por el contrario, la

sonda di-4-ANEPPHQ poseería un espectro de emisión muy amplio, y por

lo tanto presenta una alta probabilidad de solaparse con el espectro de otros

fluoróforos comúnmente utilizados en el área de Química Biológica

dificultando la detección independiente de las distintas sondas.

Creemos que, de este modo, se vuelve accesible esta herramienta de

análisis de microfluidez de membranas a grupos que cuenten con

microscopía confocal sin necesidad de contar con un costoso equipamiento

necesario para microscopía por 2 fotones, y puede abrir la puerta a nuevas

investigaciones en el área.

186

8.8 Referencias Amos, W. B., S. Reichelt, D. M. Cattermole y J. Laufer (2003). "Re-evaluation of differential phase contrast (DPC) in a scanning laser microscope using a split detector as an alternative to differential interference contrast (DIC) optics." Journal of Microscopy 210(2): 166-175.

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Conclusiones y

Perspectivas

Capítulo 9

Conclusiones y perspectivas

9.1 Introducción

En los capítulos previos presentamos y discutimos los resultados

obtenidos en el estudio de la modulación de la actividad de PMCA por

fosfolípidos y en la puesta a punta de una nueva sonda para poder abordar

estudios de fluidez de membranas con microscopía confocal de un fotón.

En este capítulo recapitulamos las conclusiones parciales obtenidas en cada

capítulo y presentamos nuestros interrogantes y puntos de partida para

estudios futuros.

9.2 Conclusiones

En el capítulo 6 estudiamos la influencia de la composición de las

micelas en la actividad de la PMCA y mostramos que ésta aumenta a

medida que las micelas se enriquecen en el fosfolípido DPPC. Mostramos

que la fracción molar de fosfolípidos en micelas (XFL), es un muy buen

parámetro para la descripción de la activación de la proteína (sección 6.2).

Esta variable permite unificar los resultados de experimentos hechos con

distintas concentraciones finales de lípidos y detergentes.

A continuación, decidimos explorar mediante el uso de

espectroscopía de fluorescencia y dicroísmo circular los cambios

estructurales asociados a la activación verificada previamente. Los ensayos

de dicroísmo circular sugirieron que la estructura secundaria de la proteína

no cambiaría sustancialmente al modificarse la composición de las micelas.

Por otra parte, los ensayos de fluorescencia de triptofanos, aminoácidos

ubicados en la interfase lípido-agua en los dominios transmembrana,

tampoco mostraron cambios asociados a la activación.

193

Los cambios detectados por la sonda ANS pueden explicarse

considerando que el dominio transmembrana presenta una estructura más

compacta en micelas enriquecidas en lípidos.

Estos resultados espectroscópicos mostraron que los cambios

conformacionales producidos por la activación son sutiles, y no implican

reorganizaciones estructurales grandes tales como un desplegamiento

parcial/total en presencia de detergente. En otras palabras, a pesar de que la

proteína es inactiva en micelas de detergente, su conformación sería

similar a la nativa.

Estos resultados son de gran importancia ya que, de ser extrapolables

a otras proteínas de membrana, validaría la hipótesis asumida en muchos

trabajos experimentales y de simulación en proteínas de membrana: las

estructuras cristalinas resueltas en detergentes aportan información sobre

conformaciones nativas o cuasi-nativas.

Para desarrollar una descripción cuantitativa de estos fenómenos

utilizamos un modelo de adsorción y desorción de anfifilos ya utilizado en

estudios de estabilidad térmica de PMCA. Conjugando la información

proveniente de los experimentos de actividad y los de espectroscopía,

elaboramos una explicación microscópica de la activación de PMCA con

un modelo de dos etapas. En la primera etapa los fosfolípidos que integran

las micelas pueden ponerse en contacto con la región transmembrana de la

proteína. La mayor afinidad relativa de la proteína por fosfolípidos

respecto a las moléculas de detergente, genera un enriquecimiento en

fosfolípidos en la región de la micela que rodea el dominio transmem-

brana. La segunda etapa ocurre cuando los fosfolípidos en contacto con la

región transmembrana inducen un sutil cambio conformacional que se

transduce hasta el dominio catalítico, aumentando la actividad de PMCA.

