Estudio de la biodiversidad fúngica en el suelo del viñedo de la ...

Alejandro Burgos Ramírez

María del Mar Hernández Álamos y Cristina Menéndez Menéndez

Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática

Proyecto Fin de Carrera

Agricultura y Alimentación

2013-2014

Título

Director/es

Facultad

Titulación

Departamento

PROYECTO FIN DE CARRERA

Curso Académico

Estudio de la biodiversidad fúngica en el suelo del viñedo de la Finca La Grajera

Autor/es

© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2014

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Estudio de la biodiversidad fúngica en el suelo del viñedo de la Finca LaGrajera, proyecto fin de carrera

de Alejandro Burgos Ramírez, dirigido por María del Mar Hernández Álamos y Cristina Menéndez Menéndez (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una

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Facultad

Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática

Titulación

Ingeniería Técnica Agrícola - Hortofruticultura y jardinería

Título

Estudio de la biodiversidad fúngica en el suelo del viñedo de la

Finca La Grajera

Autor/es

Alejandro Burgos Ramírez

Director/es

Mª del Mar Hernández Álamos - Cristina Menéndez Menéndez

Departamento

Agricultura y Alimentación

Curso académico

2013/2014

ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD FÚNGICA EN EL SUELO DEL VIÑEDO DE LA FINCA LA GRAJERA

Alejandro Burgos Ramírez Página 1

RESUMEN:

La diversidad fúngica del suelo tiene gran importancia como indicador de la fertilidad y del estado sanitario del suelo, por lo que va a jugar un papel fundamental en el desarrollo de las especies vegetales instaladas en el mismo.

Las prácticas agrícolas condicionan y ejercen una influencia importante en la biodiversidad al modificar las condiciones de equilibrio que suelen darse en los ecosistemas naturales.

El objetivo de este trabajo ha sido el estudio de la biodiversidad de los hongos filamentosos en el suelo del viñedo, para lo que se ha muestreado en las zonas con cubierta y sin cubierta de este cultivo en las cuatro estaciones del año.

Para extraer los hongos del suelo se ha utilizado el método de diluciones y para la identificación y estudio de las poblaciones se realizó el cultivo in vitro de estas diluciones y de los morfotipos aislados. Se identificaron hongos de los géneros Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Paecilomyces y Rhizopus, muy habituales, todos ellos, en los estudios de diversidad del suelo independientemente de los métodos utilizados para ello.

Los resultados obtenidos nos dicen que no se han observado grandes diferencias entre las poblaciones de hongos en las distintas estaciones del año salvo en el otoño. En el caso de los suelos con cubierta vegetal, se obtuvieron valores ligeramente superiores de poblaciones y morfotipos con respecto a los suelos cultivados con laboreo.

El índice de diversidad de Shannon tuvo valores aproximados entre 2 y 3, acordes a una diversidad media en consonancia con un monocultivo como puede ser el viñedo.



ÍNDICE:

1. INTRODUCCIÓN. 3. 1.1. Importancia de los hongos en el suelo. 3. 1.2. Métodos de estudio de los hongos en el suelo. 3. 1.3. Influencia de los factores abióticos y bióticos

en los hongos del suelo. 5. 1.4. Principales géneros de hongos que aparecen en el suelo. 7.

2. OBJETIVOS. 7.

3. MATERIALES Y MÉTODOS. 8.

3.1. Localización de la zona de estudio. 8. 3.2. Toma de muestras. 10. 3.3. Siembra de diluciones. 10. 3.4. Siembra de morfotipos aislados. 11. 3.5. Descripción de las características macroscópicas. 11. 3.6. Descripción de las características microscópicas. 12. 3.7. Índices ecológicos. 13.

4. RESULTADOS 15.

4.1. Estudio general de las poblaciones de hongos. 15. 4.2. Estudio general del número de morfotipos. 15. 4.3. Estudio detallado de los morfotipos y géneros identificados. 16. 4.4. Estudio de los índices ecológicos. 18. 4.5. Identificación de los morfotipos aislados. 19.

4.5.1. Género Aspergillus: Morfotipos A1, B1, N1, V2 y V5. 20. 4.5.2. Género Penicillium: Morfotipos B4, V3 y V4. 21. 4.5.3. Género Alternaria: Morfotipos N2 y V1. 22. 4.5.4. Género Paecilomyces: Morfotipos B3 y R2. 23. 4.5.5. Género Rhizopus: Morfotipo G1. 24. 4.5.6. Géneros sin identificar: Morfotipos A2, B2 y R1. 25.

5. DISCUSIÓN. 27.

6. BIBLIOGRAFÍA. 29.

7. AGRADECIMIENTOS. 33.

8. ANEXO 1. 34.



1. INTRODUCCIÓN.

1.1. Importancia de los hongos en el suelo.

La diversidad microbiana puede ser un buen indicador de la salud de los suelos (Garbisu et al, 2007)). Esta diversidad, es particularmente importante cuando se considera la suficiencia de los ecosistemas para responder a condiciones ambientales cambiantes ya que incrementa la capacidad de amortiguación y de resilencia de éstos a situaciones de estrés.

De los microorganismos encontrados en el suelo, los hongos tienen una importancia excepcional en la degradación de la materia orgánica. Además del beneficio que reporta esta actividad al cultivo en cuanto al incremento de la fertilidad del suelo, varios estudios han demostrado que la diversidad fúngica del suelo se relaciona con la disminución de la incidencia de enfermedades en los cultivos (Manici and Caputo, 2010) favoreciendo la presencia y desarrollo de antagonistas y estimulando el sistema de defensa de las plantas, reafirmando los estudios que contemplaban su potencial como agentes de control biológico sobre otros hongos, nematodos y artrópodos (Alexopoulos et al. 1996).

Los hongos representan la mayor parte de la biomasa microbiana en el volumen del suelo, donde pueden formar estructuras de resistencia que les permiten sobrevivir en ambientes desfavorables presentando una baja probabilidad de extinción local (Maron et al. 2011). Además juegan un papel importante en la formación de macroagregados, afectando a la estructura del suelo a través de mecanismos físicos donde las hifas mantienen unidas las partículas del suelo mientras invaden nuevos poros. De esta manera el micelio y algunas partículas del suelo se van extendiendo conjuntamente creando una capa mullida de tierra cultivable que favorece el crecimiento de las raíces. (Celik et al., 2004)

1.2. Métodos de estudio de los hongos del suelo.

Los estudios que conllevan la cuantificación de la biodiversidad del suelo y el análisis de su papel en el funcionamiento biológico de los ecosistemas son mucho menos comunes que aquellos similares que se han llevado a cabo para organismos sobre el nivel de la tierra, en particular sobre las plantas.

