ESTUDIO DE CASO DE UNA POBLACIÓN ESTUDIO DE CASO DE UNA POBLACIÓN EXPUESTA A PAH EN MÉXICOEXPUESTA A PAH EN MÉXICO

Dra. Ania Mendoza CantúDra. Ania Mendoza Cantú

Determinación del genotipo y fenotipo del CYP1A2 Determinación del genotipo y fenotipo del CYP1A2 en una población expuesta a Hidrocarburos en una población expuesta a Hidrocarburos

Aromáticos Policíclicos Aromáticos Policíclicos

CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL IPN

Q.F.B. Fabiola Castorena TorresQ.F.B. Fabiola Castorena Torres

Sección Externa de Toxicología

* Sólidos a temperatura ambiente

* Altos puntos de fusión

* Lipofílicos

Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (PAH)Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (PAH)

NaftalenoNaftaleno AntracenoAntraceno FluorenoFluoreno

PirenoPireno

Benzo[a]pirenoBenzo[a]pireno

CrisenoCriseno

Efectos Tóxicos de los PAH en el HumanoEfectos Tóxicos de los PAH en el Humano

Dosis letal oral (mg)

5000-15000 adulto

2000 niño

* Toxicidad aguda Se requieren altas concentracionesSe requieren altas concentracionesde PAH para presentar toxicidadde PAH para presentar toxicidadagudaaguda

*Toxicidad crónica Efectos degenerativos, principalmente Efectos degenerativos, principalmente procesos cancerígenos entre procesos cancerígenos entre los que selos que se encuentran cáncer de pulmón, piel, encuentran cáncer de pulmón, piel, vejiga, esófago, laringe y lengua, entre vejiga, esófago, laringe y lengua, entre otros otros

Biomarcadores a PAH Biomarcadores a PAH

DañoDaño

CáncerCáncer

EfectoEfectoTempranoTemprano

InducciónInducciónde CYP1A2de CYP1A2

ExposiciónExposición

BaseBaseGenéticaGenética

FenotipoFenotipo

GenotipoGenotipo

Polimorfismo Genético del Polimorfismo Genético del CYP1A2 CYP1A2

MutaciónMutación FrecuenciaFrecuencia

%%

Efecto Efecto ReferenciaReferencia

Región del promotor -2964 ( n=116)

77 G/G

18 G/A

5 A/A

Actividad

Nakajima y cols.,1999.

Intrón 1 734 (n=216)

10 C/C

44 C/A

46 A/A

Actividad

Sachse y cols.,1999.

5´ 1 2 3 4 5 6 73´

P1f P4fR2

R3Bsp120I

15q15q

BslI

Evaluar en una población la relación entre Evaluar en una población la relación entre fenotipo y el genotipo del CYP1A2 con la fenotipo y el genotipo del CYP1A2 con la

exposición a PAH exposición a PAH

Objetivo GeneralObjetivo General

2. Evaluar el fenotipo del CYP1A2 (indicador de efecto temprano)

Actividad enzimática mediante el CMR

Contenido de mRNA

Objetivos Particulares

1. Evaluar la exposición a PAH mediante la cuantificación de 1-OH pireno 1. Evaluar la exposición a PAH mediante la cuantificación de 1-OH pireno

en orina (indicador de exposición)en orina (indicador de exposición)

3. Determinar el genotipo del CYP1A2 (indicador de susceptibilidad)3. Determinar el genotipo del CYP1A2 (indicador de susceptibilidad)

4. Determinar la relación estadística entre los parámetros evaluados 4. Determinar la relación estadística entre los parámetros evaluados

REGIÓN CARBONÍFERAREGIÓN CARBONÍFERA(Hornos de Coquizado)(Hornos de Coquizado)

-BARROTERAN, Muz.BARROTERAN, Muz.-CLOETE, Sab.CLOETE, Sab.-JUÁREZ, Jua.JUÁREZ, Jua.