Pudimos describir empíricamente el comportamiento de las curvas

de actividad de DPPC hasta una fracción molar de 0.35 a partir de una

ecuación logística. En un modelo global pudimos integrar la información

proveniente de los ensayos de FRET con un fosfolípidos marcado con

pireno que nos permitió cuantificar directamente la afinidad relativa de

PMCA por fosfolípidos, con los datos obtenidos de ensayos de actividad

enzimática (sección 6.4). También propusimos un modelo concertado más

sencillo que vincula la actividad ATPasa y la fracción molar a partir de

parámetros que describen los mínimos y máximos de actividad (A0 y A1

194

respectivamente) junto con la fracción molar que produce la mitad de la

máxima activación (X0.5) y un parámetro que describe la cooperatividad de

la activación (cx) (sección 6.5).

En un estudio posterior, exploramos la actividad ATPasa abarcando

un rango más amplio de fracciones molares y observamos que la actividad

disminuye a partir de una fracción molar de fosfolípidos de

aproximadamente 0.35 tanto en micelas compuestas por C12E10 y DPPC

como en aquellas compuestas por C12E10 y DMPC. Esto nos llevó a

considerar otras variables físicas del sistema micelar además de la

composición relativa del mismo.

Para llevar a cabo este estudio utilizamos las técnicas de dispersión

estática de luz, calorimetría de titulación isotérmica, espectroscopía de

correlación de fluorescencia y espectroscopía de polarización generalizada

(GP) de Laurdan. Estas técnicas nos permitieron caracterizar la transición

micela-vesícula en el sistema de anfifilos DMPC-C12E10 y comprobar que

la caída en la actividad comienza a producirse a menores XFL que la

correspondiente a dicha transición lo que nos llevó a descartar que este

fenómeno se relacione con la caída en actividad. Estos resultados se

vieron apoyados por el hecho de que la actividad ATPasa no varía en

presencia de un ionofóro de Ca2+ en un sistema micelar con alta

concentración relativa de fosfolípidos.

Además, nuestros resultados nos llevaron a especular que la

inactivación observada a XFL mayores a 0.35 podría deberse a un cambio

en la estructura de las micelas las cuales serían de mayor tamaño y menor

fluidez

Un cambio de tamaño y/o forma en las micelas puede modificar los

perfiles de curvatura y la presión lateral. Estos cambios podrían ser

sensados por PMCA, alterando levemente su conformación y

disminuyendo su actividad.

Los ensayos de espectroscopía de fluorescencia en cubeta presentan

la desventaja de no ofrecer resolución espacial de los fenómenos

reportados. En este tipo de estudios se obtiene el comportamiento global

de la muestra y por lo tanto la información obtenida en sistemas

heterogéneos y complejos es muy limitada.

En nuestro sistema de estudio, es entonces imprescindible obtener

una descripción acabada de fenómenos de heterogeneidad lateral

195

relacionados con interacciones lípido-proteína interacción lípido-proteína.

Por este motivo, utilizamos microscopía de fluorescencia ya que permite

resolver estos fenómenos en el espacio y el tiempo ya sea en sistemas

artificiales simplificados o en las membranas biológicas naturales. Con

este objetivo, exploramos el uso de sondas fluorescentes que reporten

información sobre la fluidez de membranas en microscopía confocal.

La primera sonda que ensayamos fue di-4-ANEPPDHQ, una sonda

que puede excitarse a 488 nm y cuyo espectro de emisión abarca gran parte

del espectro visible (sección 8.2). En nuestros experimentos no pudimos

reproducir los resultados reportados para esta sonda en experimentos

relativamente simples de transición de fases en fosfolípidos. La sonda

Laurdan ya tiene probados resultados en este aspecto pero, por su máximo

de absorción a 356 nm y su limitada fotoestabilidad, su uso se encontró

siempre restringido a la costosa microscopía de 2-fotones. Decidimos

utilizar una molécula derivada de Laurdan, C-Laurdan que presenta entre

otras características, una mayor fotoestabilidad y un espectro de absorción

más cercano al visible. Como punto de partida, exploramos su desempeño

en ensayos en cubeta (sección 8.3). La sonda mostró ser extremadamente

sensible para detectar transiciones de fase en vesículas artificiales de

fosfolípidos. Además, pudimos mostrar que a pH fisiológico C-Laurdan

presenta una mayor interacción (sección 8.4) con las cabezas polares de

una bicapa fosfolipídica, lo que vuelve a la sonda sensible a las

pretransiciones de fase gel a fase ondulada o “rippled”.