El cultivo “in vitro” de hongos a partir del método de diluciones (en el que se basó nuestro estudio) nos aporta información sobre las colonias desarrolladas que proceden de esporas u otros propágulos (Warcup, 1957). Las limitaciones que tiene este método incluyen la dificultad para extraer esporas de las partículas del suelo (Tabacchioni et al., 2000), la incapacidad del cultivo de un gran número especies de hongos en las condiciones de crecimiento (temperatura, pH, luz) a las que se someten en el laboratorio para su desarrollo y la potencial inhibición de ciertas colonias por la acción de otras colonias en el medio de cultivo (kirk et al, 2004). Además, el tamaño de la placa de cultivo favorece a los microorganismos que crecen con más rapidez y a aquellos hongos que producen un mayor número de esporas (Dix and Webster, 1995).

http://translate.googleusercontent.com/translate_c?depth=1&hl=es&prev=/search%3Fq%3DJournal%2Bof%2BMicrobiological%2BMethods%2B58%2B%282004%29%2B169-188%26client%3Dfirefox-a%26hs%3D1HG%26rls%3Dorg.mozilla:es-ES:official%26channel%3Dnp&rurl=translate.google.es&sl=en&u=http://www.dms.ufsc.br/mip7013/arquivos/9268_Kirk_2004.pdf&usg=ALkJrhiJc0WvPMRTDze0uI9-0hqHhQrYiw#19





Las limitaciones que presenta el estudio de la diversidad de hongos en el suelo no dependen solamente de los métodos de estudio sino también del desconocimiento sobre cómo clasificar e identificar las especies presentes (Kirk et al. 2004). En cuanto a la metodología, una de las dificultades es la heterogeneidad innata del suelo y de la distribución espacial de los microorganismos en el mismo (Trevors, 1998; Franklin and Mills, 2003). Lo mismo pasa con la distribución temporal que hace que los resultados de los estudios realizados en intervalos de tiempo amplios la variabilidad sea muy grande (Klironomos et al. 1999).

Otra es la dificultad que presentan muchas especies de hongos para su cultivo en laboratorio (Van Elsas et al., 2000). Para solucionar este problema se han desarrollado una serie de métodos basados en técnicas moleculares de extracción de DNA y RNA. Estas técnicas no están exentas de sus propias limitaciones entre las que está la eficiencia de lisis de las estructuras fúngicas, así las esporas pueden romperse de distinta forma que el micelio y los micelios de diferentes edades también presentan esta diferencia a la hora de romperse (Proser, 2002). Además, los métodos de extracción de DNA y RNA pueden descomponer los ácidos nucleicos provocando problemas en la detección posterior con el PCR (Wintzingerode et al. 1997). En muestras tomadas en medios naturales, en las que aparecen ácidos húmicos se tiende a realizar procesos de purificación que suelen acarrear la pérdida de parte de DNA y RNA con la consiguiente devaluación de los resultados (Kirk et al., 2004).

Como ya se ha mencionado, también existen dificultades a la hora de identificar los hongos. La mayor parte de las corrientes taxonómicas se basan en el estudio de los órganos de reproducción sexual de los hongos y el problema existe cuando intentamos identificar las estructuras vegetativas que están en el interior del suelo (Horton, 2002). Los métodos moleculares han avanzado en este sentido pero las bases de datos en las que se apoyan no son lo suficientemente amplias para resolver muchas incógnitas.

La Taxonomía AMF (hongos micorríticos arbusculares) también se encuentra con problemas a la hora de identificar esporas morfológicamente similares. Esto hace que exista una limitación importante de la utilización de las técnicas moleculares con la taxonomía AMF dada la falta de comprensión de polimorfismo genético en esta clasificación (Redecker et al. 1999).

Pese a estos inconvenientes que se han expuesto, la metodología con la que hemos llevado a cabo el estudio nos ha permitido, en un plazo corto de tiempo, con un coste mínimo y una serie de conocimientos básicos que se han ido adquiriendo a lo largo del mismo, obtener una relación de datos que nos han servido para evaluar la biodiversidad fúngica del suelo de las zonas de muestreo establecidas en el viñedo con resultados muy similares a estudios realizados con este mismo objetivo.






1.3. Influencia de los factores abióticos y bióticos en los hongos del suelo.

El nivel y tipo de materia orgánica influye en las comunidades de hongos que aparecen en el suelo ya que las plantas constituyen los hábitats y fuentes de energía para la mayoría de las especies fúngicas que siempre presentan algún grado de especificidad por el hospedante o el tipo de sustrato (Jansen, 1988; Sarrionandia Areitio, 2006).

Los hongos suelen tener mayor capacidad de adaptación a rangos de pH más amplios que otros microorganismos del suelo, aunque el óptimo es entre 4 y 6 (Rousk et al, 2009).

La salinidad influye sobre el desarrollo de la vegetación por lo que la cantidad y calidad de la materia orgánica disminuye afectando así a los hongos que se establecen en estos suelos. (Samaniego-Gaxiola and Chew-Madinaveitia, 2007)

En general, la mayoría de los géneros de hongos que se encuentran en el suelo son mesófilos, es decir su temperatura óptima de crecimiento está entre los 15 y 35ºC, aunque pueden soportar temperaturas de 0 a 62ºC (Ramos and Zúñiga, 2008).

Al aumentar el nivel de humedad en el suelo, necesario para la mineralización de la materia orgánica, se favorece el desarrollo de los hongos, aunque el exceso impide la difusión de O2 inhibiendo la actividad de los hongos aeróbicos. (Samaniego-Gaxiola and Chew-Madinaveitia, 2007)

A medida que descendemos en el perfil del suelo, el contenido en materia orgánica y la presencia de O2 disminuyen, debido a la falta de agregados y espacios porosos, por lo que se limita el desarrollo de los hongos (Grantina et al,. 2012).

A nivel biológico, en el suelo, los hongos establecen relaciones complejas entre ellos y con el resto de los microorganismos que habitan este ecosistema (bacterias, algas, protozoos, helmintos, artrópodos). Muchos Ascomicetes del suelo y sus anamorfos producen compuestos con actividad inhibitoria sobre otros organismos, como los antibióticos, dióxido de carbono, etileno o amonio. Los antibióticos son sustancias derivadas de su metabolismo secundario, y se producen cuando las fuentes de carbono son abundantes pero el crecimiento está limitado por la carencia de otros nutrientes esenciales (Carlile et al., 2001). También establecen relaciones con las plantas actuando como saprófitos, degradando la materia orgánica muerta que generan, como patógenos afectando a los tejidos vivos de los vegetales (algunos hongos como Armillaria mellea pueden comportarse como saprófitos y como patógenos cuando tienen un huésped que parasitar, son lo que se llaman saprófitos facultativos y como organismos simbiontes beneficiándose de su convivencia con las mismas. (Redmond et al, 1986).