Diseño del estudioDiseño del estudio

Cuestionario Toma de muestraCuestionario Toma de muestra

Contempló: Estilo de vida, hábitos alimenticiosContempló: Estilo de vida, hábitos alimenticios

historia clínica, historia laboral historia clínica, historia laboral

Participaron 46 individuosParticiparon 46 individuos

14 individuos de Barroterán 14 individuos de Barroterán

Muestreo 13 individuos de Cloete Muestreo 13 individuos de Cloete

19 individuos de Juárez 19 individuos de Juárez

Individuos sanos, mayores de 18 años, Individuos sanos, mayores de 18 años,

Criterios de inclusión de sexo masculino, que firmaran el Criterios de inclusión de sexo masculino, que firmaran el

consentimiento informadoconsentimiento informado

que pertenecieran a la zona de estudioque pertenecieran a la zona de estudio

Diseño de corte transversal, muestreo por convenienciaDiseño de corte transversal, muestreo por conveniencia

Estrategia del EstudioEstrategia del Estudio

Cuestionario Cuestionario MuestreoMuestreo

Sangre –EDTASangre –EDTA

Sangre Sangre SueroSuero

DNADNA mRNA mRNA

Polimorfismo Polimorfismo CYP1A2CYP1A2

Cuantificación Cuantificación mRNAmRNA

Pruebas de Pruebas de

funcionamientofuncionamiento hepático y renalhepático y renal

OrinaOrina

Metabolitos Metabolitos cafeínacafeína

1-OHP1-OHP

Determinación del 1-hidroxipirenoDeterminación del 1-hidroxipireno (Jongeneelen y cols., 1986)(Jongeneelen y cols., 1986)

Niveles de 1- Hidroxipireno por poblado Niveles de 1- Hidroxipireno por poblado

1414

1313

1919

4646

2.3 2.3 ± 1.53± 1.53

(n.d – 6.38) (n.d – 6.38)

0.452 ± 0.980.452 ± 0.98

(n.d -2.80)(n.d -2.80)

0.038 ±0.0760.038 ±0.076

(n.d – 0.453)(n.d – 0.453)

0.083 ± 1.660.083 ± 1.66

Barroterán (trabajadores)Barroterán (trabajadores)

IntervaloIntervalo

Cloete (ex-trabajadores)Cloete (ex-trabajadores)

IntervaloIntervalo

Juárez Juárez

IntervaloIntervalo

TotalTotal

nn1-OHP 1-OHP

((mol/mol creatinina)mol/mol creatinina)

media media ± D.S± D.S

PobladoPoblado

n.d-. Niveles que están por debajo de 1 nmol/L. n.d-. Niveles que están por debajo de 1 nmol/L. El Limite de Evaluación Biológica para la TRK (Guía Técnica Alemana) es de 4.2-5.8 El Limite de Evaluación Biológica para la TRK (Guía Técnica Alemana) es de 4.2-5.8 mol/mol mol/mol de creatinina de creatinina

Determinación del polimorfismo del CYP1A2Determinación del polimorfismo del CYP1A2

Polimorfismo en la RegiónPolimorfismo en la Región

del promotordel promotor

((Nakajima y cols., 1999Nakajima y cols., 1999))

Polimorfismo en elPolimorfismo en el

Intron IIntron I(Sachse y cols., 1999)(Sachse y cols., 1999)

8501500

650pb

M C/C A/A C/A

1500 500

PCR-RFLP del gen PCR-RFLP del gen CYP1A2CYP1A2

TGGGCCCAGGATGGGCCCAGGA

AA

734734

Enzima de restricción Enzima de restricción Bsp120IBsp120I

Frecuencia del Polimorfismo del Frecuencia del Polimorfismo del CYP1A2CYP1A2

Polimorfismo genético Polimorfismo genético CYP1A2CYP1A2

GenotipoGenotipo n n  FrecuenciaFrecuencia%%

Total Total (n)(n)

Región del promotor(-2964)   Intrón I (734)

G/G G/G G/AG/AA/AA/A

C/C C/C C/AC/AA/AA/A

181817171111  00

212125 25 

37.537.539.539.52323  00

45455555

 4646   

4646

Evaluar el fenotipo del CYP1A2Evaluar el fenotipo del CYP1A2

Determinación de la actividad enzimática Determinación de la actividad enzimática del CYP 1A2 (CMR) del CYP 1A2 (CMR) (Extracción por el método modificado de Grand y cols., 1983 y la (Extracción por el método modificado de Grand y cols., 1983 y la determinación por HPLC por el método de Berthou y cols., 1989)determinación por HPLC por el método de Berthou y cols., 1989)

