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ESTUDIO CROMATOGRÁFICO POR HPLC-UV, CUANTIFICACIÓN DE FENOLES, FLAVONOIDES Y EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE EN MIEL DE ABEJAS LAURA XIMENA ANGARITA SALAMANCA DIANA MARCELA COBOS TORRES UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA BOGOTÁ, COLOMBIA 2017
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ESTUDIO CROMATOGRÁFICO POR HPLC-UV, CUANTIFICACIÓN DE
FENOLES, FLAVONOIDES Y EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD
ANTIOXIDANTE EN MIEL DE ABEJAS
LAURA XIMENA ANGARITA SALAMANCA
DIANA MARCELA COBOS TORRES
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
BOGOTÁ, COLOMBIA
2017
ESTUDIO CROMATOGRÁFICO POR HPLC-UV, CUANTIFICACIÓN DE
FENOLES, FLAVONOIDES Y EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD
ANTIOXIDANTE EN MIEL DE ABEJAS
LAURA XIMENA ANGARITA SALAMANCA
DIANA MARCELA COBOS TORRES
TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE LICENCIADAS EN
QUÍMICA
DIRECTORES:
WILLIAM FERNANDO CASTRILLÓN CARDONA
QUÍMICO, ESPECIALISTA EN EDUMATICA, MAGISTER EN CIENCIAS
AMBIENTALES
WILLY FERNANDO CELY VELOZA
MAGISTER EN QUÍMICA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
BOGOTÁ, COLOMBIA
2017
AGRADECIMIENTOS
A Dios por guiarnos y no dejarnos desfallecer.
A nuestras familias por estar presentes durante todo el proceso, apoyándonos
incondicionalmente y alentándonos a culminar ésta etapa.
A la Universidad Militar Nueva Granada, especialmente al profesor Ericsson Coy al
abrirnos las puertas y permitirnos trabajar en las instalaciones del Laboratorio de
InQuiBio y a Willy Cely Veloza por guiarnos y ayudarnos a terminar éste anhelado
proceso.
A la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, a William Castrillón y Javier
Matulevich por darnos la oportunidad de realizar ésta investigación.
CONTENIDO
JUSTIFICACIÓN ................................................................................................... 12
PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN ....................................................................... 13
OBJETIVOS .......................................................................................................... 14
OBJETIVO GENERAL ....................................................................................... 14
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................. 14
CAPÍTULO 1: ....................................................................................................... 15
ESTADO DEL ARTE ............................................................................................. 15
1.1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................ 15
1.2. ESTADO ACTUAL DEL TEMA ................................................................... 17
1.2.1. Apicultura en Colombia ......................................................................... 17
1.2.2. Abeja que prolifera en Colombia ........................................................ 19
1.2.3. Ciclo de vida y desarrollo de la abeja ................................................ 21
1.2.4. Miel de abejas.................................................................................... 22
1.2.5. Composición de la miel ...................................................................... 23
1.2.6. Flavonoides y compuestos fenólicos presentes en la miel ................ 25
1.3. MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN .......................................................... 29
1.3.1. Contenido de fenoles totales (CFT) por el método de Folin-Ciocalteu .. 29
1.3.2. Determinación del contenido de flavonoides (CF) ................................ 30
1.4. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE .............................. 31
QUIMIOMETRÍA ................................................................................................ 35
REFERENCIAS.................................................................................................. 36
CAPÍTULO 2: ........................................................................................................ 40
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE, CUANTIFICACIÓN DE FENOLES Y
FLAVONOIDES EN MIEL DE ABEJAS ................................................................. 40
2.1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................ 40
2.2.1. General ................................................................................................. 41
2.2.2. Colecta del material .............................................................................. 42
2.2.3. Tratamiento térmico .............................................................................. 43
2.2.4. Liofilización de la miel ........................................................................... 44
2.2.5 Extracción sólido- líquido ....................................................................... 44
2.2.6. Preparación de las soluciones de trabajo ............................................. 44
2.2.7. Cuantificación del contenido de fenoles totales (CFT) .......................... 44
2.2.8. Cuantificación del contenido de flavonoides (CF) ................................. 45
2.2.9. Capacidad antioxidante ........................................................................ 45
2.2.10. Análisis Estadístico ............................................................................. 46
2.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.................................................................... 46
2.3.1. Efecto del tratamiento térmico .............................................................. 46
2.3.2. Cuantificación de CFT .......................................................................... 48
2.3.3. Cuantificación de CF ............................................................................. 49
2.3.4. Capacidad antioxidante por el ensayo de FRAP .................................. 51
2.3.5. Evaluación de la capacidad antioxidante por el ensayo de DPPH y ABTS
........................................................................................................................ 52
2.3.6. Análisis de varianza y test de Tukey ..................................................... 57
2.3.7. Correlación de Pearson entre variables espectrofotométricas .............. 58
2.4. CONCLUSIONES ....................................................................................... 60
REFERENCIAS.................................................................................................. 62
CAPÍTULO 3 ......................................................................................................... 65
PERFIL CROMATOGRÁFICO POR HPLC-UV DE FRACCIONES METANÓLICAS
DE MIEL DE ABEJAS ENRIQUECIDAS EN COMPUESTOS FENÓLICOS ......... 65
3.1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................ 65
3.2. MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................... 66
3.2.1. Preparación de muestras ...................................................................... 67
3.2.2. Perfilado por HPLC-UV ......................................................................... 67
3.2.3. Pretratamiento de datos cromatográficos ............................................. 67
3.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.................................................................... 67
3.3.1. Comparación de los perfiles cromatográficos de las fracciones de mieles
de abejas con y sin tratamiento térmico.......................................................... 70
3.4. CONCLUSIONES ....................................................................................... 78
REFERENCIAS.................................................................................................. 79
CONCLUSIONES GENERALES Y RECOMENDACIONES .................................. 81
ANEXOS ............................................................................................................... 83
ÍNDICE DE TABLAS
Capítulo 1:
Tabla 1-1. Taxonomía de la abeja doméstica........................................................ 20
Tabla 1- 2.Periodo de desarrollo de crecimiento de la abeja. ............................... 21
Tabla 1-3. Principales constituyentes de los carbohidratos en la miel .................. 23
Tabla 1-4.Resultados ORAC para compuestos fenólicos y flavonoides de mieles
chilenas ................................................................................................................. 26
Tabla 1-5. Contenido de flavonoides totales en distintas muestras de mieles
expresado como EQ/100 g muestra ...................................................................... 28
Capítulo 2:
Tabla 2-1.Medias del CFT y CF de las muestras de mieles .................................. 48
Tabla 2-2.Intervalos de correlación de Pearson. ................................................... 58
Capítulo 3:
Tabla 3-1.Tiempos de retención reportados en estudios de miel de abejas para
diferentes compuestos fenólicos ........................................................................... 76
Tabla 3-2.Posibles compuestos para las señales obtenidas en los perfiles
cromatográficos ..................................................................................................... 76
Tabla 3-3.Absorción espectral de varias clases de flavonoides ............................ 77
Anexos
Tabla de anexos 2-1.Ubicación y fecha de colecta de las muestras de mieles ..... 83
Tabla de anexos 2-2.Datos totales de CFT, CF, FRAP, ABTS y DPPH ................ 84
ÍNDICE DE FIGURAS
Capítulo 1:
Figura 1-1. Colmena Langstroth (colmena moderna) ............................................ 18
Figura 1-2. Apis mellifera (A), Meliponinae (B) ...................................................... 20
Figura 1-3.Ciclo de vida y desarrollo de la abeja ................................................... 22
Figura 1-4.Flavonoides presentes en la miel chilena. (1) pinocembrina, (2)
pinobanksina, (3) quercetina, (4) kaempferol, (5) crisina, (6) galangina ................ 26
Figura 1-5.Reacción de Folin-Ciocalteu para la cuantificación espectrofotométrica
de compuestos fenólicos ....................................................................................... 30
Figura 1-6.Reacción de AlCl3 para la cuantificación espectrofotométrica de
flavonoides ............................................................................................................ 31
Figura 1-7.Estructura del DPPH antes y después de la reacción con el agente
antioxidante ........................................................................................................... 32
Figura 1- 8.Mecanismo de reacción del DPPH...................................................... 32
Figura 1-9.Estructura del ABTS antes y después de la reacción con el antioxidante
.............................................................................................................................. 33
Figura 1-10.Mecanismo de reacción del ABTS antes y después de la reacción con
el antioxidante ....................................................................................................... 34
Figura 1-11.Reducción del Fe3+ (rojo) a Fe2+ (azul) por el método FRAP. ............ 34
Figura 1-12.Mecanismo de reacción de reducción del hierro por el método FRAP.
.............................................................................................................................. 35
Capítulo 2:
Figura 2-1.Diagrama general de la metodología de investigación realizada ......... 41
Figura 2-2.Relación entre los departamentos y lugares de colecta de cada muestra
de miel de abejas .................................................................................................. 42
Figura 2-3.Contenido total de fenoles de las fracciones acuosas obtenidas de miel
de abejas ............................................................................................................... 48
Figura 2-4. Contenido de flavonoides de las fracciones acuosas obtenidas de miel
de abejas ............................................................................................................... 50
Figura 2-5.Capacidad antioxidante por el ensayo de FRAP con agrupaciones según
el test de Tukey ..................................................................................................... 51
Figura 2-6.Resultado positivo para el ensayo de FRAP ........................................ 51
Figura 2-7.IC50 para el ensayo de DPPH de las mieles de SR, M, GT y B ............ 52
Figura 2-8.IC50 para el ensayo de ABTS de las mieles de Bo, C, S y G ............... 53
Figura 2-9.Resultado positivo para el ensayo DPPH (a) y ABTS (b) de las muestras
más activas ........................................................................................................... 53
Figura 2-10.Capacidad antioxidante en términos de IC50 para el ensayo de DPPH
.............................................................................................................................. 54
Figura 2-11.Capacidad antioxidante en términos de IC50 para el ensayo de ABTS
.............................................................................................................................. 55
Figura 2-12.Correlación de Pearson entre variables espectrofotométricas en las
fracciones acuosas de miel. .................................................................................. 59
Capítulo 3:
Figura 3-1.Diagrama general de la metodología implementada para el perfilado
metabólico por HPLC-UV de las fracciones metanólicas de miel .......................... 66
Figura 3-2.Perfil cromatográfico comparativo de las 40 fracciones metanólicas de
mieles .................................................................................................................... 68
Figura 3-3.Perfil cromatográfico en 3D de las 40 fracciones metanólicas de mieles
.............................................................................................................................. 69
Figura 3-4.Perfiles cromatográficos de las muestras sin tratamiento térmico (a) y con
tratamiento térmico (b) .......................................................................................... 70
Figura 3-5.Perfil cromatográfico de la miel de Guatavita (a) sin tratamiento térmico
(b) con tratamiento térmico.................................................................................... 71
Figura 3-6.Perfil cromatográfico de la miel de Cartagena (a) sin tratamiento térmico
(b) con tratamiento térmico.................................................................................... 71
Figura 3-7.Perfil cromatográfico de la miel de Santa Rosa (a) sin tratamiento térmico
(b) con tratamiento térmico.................................................................................... 71
Figura 3-8.Comparación de cromatogramas de mieles de diferentes departamentos.
Cundinamarca (a), Valle (b), Meta (c), Bolívar (d), Córdoba (e), Santander (f),
Boyacá (g) y Tolima (h) ......................................................................................... 73
Figura 3-9.Cromatogramas de las mieles F (a) y FT (b). ...................................... 74
Figura 3-10.Cromatogramas de las mieles V (a) y VT (b). .................................... 74
Figura 3-11.Estructuras de los posibles compuestos presentes en las muestras de
mieles. ................................................................................................................... 77
LISTA DE ABREVIATURAS
ABREVIATURA TÉRMINO
ABAP 2,2'-azo-bis-amidinopropano
ABTS 2,2 'azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)
AG Ácido Gálico
BHT Butil hidroxitolueno
CF Contenido de flavonoides
CFT Contenido de fenoles totales
DPPH 1,1-difenil picril hidracilo
EAG Equivalentes de Ácido Gálico
EQ Equivalentes de quercetina
FC Folin-Cioucalteu
FRAP Reducción férrica / poder antioxidante
FS Fracción seca
HAT Transferencia de átomos de hidrógeno
HPLC Cromatografía líquida de alta eficiencia
HPLC-DAD Cromatografía líquida de alta eficiencia acoplada a arreglo de
diodos
HPLC-MS Cromatografía líquida de alta eficiencia acoplada a
espectrometría de masas
HPLC-UV Cromatografía líquida de alta eficiencia acoplada a detector UV
IC50 Concentración media inhibitoria
MeOH Metanol
NTC Norma técnica colombiana
ORAC Capacidad de absorción de radicales de oxígeno
Q Quercetina
T Tratamientos térmicos
TEAC Capacidad antioxidante equivalente de Trolox
TPTZ 2, 4, 6-tripiridil-s-triazina
tr Tiempo de retención
RESUMEN
Los productos provenientes de la apicultura como la miel, la jalea y el propóleo, son
conocidos por las propiedades nutricionales y beneficios medicinales que le aportan
al consumidor. La miel es una sustancia elaborada por la abeja Apis mellifera y otras
especies a partir del néctar extraído de las flores. Su composición química varía
dependiendo de la fuente del néctar, el clima, la ubicación geográfica de las
colmenas y de la especie; en su composición se encuentran enzimas, proteínas,
aminoácidos, ácidos orgánicos, vitaminas, minerales, compuestos fenólicos y un
alto contenido de carbohidratos. La capacidad antioxidante de las mieles dada la
presencia de compuestos fenólicos ha llamado la atención de los investigadores y
de los productores en tanto que genera un valor agregado al producto y mejora los
procesos de comercialización.