La presencia del hombre y el desarrollo de su actividad tienen una enorme influencia en los ecosistemas. Se ha demostrado que las diferentes prácticas agrícolas, el tipo de plantas que se cultivan, la fertilización y los tratamientos con pesticidas y herbicidas tienen un marcado efecto en la diversidad de las comunidades microbianas de suelos (El Fantroussi, et al., 1999; 2003; Girvan, et al., 2004).



La vid es uno de los cultivos más importantes en el mundo. España es el país con más superficie dedicada al cultivo de la vid a nivel mundial, extendiéndose por todas las provincias españolas y representando aproximadamente el 8% de la superficie total cultivada, siendo superada sólo por trigo y olivo.

En el manejo más habitual del viñedo, los suelos requieren del aporte añadido de insumos como son fertilizantes, productos químicos para el manejo fitosanitario y de la realización de laboreo para evitar la competencia de adventicias con el cultivo. El uso de la cubierta vegetal en este cultivo es poco significativo a nivel de la superficie en que se lleva a cabo, aunque se va introduciendo, cada vez más, en fincas en las que la inclusión de esta técnica de cultivo no implica un exceso de competencia con el desarrollo adecuado del viñedo. En el plan de ordenación territorial, en La Rioja, se va a proponer en viñedos situados en zonas con más de un 8% de inclinación.

El uso de cubierta vegetal incrementa la diversidad de plantas en este cultivo, sobre todo cuando se favorece el desarrollo de la vegetación autóctona, y además tiene una serie de consecuencias favorables como la reducción del riesgo de erosión, la mejora de la estructura del suelo evitando el lavado de nutrientes y contribuyendo al reciclaje de los mismos, así como el aumento del contenido en materia orgánica con la consiguiente mejora de la actividad biológica del suelo. En los cultivos donde existe una mayor diversidad de plantas se ha demostrado que la biodiversidad puede ser una herramienta importante en el equilibrio de la interacción entre plantas, insectos y microorganismos (Altieri, 2002).

La cubierta vegetal permanente en cultivos leñosos, tiene como consecuencia la creación de la típica cama rica en material herbáceo, que da lugar a la existencia de hongos que están relacionados con la descomposición de este material herbáceo y que forman parte de las comunidades de hongos que habitan en la capa superficial del suelo (Manici and Caputo, 2010).



1.4. Principales géneros de hongos encontrados en los suelos.

La mayor parte de las especies identificadas pueden ser consideradas saprófitas, es decir, se desarrollan sobre materia orgánica muerta y así se refleja en la mayoría de los estudios llevados a cabo sobre la presencia de hongos en el suelo.

Como los patrones o modelos de aislamiento suelen ser los mismos para este tipo de estudios es habitual encontrarnos con el mismo tipo de géneros de hongos independientemente del lugar del mundo donde el estudio se lleve a cabo. (Azaz 2003, Cavalcanti et al. 2006, Tangjang et al. 2009).

Debido a los métodos utilizados para la identificación de los hongos del suelo, se tienden a encontrar aquellos géneros que producen estructuras como conidias, clamidosporas y/o esclerocios. Así es muy común encontrar e identificar géneros como Penicilliun, Aspergillus, Trichoderma y Fusarium entre los Hyphomicetos y Mucor, Rhizopus o Mortiriella entre los Zygomicetos. La mayoría de estos géneros se repiten en estudios realizados en plantaciones de melocotón en Italia (Manici and Caputo, 2010), bosques tropicales de La India (Satish et al. 2007), bosques atlánticos de Brasil (Costa et al. 2011), reservas forestales de Nigeria (Adeduntan, 2009), cultivos de Nogal en México y desiertos de Israel (Samaniego-Gaxiola and Chew-Madinaveitia, 2007) y entre ellos aparecen siempre Penicillium y Aspergillus.

2. OBJETIVO.

El objetivo de este trabajo fue evaluar la diversidad fúngica en el suelo del viñedo situado en la Finca de La Grajera en Logroño. Se compararon dos sistemas de manejo del cultivo, con cubierta vegetal y laboreo convencional, en los que se estudiaron las poblaciones de hongos del suelo en cada una de las cuatro estaciones del año. Este trabajo se integra dentro del Proyecto Life BioDivine que reside en el ICVV. Mi contribución ha sido el muestreo, siembra, identificación y análisis de los resultados obtenidos durante el año 2013 en las zonas establecidas en el viñedo, así como el estudio comparativo de los datos.



3. MATERIALES Y MÉTODOS.

3.1. Localización de la zona de estudio.

El estudio se llevó a cabo en el viñedo de la Finca de La Grajera situada en la carretera nacional a 3 km de Logroño.

Esta finca está caracterizada por dos tipos de uso del terreno: reserva natural y viñedo. La reserva natural representa un alto porcentaje sobre el total de superficie donde el viñedo ocupa el 23,81%. El resto de la superficie está ocupada por praderas (gramíneas), matorral, bosque mediterraneo y cultivo de olivo.

El clima es el típico de las zonas mediterráneas, con unas precipitaciones anuales que oscilan entre 400-500 mm, una evapotranspiración intensa, superior a los 800 mm anuales. La temperatura media es de 13-14ºC y la duración media del período seco oscila entre 4-5 meses. Incluye también microclimas condicionados por su orografía y la presencia de un pantano que fue construido en 1883 y ampliado en 1908, con el fin de aprovechar esa reserva de agua procedente del río Iregua para regar las huertas del sur de la ciudad.

Los suelos son de origen sedimentario y están constituidos por arcillas calcáreas rojas más o menos limosas y en algunas zonas, bandas de arenisca intercaladas que se corresponden con depósitos de antiguos canales.

La vegetación natural del espacio estaría representada por matorrales nitrófilos, con especies como la ontina, y especies propias de suelos salobres como albardín y orgaza. También vemos carrascas, representando a la restante vegetación destacable en la zona y áreas de coscoja en la zona oeste. Más cerca de la zona húmeda, crecen ejemplares como sauces, olmos, álamos blancos y tamarices.

En lo concerniente a las prácticas agrícolas, la cubierta vegetal en el viñedo se limita a una zona donde se esta estudiando la influencia de cubiertas de gramíneas y leguminosas sobre el desarrollo de las plantas de vid (hay que ver como se referencia). En cuanto a la protección fitosanitaria hay que reseñar que parte del área cultivada de viñedo y olivo, dentro de la Grajera, está sujeta a la normativa de producción en Agricultura Ecológica.



Figura 1: Mapa de distribución de las diferentes zonas que componen La Grajera y que se detallan en la tabla1 (Escala 1:10.000).