Relación de los Metabolitos de la Cafeína en OrinaRelación de los Metabolitos de la Cafeína en Orina

Índice de la actividad enzimática del CYP1A2 (CMR)Índice de la actividad enzimática del CYP1A2 (CMR)

CYP1A2 = (AFMU+1-MU+1-MX) 1,7-DMU

(Campbell y cols., 1987)(Campbell y cols., 1987)

Análisis semicuantitativo del mRNAAnálisis semicuantitativo del mRNA(Gilliland y cols., 1990 modificado por Vanden Hiuvel y cols., 1993 )(Gilliland y cols., 1990 modificado por Vanden Hiuvel y cols., 1993 )

Muestras de sangre

Extracción de RNA total

PCR con oligos CYP1A2

Purificación de Linfocitos

646

738

Ensayos de RT-PCR semicuantitativoEnsayos de RT-PCR semicuantitativo

cDNA- Kit comercialcDNA- Kit comercial cDNA estándarcDNA estándarGAPDHGAPDH

El índice de la actividad enzimática del CYP1A2 se expresa como el CMR ( caffeine metabolic ratio), El índice de la actividad enzimática del CYP1A2 se expresa como el CMR ( caffeine metabolic ratio), n.d niveles no detectablesn.d niveles no detectables

(1.11 -12.7)

(n.d - 3.65)

2.51 ± 1.77

0.83 ± 0.33

Actividad enzimática

Niveles de mRNA del CYP1A2

IntervaloNivel PromedioPromedio

Variable

Fenotipo del CYP1A2 en la Población EstudiadaFenotipo del CYP1A2 en la Población Estudiada

Resultados de la población Resultados de la población

Características Generales de la Población

22-8422-84

60-11060-110

1.56-1.861.56-1.86

20.04-38.6220.04-38.62

25-47.525-47.5

31-4531-45

80.9-12780.9-127

49.14 49.14 ± 15.07± 15.07

80.13 ± 80.13 ±

1.69 ± 1.69 ±

27.64 ±27.64 ±

27 ± 27 ±

35.06 ± 35.06 ±

86.84 ± 19 86.84 ± 19

Edad (años)Edad (años)

Peso (kg)Peso (kg)

Talla (m)Talla (m)

IMC*IMC*

TGO (U/L)TGO (U/L)

TGP (U/L)TGP (U/L)

Depuración de Depuración de creatinina (ml/min)creatinina (ml/min)++

IntervaloPromedio ± D.SCaracterísticas de la población

14

0.307.60

17.6

6.0

Análisis de EstadísticoAnálisis de Estadístico

Variables Evaluadas Estratificadas por GenotipoVariables Evaluadas Estratificadas por Genotipo

Nativon=18

Heterocigoton=17

Homocigoto mutado n=11

IMC +

Media ± S.DIntervalo 1-OHP †

Media ± S.DIntervalo 

Actividad CYP1A2∞

Media ± S.DIntervalo 

mRNAMedia ± S.Dintervalo

 

28.77 ±1.25(22.04-24.36)  0.765 ± 0.9939(0.008-6.38)  1.31 ± 2.932(1.11-12.70)

0.8092 ± 2.067(0.097-3.21)

 

27.71 ± 5.67(24-39.03)   0.7803 ± 0.84(0.055-3.85)  1.45 ± 2.66(1.2 -7.93)

0.9937 ± 0.6032(0.45 ± 0.9194)

 

26.98 ± 3.50(22.54-32.56)  0.571 ± 0.723(0 -1.79)  0.774 ± 3.26(1.12 -6.00) 

0.642 ± 2.77(0.051- 1.7)

VariableVariable

PromotorPromotor

 IMC +

Media ± S.DIntervalo 1-OHP †

Media ± S.DIntervalo

mRNAMedia ± D.SIntervalo 

Actividad CYP1A2♣

Media ± S.DIntervalo

  