El objetivo del presente trabajo de investigación se enfocó en establecer si existen
diferencias significativas en el contenido de polifenoles, flavonoides y capacidad
antioxidante entre las muestras de mieles colectadas en apiarios ubicados en
diferentes zonas geográficas del país, demostrando que la composición química de
las muestras varía de acuerdo al origen geográfico y que no se evidenció una
variación significativa al hacer un tratamiento térmico.
Las fracciones acuosas que exhibieron mayor contenido de fenoles totales, y
flavonoides fueron las provenientes de los municipios de Cartagena con tratamiento
térmico y Falan, respectivamente. Luego se evaluó la capacidad antioxidante por
los métodos de DPPH y ABTS, donde en ambos métodos la muestra proveniente
de Falan con tratamiento térmico, exhibió la mejor capacidad media inhibitoria y
para FRAP fue la del municipio de Santa Rosa. De acuerdo con la cuantificación
espectrofotométrica, en la correlación de Pearson, se evidenciaron coeficientes de
correlación altos entre el contenido de fenoles totales y flavonoides con la capacidad
antioxidante, exceptuando al método de DPPH en el cual se obtuvo una correlación
moderada con el contenido de fenoles totales.
Finalmente, por HPLC-UV se identificaron varios picos en diferentes tiempos de
retención, donde los más comunes entre muestras fueron las señales de los
compuestos B, C, D y G con un tiempo de retención en 6, 9, 12 y 21-24 minutos,
respectivamente, destacándose la miel de Falan-Tolima al tener mayor cantidad y
abundancia en las señales obtenidas.
En conclusión, las muestras de mieles colectadas en las diferentes municipios del
país, poseen gran variabilidad química debido a la abundancia de plantas del país,
el origen geográfico y las condiciones climáticas.
PALABRAS CLAVE: miel, flavonoides, polifenoles, capacidad antioxidante, HPLC-
UV.
12
JUSTIFICACIÓN
El proceso de recolecta del néctar por parte de las abejas es importante para la
elaboración de la miel, si no se realiza el debido proceso, la miel no tendría las
características a las cuales se le atribuyen sus propiedades nutricionales. Teniendo
en cuenta que el néctar proviene de plantas, aunque en muy bajo porcentaje, la
probabilidad de encontrar metabolitos segundarios en la miel como compuestos
fenólicos y flavonoides, es significativa. Estos metabolitos impiden la oxidación de
otras sustancias químicas ocasionadas en reacciones metabólicas producidas por
componentes exógenos. Por tanto, una investigación de los componentes en la miel
contribuiría a determinar la calidad de esta como agente antioxidante en el cuerpo
humano (Gutiérrez, Rodríguez-Malavaer, & Vit, 2008).
La miel de abeja es considerada como uno de los alimentos más completos en la
historia y por sus componentes es utilizada en diversas aplicaciones medicinales y
nutricionales (Ulloa, Mondragón, Rodríguez, Reséndiz, & Rosas-Ulloa, 2010). Por
ello, la autenticidad del producto es indispensable para que sus propiedades no se
vean afectadas por adulteración en su producción. Hoy día este tipo de prácticas
tiene en preocupación a los productores apícolas, por ello resulta de gran
importancia las investigaciones tendientes a determinar sus componentes y
caracterizar la calidad de la miel que se produce directamente en las zonas apícolas
de Colombia. Estudios realizados en varios países latinoamericanos han
comprobado que la miel de abeja contiene metabolitos secundarios como
flavonoides y compuestos fenólicos, estos en menor porcentaje de su composición
pero que confiere actividad biológica, destacándose las propiedades antioxidantes.
Lo anterior depende básicamente del origen botánico y geográfico, el contenido de
la miel y el tratamiento que recibe previo a su comercialización; por lo cual el estudio
de estos factores resulta de gran importancia e interés en la determinación de las
propiedades que pueden atribuirse a diferentes muestras de miel y será de vital
importancia para ampliar el conocimiento acerca de la química de éste producto
apícola.
13
PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
La miel que inicialmente fue utilizada como endulzante y edulcorante, hoy en día
junto con el propóleo y los diferentes productos de la colmena, es consumida por
sus propiedades y ha llegado a considerarse como alimento funcional proveniente
de productos naturales. La capacidad antioxidante en la miel se debe a diversos
factores como el pH, lo niveles de peróxido de hidrogeno, el gran contenido de
azúcares y el contenido de compuestos fenólicos
Con estos estudios se pretende generar conocimiento en la influencia que tienen
factores como el clima, la altitud y la vegetación de la zona donde están ubicados
los apiarios en el contendido de fenoles en la miel. Por ello conocer el porcentaje de
éstos compuestos en la miel y su capacidad antioxidante es de vital importancia
para darle valor agregado al producto apícola, así como también identificar la
influencia de los tratamientos térmicos a los que son sometidas las mieles para su
posterior comercialización.
Con respecto a lo anterior se estableció la siguiente pregunta de investigación:
¿Existen diferencias significativas en el contenido de polifenoles, flavonoides y la
capacidad antioxidante entre muestras de mieles colectadas directamente en la
colmena y sus respectivas muestras sometidas a tratamiento térmico?
14
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Determinar si existen diferencias significativas en el contenido de polifenoles totales,
flavonoides y la capacidad antioxidante entre las muestras de mieles colectadas en
diferentes regiones de Colombia, y sus respectivas muestras sometidas a
tratamiento térmico.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar el contenido de polifenoles totales (CFT) y flavonoides (CF) por métodos
espectrofotométricos de las muestras de mieles colectadas.
Determinar mediante el ensayo de 1,1-difenil-2-picril-difrazilo (DPPH), ácido
2,2’azinobis-(3-etilbenzotiazolina)-6-sulfónico) (ABTS) y Reducción férrica/poder
antioxidante (FRAP), la capacidad antioxidante de los extractos acuosos de las
muestras de mieles colectadas.
Identificar cualitativamente los compuestos presentes en las muestras de mieles, a
través de la técnica de Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia Acoplada a un
detector UV (HPLC-UV).
15
CAPÍTULO 1:
ESTADO DEL ARTE
1.1. INTRODUCCIÓN
La miel de abeja producida por la especie Apis mellifera y otras especies, es una de
las sustancias naturales más dulces, se obtiene del néctar de las flores y
secreciones que las abejas productoras catan, trasportan, transforman, combinan
con otras sustancias, deshidratan, concentran y almacenan en los panales
(Barragán Rivera, 2014). Es considerada como uno de los alimentos prehistóricos
que el hombre ha utilizado para su alimentación y endulzamiento, en ella
encontramos diferentes compuestos que hacen de sus propiedades algo complejo,
los carbohidratos abarcan mayor porcentaje de su composición, predominando la
fructosa y la glucosa, junto con otras sustancias presentes en menor proporción,
como las proteínas, aminoácidos, antioxidantes (polifenoles y flavonoides),
vitaminas, minerales, entre otros (Ulloa, Mondragón, Rodríguez, Reséndiz, &
Rosas-Ulloa, 2010).
Las características de la miel como la viscosidad, el color desde ámbar hasta casi
incoloro y blanquecino, son atribuidas a sus orígenes botánico y entomológico que
ocasionan variaciones en los tipos de mieles fabricadas por las abejas. La
melisopalinología estudia los principios geográficos y su botánica hacia lo
microscópico, lo cual proporciona una mayor información para la identificación de
las plantas originarias del néctar recogido por las abejas. Los compuestos
fitoquímicos son sustancias originarias de vegetales, su investigación en alimentos
se ha convertido en tema de importancia para la comunidad científica y su aporte a
la salud, esto se debe a la amplia variación de polifenoles, flavonoides y la
capacidad antioxidante de estos compuestos (Gutiérrez, Rodríguez-Malavaer, & Vit,
2008).
Actualmente, los diferentes problemas de salud generados por el exceso de
radicales libres en el cuerpo, producto mayormente de la contaminación atmosférica
16
y del humo de cigarrillo, han despertado gran interés por la capacidad antioxidante
de los alimentos, es decir, por lo compuestos presentes en su composición que
serán capaces de liberar electrones en la sangre para neutralizar la acción oxidante
de los radicales libres (Avello & Suwalsky, 2006).
La Apis mellifera es la especie que produce la gran totalidad de miel en Colombia,
pero no es la única encargada de esta labor, ya que existen también especies de
abejas sin aguijón (Meliponinos) propias del continente americano productoras de
miel (Hernández Londoño, Ascencio, & Quicazán, 2014); a diferencia de la Apis
mellifera estas abejas no son agresivas lo que facilita el manejo de la especie en la
crianza y el mantenimiento. Actualmente, en Colombia existen más de 101 especies
de Meliponinos de las cuales solo 17 especies se utilizan para la producción apícola
como la Tetragonisca angustula. Además, Colombia posee una gran ventaja para
la obtención de éste producto alimenticio, ya que el país posee una riqueza botánica
que le permitiría albergar cerca de un millón de colmenas productivas de abejas
(Sánchez Alarcón, 2014). Esta miel producida es reconocida en Colombia gracias a
sus atributos medicinales, por tanto, una caracterización de este producto es de vital
importancia ya que permitirá establecer sus propiedades químicas a nivel de calidad
(Hernández Londoño et al., 2014)
En Colombia existen aproximadamente 2100 apicultores que comercializan los
diferentes productos de la colmena, pero la gran mayoría de estudios como los
realizados por (Nieto & Quicazán, 2016), (Aguas, Olivero, & Cury, 2010) y (Méndez,
Lopez, & Portilla, 2011) sólo reportan parámetros fisicoquímicos como pH,
humedad, color, acidez, cenizas, glucosa, contenido de hidroximetilfurfural, entre
otros; mas no se han reportado varios estudios sistemáticos del contenido de
flavonoides y polifenoles totales que caractericen las mieles de acuerdo con su
contenido y su capacidad antioxidante. Este conocimiento es importante para
aportar a la trazabilidad de las mieles y al conocimiento que de ellas se puede tener
dependiendo de la zona de producción.
Por lo anterior, la importancia de realizar un análisis de la composición de la miel y
determinar el contenido de polifenoles y flavonoides totales, evaluar la capacidad
17
antioxidante y caracterizar los compuestos presentes, para así determinar si existen
diferencias entre las muestras de mieles obtenidas en diferentes regiones de
Colombia.
1.2. ESTADO ACTUAL DEL TEMA
1.2.1. Apicultura en Colombia
“El término Apicultura tiene su origen en el latín: apis (abeja) y cultura (cultivo)”. Se
define como una actividad agropecuaria que tiene como finalidad el cultivo de
abejas, especialmente de la especie Mellifera, y el desarrollo de técnicas fijas o
migratorias, para obtener una serie de productos apícolas, como la miel, la cera, el
propóleo y la jalea (Silva Garnica, 2005).
En Colombia, el cultivo y manipulación de abejas ha sido una actividad que se
desarrolla desde la época precolombina, donde etnias indígenas como la Muisca,
Chibchas y Tayronas, ubicados en la Sierra Nevada de Santa Marta, hacían uso de
los productos que obtenían para endulzar los alimentos, en la orfebrería y como
productos para tratar algunas enfermedades (Silva Garnica, 2005).
El desarrollo de la apicultura en Colombia y debido al mejoramiento de las técnicas
usadas, se logró evidenciar continuamente hasta la conquista española, pues fue
un suceso que ocasionó la alteración de los avances tras la introducción al
continente de la abeja africanizada Apis mellifera en 1978, especie diferente a la
abeja nativa en cuanto a su morfología y capacidad de producción (Sánchez
Alarcón, 2014).
El principal inconveniente y la razón por la cual muchos apicultores de la época de
los años 80 desertaron masivamente de la actividad apicultora, fue la presencia del
aguijón en la especie Apis mellifera, debido a que las abejas nativas colombianas
no lo poseían. Frente a éste hecho, los apicultores no conocían cuál sería el manejo
apropiado de las abejas para su protección física en el cultivo de la nueva especie
(Sánchez Alarcón, 2014).
Durante éste período, el desarrollo de la actividad no estuvo estructurado del mejor
modo, pero los apicultores que continuaron con la adaptación a la nueva especie de
18
abejas lograron establecer nuevas técnicas y tecnologías que les permitieron el
manejo de la abeja africanizada. Entre las nuevas estrategias se reportó la
reubicación de los apiarios a lugares más alejados de la civilización y el uso de ropa
más gruesa. Al persistir en la actividad, se halló que las abejas africanizadas
resistían frente al ácaro V. destructutor y su capacidad de producción era más alta
que la de las abejas nativas, lo que obligó a ésta última especie a adaptarse
genéticamente (Sánchez Alarcón, 2014).