Tabla 1. Descripción de las diferentes zonas que componen la Finca de La Grajera con su superficie y el porcentaje que ocupan dentro de la misma

Zonas Superficie (Ha) %

Áreas artificiales 18.86 4.77

Gramíneas 12.86 3.20

Viñedo 96.26 23.81

Olivar 18.47 4.57

Bosque 91.92 22.74

Vegetación dispersa 115.50 28.57

Pantano 13.12 3.25

Agua 37.24 9.21

Total 404.24 100



3.2. Toma de muestras.

La toma de muestras se realizó en la superficie destinada al cultivo del viñedo. Se diferenciaron cuatro zonas de muestreo:

CC Calle: Calle entre líneas de cultivo con cubierta vegetal. Las muestras fueron recogidas en el centro de la calle. CC Cepa: Líneas de cultivo con cubierta vegetal. Las muestras fueron recogidas a 50 cm del pie de la cepa en la misma línea de cultivo. SC Calle: Calle entre líneas de cultivo sin cubierta vegetal. Las muestras fueron recogidas en el centro de la calle. SC Cepa: Líneas de cultivo sin cubierta vegetal. Las muestras fueron recogidas a 50 cm de la cepa en la misma línea del cultivo.

Cada toma de muestra se realizó en un perfil de suelo entre 5 y 20 cm, recogiendo, aproximadamente, 500 gr de tierra de cultivo.

Se extrajeron dos muestras en cada zona de muestreo. En cada extracción se limpiaron con alcohol los utensilios (azada, pala jardinera,…) utilizados, evitándose así contaminaciones de unas tomas a otras.

Las muestras extraídas se llevaron a laboratorio, allí se colocaron cada una de ellas sobre un papel, en el que se detalló el origen de la misma (zona de muestreo donde se ha recogido). Se dejaron secar, en una habitación aireada, durante dos semanas.

3.3. Siembra de las diluciones.

Las muestras, se cribaron utilizando un tamiz de 2 mm y se pasaron cada una de ellas por separado, limpiando bien con alcohol al cambiar de muestra. De cada una de ellas se separaron 50 gramos.

Se tomaron 50 gramos de las dos muestras de la misma zona de muestreo y se juntaron, removiendo hasta uniformizar la mezcla. De estos 100 gramos, se escogieron 10 gramos y se introdujeron en un matraz, añadiéndose 90 ml de agua destilada, previamente esterilizada en autoclave. El matraz con la disolución, después de taparse se introdujo en un agitador a 120 r.p.m. durante 20 minutos.

Con esta disolución 10 -1 se cogieron 0,5 ml (500 µl) y se introdujeron en un tubo de ensayo, añadiendo 4,5 ml de agua esterilizada previamente en autoclave, obteniéndose una dilución 10-2. De cada dilución se sembraron 3 placas Petri de 9 cm de diámetro en medio de cultivo RB (rosa bengala), añadiendo 100 µl de la disolución en cada placa para cada zona de muestreo.

La siembra se llevó a cabo en una cámara de flujo, donde se mantenía encendido un mechero Bounsen para evitar las contaminaciones y desinfectar el asa Digralsky con la que se extendió la disolución depositada en cada placa.



Una vez sembrados se cerraron con parafilm las placas y se introdujeron en una cámara de incubación a 25ºC de temperatura y humedad del 80% durante 5 días. Al cabo de una semana, se tomaron las placas y se realizó el conteo del número de morfotipos y UFCs (unidades formadoras de colonias) que aparecían en cada placa. Después se eligieron los morfotipos de hongos más representativos y aquellos que no se habían aislado en estudios anteriores. Cada uno de los morfotipos se definió, con un código alfanumérico, según su color. Se marcó la posición en la placa donde fueron elegidos.

Se contaron el número total de colonias en cada una de las placas, tanto en el anverso como en el reverso, así como el número de morfotipos para calcular la riqueza de cada zona y las UFCs de cada morfotipo en las placas de la dilución 10-2.

3.4. Siembra de los morfotipos aislados.

Se seleccionaron 16 morfotipos para su identificación. Se prepararon cuatro placas Petri de 5 cm por morfotipo: dos con medio RB (Rosa Bengala) y dos con medio PDA (Patata dextrosa agar). La siembra de los aislados se llevó a cabo en la cámara de flujo, donde se mantuvo un mechero Bunsen de gas encendido para evitar contaminaciones y desinfectar la aguja con la que realizamos la extracción de parte del micelio de la placa matriz para su inoculación en las placas de aislados. Se cerraron con parafilm cada una de las placas y se introdujeron en la cámara de crecimiento a 25 ºC de temperatura, sin fotoperíodo, en oscuridad durante 24 horas y con humedad del 80 %.

Se mantuvieron en la cámara de crecimiento hasta que su desarrollo invadió la superficie total de la placa (en la mayoría de ellos), midiendo el crecimiento miceliar cada día, a partir del día siguiente a la siembra en cada una de las placas de los dos medios (PDA y RB), repitiéndose esta operación durante 12 días.

Al término de estas mediciones, se definieron las características más importantes de cada morfotipo aislado, describiéndose las características macroscópicas relacionadas con la forma, color, textura, topografía, presencia de anillos o radios en su desarrollo y aparición de exudados y/o secreciones.

3.5. Descripción de las características macroscópicas.

Las referencias para describir macroscópicamente los morfotipos aislados fueron las siguientes:

Forma

Punteada Circular Filamentosa Irregular Rizoide Lanceolada

Figura 2: Formas de desarrollo en placa de los aislados cultivados.



Topografía

Plana Elevada Convexa Cúpula Umbonada Umbilicada Figura 3: Topografía del desarrollo en placa de los aislados cultivados.

Textura

Textura algodonosa: Se caracteriza por un micelio aéreo denso y muy alto, con aspecto de algodón. Textura granular o pulverulenta: con facilidad se desmenuzan por la excesiva producción de conidias. Con frecuencia estos dos términos se intercambian, sin embargo la textura granular es más rugosa semejante al azúcar granulado, mientras que la pulverulenta parece harina. Textura terciopelo: Produce micelio aéreo bajo, con aspecto de felpa o terciopelo. Textura glabrosa o cerosa: No producen micelio aéreo, por lo tanto tienen una superficie pareja. Generalmente se presentan en las colonias de levaduras Figura 4: Textura del desarrollo en placa de los aislados cultivados

Color: Se hizo referencia al color del aislado en el anverso de la placa.

Crecimiento miceliar

Muy rápido o invasor: Ocupa la placa en 1 ó 2 días. Rápido: Ocupa la placa en 3-7 días. Moderado: Crece de 10-30 mm en 7-12 días. Lento: Crece menos de 10 mm en más de 12 días Figura 5: Velocidad de crecimiento miceliar.

3.6. Descripción microscópica de los morfotipos

Para el estudio microscópico se precisó de un microscopio con una lente de 100 aumentos en el que se pudiera acoplar una cámara fotográfica de precisión. Se dispuso de un “portaobjeto” además de cinta adhesiva de celo con la que se extrajo parte de la estructura del hongo para fijarla en el “portaobjeto” sin dañarla. Añadimos una gota de aceite de inmersión, cada vez que se observó al microscopio una muestra, para optimizar el paso de los rayos de luz y tener una imagen más nítida. Se miró cada muestra hasta lograr visualizar imágenes de hifas y/o esporas y cuerpos fructíferos, realizándose fotografías de las mismas.