*Expresado como la media geométrica, + Índice de masa corporal expresado como Kg/m2, † Expresado en mol/mol de creatinina, ∞ actividad enzimática dada por la relación de [(AFMU+1MX+1MU)/17DMU], ♣ aplicando la prueba estadística de ANOVA, ☼ ☼ (p<0.001)(p<0.001), valores similares a , valores similares a los detectados por Sachse, y cols., 1999 (C/A 0.82, A/A 1.37)los detectados por Sachse, y cols., 1999 (C/A 0.82, A/A 1.37)

VariableIntrón I

Heterocigoton=20

Homocigoto mutadon=26

  27.00 ± 4.86(21.0 – 27.02)  1.08 ± 1.35(0.087 – 3.30)  0.8101 ± 1.001(0.051-3.65)

0.7446 ± 2.860.7446 ± 2.86(1.11 – 4.76)(1.11 – 4.76)

  28.65 ± 5.63(20.54 ± 39.06)  0.466 ± 2.40(0.009 – 6.38)  0.864 ± 0.536(0.097 -2.153)

1.99±2.531.99±2.53☼☼(1.32 – 12.70)(1.32 – 12.70)

Tabaquismo, consumo de alimento con cierta carga de PAH, Tabaquismo, consumo de alimento con cierta carga de PAH, consumo de bebidas, alimentos y golosinas con cierta carga de consumo de bebidas, alimentos y golosinas con cierta carga de

cafeína, consumo de alcoholcafeína, consumo de alcohol

Aplicando la prueba estadística de ANOVA, con una p>0.05Aplicando la prueba estadística de ANOVA, con una p>0.05

Posibles factores que nos pudieran dar un cambio en la actividad Posibles factores que nos pudieran dar un cambio en la actividad enzimática del CYP1A2 o en los niveles de 1-OHPenzimática del CYP1A2 o en los niveles de 1-OHP

Relación entre la actividad enzimática el nivel de 1-OHP y Relación entre la actividad enzimática el nivel de 1-OHP y el polimorfismo en el intrón I del CYP1A2el polimorfismo en el intrón I del CYP1A2

Aplicando una regresión lineal, Aplicando una regresión lineal, A/AA/A ( (= 0.0730, = 0.0730,

rr2 2 =0.096 p=0.50 ), C/A (b= 0.059, rb= 0.059, r22 =0.049 p=0.50)

Aplicando una regresión lineal, Aplicando una regresión lineal, = 0.8755, = 0.8755,

rr22= 0.18, p<0.001

C/C Nativo, C/A Heterocigoto, C/C Nativo, C/A Heterocigoto, A/A Homocigoto mutado/A Homocigoto mutado

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

C/C C/A A/AC/C C/A A/A

(P<0.001)(P<0.001)

CM

R U

rin

aria

(L

og)

C/A

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2

CM

R U

rin

aria

(L

og

)

1- OHP (mol/mol de creatinina)

A/A

C/A

ConclusionesConclusiones

1.1. La mutación localizada en el intrón ILa mutación localizada en el intrón I

Para el alelo mutado (A/A) observó una frecuencia de 76%, Para el alelo mutado (A/A) observó una frecuencia de 76%, el cual está relacionado con un incremento en la actividad el cual está relacionado con un incremento en la actividad enzimática CYP1A2 y puede ser un factor de riesgo en enzimática CYP1A2 y puede ser un factor de riesgo en algunas alteraciones asociadas con la exposición PAH algunas alteraciones asociadas con la exposición PAH (cáncer)(cáncer)

2. 2. La variabilidad fenotípica observada en los individuos La variabilidad fenotípica observada en los individuos mutados con respecto a los heterocigotos para el mutados con respecto a los heterocigotos para el polimorfismo en el intrón I fue estadísticamente significativa polimorfismo en el intrón I fue estadísticamente significativa ((pp<<0.001) 0.001)

3. Para la mutación en el promotor (-2964) la frecuencia del alelo mutado fue del 58% y para el aleo nativo fue del 42%. No se observó una diferencia entre este polimorfismo y la actividad del CYP1A2

4. Existe una tendencia a presentarse mayor actividad enzimática del CYP1A2 respecto a los niveles de exposición.

5. No existe relación entre los niveles de exposición y los niveles del mRNA para esta isoforma

ConclusionesConclusiones