Gracias a Lorenzo Langstroth, quien en 1852 patentó la colmena Langstroth se
desarrollaron los espacios entre los panales de la colmena, se crearon los cuadros
móviles y se construyó la colmena moderna (Figura 1-1) y, con el trabajo del padre
Rizzardi , conocido como el padre de las abejas, se funda en el siglo XIX el primer
apiario en Colombia de abejas italianas, ubicado en el Noviciado de Mosquera,
Cundinamarca (Barragán Rivera, 2014).
Figura 1-1. Colmena Langstroth (colmena moderna) Fuente: ("Colmena Langstroth Entrelazada", 2017)
Actualmente Colombia cuenta con aproximadamente 2100 apicultores ubicados a
lo largo de todo el territorio, pero concentrados mayoritariamente en los
departamentos de Santander, Magdalena, Sucre, Cauca, Huila, Antioquia, Boyacá
y Cundinamarca (Sánchez Alarcón, 2014), donde el método que es más
desarrollado debido a las condiciones topográficas, es la apicultura fija o
permanente, “consiste en la instalación de un apiario fijo con cantidades
19
considerables de colmenas en un solo sitio o lugar, permitiendo un mayor volumen
de producción” (Silva Garnica, 2005). Sin embargo, la apicultura trashumante o
migratoria, es otro método en el que las colmenas son transportadas hacia
diferentes lugares y diversos periodos de clima.
La normatividad que rige la calidad, almacenamiento y venta de la miel de abeja
recogida de los apiarios es muy importante, de ello depende del buen manejo y
aceptabilidad que se le dé a la miel, estudios hechos por la universidad Nacional de
Colombia determinaron que la acidez, pH, y humedad son factores fundamentales
en la calidad de la miel y de la certificación de cada apiario, y que depende de ellos
los atributos medicinales se verán favorecidos (Hernández Londoño et al., 2014).
Por otro lado, en Cartagena con respecto a la producción no tecnificada y carente
de reglamentación de su miel cosechada evaluaron la aceptabilidad y la presencia
de adulteración en mieles de Apis mellifera ubicada en 6 zonas de la costa caribe.
Se realizaron determinaciones de glucosa por la detección de dextrinas de almidón
propios de la glucosa comercial donde se demostró la ausencia de glucosa
comercial, parámetros fisicoquímicos como humedad y pH fueron determinantes
para evaluar la calidad de su producto; ambos parámetros estaban dentro de los
rangos establecidos en la norma técnica colombiana NTC 1273 donde los
resultados de humedad estuvieron próximos al límite permitido, donde se
encontraron muestras de 3 zonas provenientes de Bazurto, por otro lado se
realizaron pruebas sensoriales relacionadas con la apariencia de la miel las cuales
dieron como preferencia 4 zonas de las 6 estudiadas, la miel se encontró libre de
moho, impurezas y malos sabores concluyendo así que la miel comercializada en
la ciudad de Cartagena es apta para el consumo humano cumpliendo así la
normatividad vigente que regula la miel de abejas en la ciudad, descartando la
posibilidad de adulteración (Aguas, Olivero, & Cury, 2010).
1.2.2. Abeja que prolifera en Colombia
En Colombia la especie de abeja que prolifera es la Apis mellifera (Figura 1-2-A),
especie producto de la mezcla entre las diversas abejas que llegaron al país, como
las europeas (Apis mellifera mellífera) italianas (Apis mellifera ligustica),
20
caucasianas (Apis mellifera caucasica) y africanas (Apis mellifera scutellata). Sin
embargo, las expresiones genéticas de la subespecie Apis mellifera scutellata son
las que predominan por encima de las demás, razón por la que se conocen como
las abejas africanizadas (Silva Garnica, 2005).
La clasificación taxonómica de la abeja doméstica se detalla en la Tabla 1-1:
Tabla 1-1. Taxonomía de la abeja doméstica
Clasificación Descripción
Reino Animal
Subreino Metazoa (animales pluricelulares )
Phylum Artropoda (miembros articulados)
Orden Hymenóptera (una hembra fecunda - reina)
Clase Insecta (cuerpo dividido en cabeza, tórax y abdomen)
Familia Apidae (con aguijón)
Subfamilia Apinae
Tribu Apini
Género Apis
Especie Mellifera (que transporta miel)
Subespecie
Apis mellifera mellifera (alemana) Apis mellifera lingûstica (italiana) Apis mellifera caucásica (caucasiana) Apis mellifera cárnica (carniola) Apis mellifera scutellata (africana)
Especies como las meliponinae (Figura 1-2-B), abejas sin aguijón, son las especies
nativas del continente americano, por lo que en los en los diversos territorios se
encuentran presentes aproximadamente 101 especies. Sin embargo, la Apis
mellifera es la encargada de la mayor producción de la miel, ya que sólo 17 especies
de las meliponinae son usadas con esa finalidad.
Figura 1-2. Apis mellifera (A), Meliponinae (B) Fuente: ("Archivo:Apis mellifera oeste.jpg - EcuRed", 2017), ("Melipona (Abeja sin aguijón)", 2017),
respectivamente.
21
Una de las razones por las que las abejas nativas no son prioridad para los
apicultores, radica en las diferencias en cuanto al contenido de la miel y a la cantidad
que elaboran de éste producto. La caracterización de ésta miel arrojó datos de
notable importancia, donde se determina que la miel de las abejas nativas no
cumple con los mismos parámetros de la obtenida de la Apis mellifera, al superar el
contenido de humedad establecido para la miel de la abeja africanizada, por lo que
son productos que tienen una mayor actividad del agua y por tanto son más
propensos a la fermentación y formación de moho y levadura (Hernández Londoño
et al., 2014).
1.2.3. Ciclo de vida y desarrollo de la abeja
Como todos los insectos, las abejas tienen un ciclo de vida que es completo desde
el huevo depositado por la abeja reina hasta su formación como abeja adulta,
pasando por ser larva y pupa. En los primeros estados de su ciclo ellas crecen en
las celdas de los panales y son denominadas crías, el crecimiento de las larvas y
los huevos se dan en celdas abiertas, estas son cuidadas por las abejas adultas
encargadas de proteger y de alimentar a la cría hasta que estas llegan a su fase
larval, seguido de ello, estas abejas adultas sellan las celdas para dar inicio a la
transformación de la larva a pupa y por último a abeja adulto, en la Tabla 1-2 y
Figura 1-3 se encuentran los periodos de desarrollo de las abejas (Avello &
Suwalsky, 2006).
Tabla 1- 2.Periodo de desarrollo de crecimiento de la abeja.
ESTADO REINA OBRERA
ZÁNGANO
Huevo 3 3 3
Larva 5,5 6,5 6,5
Periodo de alimentación en larva 5 6 6
Operculación de la celda 8 7-8 10
Periodo de transformación en pupa 1 1 1
Emergencia del adulto en días 15-16 19-20 24
22
Figura 1-3.Ciclo de vida y desarrollo de la abeja Tomado de: (Abejas, 2017)
1.2.4. Miel de abejas
La miel de abeja es una sustancia viscosa de diversas tonalidades de acuerdo a la
planta escogida por la abeja para la recolecta del néctar y secreciones florales, este
producto es elaborado por diferentes especies como la Apis mellifera y la Melipona,
ellas realizan un proceso de recolección, transporte, producción de la sustancia,
posterior a ello realizan su almacenamiento en colmenas (Silva Garnica, 2005).
En ella encontramos vitaminas, enzimas, sales minerales, aminoácidos,
compuestos fenólicos, flavonoides, carbohidratos que brindan a las personas
grandes beneficios para su dieta alimenticia (Silva Garnica, 2005).
La elaboración de la miel inicia cuando la planta segrega el néctar, es decir, la
materia prima que utilizan las abejas recolectoras para llevarlas al panal. Las abejas
obreras (pecoreadoras) y mediante el uso de sus largas lenguas, son las
encargadas de realizar la recolección del néctar, lo almacenarán en su buche y
transportarán hasta la colmena. Seguidamente, las abejas receptoras se encargan
de almacenarlo en su buche durante el tiempo que sea necesario para obtener el
producto (Hoyos Sánchez, 2007).
Los procesos que el néctar sufre desde que es succionado por la abeja son:
• Dilución del néctar y mezclado con saliva.
• Inversión de la sacarosa en fructuosa y glucosa por acción de la α-
glucosidasa o invertasa.
• Evaporación del agua para concentrar el néctar
23
La miel presentará diversos aspectos, desde el estado líquido hasta el sólido, y
colores que van del blanco a amarillento claro o al moreno oscuro. Éstas
características serán determinadas por la especie de abeja que la elabore, la
ubicación tipográfica, el tipo de flores y la temperatura ambiental (Hoyos Sánchez,
2007).
1.2.5. Composición de la miel
La miel es un compuesto complejo, debido a la diversidad de compuestos presentes
en ella:
• Carbohidratos: constituyentes principales de la miel y a quienes se les
atribuye el sabor dulce de ésta. Abarcan entre el 76 y el 85 % de la composición,
predominando los monosacáridos glucosa y fructuosa, aunque también pueden
encontrarse los disacáridos sacarosa, maltosa e isomaltosa en concentraciones
menores (Tabla 1-3) (Zandamela Mungói, 2008).
Tabla 1-3. Principales constituyentes de los carbohidratos en la miel
Monosacáridos
Disacáridos Trisacáridos Sacáridos complejos
Fructuosa Glucosa
Gentibiosa Isomaltosa
Maltosa Maltulosa Nigerosa
Palatinosa Sacarosa Turalosa
Centosa Eriosa
Isomaltotriosa Isopanosa
Laminaritriosa Maltotriosa Melezitosa
Panosa
Isonaltopentanosa Isomaltotetraosa
• Agua: en la miel de abeja el contenido normal de agua está entre 14,5 y 18,5
%. Valores más altos al rango óptimo podrían inducir a la fermentación de la miel,
mientras que si la humedad es inferior al 17 % no existirá la posibilidad de
fermentación en el producto. Con tan solo estos porcentajes de agua se puede
definir la calidad de la miel (Zandamela Mungói, 2008).
• Enzimas: unidades proteicas presentes en bajas cantidades y adicionadas
por las abejas para fermentar el néctar. La enzima más importante es la -
24
glucosidasa o invertasa, encargada de catalizar la conversión de la sacarosa en sus
monosacáridos constituyentes: glucosa y fructuosa (Ulloa et al., 2010).
• Aminoácidos y proteínas: compuestos minoritarios presentes en la
composición de la miel (0.5 %), pero capaces de determinar la formación del
espumado (proteínas) y de la formación de sustancias amarillas o cafés,
responsables del oscurecimiento del color (aminoácidos) (Ulloa et al., 2010).
• Ácidos orgánicos: el pH de la miel puede variar entre valores del 3.5 y el
5.5; éste carácter ácido se debe a la presencia de los diferentes tipos de ácidos
orgánicos como el fórmico, acético, butírico, láctico, oxálico, entre otros, aunque
debido al alto contenido de monosacáridos y disacáridos causantes del sabor dulce
en la miel, su acidez es enmascarada (Ulloa et al., 2010).
• Otros compuestos presentes en menor concentración:
✓ Vitaminas y minerales; se pueden hallar entre el 0,02 y el 1 %, lo que no
genera aportes significativos a la dieta.
✓ Compuestos fenólicos: relacionados con el color de miel, a mayor
concentración, mayor oscurecimiento y con la capacidad antioxidante de la
miel, una de las características más resaltadas e importantes para la salud
humana (Ulloa et al., 2010).
Debido a ésta composición, alto contenido de carbohidratos y bajo porcentaje de
agua, la miel es considerada como una solución supersaturada que se cristaliza con
facilidad, ya que la glucosa se solidifica y precipita. Además, la cristalización
también es estimulada por la presencia de pequeñas partículas de polvo, polen,
cera, propóleo o burbujas de aire (Hernández Londoño, 2016).
Las condiciones de almacenamiento, como temperatura, humedad, luz y tipo de
material en el que se recolecta, también pueden influenciar. La temperatura que
favorece la cristalización es de 10 a 21 ° C, menores a 10 ° C evitan este proceso
al igual que las superiores a 21 ° C, pero por encima de éstas, la miel tiende a
25
fermentarse y degradarse. Además, también se sugieren lugares de
almacenamiento con poca luz y el uso de envases de material de vidrio (Pérez
Arquillue & Jimeno Benito, 1985).
Según Hernández Londoño, (2016) el tratamiento térmico a 65 °C por 15 o 21
minutos evitará que la miel sufra procesos de cristalización, sin embargo será
necesario la rigurosidad durante el proceso, puesto que de no controlar estos
factores, la miel puede degradarse y fermentarse. Por lo anterior, y según la
composición y características fisicoquímicas de las muestras, algunos compuestos
termolábiles podrán ser liberados.
1.2.6. Flavonoides y compuestos fenólicos presentes en la miel
“Los flavonoides son compuestos fenólicos con una alta capacidad antioxidante que
están presentes en la mayoría de las plantas, especialmente en las frutas y las
hortalizas”. Debido a su capacidad biológica han atraído fuertemente la atención de
las industrias de procesamiento de alimentos y de las compañías de pigmentos,
cosméticas y farmacéuticas (Ochoa M. & Ayala A., 2004).
Se ha demostrado que los compuestos fenólicos poseen estructura química ideal
para secuestrar radicales libres, lo que da un aporte de actividad antioxidante mayor
a la proporcionada por las vitaminas E y C (Cartaya & Reynaldo, 2001).