Estas fotografías microscópicas junto con el estudio de crecimiento de los aislados y su descripción macroscópica nos ayudaron a determinar el género de varios de los morfotipos aislados.



Los hongos aislados fueron identificados en base a las características morfológicas macroscópicas y microscópicas usando las claves taxonómicas más relevantes (Ellis, 1971; Nelson et al., 1983; Samson and van Reenen-Hoekstra, 1988; Watanabe, 2002)

3.7. Índices ecológicos.

Después de determinar el número de morfotipos en las diferentes muestras, para las cuatro estaciones del año, se aplicaron a los resultados obtenidos los siguientes índices (Costa et al, 2012):

Índice de diversidad de Shannon-Wiener (H’)

Este índice es una medida de la incertidumbre para predecir a qué especie pertenecerá un individuo elegido al azar de una muestra de S especies y N individuos. Por lo tanto, H’ = 0 cuando la muestra contenga solo una especie, y, H’ será máxima cuando todas las especies S estén representadas por el mismo número de individuos ni.

Combina tanto la riqueza de especies como la equitabilidad:

H´= -

pi = ni/N donde: N: número total de morfotipos de la muestra ni: número de individuos de cada morfotipo

Varía entre valores de 0 y un valor máximo que suele estar cerca de 5, aunque hay ecosistemas excepcionalmente ricos que pueden superar este valor.

Indice de equitabilidad de Pielou (J´)

Este índice hace referencia a cómo la abundancia (número de individuos, biomasa, cobertura, etc.) se distribuye entre las especies de la comunidad. Por ejemplo, en una comunidad con 10 especies, si el 90% de los individuos pertenecen a una sola especie y el restante 10% se distribuye entre las otras 9, la equitabilidad se considera baja. En cambio, si cada una de las 10 especies cuenta con el 10% del total de los individuos, la equitabilidad se considera máxima.

H´: Índice de diversidad de Shannon-Wiener S: Riqueza de morfotipos de cada muestra

Adquiere valores comprendidos entre 0 y 1.



Índice de dominancia de Berger-Parker (d)

Tiene en cuenta parámetros inversos al concepto de uniformidad o equitabilidad de la comunidad. Mide la dominancia del morfotipo más abundante sin evaluar la contribución del resto de los morfotipos.

N max: Número de individuos del morfotipo más abundante

N total : Número de individuos de una muestra. Este índice adquiere valores comprendidos entre 0 y 1.



4. RESULTADOS.

4.1. Estudio general de las poblaciones de hongos.

Los datos obtenidos sobre población total de hongos, en cada una de las zonas de muestreo, en las diferentes estaciones se interpretan a partir de la tabla 1. La estación en la que se obtuvo la mayor población fue el otoño, especialmente en la calle con cubierta y en la línea de cepas sin cubierta.

ESTACIONES ECOSISTEMAS

CC CALLE CC CEPA SC CALLE SC CEPA

INVIERNO 23,00 26,33 18,33 22,00

PRIMAVERA 32,00 30,00 30,33 24,33

VERANO 26,33 22,00 33,33 27,00

OTOÑO 56,67 32,67 27,00 40,00 Tabla 2. Unidades formadoras de colonias (UFC x 103/ g de suelo) de hongos aislados en el viñedo de la Finca La Grajera.

En invierno, primavera y otoño el número de UFCs en la zona de muestreo con cubierta fue ligeramente más alto que en el de sin cubierta. En verano se dio el caso contrario, al obtenerse un mayor número de hongos en la zona sin cubierta, aunque las diferencias no fueron significativas.

Con respecto a los resultados en las zonas de muestreo de cepa y calle, se observó que en las calles (en las estaciones de primavera y verano) el número de hongos fue mayor que en las muestras recogidas en la línea de las cepas. En invierno el número de hongos fue mayor en las cepas, mientras que en el otoño las diferencias en la población fúngica entre calle y cepa son significativas, en la cubierta fue mayor en calle mientras que sin cubierta los mayores números los obtuvimos en la cepa.

4.2. Estudio general del número de morfotipos.

Los resultados relacionados con el número de morfotipos en cada uno de las zonas de muestreo en las diferentes estaciones se indican en la Figura 6. Se observó que el otoño es la estación que presentó mayor número de morfotipos en cada una de las zonas de muestreo. Los valores máximos se obtuvieron en la calle con cubierta vegetal y en la línea de cepas sin cubierta. Por el contrario, la estación de primavera es la que menos morfotipos presentó, con un valor mínimo en la calle sin cubierta.

En el caso de la cubierta, el mayor número de morfotipos se dio en las estaciones de invierno y otoño. En el muestreo sin cubierta, el menor número de morfotipos se obtuvo en la calle, significativamente más bajo en la estación de invierno con respecto al resto de las zonas de muestreo.



Figura 6. Número de morfotipos de cada muestra en las diferentes estaciones.

4.3. Estudio de los índices ecológicos.

La tabla 3 muestra los índices que se consideraron más representativos para valorar las poblaciones de hongos en el suelo.

INDICES ESTACIONES ECOSISTEMAS

CC Calle CC Cepa SC Calle SC Cepa

(J) Índice de equitabilidad de Pielou

INVIERNO 0,64 0,71 0,63 0,76

PRIMAVERA 0,82 0,72 0,78 0,74

VERANO 0,64 0,45 0,54 0,63

OTOÑO 0,48 0,73 0,52 0,69

(d) Índice de dominancia de Berger-Parker

INVIERNO 0,39 0,25 0,28 0,33

PRIMAVERA 0,21 0,26 0,33 0,25

VERANO 0,31 0,47 0,40 0,29

OTOÑO 0,62 0,23 0,27 0,28

(H´) Índice de diversidad de Shannon-Wiener

INVIERNO 2,69 2,91 2,27 2,97

PRIMAVERA 3,04 2,67 2,70 2,80

VERANO 2,43 1,90 2,20 2,46

OTOÑO 2,07 3,03 2,23 2,97 Tabla 3. Índices de equitabilidad de Pielou (J), de dominancia de Berger-Parker (D), y de diversidad de Shannon-Wiener (H´).