A continuación, decidimos probar el desempeño de C-Laurdan en

microscopía confocal utilizando GUVs como sistema modelo y mezclas

que presentan coexistencia de fases y macrodominios lipídicos. Pudimos

observar que C-Laurdan permite obtener imágenes de las muestras

estudiadas con alta relación señal/ruido en condiciones estándares de

medición y cuantificar la fluidez de los dominios observados utilizando la

polarización generalizada de fluorescencia. Validamos estos resultados

trabajando en simultáneo con la sonda Rho-DPPE que particiona

preferencialmente a fases líquido-desordenadas. Pudimos además

configurar nuestro microscopio confocal de modo tal de evitar artificios en

el cálculo de la GP asociados a la polarización lineal del láser al excitar a

C-Laurdan en un medio anisotrópico como las GUVs (sección 8.5).

196

Para finalizar nuestra caracterización exploramos si C-Laurdan

puede ser utilizado para mapear la fluidez de membranas biológicas en

células. Con este fin, teñimos células melanóforas de Xenopus laevis con

Laurdan y C-Laurdan en las mismas condiciones. Mientras que no

pudimos detectar señal apreciable en Laurdan, la tinción con C-Laurdan dio

muy buena marcación y nos permitió obtener excelentes imágenes de GP

de las células. Pudimos observar que la GP de las membranas es más alta

que la del sistema de endomembranas. También la sonda reportó un mayor

orden en regiones de la célula como adhesiones focales y filopodios, algo

que ya había sido reportado en microscopía de 2 fotones utilizando la sonda

Laurdan (sección 8.6). Por último efectuamos ensayos de remoción de

colesterol en estas células utilizando metil-く-ciclodextrinas. Estos ensayos

mostraron que C-Laurdan pudo sensar la disminución del orden y aumento

de la fluidez de membranas biológicas, traducido en una caída de GP

(sección 8.7). Estos resultados nos permiten sumar esta potente

herramienta de microespectroscopía al estudio de biomembranas sin

necesidad de contar con un costoso microscopio de dos fotones. Además,

el espectro de emisión de C-Laurdan permite su uso en conjunción con

otras sondas fluorescentes dado que su emisión es comparativamente

despreciable a partir de 540 nm. En una configuración típica de

microscopía confocal, esto permite el uso en simultáneo de una o dos

sondas más con máximos de emisión hacia el rojo en el espectro visible.

9.3 Perspectivas y líneas futuras

Este trabajo de tesis abre las puertas a nuevas preguntas.

En particular, planeamos explorar la influencia en la actividad

ATPasa de propiedades de los fosfolípidos tales como el largo de las

cadenas hidrofóbicas y la estructura de la cabeza polar. Esto nos permitiría

estudiar los límites y predicciones del modelo propuesto en el capítulo 6.

Ampliaremos el estudio explorando la influencia sobre la actividad

ATPasa de micelas compuestas por detergente y dos o más fosfolípidos en

proporciones controladas para estudiar cuantitativamente la influencia en la

actividad de sistemas micelares de complejidad creciente. Este estudio

deberá realizarse caracterizando además las propiedades biofísicas del

sistema micelar.

197

Por otro lado, buscaremos complementar los estudios de actividad

con estudios biofísicos para determinar la forma y tamaño de las micelas en

las cuales se encuentra inserta la proteína de membrana. En este sentido,

realizamos medidas preliminares de FCS en un sistema en el cual la PMCA

se encontraba marcada covalentemente con la sonda FITC. En dichos

ensayos verificamos que la proteína cambia significativamente el tamaño

de las micelas de 7.5 a 9.7 nm.