Estudios realizados en Chile sobre la determinación de polifenoles y flavonoides,
lograron aislar los componentes fenólicos y flavonoides de 26 mieles de diferentes
trópicos de ese país, obteniendo así que la naturaleza de flavonoides presentes en
la miel son: pinocembrina, pinobanksina, quercetina, kaempferol, crisina, galangina,
cuyas estructuras se pueden observar en la Figura 1-4. En cuanto a la
determinación de polifenoles estos se correlacionan mejor a su capacidad
antioxidante determinada por el método de Capacidad de absorción de radicales de
oxígeno (ORAC) (Tabla 1-4), sin embargo este coeficiente es bajo debió a que la
muestra se utilizó entera y no fraccionada. Al concluir los investigadores sugieren
que tanto los flavonoides como los polifenoles poseen niveles significativos, pero el
26
valor relativo es bajo en significación biológica como un antioxidante importante en
el consumo humano (Muñoz, Copaja, Speisky, Peña, & Montenegro, 2007).
Figura 1-4.Flavonoides presentes en la miel chilena. (1) pinocembrina, (2) pinobanksina, (3) quercetina, (4) kaempferol, (5) crisina, (6) galangina
Tabla 1-4.Resultados ORAC para compuestos fenólicos y flavonoides de mieles chilenas
Muestra Región µmol TE Compuestos
fenólicos (mg/100 g miel)
Flavonoides (mg/100 g miel)
1 IV 5,8 2,83 4,58
2 VI 3,43 6,49 4,3
3 VII 3,04 3,08 4,41
4 VII 5,17 0 5,52
5 VII 2,99 0 7,31
6 VII 4,67 0,55 7,05
7 VII 12,31 2,82 6,22
8 VII 3,46 2,31 5,3
9 VII 2,51 1,76 5,11
10 VII Nd* 0,55 0,01
11 VIII 6,45 0,63 6
12 VIII 2,22 0,91 7,2
13 IX 4,73 1,7 5,06
14 X 2,01 0,36 4,41
27
Muestra Región µmol TE Compuestos
fenólicos (mg/100 g miel)
Flavonoides (mg/100 g miel)
15 X 5,25 0,54 4,8
16 X 6,63 0,71 11,5
17 RM** 5,81 0,16 12,5
18 RM
4,81 0,55 10,1
19 RM
1,26 0,11 13,8
20 RM
7,75 0,57 9
21 RM
1,77 8,83 11,9
22 RM
7,83 0,74 9
23 RM
4,72 0,45 9
24 RM
6,47 0,64 7.2
25 RM
9,08 0,43 8,41
26 RM
2,5 0 11
*nd: no detectado; **RM: Región metropolitana. El contenido de los flavonoides de las veintiséis
muestras de mieles, se varió entre 0,014 y 13,8 mg/100g; y el de fenoles entre 0 y 8,83 mg/100g en muestras frescas de miel.
Se han realizado diferentes investigaciones sobre la caracterización de los
componentes en la miel, especialmente en países latinoamericanos, zonas en las
que se encuentran diversidad de trópicos y variedad en plantas seleccionadas por
las abejas.
En Lima, Perú se han llevado a cabo estudios en 12 diferentes marcas de miel
colectadas en distintos puntos de venta ubicados en la ciudad, donde realizaron la
determinación de compuestos fenólicos totales, flavonoides totales, capacidad
antioxidante por el método de ABTS/ABAP y ensayo de 2-Desoxi-D-Ribosa, el
efecto antioxidante sobre el anión superóxido y contenido fenólico por HPLC (Muñoz
Jáuregui et al., 2014).
Los resultados arrojados por esta investigación para el CFT y CF muestran que la
miel de floración silvestre tiene mayor CFT y en menor contenido la miel de eucalipto
(Muñoz Jáuregui et al., 2014). Estos valores determinados en Perú son superiores
a los encontrados en estudios realizados por Muñoz, Copaja, Speisky, Peña, &
Montenegro con mieles chilenas, cuyos valores más altos se registraron en 207,89
28
y 8,8 mg equivalentes de ácido gálico (EAG)/100g, respectivamente (Muñoz
Jáuregui et al., 2014).Por otro lado (Vit et al., 2009) determinaron polifenoles de miel
de abeja producida por la especie yateí (Tetragonista fiebrigi) en Argentina y
Paraguay donde su CFT es de 240,7 mg/100g.
Los contenidos de flavonoides totales de las muestras de mieles fueron arrojados
como equivalente de quercetina (EQ)/100 g de muestra, donde el máximo contenido
fue en la floración de la miel multifloral en piura, la de menor contenido fue miel
zapote y de apigenina (Tabla 1-5) pero con una menor inhibición del anión
superóxido con una porcentaje del 53,21 %. En cuanto a la capacidad antioxidante
la miel de eucalipto tuvo mayor contenido, concluyendo así que la miel en general
es un agente antioxidante con un buen contenido de compuestos fenólicos y que
varían en contenido dependiendo el origen del néctar y el trópico en donde se ubica
(Muñoz Jáuregui et al., 2014).
Tabla 1-5. Contenido de flavonoides totales en distintas muestras de mieles expresado como
EQ/100 g muestra
N° Característica: Floración Flavonoides
(mg EQ/100 g muestra)
1 Miel eucalipto 1,4058
2 Miel silvestre 1,4032
3 Miel algarrobo 1,0063
4 Miel zapote y otros 0,9651
5 Miel eucalipto 1,5736
6 Miel flora silvestre 1,7563
7 No indica 2,0755
8 Multifloral de Piura 3,8391
9 Multifloral (3ra semana 16.8 %) 0,9692
10 Zapote miel en panal de Piura 0,9139
17 Miel eucalipto 1,6264
18 Miel silvestre 1,4329
29
(Frankel, Robinson, & Berenbaum, 1998) estudiaron 19 mieles de origen multifloral
donde obtuvieron valores de actividad antioxidante entre 21.3 y 432, a lo que
afirmaron que la composición química (contenido de azúcares individuales, cenizas,
nitrógeno, contenido de metales) de la miel de abejas puede variar según la especie
floral que se utiliza como fuente del néctar recogido por la abejas. Por otro lado
sugieren que las propiedades antioxidantes de la miel se encuentran estrechamente
relacionadas por su apariencia (color) y el contenido de humedad, ya que muchos
de los pigmentos que contienen (flavonoides) presentan actividad antioxidante y el
porcentaje de agua de la miel puede determinar el grado de acumulación de
compuestos antioxidantes que son solubles en agua. Estos factores pueden ser los
responsables de las variaciones en actividad antioxidante encontradas dentro de
cada grupo botánico seleccionado por las abejas.
Los productos elaborados por la abeja como la miel, propóleo, jalea, cera, entre
otros, son particularmente ricos en compuestos polifenólicos a los que se les
atribuye el papel de agente antioxidante (Ciappini, Stoppani, Martinet, & Alvarez,
2013). El trabajo realizado por investigadores en Argentina tuvo como objetivo
evaluar la capacidad antioxidante en miel de especies monoflorales, el CFT y CF,
con el fin de establecer ciertas correlaciones entre estos factores. Para ello se
analizaron alrededor de 81 muestras de mieles de las plantas “tréboles”, “eucalipto”
y “alfalfa”, por el método de Folin Ciocalteau (FC), por AlCl3 y método DPPH, para
el CFT, CF y la actividad antioxidante, respectivamente. Los resultados obtenidos
indican mayor contenido de compuestos polifenólicos en la miel de tréboles que la
hallada en la de eucalipto y alfalfa. El CFT se correlacionó con la actividad captadora
de radicales, corroborando la influencia de estos compuestos en la actividad
antioxidante de la miel de abejas (Ciappini et al., 2013).
1.3. MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN
1.3.1. Contenido de fenoles totales (CFT) por el método de Folin-Ciocalteu
El ensayo de FC es un método basado en la reducción del ácido
fosfomolibdotúngstico de color amarillo que reacciona a pH básico dando lugar a
complejos de molibdeno de coloración azul intenso y cuya intensidad puede ser
30
medida espectrofotometricamente a una longitud de onda de 765nm para evaluar
su contenido (Tovar del Rio, 2013). Este método es utilizado como medida del
contenido en compuestos fenolicos totales en los productos vegetales (A. C. De
Oliveira et al., 2009).
La reacción general se ilustra en la Figura 1-5 y es dado por el mecanismo de
oxidación/reducción, por lo que es considerada como un método de medida en la
actividad antioxidante (García Martínez, Fernández Segovia, & Fuentes López,
2015).
Figura 1-5.Reacción de Folin-Ciocalteu para la cuantificación espectrofotométrica de compuestos
fenólicos Fuente: (A. C. De Oliveira et al., 2009)
Los polifenoles poseen importante actividad biológica y es relacionada con su
carácter antioxidante, su habilidad para la quelación de metales inhibe la actividad
de enzimas y actúa como captador de radicales libres. Además de los efectos que
posee en la salud por la calidad de los alimentos que lo contienen antioxidante
(García Martínez et al., 2015)
1.3.2. Determinación del contenido de flavonoides (CF)
El análisis y cuantificación de flavonoides en mieles y propóleos se ha realizado
mediante métodos colorimétricos con reacciones de 2,4 dinitrofenilhidrazina y AlCl3.
El principio de éste último se basa en la formación de complejos estables en medio
ácido, entre el tricloruro de aluminio y el grupo ceto C-4 o con el grupo hidroxilo C-
31
3 o C-5 de flavonas y flavonoles; y complejos lábiles ácidos con los grupos
ortodihidroxilo en el anillo A o B de los flavonoides. La formación de dichos
complejos se evidencia tras la formación de una coloración amarilla que muestra
una fuerte absorción a 415 y 440 nm (Chang, Yang, Wen, & Chern, 2002).
La reacción general se ilustra en la Figura 1-6:
Figura 1-6.Reacción de AlCl3 para la cuantificación espectrofotométrica de flavonoides
Fuente:(Bosco, 2017.).
Sin embargo, los ensayos colorimétricos están dirigidos a flavonoides con
estructuras similares, por lo que los tipos de flavonoides que podrán ser detectados
con mayor facilidad serán flavonas y flavonoles al ser complejos de forma estable
con el cloruro de aluminio. Por lo anterior, se sugiere completar el estudio de
flavonoides por cromatografía en capa fina, cromatografía de gases, cromatografía
de gases acoplado a espectrometría de masas y/o cromatografía líquida de alta
resolución (Chang et al., 2002).
1.4. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
Los métodos de determinación de la capacidad antioxidante se basan en comprobar
cómo un agente oxidante induce daño oxidativo a un sustrato oxidable, daño que
es inhibido o reducido en presencia de un antioxidante. Esta inhibición es
proporcional a la actividad antioxidante del compuesto o la muestra (Fernández-
Pachón, Villaño, Troncoso, & García-Parrilla, 2006)
32
Los métodos usados para la determinación de la capacidad antioxidante:
• MÉTODO DEL RADICAL 1,1-DIFENIL PICRIL HIDRACILO (DPPH)
Determina actividades de captura de material radicalario en presencia de una
sustancia antioxidante, midiendo el potencial de inactivación de dicho radical en
medio acuoso (Figura 1-7).
Figura 1-7.Estructura del DPPH antes y después de la reacción con el agente antioxidante Fuente: (Salinas Salinas, 2012).
Figura 1- 8.Mecanismo de reacción del DPPH.
Fuente:(Gülçin, 2012).
El método de captura del radical DPPH es utilizado desde hace muchos años por
numerosos autores que han ido realizando adaptaciones del mismo a la matriz
alimentaria de la que quieren obtener información, como modificar la concentración
33
de DPPH (0,1 mM, 0,2 mM, 600 mM), tiempo de incubación o ataque (30 min, 60
min, 500 min o incluso sin tiempo definido, hasta llegar a saturación) (Jiménez
Monreal, Sánchez Manzanera, & Martínez Tomé, 2012).
• MÉTODO DEL 2,2 'AZINO-BIS (ÁCIDO 3-ETILBENZOTIAZOLINA-6-
SULFÓNICO) (ABTS)
El radical ABTS es generado por el precursor Ácido 2,2’-azinobis (3-
etilbenzotiazolín)-6-sulfónico. El radical que es obtenido de este precursor es de
color verde-azulado (Figura 1-9) con alta estabilidad y con espectro de absorción en
UV-visible (Agudo, 2002).
Es un radical artificial que no alcanza a mimetizar bien una situación in vivo
pudiendo así reaccionar con este radical diversos compuestos fenólicos con
potenciales altos o bajos, los puntos finales de la reacción con el radical lo marca la
sustancia antioxidante empleada a través del tiempo (Figura 1-10), interfiriendo así
en los resultados. La ventaja de este ensayo es que puede realizarse tanto en
muestras hidrosolubles como liposolubles, eligiendo el disolvente apropiado en
cada caso (Agudo, 2002).
Figura 1-9.Estructura del ABTS antes y después de la reacción con el antioxidante Fuente: (Osman, Wong, & Fernyhough, 2006).