El índice de diversidad de Shannon varió en este estudio entre valores mínimos aproximados de 2 y valores máximos aproximados de 3. Se trata de valores que indican una diversidad media en consonancia con un monocultivo como es el viñedo

Destaca el valor (2,07) en el índice de Shannon-Wiener de otoño en la calle con cubierta vegetal, que se explica por la alta presencia del morfotipo B5 (41 UFCs) en

0

5

10

15

20

25

CC Calle CC Cepa SC Calle SC Cepa

Invierno

Primavera

Verano

Otoño



esta zona de muestreo incrementando la dominancia de este morfotipo frente al resto y haciendo que disminuya considerablemente el índice de diversidad. El valor más bajo de este índice (1,90) se da en verano en la línea de cepa con cubierta, donde aparece el menor número de morfotipos y se puede deber al exceso de competencia por la falta de humedad que hace que, solamente, aquellos más adaptados mantengan su actividad en esta época. (Ramos y Zúñiga, 2008).

El índice de equitabilidad de Pielou tiene su mayor valor en primavera, donde alcanza resultados muy altos en todas las zonas de muestreo. Su valor más bajo es en otoño en la calle con cubierta.

El índice de dominancia de Berger-Parker tiene valores por debajo de 0,5 en todas las estaciones y zonas de muestreo, salvo en otoño en la calle con cubierta.



4.4. Estudio detallado de los morfotipos y géneros identificados.

Tabla 4. Mofotipos que aparecen en los diferentes muestreos en las estaciones de 2013.

MORFOTIPOS

INVIERNO PRIMAVERA VERANO OTOÑO

CC CALLE CC CEPA SC CALLE SC CEPA CC CALLE CC CEPA SC CALLE SC CEPA CC CALLE CC CEPA SC CALLE SC CEPA CC CALLE CC CEPA SC CALLE SC CEPA

A1 1 1 2

A2 1 1 1

B1 1 3 1

B2 2 2 1 5 11 8 8 4 3 10 8 8 2 2

B3 1 1 2

B4 1 1 1 1 1 1 1 3 2 B5 1 4 5 3 4 6 2 8 8 2 6 41 4

B6 1 1 1 2 1 1 1 1 3 1 1 1 1 2

B7 2 4 1 10 3 8 2 4 1 6 2 9

G1 1 2

M1 2 9 1 8 12

N1 9 6 6 9 4 4 5 3 5 2

N2 5 3 1 1 2

N3 3 7 2 1 NA1 4 6 1

R1 3 1 1 1 6

R2 1 1

V1 1 1 2 1

V2 1 1

V3 1 1 1

V4 1 4 12 2 5 V5 3 3 6 3 1

V6

1 4 14 5 5



La tabla 4, nos dio una idea de la presencia y número de cada uno de los morfotipos en las diferentes zonas de muestreo en las cuatro estaciones del año. Los morfotipos B2, B5, B6 y B7 aparecen en todas las zonas de muestreo y en todas las estaciones, por lo que se puede decir que son aquellos que soportan mejor las variaciones edafoclimáticas y los diferentes manejos del suelo.

Los morfotipos G1, NA1 y N3, sólo aparecen en una estación del año, otoño, invierno y primavera respectivamente por lo que probablemente sean especies que aparezcan en unas condiciones ambientales específicas y se desarrollen, solamente, cuando estas condiciones sean propicias para su establecimiento. Solo N3 se encontró en las zonas con cubierta y sin cubierta y en las muestras de calle y en las de la línea.

El morfotipo V3 es exclusivo de la línea de cepas donde se realiza laboreo, apareciendo en todas la estaciones excepto en verano y los morfotipos A1, R2 y V2 son exclusivos de zonas de muestreo con cubierta vegetal.

En la zona con cubierta estarían representados todos los morfotipos aislados, mientras que en la zona sin cubierta no aparecerían 3 de los 16 morfotipos. En ambas hubo una representación de los géneros identificados.

En la calle sin cubierta sólo aparecen 6 de los 16 morfotipos identificados, quedándose sin representación los géneros Alternaria, Paecilomyces y Rhizopus.

En la línea de cepas con cubierta se quedaría sin representar el género Rhizopus y en la de sin cubierta aparecen todos los géneros.

4.5. Identificación de los aislados.

La evaluación de las características macro y microscópicas de los 16 aislados permitió identificar 5 géneros de hongos. Los morfotipos aislados (R1, A2 y B2) se quedaron sin determinar. Los morfotipos identificados pertenecen a los géneros: Aspergillus (A1, B1, N1, V2 y V5), Penicillium (B4, V3 y V4), Alternaria (N2 y V1), Paecilomyces (R2 y B3) y Rhizopus (G1).

En el ANEXO 1, se encuentran las imágenes del desarrollo del cultivo de los morfotipos aislados en placas con medio de cultivo PDA (Patata Dextrosa Agar) y las fotografías microscópicas de cada uno de ellos.



4.5.1. Género Aspergillus: Morfotipos A1, B1, N1, V2 y V5.

En la tabla 5, se detallan las características macroscópicas de los morfotipos identificados dentro del género Aspergillus que forman colonias entre aterciopeladas y granulosas.

Presentan hifas relativamente anchas, conidióforos rectos sin ramificar de tamaño variable que terminan en una vesícula apical que puede ser redonda, hemiesférica o elipsoidal. Las esporas, en ocasiones, tienen estrías en su contorno (Tabla 11 del ANEXO 1).

La velocidad de crecimiento miceliar en la placa fue entre moderada y rápida en los morfotipos de este género (Figura 7).

A1 B1 N1 V2 V5

Forma Circular Circular Ovalado-circular

Ovalado irregular

Circular

Color Marrón sobre fondo blanco

Blanco Negro sobre fondo amarillo transparente

Verde pistacho sobre fondo amarillo transparente

Verde negruzco en el centro

Textura Terciopelo granulosa

Pulverulenta Granulosa Granulosa Terciopelo-Granulosa

Topografía Ligeramente convexa

Plana Ligeramente convexa

Plana, ligeramente umbonada

Plana

Anillos Anillos exterior granuloso marrón

Anillos muy marcados

Anillos en el reverso

Anillos difuminados grumosos en el reverso

Anillos muy numerosos y marcados en el reverso

Radios Radios dispuestos de forma irregular en el reverso

Radios muy marcados en anverso y reverso

Radios en el anillo central

No presenta radios

Radios muy numerosos y marcados

Secreción Secreción amarillo transparente

Secreción amarillo chillón

Secreción amarillo transparente

Secreción amarillo claro

Secreción amarillo verdoso brillante

Exudados No se aprecian

Exudado con gotas gruesas y pequeñas

No se aprecian

No se aprecian Exudado en gotas pequeñas

Tabla 5. Descripción macroscópica de morfotipos identificados dentro del género Aspergillus en placas con medio de cultivo PDA (Patata Dextrosa Agar).



Figura 7. Gráfica del crecimiento en medio PDA expresada en mm/día

4.5.2. Género Penicillium: Morfotipos B4, V3 y V4.

En la tabla 6, se describen las características macroscópicas de aquellos morfotipos identificados dentro del género Penicillium, que presentan hifas relativamente delgadas que dan origen a conidióforos rectos y septados. Éstos pueden ser únicos (monoverticilados) o ramificados (bi o terverticilados)

Presentan el típico penicilio (pincel) con métulas y fiálides que generan conidios ovoides o elipsoides, unicelulares y en cadena (Tabla 12 del ANEXO 1)

En el desarrollo en placa del aislado aparecieron varias colonias que acabaron ocupando toda la superficie de la placa con un crecimiento lineal moderado (Figura 8).