Proponemos profundizar este estudio utilizando un sistema en el cual

las micelas se encuentren marcadas con una sonda fluorescente y la PMCA

con otra sonda de distintas características espectrales. Esto nos permitiría

trabajar en correlación cruzada de FCS (FCCS) (Bacia y Schwille 2007),

una técnica que permite discernir entre las fluctuaciones asociadas a una

especie química particular y a las producidas por una partícula de doble

marca. De esta forma, podremos identificar con mayor precisión el tamaño

de la subpoblación formada por las micelas/vesículas en las cuales están

incluídas moléculas de PMCA de aquellas que no la contienen, de modo

de analizar los cambios producidos en las micelas que solubilizan a la

proteína.

Proponemos además explorar otras ATPasas de cobre recientemente

clonadas en nuestro laboratorio, que constituyen una serie homóloga de

termófilas, mesófilas y psicrófilas aisladas de organismos extremófilos. En

estos casos, el entorno fosfolipídico natural de las arqueobacterias presenta

lípidos isoprenoides que unen ácidos grasos con una unión éter (van de

Vossenberg et al. 1998). Esto brinda por un lado la oportunidad de estudiar

las características biofísicas de estos sistemas lipídicos adaptados a

condiciones ambientales extremas. Por otro lado, dado que estas ATPasas

son funcionales en preparaciones de fosfolípidos y detergentes, podremos

explorar la modulación por fosfolípidos sumándole una perspectiva

estructural relacionada con adaptaciones a distintas temperaturas de

funcionamiento óptimo de estas ATPasas.

Dilucidar los mecanismos moleculares que producen la modulación

en la actividad de proteínas de membrana por fosfolípidos en el paradigma

actual requiere de conocer las estructuras cristalinas. La cristalización de

proteínas de membrana todavía presenta un desafío considerable. En el

caso de las ATPasas de Ca2+, se cuenta con la estructura cristalina de la

ATPasa de retículo endoplasmático liso (SERCA) (Toyoshima et al. 2000).

198

También se cuenta con la estructura de las ATPasas de cobre clonadas en el

laboratorio (Gourdon et al. 2011; Andersson et al. 2014)

Un desafío es encarar el análisis mecanístico utilizando técnicas de

dinámica molecular. Estos sistemas presentan la complejidad adicional de

sumar la simulación de la membrana lipídica al ya para nada trivial

problema de simular una proteína integral formada por decenas de miles de

átomos y las moléculas de solvente. Si los mecanismos de interacción y

activación implican interacciones específicas entre fosfolípidos, ya sea con

sus colas o sus cabezas polares, y regiones definidas de la proteína; puede

no ser suficiente el uso de técnicas de grano grueso que son más

económicas computacionalmente a expensas de perder detalle en algunos

aspectos de la simulación (Stansfeld y Sansom 2011). En los últimos años

han aparecido parametrizaciones de moléculas de detergente, abriendo la

puerta a simulaciones de estos sistemas micelares mixtos (Velinova et al.

2011). Simular una proteína de membrana en un entorno micelar permitiría

por un lado la generación de hipótesis en cuanto a interacción lípido-

proteína y sus efectos estructurales, y por otro lado, la validación

experimental de predicciones que puedan surgir de la simulación: algo por

demás valioso para el campo de la biología teórica y computacional.

Por último, nuestro trabajo abre las puertas a incorporar la PMCA

en sistemas de GUVs con el fin de estudiar in situ la interacción de esta

proteína con los lípidos. Esto nos permitiría realizar estudios de partición

diferencial de estas proteínas en dominios lipídicos y correlacionar estas

distribuciones con la fluidez de los dominios utilizando con este fin la

fluorescencia de C-laurdan.