34
Figura 1-10.Mecanismo de reacción del ABTS antes y después de la reacción con el antioxidante Fuente: (S. De Oliveira et al., 2014)
• MÉTODO DE REDUCCIÓN FÉRRICA / PODER ANTIOXIDANTE (FRAP)
En este método se determina la capacidad antioxidante de forma indirecta. Se basa
en el poder que tiene una sustancia antioxidante para reducir el Fe3+ a Fe2+ que es
menos antioxidante. El complejo férrico-2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) incoloro en
el que a bajo nivel de pH es reducido al complejo ferroso de color azul (Figura 1-
11). Se trata de un método espectrofotométrico ya que se mide la absorbancia del
Fe2+. Así, cuanto más antioxidante es la sustancia objeto de estudio, mayor es la
reducción, mayor la concentración de Fe2+ y más alta la señal de absorbancia
(Agudo, 2002).
Figura 1-11.Reducción del Fe3+ (rojo) a Fe2+ (azul) por el método FRAP. Fuente: (Gülçin, 2012)
35
Figura 1-12.Mecanismo de reacción de reducción del hierro por el método FRAP. Fuente:(Gülçin, 2012)
Los mecanismos de reacción de las Figuras 1-8,1-10 y 1-12 se basan en la
transferencia de átomos de hidrogeno (HAT), donde el antioxidante atrapa los
radicales libres por donación de átomos de hidrogeno generando un hidroperóxido
y un radical antioxidante más estable químicamente, como se describe en la
siguiente reacción (Zapata, Piedrahita, & Rojano, 2014):
ROO• + ArOH ROOH + ArO• (HAT)
QUIMIOMETRÍA
Los grandes avances en la ciencia han permitido obtener una serie de datos a gran
escala y debido a ello es importante tratarlos mediante técnicas matemáticas de la
estadística y de la química analítica, para lograr transformar procedimientos
químicos o señales analíticas en información útil, confiable y reproducible. De la
anterior relación, se desarrolló la disciplina conocida como la quimiometría, para dar
solución a los problemas analíticos en la identificación y cuantificación de las
sustancias química (Tortosa Muñoz, 2011).
36
REFERENCIAS
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Agudo, L. (2002). Técnicas para la determinación de compuestos antioxidante en alimentos. Autodidacta, 1, 27–34.
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Cartaya, O., & Reynaldo, I. (2001). Flavonoides: características químicas y aplicaciones. Cultivos Tropicales, 22(2), 5–14.
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Ciappini, M. C., Stoppani, F. S., Martinet, R., & Alvarez, M. B. (2013). Actividad antioxidante y contenido de compuestos fenólicos y favonoides en mieles de tréboles , eucalipto y alfalfa. Revista Ciencia Y Tecnología, 15(19), 45–51.
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40
CAPÍTULO 2:
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE, CUANTIFICACIÓN DE
FENOLES Y FLAVONOIDES EN MIEL DE ABEJAS
2.1. INTRODUCCIÓN
Los flavonoides son metabolitos secundarios que se encuentran de forma selectiva
en las plantas como glicósidos. Son biosintetizados de la ruta del shikimato, que
genera unidades elementales C6-C3-C6 y se caracterizan por su estructura ɤ-
benzopirano y flavilio dependiendo del tipo del flavonoide del que se hable. Son de
vital importancia para el buen funcionamiento de la planta debido a que actúan como
atrayentes de animales, protectores contra la luz o infecciones por organismos
fitopatógenos, además, presentan propiedades en beneficio de la salud humana por
su capacidad antioxidante (Cartaya & Reynaldo, 2001).
Los flavonoides también han sido reportados ampliamente en la miel y su contenido
varía de acuerdo al origen botánico y geográfico de dónde las abejas extraen el
néctar para la producción, por lo cual un grupo selectivo de flavonoides como la
quercetina, kaempferol y apigenina están presentes en casi todas las mieles,
mientras que la mayor parte de los flavonoides a nivel general se encuentran
distribuidos en especies vegetales de diferentes géneros y familias, lo que podrá ser
utilizado como indicadores para determinar los tipos de plantas o lugares que la
abeja visita (Kenjerić, Mandić, Primorac, & Čačić, 2008).
Los flavonoides presentes en la miel se dividen en tres clases con estructuras
similares: flavonoles, flavonas y flavanonas. Estos flavonoides son importantes
debido a su contribución al color y el sabor de la miel y también por sus efectos
beneficiosos para la salud (Castro Cruz, 2015)
A la presencia de compuestos fenólicos también se le pueden atribuir propiedades
antioxidantes, lo cual se define como la medición analítica de concentraciones de
radicales de diferente naturaleza en un sistema oxidativo controlado. Estas
41
propiedades se atribuyen especialmente a los flavonoides, cuya actividad resulta de
la combinación de las propiedades quelantes del hierro y captadoras de radicales
libres (Ciappini, Stoppani, Martinet, & Alvarez, 2013).
El presente trabajo de investigación se desarrolló desde dos aspectos, uno químico
y otro biológico. El estudio químico se orientó hacia la determinación del CFT y CF
y en cuanto al estudio biológico se evaluó la capacidad antioxidante por el método
de DPPH, ABTS Y FRAP (Figura 2-1). El análisis estadístico se realizó mediante los
programas estadísticos The R Project for Statistical Computing y IBM SSPS
statistics, asumiendo un análisis de t-Student para muestras relacionadas, una
correlación de Pearson, Anova y Tukey.
Figura 2-1.Diagrama general de la metodología de investigación realizada
2.2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.2.1. General
Para el desarrollo de los métodos se usó etanol destilado, reactivo de FC al 10 %,
Na2CO3 al 7.35 %, AlCl3 al 10 %, CH3COONa 0,1 M, una solución de DPPH 20 mM,
42
ABTS relación 1:40 solución stock ABTS:etanol, buffer pH 3.6, FeCl3 20 mM, Y
TPTZ 10 Mm en relación 100:10:10. Las lecturas de cada método fueron realizadas
en un lector de microplacas Biochrom EZ Read 2000.
El desarrollo de la parte experimental, se realizó en el Grupo Integrado de
Investigaciones en Química y Biología InQuiBio de la Universidad Militar Nueva
Granada (UMNG).
2.2.2. Colecta del material
Las mieles fueron colectadas en diferentes épocas del año 2016 (Tabla de anexos
2-1) y en 8 departamentos de Colombia (Figura 2-2) ubicados en Cartagena,
(Bolívar); Mira flores, Rondón, Samacá, Santa Rosa, Viracachá y Zetaquirá
(Boyacá); Montería, (Córdoba); Bogotá, Guasca, Guatavita, Madrid, Soacha y Tabio
(Cundinamarca); Puerto López (Meta), Charalá y Oiba (Santander), Falan (Tolima)
y Caicedonia (Valle del Cauca).
Figura 2-2.Relación entre los departamentos y lugares de colecta de cada muestra de miel de abejas
43
El contenido (gramos) recolectado de cada una de las muestras de mieles, fue
separado en dos cantidades iguales con la finalidad de obtener una muestra original
y una muestra térmica para cada región y así obtener un total de 40 muestras.
2.2.3. Tratamiento térmico
El tratamiento térmico se realizó con base a lo descrito por (Hernández Londoño,
2016), el cual sugiere realizar un calentamiento a 65°C durante 15 o 20 minutos, por
lo anterior, cada una de las mieles originales y con tratamientos térmicos (T) fueron
denominadas de la siguiente forma:
• Cartagena: C
• Mira flores: MF
• Cartagena T: CT
• Mira flores T: MFT
• Rondón: R • Rondón T: RT
• Samacá: S
• Santa Rosa: SR
• Samacá T: ST
• Santa Rosa T: SRT
• Viracachá: V
• Zetaquirá: Z
• Viracachá T: VT
• Zetaquirá T: ZT
• Montería: M • Montería T: MT
• Hospital San Ignacio: B
• Av. Boyacá – Av. Suba: Bo
• Guatavita: Gu
• Hospital San Ignacio T: BT
• Av. Boyacá – Av. Suba T: BoT
• Guatavita T: GuT
• Guasca: G
• Madrid: Ma
• Guasca T: GT
• Madrid T: MaT
• Soacha: So
• Tabio: Ta
• Puerto López: P
• Charalá: Ch
• Soacha T: SoT
• Tabio T: TaT
• Puerto López T: PT
• Charalá T: ChT
• Oiba: O • Oiba T: OT
• Falan: F
• Caicedonia: Ca
• Falan T: FT
• Caicedonia T: CaT
44
2.2.4. Liofilización de la miel
7 g de cada muestra de miel fueron liofilizadas durante 24 horas en un equipo
Freeze Dryer 18N y hasta sublimar por completo la humedad presente. Las
muestras liofilizadas fueron pesadas para obtener el valor de miel seca y así poder
realizar los respectivos análisis colorimétricos y por HPLC-UV, para estimar la
presencia de compuestos fenólicos.
2.2.5 Extracción sólido- líquido
1 g de muestra liofilizada fue sometida a irradiación por ultrasonido utilizando
metanol (MeOH) como disolvente extractor. Este procedimiento se realizó durante
30 minutos a 20 °C y por triplicado con el fin de garantizar una reproducibilidad a
nivel estadístico. Posteriormente se filtraron y rotaevaporaron los sobrenadantes
obtenidos y se procedió a realizar un ensayo colorimétrico de cada muestra extraída
con el disolvente en mención. Para este ensayo se utilizó como parámetro el
reactivo de FC.
2.2.6. Preparación de las soluciones de trabajo
400 mg de la fracción metanólica de cada una de las 40 mieles fueron disueltas en
4 mL de agua destilada con el fin de llevarlas a una concentración de 100 mg/mL.
Cada una de estas soluciones fueron utilizadas para la cuantificación de fenoles,
flavonoides y capacidad antioxidante.
2.2.7. Cuantificación del contenido de fenoles totales (CFT)
Se siguió el método espectrofotométrico de FC, según lo descrito por (Alvarez-
suarez et al., 2010), con las modificaciones establecidas por el Grupo InQuiBio de
la UMNG. En este procedimiento 20 μL de cada fracción acuosa de miel se hicieron
reaccionar con 40 μL del reactivo de FC y 140 μL de Na2CO3. La mezcla se hizo
reaccionar durante 2 horas bajo la oscuridad y posteriormente se midió la
absorbancia a una longitud de onda de 765 nm. Como patrón de referencia se utilizó
acido gálico (AG) y los resultados fueron expresados en términos de EAG/ g FS
(equivalentes de ácido gálico / mg fracción seca).
45
2.2.8. Cuantificación del contenido de flavonoides (CF)
Se siguió el método espectrofotométrico de AlCl3, según lo descrito por (Meda,
Euloge, Romito, Millogo, & Germaine, 2005) con las modificaciones establecidas
por el Grupo InQuiBio de la UMNG. Se tomaron 170 µL de cada fracción acuosa, se
adicionaron 50 µL de etanol, 15 µL de AlCl3 y 15 µL de CH3COONa. Se dejó
reaccionar en reposo y a la oscuridad durante 40 minutos y posteriormente se midió
la absorbancia a una longitud de onda de 420 nm. Cada muestra se sembró por
triplicado y los resultados se expresaron en términos de mg EQ/ g de FS. Como
patrón de referencia se utilizó quercetina (Q).
2.2.9. Capacidad antioxidante
2.2.9.1. Ensayo de FRAP
Para determinar la reducción férrica / poder antioxidante del Fe3+ a Fe2+, se siguió
el protocolo descrito por (Bolanos de la Torre, Henderson, Nigam, & Owusu-
Apenten, 2015) en el cual se adicionaron 5 µL de cada fracción acuosa más 15 µL
de etanol y 180 µL de la solución FRAP. Se dejó reaccionar en ausencia de luz y a
una temperatura de 37 °C durante 30 minutos. Posteriormente se leyó la
absorbancia a una longitud de onda de 593 nm. Cada extracto se sembró por
triplicado y los resultados fueron expresados en términos de la capacidad
antioxidante equivalente a Trolox (TEAC) (μM) /g FS.
2.2.9.2. Evaluación de la capacidad antioxidante utilizando el radical DPPH
La evaluación de la capacidad antioxidante se determinó por el método
espectrofotométrico del radical libre DPPH siguiendo la metodología propuesta por
(Can et al., 2015) con las modificaciones establecidas por el grupo InQuiBio de la
UMNG. Se tomaron alícuotas de 5, 15, 25, 35 y 50 µL de la fracción acuosa de cada
miel, completando volumen a 50 µL con etanol para luego hacerlos reaccionar con
150 µL de DPPH. La mezcla se dejó en reacción bajo la oscuridad durante 60 min,
luego de los cuales se midió la absorbancia de cada muestra por triplicado a una
longitud de onda de 515 nm. Los resultados fueron reportados en términos de IC50
46
el cual fue calculado con ayuda del software Graph Pad Prism 5.0 y el patrón de
referencia fue Butil hidroxitolueno (BHT).
2.2.9.3. Ensayo de ABTS
Para la evaluación de la capacidad antioxidante por el método de captación del
radical ABTS, se procedió de acuerdo al protocolo reportado por (Bueno-costa et
al., 2016) y con la modificaciones realizadas por el Grupo InQuiBio de la UMNG.