B4 V3 V4

Forma Circular Ovalo-circular Ovalo-circular

Color Gris ceniza Verde grisácea Verde grisácea

Textura Terciopelo Pulverulenta

Terciopelo Pulverulenta

Terciopelo Pulverulenta

Topografía Plana, ligeramente umbonada

Ondulada como formando terrazas


Anillos Anillos muy marcados Anillos muy marcados Anillos muy marcados

Radios No presenta radios No presenta radios Radios muy marcados en el reverso

Secreción Secreción grisácea pulverulenta

Secreción grisácea Secreción gris transparente

Exudados No presenta exudado No presenta exudado No presenta exudado Tabla 6. Descripción macroscópica de morfotipos identificados dentro del género Aspergillus en placas con medio de cultivo PDA (Patata dextrosa Agar).

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A1

B1

N1

V2

V5




4.5.3. Género Alternaria: Morfotipos N2 y V1.

La tabla 7 incluye las características macroscópicas de los morfotipos N2 y V1, identificados dentro del género Alternaria que se caracteriza por presentar conidióforos septados, pigmentados simples o ramificados. Conidios oscuros, con septos transversales y longitudinales, pared lisa o rugosa, pueden estar solos o en cadenas (Tabla 13 del ANEXO 1).

En la placa, el desarrollo miceliar en la placa tuvo una velocidad de crecimiento moderada (Figura 9).

N2 V1

Forma Ovalado-circular Circular con perímetro irregular

Color Negro Verde, negruzco en el centro

Textura Pulverulenta Terciopelo Pulverulenta

Topografía Plana con ligero tono gris umbonado


Anillos Anillos difusos Anillos irregulares con manchas grumosas

Radios No presenta radios Radios marcados

Secreción Secreción gris amarillenta Secreción marrón amarillenta

Exudados No se aprecian No se aprecian Tabla 7. Descripción macroscópica de morfotipos identificados dentro del género Alternaria en placas con medio de cultivo PDA (Patata Dextrosa Agar).

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

B4

V3

V4



Figura 9. Gráfica del crecimiento en medio PDA expresada en mm/día.

4.5.4. Género Paecilomyces: Morfotipos B3 y R2.

La tabla 8 incluye las características macroscópicas de los dos morfotipos identificados dentro del género Paecilomyces que presenta conidióforos lisos o rugosos, ramificados en cuyo extremo se desarrollan fiálides de base ancha y cuello largo, conidios unicelulares lisos, elípticos o elipsoides (Tabla 14 del ANEXO 1).

En la placa el desarrollo del micelio tuvo un crecimiento rápido (Figura 10).

B3 R2

Forma Circular Circular

Color Blanco amarillento Blanco con tono verde difuso en el centro

Textura Terciopelo algodonosa Terciopelo

Topografía Plana, ligeramente umbonada Plana, muy ligeramente umbonada

Anillos Anillos marcados Anillos poco marcados

Radios No presenta radios Radios muy difusos

Secreción Secreción amarilla Secreción blanquecina

Exudados No se aprecian Exudados de gotas pequeñas en el centro

Tabla 8. Descripción macroscópica de morfotipos identificados dentro del género Paecilomyces en

placas con medio de cultivo PDA (Patata Dextrosa Agar).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

N2

V1




4.5.5. Género Rhizopus: Morfotipo G1.

En la tabla 9 se describen las características macroscópicas del morfotipo G1 identificado dentro del género Rhizopus presentando hifas aseptadas que terminan en la típica apófisis (hinchamiento apical del esporangióforo) circular. (Tabla 15 del ANEXO 1).

Micelio de crecimiento muy rápido (Figura 10).

G1 (Rhizopus)

Forma Circular

Color Gris blanquecino

Textura Algodonosa

Topografía Elevada

Anillos Anillos muy difusos en el reverso

Radios No presenta radios

Secreción No se observa secreción

Exudados No se aprecian Tabla 9. Descripción macroscópica del morfotipo identificado dentro del género Rhizopus en placas con medio de cultivo PDA (Patata Dextrosa Agar).

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

B3

R2




4.5.6. Géneros sin identificar: Morfotipos A2, B2 y R1. No se identificaron puesto que no se encontraron, en las observaciones

microscópicas, cuerpos de fructificación que se correspondieran con lo de un género concreto en las claves utilizadas.

El morfotipo A2 presenta hifas septadas que aparecen entrelazadas con esporas irregulares que se presentan agrupadas.

El morfotipo B2 presenta hifas septadas y esporas que aparecen agrupadas. El morfotipo R1 presenta hifas septadas y esporas circulares agrupadas. (Tabla

16 en el ANEXO 1) El crecimiento miceliar en la placa en estos casos fue rápido (Figura 11).

A2 B2 R1

Forma Circular Circular Circular

Color Blanco amarillento Blanco Blanco amarillento

Textura Terciopelo algodonosa Ligeramente algodonosa

Pulverulenta granulosa

Topografía Plana, ligeramente umbonada en el centro con un penacho blanco


Plana

Anillos Anillos poco marcados No presenta anillos Anillos marcados

Radios No presenta radios No presenta radios No presenta radios

Secreción Secreción amarillo marrón

Secreción amarillo marrón

Secreción blanco amarillenta

Exudados No se aprecian No se aprecian Exudado en gotas grandes en el centro y más pequeñas en el anillo extremo

Tabla 10. Descripción macroscópica de los morfotipos sin identificar en placas con medio de cultivo PDA (Patata Dextrosa Agar).

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

G1




0

10

20

30

40

50

60

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A2

B2

R1



5. DISCUSIÓN.

Los estudios sobre la biodiversidad fúngica en el suelo del viñedo no son muy habituales, hay mas información relacionada sobre la introducción y adaptación de AMF (hongos micorríticos arbusculares) (Adams, 2011) o sobre la presencia de posibles hongos patógenos o toxinas derivadas de alguno de ellos que pueden afectar negativamente al cultivo como la ocratoxina de Aspergillus ochraceus (Eltem et al, 2008). En este trabajo se han aislado 16 morfotipos de los que se han identificado 6 géneros, otros autores han llegado a identificar hasta 66 especies agrupadas en 16 géneros diferentes entre los que destacaban Aspergillus, Penicillium, Alternaria y Rhizopus, al igual que en nuestro estudio; pero también identificaron otros géneros como Cladosporium y Fusarium entre otros. (Eltem et al. 2008)

La mayoría de estos géneros se repiten en todos los trabajos relacionados con el estudio de los hongos del suelo independientemente del uso, manejo o cultivo que se lleve a cabo en él. Se han descrito en en plantaciones de melocotón en Italia (Manici y Caputo, 2010), bosques tropicales de La India (Satish et al. 2007), bosques atlánticos de Brasil (Costa et al. 2011), reservas forestales de Nigeria (Adeduntan, 2009), cultivos de Nogal en México e incluso en desiertos de Israel (Samaniego-Gaxiola and Chew-Madinaveitia, 2007).