En los últimos meses realizamos pruebas en esta dirección utilizando

el protocolo de reconstitución de proteínas en GUVs de Dezi (2013), que

básicamente consiste en desestabilizar con concentraciones bajas de

detergente las GUVs, agregar la proteína de interés en micelas de

detergente, incubar de modo que se produzca la fusión de las micelas en las

vesículas, y finalmente remover el detergente con resinas hidrofóbicas

como Bio-Beads™. Utilizamos PMCA marcada con FITC pero

lamentablemente no logramos que se produzca la inserción de la misma en

las GUVs.

Como mencionamos en la sección 1.3.4, las técnicas de

reconstitución de proteínas en GUVs requieren condiciones extremas de

199

trabajo como la desecación de las muestras proteicas y el uso de altas

temperaturas requeridas para la electroformación de vesículas de ciertas

composiciones (Doeven et al. 2005; Montes et al. 2007). Por estos

motivos, planeamos incorporar ATPasas termófilas de Cu+ mencionadas

previamente en lugar de la PMCA ya que serían mucho más resistentes a

las condiciones de obtención de estos sistemas lípido-proteína.

Además planeamos realizar experimentos de correlación cruzada de

fluorescencia entre PMCA-FITC y C-Laurdan en GUVs. Hemos intentado

realizar medidas de fluctuaciones de GP utilizando C-Laurdan pero

lamentablemente no pudimos encontrar parámetros adecuados para dichas

mediciones. Es importante mencionar que Sánchez y colaboradores (2012)

han utilizado la técnica de FCS combinada con Laurdan y microscopía de 2

fotones para medir fluctuaciones de GP que proveyeron información

dinámica de dominios lipídicos de diámetro inferior al límite de resolución

del microscopio. Obtener esta información y correlacionarla con la

dinámica de la proteína será nuestro objetivo en los próximos estudios.

200

9.4 Referencias Andersson, M., D. Mattle, O. Sitsel, T. Klymchuk, A. M. Nielsen, L. B. Møller, S. H. White, P. Nissen y P. Gourdon (2014). "Copper-transporting P-type ATPases use a unique ion-release pathway." Nature Structural and Molecular Biology 21(1): 43-48.

Bacia, K. y P. Schwille (2007). "Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy." Nature Protocols 2(11): 2842-2856.

Dezi, M., A. Di Cicco, P. Bassereau y D. Lévy (2013). "Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents." Proceedings of the National Academy of Sciences 110(18): 7276-7281.

Doeven, M. K., J. H. Folgering, V. Krasnikov, E. R. Geertsma, G. van den Bogaart y B. Poolman (2005). "Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles." Biophysical Journal 88(2): 1134-1142.

Gourdon, P., X.-Y. Liu, T. Skjorringe, J. P. Morth, L. B. Moller, B. P. Pedersen y P. Nissen (2011). "Crystal structure of a copper-transporting PIB-type ATPase." Nature 475(7354): 59-64.

Montes, L. R., A. Alonso, F. M. Goni y L. A. Bagatolli (2007). "Giant unilamellar vesicles electroformed from native membranes and organic lipid mixtures under physiological conditions." Biophysical Journal 93(10): 3548-3554.

Sanchez, S. A., M. A. Tricerri y E. Gratton (2012). "Laurdan generalized polarization fluctuations measures membrane packing micro-heterogeneity in vivo." Proceedings of the National Academy of Sciences 109(19): 7314-7319.

Stansfeld, P. J. y M. S. P. Sansom (2011). "From Coarse Grained to Atomistic: A Serial Multiscale Approach to Membrane Protein Simulations." Journal of Chemical Theory and Computation 7(4): 1157-1166.

201

202

Toyoshima, C., M. Nakasako, H. Nomura y H. Ogawa (2000). "Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 [angst] resolution." Nature 405(6787): 647-655.

van de Vossenberg, J. L. C. M., A. J. M. Driessen y W. N. Konings (1998). "The essence of being extremophilic: the role of the unique archaeal membrane lipids." Extremophiles 2(3): 163-170.

Velinova, M., D. Sengupta, A. V. Tadjer y S.-J. Marrink (2011). "Sphere-to-Rod Transitions of Nonionic Surfactant Micelles in Aqueous Solution Modeled by Molecular Dynamics Simulations." Langmuir 27(23): 14071-14077.