Para este procedimiento se tomaron alícuotas de 5, 15, 25, 35 y 50 µL de cada
fracción de miel con 150 µL del ABTS. Esta mezcla se dejó reaccionar durante 6
min, luego de los cuales se leyó la absorbancia a 734 nm. Los resultados fueron
reportados en términos de IC50, el cual fue calculado con ayuda del software Graph
Pad Prism 5.0 y el patrón de referencia fue BHT.
2.2.10. Análisis Estadístico
A los resultados obtenidos en los métodos espectrofotométricos anteriormente
mencionados, se les realizó una prueba t-Student de muestras relacionadas para
establecer si existen diferencias significativas entre las mieles originales y las
sometidas al tratamiento térmico, un análisis de varianza (ANOVA) para determinar
si existen diferencias significativas entre cada muestra según su origen y una prueba
Tukey para establecer agrupaciones entre las muestras según las diferencias
significativas observadas. Por último, se construyó una gráfica de correlación de
Pearson para obtener los respectivos coeficientes.
2.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
2.3.1. Efecto del tratamiento térmico
En la presente investigación se evalúo el efecto del tratamiento térmico a 65°C por
15 minutos con el fin de determinar si existen diferencias significativas en las
propiedades de la miel antes y posteriormente al tratamiento térmico.
Con el fin de establecer diferencias significativas entre los datos obtenidos para el
CF y CFT tanto en las muestras originales como en las muestras sometidas al
tratamiento térmico, se realizó el análisis estadístico t-Student para muestras
47
relacionadas planteando las siguientes hipótesis: Ho: No hay diferencias
significativas en el contenido de flavonoides y de fenoles antes y después del
tratamiento térmico, y H1: Hay diferencias significativas en el contenido de
flavonoides y de fenoles antes y después del tratamiento térmico.
De acuerdo a un P-valor > 0,05 se pudo establecer que no existen diferencias
significativas al realizar un tratamiento térmico sobre las muestras de mieles.
Basados en (Fuenmayor, 2009), quien realizó un estudio del efecto del tratamiento
térmico sobre la capacidad antioxidante del polen, ésta capacidad aumenta
ligeramente (sin diferencias significativas) al someter la muestra a tratamientos
térmicos alrededor de temperaturas de 70 y 80 °C debido a la formación de
compuestos que pueden contribuir a un aumento en esta propiedad, como es el
caso de algunos aminoácidos y productos de las reacciones de Maillard (como los
residuos histidina‐azúcares reductores) que pueden reaccionar con el radical DPPH
cuando hay hidrolisis parcial de las proteínas, pero disminuye si se sigue
aumentando la temperatura en el proceso ya que generará cambios químicos en los
que se podrá perder algunas de las sustancias que tienen poder de atrapamiento
de radicales (como tocoferoles y vitamina D) principalmente por reacciones
oxidativas. Sin embargo una temperatura adecuada en el calentamiento de la miel
según (Correa Mosquera, 2015) serían 62.8 o 65 °C.
Lo anterior se puede evidenciar al observar la tabla de medias (Tabla 2-1) de los
CFT y CF para las mieles sin y con tratamiento térmico, ya que no existe una
tendencia general de la afectación de éstos compuestos por la aplicación de un
tratamiento térmico, al ser mayor la media de las mieles con tratamiento térmico en
el CFT y menor en CF y, viceversa con las mieles sin tratamiento.
Un ejemplo que comprueba lo descrito anteriormente se puede observar en las
muestras de Z-ZT, Bo-BoT, P-PT y Ch-ChT de la Figura 2-3 donde el CFT es mayor
en las muestras de ZT, Bo, Ch y P y menor en las demás
48
Tabla 2-1.Medias del CFT y CF de las muestras de mieles
FUENTE CFT
mg EAG/g FS
CF
mg EQ/g FS
Miel sin tratamiento térmico
0.035 0,006
Miel con tratamiento térmico
0,037 0,004
.
2.3.2. Cuantificación de CFT
Los resultados obtenidos por el método de FC muestran que el CFT más alto se
encuentran en las muestras C, F, CT y FT con valores de 0.758 ± 0.05, 0.690 ± 0.01,
0.800 ± 0.03 y 0.730 ± 0.05 mg EAG/g FS, respectivamente (Figura 2-3). El menor
contenido se registró en las fracciones acuosas de las muestras Ma, O, MaT y PT
con valores de 0,175 ± 0.02, 0.299 ± 0.01, 0.160 ± 0.02 y 0.258 ± 0.02 mg EAG/g
FS, respectivamente (Tabla de anexos 2-2).
Figura 2-3.Contenido total de fenoles de las fracciones acuosas obtenidas de miel de abejas
El CFT de las diferentes mieles trabajadas mostró diferencias significativas
encontrándose mayores contenidos en la miel de Cartagena lo cual coincide en
términos geográficos con las investigaciones reportadas por Castro (2015) quien
49
trabajó con mieles de Santa Marta, sin embargo en términos generales encontró
valores más altos (oscilan entre 2.13 y 11.51 mg EAG/g miel) en comparación con
los reportados en este estudio, debido a la alta temperatura de esa ciudad. Así como
los de (Muñoz Jáuregui et al., 2014) en trabajos realizados en mieles de Lima-Perú,
reportan contenidos entre 2.08 y 8.31 mg EAG/g miel, Bueno-costa et al. (2016)
trabajaron mieles de varias regiones de Río Grande del Sur, Brasil, reportando
valores que se comprenden en un rango de 0.59 a 1.11 mg EAG/g miel. Por otro
lado, en trabajos realizados en el continente europeo (República Checa) y africano
(Burkina Fasan), respectivamente (Vit, Gutiérrez, Titera, Bednar, & Rodríguez-
Malaver, 2008) obtuvieron valores de 1.15 a 1.29 mg EAG/g miel y Meda et al.,
(2005) para mieles multiflorales y de mielada, contenidos entre 0.32 y 1.14 mg
EAG/g miel.
En cuanto al estudio realizado por Ciappini et al., (2013) en mieles de plantas de
eucalipto, trébol y alfalfa provenientes de Pampeana-Argentina, los valores
comprendidos entre 0.40 a 1.93 mg EAG/g miel, son menores a los del presente
estudio.
La variación en los resultados reportados en esta investigación, se debe a las
diferentes condiciones climáticas y geográficas del origen de la planta de donde las
abejas colectaron el néctar. Por otro lado, éste método además de reaccionar con
los compuestos fenólicos, también lo hace con cualquier sustancia reductora no
fenólica, por lo que la reacción de color puede ocurrir con grupos hidroxifenólicos
oxidables (Castro Cruz, 2015).
2.3.3. Cuantificación de CF
Con el método de AlCl3 se realizó la cuantificación del CF obteniendo el contenido
más alto en las muestras F, B CT y BT con valores de 0.129 ± 0.01, 0.109 ± 0.002,
0.100 ± 0.01 y 0.091 ± 0.001 mg EQ/g FS, respectivamente (Figura 2-4). El menor
contenido se presentó en las muestras de Ch, Ca, CaT y MaT con valores de 0.032
± 0.004, 0.026 ± 0.002, 0.031 ± 0.003 y 0.033 ± 0.004 mg EQ/g FS, respectivamente
(Tabla de anexos 2-2).
50
Figura 2-4. Contenido de flavonoides de las fracciones acuosas obtenidas de miel de abejas
Castro Cruz (2015), Ciappini et al., (2013) y Vit et al., (2008) informaron valores con
mayor amplitud con rangos entre 0.59 y 0.70, 0.75 y 1.42 y, 0.63 y 0.73 mg EQ/g
miel, respectivamente. Por el contrario, autores como Muñoz Jáuregui et al. (2014),
Bueno-costa et al., (2016) y Meda et al. (2005), encontraron valores más bajos
comprendidos entre 0.01 y 0.04, 0.03 y 0.10 y, 0.002 y 0.084 mg EQ/g miel,
respectivamente.
Los resultados obtenidos por el método de AlCl3 no indican una cantidad exacta de
flavonoides totales, ya que sólo las flavonas y flavonoles forman complejos estables
con el AlCl3 al reaccionar el grupo ceto C-4 y el hidroxilo C-3 o C-5, o complejos
menos estables como los grupos ortodihidroxilo en el anillo A o B. En cambio, las
flavanonas e Isoflavonas reaccionan mejor con otros reactivos, como la 2,4-
dinitrofenilhidrazina (Chang, Yang, Wen, & Chern, 2002; Salinas Salinas, 2012).
Además de lo anterior, la longitud de onda máxima seleccionada (420 nm) para la
medición arroja lecturas de absorbancia más altas para los complejos formados por
compuestos de flavona y flavonol (exceptuando crisina y apigenina) que para los de
flavanonas e isoflavonas (Chang et al., 2002).
51
2.3.4. Capacidad antioxidante por el ensayo de FRAP
Para la capacidad antioxidante medida por el método de FRAP (reducción del Fe3+),
las muestras que presentaron mayor captura de radicales libres fueron C, CT, F y
FT con valores de 203.3 ± 4.8, 180.2 ± 0.8, 134.6 ± 3.6 y 133.6 ± 2.0 TEAC (µM)/g
FS, respectivamente (Figura 2-5 y 2-6). Las muestras que presentaron menor
capacidad fueron MaT, CaT, Ca y ChT con valores de 31.6 ± 1.2, 35.2 ± 1.3, 34.2 ±
1.4 y 35.6 ± 6.2 TEAC (µM)/g FS, respectivamente (Tabla de anexos 2-2).
Figura 2-5.Capacidad antioxidante por el ensayo de FRAP con agrupaciones según el test de Tukey
Figura 2-6.Resultado positivo para el ensayo de FRAP
Según Aljadi & Kamaruddin (2004) las muestras de mieles analizadas de Malasia
tienen mayor capacidad de reducción, ya que obtuvieron valores comprendidos
52
entre 961 y 1350 µM, mientras que (Moniruzzaman, Sulaiman, Khalil, & Gan, 2013)
reportan valores con menor amplitud que van desde 2.10 hasta 6.48 µM/g miel.
En el ensayo de FRAP es problable que algunos antioxidantes como el ácido
ascórbico y el ácido úrico puedan reducir tanto las especies reactivas como el Fe3+,
y su capacidad para reducirlo puede reflejar también su capacidad para reducir
especies reactivas. Sin embargo, no todas las sustancias capaces de reducir el Fe3+
son antioxidantes. Cualquier sustancia donante de electrones, incluso sin
propiedades antioxidantes con potencial redox inferior al del par redox Fe3+/ Fe2+,
puede contribuir al valor FRAP e indicar valores falsamente altos (Karadag, Ozcelik,
& Saner, 2009), lo que explica el por qué haber obtenido valores altos en éste
ensayo a diferencia de los demás ensayos colorimétricos.
2.3.5. Evaluación de la capacidad antioxidante por el ensayo de DPPH y
ABTS
Las Figuras 2-7 y 2-8 detallan un grupo de muestras que evidencian el
comportamiento que describe el efecto de las 5 concentraciones diferentes a fin de
determinar la concentración óptima necesaria para disminuir el 50 % de la
concentración inicial del radical DPPH y ABTS.
Figura 2-7.IC50 para el ensayo de DPPH de las mieles de SR, M, GT y B
53
Figura 2-8.IC50 para el ensayo de ABTS de las mieles de Bo, C, S y G
Los IC50 registrados permiten evidenciar una mayor capacidad antioxidante en las
mieles de F, V, FT y VT por el ensayo de DPPH (Figura 2-9-a), y en ABTS F, Bo,
FT y CT con valores son de 2707, 2649, 1721, 3745 y 2505, 2826. 1665 y 2625
µg/mL, respectivamente (Figura 2-9-b). Las de menor capacidad en términos de IC50
para DPPH fueron Ta, Ma, OT y MaT y de ABTS fueron Ma, Ca, MaT y CaT con
valores de 56474, 38465, 40750 y 54560 y 25527, 25234, 47982 y 34502 µg/mL,
respectivamente (Figuras 2-10 y 2-11). Todos los resultados obtenidos en éstos
ensayos se muestran en la tabla de anexos 2-1 en términos de IC50.
Figura 2-9.Resultado positivo para el ensayo DPPH (a) y ABTS (b) de las muestras más activas
Los valores obtenidos en términos de IC50, son promisorios para este estudio
explorativo en las diferentes regiones de Colombia, sin embargo, en otros lugares
54
tropicales se han reportado estudios con valores de IC50 significativos, como los
reportados por Patrignani et al., (2016) quienes trabajaron sobre muestras de mieles
de la provincia de Buenos Aires, Argentina, (Montenegro, Santander, Jara, Nuñez,
& Fredes, 2013) con investigaciones en mieles monoflorales de plantas nativas
chilenas, Maurya et al., (2014) quienes hacen una revisión de los estudios sobre la
capacidad antioxidante en un barrido de varias mieles de diferente flora y origen
geográfico y, Combarros et al., (2012) quienes trabajaron en mieles españolas de
diferentes orígenes florales, muestran mejor capacidad antioxidante (buen
eliminador de radicales libres), con valores de IC50 de 20.1 a 47.4 mg/mL, 1.63 a
47.62, 1.63 a 428.78 mg/Kg y 3.82 a 76.81 mg/mL, respectivamente.