En lo que se refiere al análisis de los resultados obtenidos en nuestro trabajo, la estación en la que se obtuvo la mayor población de hongos y se observó el mayor número de morfotipos fue el otoño. Se puede deber a que la temperatura y la humedad en esta estación son más adecuadas para la proliferación de hongos, además del enriquecimiento que se produce en el suelo con la materia vegetal que se desprende de las plantas. El hecho de que la calle sin cubierta, en esta estación, tenga las menores poblaciones puede estar influido por la falta de exudados radiculares que procuren un medio nutricional adecuado para su desarrollo (Fokkema and Schippers, 1986; Martínez Peña, 2008).

En general, la población de hongos fue mayor en las zonas con cubierta, sin embargo, en verano, se dio el caso contrario. Una de las razones posibles es que, en esta época, la competencia por el agua es mayor en la zona con cubierta ya que la evapotranspiración es muy elevada, aspecto que puede provocar el descenso de población que se observa en esta estación (Ramos and Zúñiga, 2008). Pasó lo mismo, probablemente por este motivo, con el índice de diversidad de Shannon que obtuvo su valor más bajo en esta estación (1,90) en la línea de cepa con cubierta.

Se observó que en el caso de la cubierta se contabilizaron un mayor número de individuos en la zona de calle que en la zona de cepa en todas las estaciones salvo en invierno. Esto puede ser debido a que en las zonas con cubierta vegetal, los exudados radiculares proporcionan recursos nutricionales para las poblaciones de hongos (Medina, 2012). En el invierno la poca actividad general, tanto de la cubierta como del cultivo, puede provocar que la actividad fúngica disminuya y los datos obtenidos varíen en este sentido. En la zona sin cubierta la población fúngica fue relativamente menos abundante, esto puede explicarse por la poca disponibilidad de los recursos nutricionales (reserva de carbono orgánico en el suelo) y en el caso de las estaciones



frías por la mayor exposición de los hongos a las bajas temperaturas (Ramos and Zúñiga, 2008).

El número de morfotipos encontrado en las líneas de cepas mantiene unos valores similares para las zonas de muestreo con cubierta y sin cubierta en las distintas estaciones. Este resultado puede deberse a que el cultivo del viñedo mantiene unas condiciones óptimas en el entorno radicular de la cepa que favorecen el asentamiento de una serie de hongos que se ven poco condicionados por el resto de factores que pueden influir en su desarrollo.

En cuanto al estudio de la diversidad fúngica, se evaluó en función del índice de Shannon que varió en nuestro trabajo entre valores mínimos aproximados de 2 y valores máximos aproximados de 3. Estos resultados estarían en consonancia con los datos publicados en estudios realizados en suelos de viñedo en Saruhanli (Turquía) donde se obtuvieron valores máximos de este índice de 3,28.(Eltem el al., 2008), los llevados a cabo en viñedos en Eskisehir (Turquía) que alcanzaron valores máximos del índice de Shannon de 3,55. (Demirel et al, 2005) o también, en viñedos de los Altos del Golán (Israel) que llegaron a unos valores máximos de este mismo índice de 2,82 (Grishkan y Nevo, 2004). Se puede convenir, en base a esta información, que los valores obtenidos en nuestro estudio indican una diversidad media, acorde con los valores de diversidad que podemos encontrar en un monocultivo como es el viñedo.

Los resultados obtenidos no indican que la biodiversidad fúngica en el suelo sea mayor en el viñedo con cubierta vegetal que en el manejo con laboreo convencional. Sin embargo, datos como que el mayor número de morfotipos y de UFCs se den en esta zona, nos ayuda a pensar que haya mayor actividad fúngica ya que la cubierta vegetal contribuye, con fotoasimilados a nivel radicular, a incrementar los recursos como la fuente de carbono para los microorganismos del suelo además de favorecer la formación y la estabilidad de los agregados, mejorando el hábitat donde éstos se desarrollan al incrementar el movimiento de gases, la humedad y las reservas del suelo (Barriga, 2009).

Tanto en el manejo con laboreo, donde se rompen los agregados del suelo y los entramados de hifas y micelios que forman ciertos hongos (Simpson et al., 2004), como en el manejo con herbicida, donde se reducen los recursos de carbono al eliminar la vegetación de la que se derivan parte de éstos, se influye negativamente sobre la vida microbiana en el suelo y por consiguiente se estaría influyendo sobre el número y la diversidad de hongos (Soto González et al, 2010).

Como cada vez parece más interesante el uso de la cubierta vegetal en el viñedo, bien sea para evitar la erosión en terrenos con pendiente o bien para controlar el vigor del viñedo con criterios de sanidad vegetal y calidad de la uva (Aguirrezábal et al, 2012; Ibánez, 2013), se considera por nuestra parte necesario el estudio aplicado a distintas clases de cubierta que cumplan estos cometidos y que nos permitan valorar cómo influyen éstas en la diversidad fúngica del suelo.



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7. AGRADECIMIENTOS.

En primer lugar, agradecer a mi directora del Trabajo de fin de Carrera, María del Mar Hernández Álamos la oportunidad de participar en un Proyecto de Investigación cuyo ámbito me ha resultado muy interesante.

Agradecer el apoyo desinteresado de Miguel, María y Raquel que han estado ahí cuando he requerido su ayuda.

Por último, el más grande de los agradecimientos a mi madre que siempre me ha ayudado a seguir con lo que me he propuesto, a Merche, Guille y Lucas por ese tiempo que les he robado, a mis hermanos que siempre me han apoyado y dedicárselo especialmente a mi padre, a quien le debo, entre otras muchas cosas, haber hecho esta carrera.



8. ANEXO 1.

Imagen macroscópica Imágenes microscópicas

A1

B1

N1

V2

V5

Tabla 11. Imágenes de los morfotipos identificados dentro del género Aspergillus.




B4

V3

V4

Figura 12. Imágenes de los morfotipos identificados dentro del género Penicillium.




N2

V1

Figura 13. Imágenes de los morfotipos identificados dentro del género Alternaria.

Imagen Macroscópica Imágenes Microscópica

B3

R2

Figura 14. Imágenes de los morfotipos identificados dentro del género Paecilomyces.




G1

Figura 15. Imágenes del morfotipo identificado dentro del género Rhizopus.


A2

B2

R1

Figura 16. Imágenes de los morfotipos sin identificar.

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