Figura 2-10.Capacidad antioxidante en términos de IC50 para el ensayo de DPPH
Los anteriores estudios muestran que existe una alta selectividad del lugar de
colecta de la miel, el cual se relaciona con alturas menores a 1000 m.s.n.m. y
temperaturas superiores a 30 °C. Estos datos muestran alta concordancia con los
resultados obtenidos, donde se observó que climas templados y fríos como los de
Cundinamarca y Boyacá no favorecen la producción de un alto contenido fenólico y
por ende una baja capacidad antioxidante, sin embargo climas cálidos y alturas más
cercanas a las del nivel del mar como es el caso de Bolívar, Córdoba y Tolima,
55
favorecen la mejor producción de compuestos fenólicos, lo cual se ve reflejado en
valores significativos de capacidad captadora de radicales libres.
Figura 2-11.Capacidad antioxidante en términos de IC50 para el ensayo de ABTS
La Figura 2-11 muestra los IC50 obtenidos para el ensayo de ABTS, en donde se
puede evidenciar que las muestras de CT, SR y F muestran valores significativos
en términos de capacidad antioxidante y, notablemente la muestra colectada en
cercanía de la avenida Boyacá-Bogotá mostró valores comparables, lo cual se
podría atribuir a las condiciones de intervención del hombre (contaminación
vehicular) por lo que las plantas (de donde se obtuvo el néctar) desarrollan mayores
mecanismos de defensa frente al estrés generado por la contaminación (Kenjerić,
2008). En estudios realizados por (Alzahrani et al., 2012), reportó que la actividad
de eliminación de radicales para las tres mieles de plantas de Manuka-Nueva
Zelanda, Acacia-Alemania y zanahoria silvestre de Argelia varió de 43.25 a 202.26
mg/mL, mientras que las 6 mieles turcas de 19 orígenes florales diferentes
reportadas por (Kıvrak & Kıvrak, 2017) arrojaron un IC50 de 10.33 a 41.20 µg/mL,
56
Lo anterior, evidencia que las mieles analizadas por los autores en mención,
presentan valores significativos de capacidad antioxidante en comparación con la
determinada en ésta investigación, lo cual se debe a una causa ambiental o
climatológica.
La cantidad en la que se presentan los compuestos responsables de la capacidad
antioxidante en la miel es muy variable y depende principalmente del color, ya que
este varía desde casi incoloro a pardo oscuro, debido a la procedencia botánica (por
la presencia de pigmentos en los néctares o en las secreciones de las plantas que
liban las abejas), la procedencia geográfica, las condiciones climáticas y la fecha de
colecta (Combarros-Fuertes, Tornadijo, Castro, & Fresno, 2012; Visquert, 2015).
Se pudo evidenciar que las muestras con mayor capacidad antioxidante son
aquellas cuya coloración es más intensa (marrón) y esta coloración es proporcional
a temperaturas de colecta más altas. Lo anterior responde a la fuerte correlación
que se ha demostrado en varios estudios entre la actividad antioxidante y el color,
y a su vez en la relación con factores composicionales, principalmente, con su
mayor contenido de compuestos fenólicos (Combarros-Fuertes et al., 2012; Frankel,
Robinson, & Berenbaum, 1998; Maurya, Kushwaha, Singh, & Singh, 2014), a
excepción de las muestras obtenidas en Viracachá-Boyacá, donde se obtuvo un
bajo CFT, pero si bien posee poca cantidad de compuestos fenólicos, éstos tienen
una gran capacidad antioxidante (Patrignani, Lupano, & Conforti, 2016).
Por último, en los resultados se pudo detallar que para la mayoría de datos
obtenidos de IC50 en el ensayo de ABTS fueron menores que en DPPH, debido a
que éste último posee mayor selectividad y no reacciona con cualquier compuesto
aromático hidroxilado independientemente de su potencial antioxidante real, con
flavonoides carentes de grupos hidroxilo en el anillo B, ni con ácidos aromáticos que
contengan un solo grupo hidroxilo, lo que explica que por el ensayo de ABTS se
obtenga mejor capacidad antioxidante (Palomino G., García P., Gil G., Rojano, &
Durango R., 2009). Sin embargo, dada la complejidad de las reacciones oxidativas,
ninguna prueba antioxidante individual puede medir todos los compuestos
57
oxidativos en todas las matrices ya que, el mecanismo de la actividad antioxidante
en un sistema puede o no predecir la actividad en otros sistemas. Por lo tanto, se
obtendrán valores más confiables al hacer uso de una combinación de ensayos para
para determinar ésta propiedad (Combarros-Fuertes et al., 2012).
2.3.6. Análisis de varianza y test de Tukey
Los resultados obtenidos en el presente trabajo se evaluaron a través de un análisis
de varianza (ANOVA) seguido por una prueba de Tukey, con el objetivo de realizar
comparaciones múltiples entre muestras y poder determinar agrupaciones similares
y/o diferentes entre las mismas según su origen, comprobando que al menos uno
de los promedios es estadísticamente diferente.
EL análisis de varianza (ANOVA) y Tukey, arrojaron diferencias significativas
(ρ<0.05) entre el origen de las muestras para la cuantificación de CFT, CF y FRAP
El test de Tukey en CFT separó las 40 muestras de mieles analizadas en 22 grupos,
donde en su gran mayoría se agrupan de 2 a 5, 10 no se agrupan y las muestras
que más difieren estadísticamente de las otras, pero no entre sí, son Ma y MaT.
Para el CF, el análisis separó las muestras en 33 agrupaciones, siendo este el
análisis con mayor variabilidad estadística ya que, 14 de las muestras se asociaron
en 7 grupos de 2 y las 26 restantes pertenecen a grupos diferentes, donde las mieles
de F, FT y B son las que más diferencias significativas presentan, ya que se
categorizaron con letras (a, e y b, respectivamente) que no se comparten de un
grupo a otro. Por último, en el ensayo de FRAP el test excluyó las muestras en 22
grupos, de los cuales 10 fueron conformados por 26 mieles en agrupaciones de 2 a
4, y los demás fueron conformados por una única muestra, donde C, CT, F y FT son
las más diferentes estadísticamente de las demás (a, b, c y c,
correspondientemente), pero F y FT pertenecen a un mismo grupo por lo que no
difieren entre sí.
En las Figuras 2-3, 2-4 y 2-5 se observan los resultados obtenidos en la
cuantificación espectrofotométrica de CFT, CF y FRAP, con lo que es posible
demostrar que no existe una tendencia definida entre los contenidos de las muestras
58
de mieles según su origen, por lo que se establece una amplia variabilidad entre los
contenidos, evidenciándose la influencia de su origen.
Como resultado del test de Tukey, se pudo determinar que CFT y FRAP son más
homogéneos estadísticamente que CF, ya que la conformación de menos grupos
es un indicativo de mayor similitud entre muestras.
2.3.7. Correlación de Pearson entre variables espectrofotométricas
La correlación es utilizada generalmente para referirse a una relación o asociación
entre dos o más datos para establecer una correlación lineal o evaluar una posible
asociación bidireccional entre las variables estudiadas.
Dicha correlación puede ser evaluada por coeficientes que pueden representar la
proximidad en un intervalo desde -1, 0 ó +1, indicando una correlación lineal
negativa perfecta, sin correlación o una correlación lineal positiva perfecta,
respectivamente. Entre más cercano a ±1 se encuentre el coeficiente, mayor será
la correlación entre las variables. Un coeficiente de correlación negativo indica una
relación inversamente proporcional y uno positivo una relación directamente
proporcional entre las variables (Mukaka, 2012).
Para la interpretación del coeficiente de correlación de Pearson se deben tener en
cuenta los valores de la Tabla 2-2.
Tabla 2-2.Intervalos de correlación de Pearson.
INTERVALO DE CORRELACIÓN INTERPRETACIÓN DE INTERVALO
± 0,90 a ± 1,0 Correlación muy alta
± 0,70 a ± 0,90 Correlación alta
± 0,50 a ± 0,70 Correlación moderada
± 0,30 a ± 0,50 Baja correlación
± 0,00 a ± 0,30 Correlación nula
Como se observa en la Figura 2-12 existe una correlación alta entre CF-CFT
(r=0,8113554), FRAP-CFT (r=0,8440954), FRAP-CF (r=0,7381455), CFT-ABTS (r=
-0,7534556), una correlación moderada entre ABTS-DPPH (r = 0,6657906), ABTS-
FRAP (r= -0,6108677), DPPH-CFT (r= -0,6080941), ABTS-CF (r= -0,6163207),
FRAP-DPPH (r= -0,5184452), una baja correlación entre DPPH-CF (r= -0,3884603).
59
Los resultados del contenido de flavonoides y FRAP se correlacionan con el de
contenido de fenoles totales puesto que los flavonoides son un subgrupo de los
compuestos fenólicos (Valenzuela et al., 2014) e indican el papel fundamental de
los compuestos fenólicos en la actividad antioxidante de la miel (Aljadi &
Kamaruddin, 2004).
Figura 2-12.Correlación de Pearson entre variables espectrofotométricas en las fracciones acuosas
de miel.
En el estudio realizado en mieles de Santa Marta, Castro Cruz (2015) halló una
correlación baja para FRAP-CFT (r=0,46) y nula para CF-CFT (r=0,23), y FRAP-CF
(r=0.11), en comparación con las altas correlaciones obtenidas en el presente
trabajo. La anterior discrepancia, puede ser debida a la diferencia en el origen
geográfico y botánico de las fuentes florales de las que se obtuvo el néctar, dado
que las plantas contienen diferentes compuestos fenólicos y muestran variación en
su contenido fenólico total (Aljadi & Kamaruddin, 2004).
Respecto a la correlación de ABTS-FRAP en resultados hallados por (Floegel, Kim,
Chung, Koo, & Chun, 2011) y (Babbar, Oberoi, Uppal, & Patil, 2011) obtuvieron
coeficientes de correlación muy altos de r=0.949 y r=0.95, respectivamente; en
comparación con el r=0,6657906 obtenido.
Las correlaciones lineales negativas perfectas obtenidas en CFT-ABTS, DPPH-
CFT, ABTS-CF, FRAP-DPPH, DPPH-CF y ABTS-FRAP, señalan una relación
60
inversamente proporcional, lo que indica que a mayor cantidad de fenoles se
alcanzará rápidamente la media inhibitoria lo que en términos de IC50 es favorable
(Di Majo, La Guardia, Giammanco, La Neve, & Giammanco, 2008).
2.4. CONCLUSIONES
Las mieles analizadas exhibieron una coloración entre blanca lechosa, pasando por
una amplia variedad de tonos amarillos hasta llegar a un color ámbar. Dicha
propiedad fue influyente para determinar entre las muestras la de mayor capacidad
de captar radicales libres y por ende comprobar la fuerte correlación que existen
entre el color y la actividad antioxidante.
La variabilidad obtenida en la prueba de Tukey para los diferentes ensayos
espectrofotométricos indicó que la miel hereda propiedades de la planta, al ser la
fuente del néctar que extrae la abeja para su producción. Por ende, factores como
la ubicación geográfica, las condiciones climáticas, la diversidad de flora, la
alimentación de las abejas por parte de los apicultores, la fecha de colecta, entre
otros, influyen directamente en su composición y por tanto en la diferencia de
contenidos de fenoles, flavonoides y capacidad antioxidante.
Los coeficientes determinados por la correlación de Pearson para las variables
espectrofotométricas establecen correlaciones lineales altas entre el contenido de
fenoles-flavonoides-capacidad antioxidante. Sin embargo, el contenido de fenoles
no es indicativo de hallar un igual contenido de flavonoides, ya que existen otros
tipos de compuestos fenólicos que son determinados por el ensayo de Folin-
Cioucalteu.
El alto contenido de carbohidratos presentes en la miel, hacen que ésta tienda a
cristalizarse con facilidad y por ello, técnicas como la pasteurización a 65 °C durante
15 o 20 minutos sean utilizadas para su comercialización. De acuerdo con los
resultados obtenidos, no es preciso establecer una tendencia acerca de lo sucedido
con los compuestos fenólicos y su capacidad antioxidante.
Las diferencias significativas arrojadas por el análisis de Anova, comprobaron gran
variabilidad entre contenido de las mieles de acuerdo al origen, y por ende se pudo
61
establecer las que mayores contenidos presentaban entre las muestras colectadas.
Sin embargo, no es apropiado asegurar que los contenidos sean específicos y se
mantengan en cada región al solo tratarse de una muestra por cada una de ella.
62
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65
CAPÍTULO 3
PERFIL CROMATOGRÁFICO POR HPLC-UV DE
FRACCIONES METANÓLICAS DE MIEL DE ABEJAS
ENRIQUECIDAS EN COMPUESTOS FENÓLICOS
3.1. INTRODUCCIÓN
La cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) es una técnica con la cual los
analitos de una mezcla de compuestos se logran separar e identificar debido a su
alta sensibilidad y a la influencia de dos efectos contrapuestos, la retención (fase
estacionaria) y el desplazamiento (fase móvil) (Alfonso Méndez, 2008). Lo anterior
es un rasgo característico de la cromatografía donde la clave para una buena
separación está en elegir un sistema de fases adecuado, ya que la velocidad de
desplazamiento y la afinidad relativa que tenga cada sustancia con la fase móvil y
estacionaria, hará que los componentes más afines a ésta última avancen
lentamente (más retenidos) mientras que los más afines a la fase móvil (menos
retenidos) se mueven con mayor rapidez (UNAM, 2007). Como consecuencia de la
distinta movilidad, los componentes de las muestras se separan en zonas
específicas que pueden analizarse cualitativa y cuantitativamente (Negrín, 2014).
Esta técnica es de vital importancia debido a que utiliza una elevada presión para
forzar a que el disolvente pase por una columna de partículas finas, consiguiendo
así separaciones óptimas, ya que no todos los compuestos poseen propiedades
físicas que les permiten ser volátiles para poder ser analizados por cromatografía
de gases (Harris, 2007).
Una de las técnicas de mayor uso para la identificación y separación de sustancias
es la HPLC en fase reversa, debido a que proporciona una mejor selectividad y una
retención óptima al separar los compuestos dependiendo de sus polaridades,
iniciando con los de mayor polaridad (Esquivel & Leal, 2004).
La técnica HPLC en fase reversa y acoplada al detector ultravioleta (UV) es una de
las más usadas en los métodos instrumentales, debido a que es estable en el
66
tiempo, no destruye las muestras a analizar, es poco afectada por la temperatura y
permite la elección de diferentes longitudes de onda de trabajo sin cambiar filtros o
lámparas, facilitando el análisis de diversos compuestos químicos que absorben
radiación UV, como los compuestos aromáticos, alquenos, moléculas con enlaces
C-O, C-N, C-S. Además, esta técnica es muy utilizada para corroborar la identidad,
ya que la identificación basada en una sola longitud de onda del rango UV puede
presentarse a interferencias (UNAM, 2007).
La cromatografía de líquidos abarca un grupo muy amplio entre los métodos
cromatográficos, puesto que el sistema de fases ofrece diversas posibilidades para
separar compuestos químicos muy diferentes como los flavonoides, un grupo bien
definido de compuestos con características físicas y químicas establecidas, lo que
especialmente cuenta para su absorción de la radiación ultravioleta (UV), al hacer
que sus espectros UV sean característicos. Se observan dos bandas de absorción
principales: 1) banda I (320-385 nm) debido a la absorción del anillo B; y 2) banda
II (250-285 nm) debido a la absorción del anillo A. La posición de estas bandas
proporciona información sobre el tipo de flavonoide y su patrón de sustitución
(Stefova, Stafilov, & Kulevanova, 2003).
3.2. MATERIALES Y MÉTODOS
La metodología general para el análisis de las muestras por HPLC-UV se resume
en la Figura 3-1.
Figura 3-1.Diagrama general de la metodología implementada para el perfilado metabólico por
HPLC-UV de las fracciones metanólicas de miel
67
3.2.1. Preparación de muestras
Para el análisis por HPLC-UV, se pesaron 500 mg de cada muestra y se diluyeron
en 1 mL de metanol grado HPLC, posteriormente se llevó a irradiación por
ultrasonido hasta dilución completa de la miel y finalmente cada muestra se filtró
usando microfiltros PTFE 0.2 µm.
3.2.2. Perfilado por HPLC-UV
Se utilizó un equipo Shimadzu Prominence LC-20 AD con un detector SPD-20AV
(UV) con lámpara de deuterio, para realizar la detección a 270 y 330 nm de manera
simultánea. Se utilizó una columna premier C18 5 µ 150 x 4.6 mm. En el método
empelado se utilizó como fase móvil una mezcla de agua en ácido fórmico al 0.01
% (A) y metanol (B) en modo gradiente. El programa de la fase móvil fue 0 % de B
durante 3 minutos, luego se aplicó un gradiente hasta el 30 % de B a los 15 minutos,
manteniendo estas condiciones por dos minutos más, seguido de un incremento
gradual hasta 100 % de B a los 20 minutos y conservando esta concentración hasta
los 27 minutos, finalmente se aplicó un descenso 0 % de B a los 29 minutos y
manteniendo constante hasta los 33 minutos. El flujo de la fase móvil fue 0.700
mL/min, el volumen de inyección fue 20 µL.
3.2.3. Pretratamiento de datos cromatográficos
Para todos los datos cromatográficos obtenidos de cada muestra, se realizó un pre-
procesamiento de corrección de línea base, alineación, normalización y
autoescalado, utilizando los softwares MATLAB y MzMINE 2 y las gráficas fueron
procesadas en el programa Origin 8.5.
3.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se obtuvieron los perfiles cromatográficos por HPLC-UV, de las 40 fracciones
metanólicas de las mieles obtenidas de diferentes regiones de Colombia. Estos
resultados permitieron realizar una comparación entre las muestras tratadas
térmicamente y las no tratadas, así como analizar la variación de metabolitos
secundarios (compuestos fenólicos y flavonoides) dependiendo del lugar de colecta,
68
lo cual estuvo directamente relacionado con factores como la temperatura, altura,
fuente de alimentación de las abejas y posibles cambios debido a la poca o alta
intervención del hombre (contaminación del entorno).
Para analizar los perfiles cromatográficos obtenidos de las muestras de mieles a
longitudes de onda de 270 y 330 nm, se hizo una comparación de los tiempos de
retención por medio de la superposición de los picos obtenidos (Figura 3-2).
Figura 3-2.Perfil cromatográfico comparativo de las 40 fracciones metanólicas de mieles
Al realizar la comparación de los cromatogramas de cada miel, fue posible detectar
una alta coincidencia de señales en la mayoría de mieles a un tiempo de retención
(tr) de 12 min, donde se aprecia el compuesto mayoritario en términos de
abundancia relativa, especialmente en SRT, Bo, BoT, Ca, CaT y C. En el tr = 16-17
min en F, FT Gu, GuT, Ta y TaT se detectó un pico con menor intensidad que el
anterior, pero abundante en relación a otros, al igual que el pico que presentan Gu,
GuT, Ta y TaT hacia un tr = 19-20 min, donde incluso para Ta y TaT es doble. Así
69
como las muestras anteriores, So y SoT tienen picos en el mismo tiempo de
retención pero con mayor abundancia relativa.
Finalmente, en el tr = 23-24 min Gu, GuT, Ta, TaT, Ch, ChT, O, OT, S, ST, V, VT, B
y BT muestran una doble señal que inicia con una banda ancha desde un tr = 21 min
pero alcanzan su máxima abundancia en aproximadamente 23 y 24 min, lo que se
puede interpretar como la presencia de más de un compuesto en esa región. Del
mismo modo, F y FT presentan un comportamiento similar a las muestras anteriores
pero la abundancia de su pico es más significativa. Las abundancias nombradas
anteriormente, se pueden observar en la Figura 3-3.
Las señales a diferentes tiempos de retención nombradas anteriormente, fueron las
que mayor abundancia presentaron a lo largo de los cromatogramas, sin embargo
en un tr = 3, 6 y 9 min aproximadamente, se presentaron señales poco abundantes
pero que están presentes en la mayoría de muestras y, se destacan en RT, CT-P-
PT y M-MT, respectivamente.
Figura 3-3.Perfil cromatográfico en 3D de las 40 fracciones metanólicas de mieles
70
3.3.1. Comparación de los perfiles cromatográficos de las fracciones de
mieles de abejas con y sin tratamiento térmico.
Al realizar una comparación entre los cromatogramas de las muestras sin
tratamiento térmico y el de las tratadas térmicamente (Figura 3-4), nuevamente se
puede comprobar que no es posible establecer una tendencia en cuanto a lo que
sucede con los compuestos analizados en el presente estudio, ya que pueden haber
presencia de compuestos altamente termolábiles que por el efecto de la temperatura
se pueden descomponer; pero en compuestos como el D, con el efecto de la
temperatura demuestra una mayor abundancia relativa y estabilidad. Por lo anterior,
si se evidencian disminuciones o aumentos en la intensidad de la señal de los
compuestos a nivel general, no serán cambios significativos entre un perfil
cromatográfico (Figura 3-4-a) y otro (Figura 3-4-b).
Figura 3-4.Perfiles cromatográficos de las muestras sin tratamiento térmico (a) y con tratamiento térmico (b)
Un ejemplo de lo anterior se evidencia en mieles como Gu y GuT (Figura 3-5) donde
las señales obtenidas se mantienen con una relación estrecha de un cromatograma
a otro, pero en muestras como la de C el contenido del compuesto D retenido en el
minuto 12 es más abundante que en CT (Figura 3-6), contrario a lo que sucede con
las muestras donde el compuesto al mismo tiempo de retención es mayor en SRT
que en la de SR (Figura 3-7).
71
Algo similar a lo anterior sucede con el pico registrado hacia un tr = 9 min, donde es
mayor para la muestra SR que en SRT pero en la miel de los municipios de Rondón
y Samacá, es mayor en la tratada térmicamente.
Figura 3-5.Perfil cromatográfico de la miel de Guatavita (a) sin tratamiento térmico (b) con tratamiento térmico
Figura 3-6.Perfil cromatográfico de la miel de Cartagena (a) sin tratamiento térmico (b) con
tratamiento térmico
Figura 3-7.Perfil cromatográfico de la miel de Santa Rosa (a) sin tratamiento térmico (b) con
tratamiento térmico
72
Además de lo anterior y teniendo en cuenta la forma de cómo se produce la miel, la
presencia de los compuestos fenólicos varía de acuerdo al origen geográfico, las
condiciones climáticas y dependiendo de las plantas que utilizaron las abejas como
fuente principal del néctar para su producción. Aunque algunos de los compuestos
fenólicos están presentes en más o menos todos los tipos de miel, como el
reportado hacia un tr = 12 min (D); otros flavonoides son específicos para un cierto
tipo planta y, por ende, podrían utilizarse como marcadores para este tipo de
producto (Kenjerić, Mandić, Primorac, & Čačić, 2008). Por lo tanto, al observar los
perfiles cromatográficos de las muestras analizadas (Figura 3-2) y las
comparaciones entre los cromatogramas de muestras tomadas de 8 departamentos
de Colombia (Figura 3-8), se observa que en la mayoría de los perfiles
cromatográficos se presentan señales en común y con alta abundancia relativa para
los compuestos D y G, y en menor intensidad para los compuestos A y C. También
se evidencia que las señales del compuesto E son exclusivas para los perfiles
cromatográficos a y h, lo que puede deberse a la temperatura templada que
presentan éstos dos municipios, pero como Falan es más cálido que Guatavita y
tiene menor altura, los compuestos H, I y J son únicos de ese lugar, en comparación
con los analizados.
Con la anterior comparación, es posible determinar que los perfiles cromatográficos
de cada miel presentan una combinación única de compuestos fenólicos, ya que los
tiempos de retención no son exactamente los mismos para cada una y en dado caso
de coincidir, la abundancia relativa que presentan son totalmente diferentes o los
picos presentan acoplamientos disímiles. De acuerdo a éste estudio y
complementándolo con una combinación entre HPLC-MS y análisis multivariado, es
posible obtener perfiles de huellas dactilares y modelos de clasificación que
permitan determinar los compuestos fenólicos que estarán presentes en las mieles
según el origen (Zhou et al., 2014).
73
Figura 3-8.Comparación de cromatogramas de mieles de diferentes departamentos. Cundinamarca (a), Valle (b), Meta (c), Bolívar (d), Córdoba (e), Santander (f), Boyacá (g) y Tolima (h)
74
Considerando los picos mencionados anteriormente y los resultados obtenidos en
la cuantificación espectrofotométrica, se evidencia que hay una relación entre la
cantidad de picos y su abundancia con la actividad que presentan las muestras. Un
ejemplo de ello son las mieles F y FT, las cuales reportaron la mayor actividad en
los análisis de los compuestos fenólicos y capacidad antioxidante, y gran cantidad
de señales en sus perfiles cromatográficos (Figura 3-9), donde los compuestos I, J
y H reportados hacia aproximadamente un tr = 11, 16-17 y 21 min respectivamente,
son los que difieren en mayor medida de los demás, ya que es en ésta única miel
en donde se ven reflejados, lo que puede deberse a que Falan está ubicado a una
altura menor a 1000 m.s.n.m. y tiene un clima templado (alrededor de 20 °C).
Figura 3-9.Cromatogramas de las mieles F (a) y FT (b).
Figura 3-10.Cromatogramas de las mieles V (a) y VT (b).
75
Sin embargo, al analizar los cromatogramas de las muestras de V y VT (Figura 3-
10) se evidencia que no hay gran cantidad de señales como las detalladas en el
perfil cromatográfico de F y FT (Figura 3-9), es decir, las señales de los compuestos
J, E, I y H se encuentran ausentes en ésta muestra, lo que se puede deber a la
diferencia de origen geográfico de las dos muestras en mención. No obstante, hacia
un tr = 21-24 min se observa una región de señales en común, y al comparar con
los datos obtenidos en el ensayo de DPPH, se evidencia que éstas son las muestras
que arrojan mejor capacidad. Lo anterior, puede deberse a que el o los compuestos
retenidos en ése tiempo poseen mayor significancia en la propiedad antioxidante de
las mieles.
Teniendo en cuenta las características de absorción y los diferentes tiempos de
retención que pueden presentar los compuestos fenólicos y flavonoides según el
sistema y gradiente que se use para su análisis, por comparación con otros autores
que realicen estudios similares, solamente es posible dar una aproximación de los
compuestos que posiblemente puedan estar presentes en la miel de estudio.
De acuerco con (Castro Cruz, 2015), (Hussein, Yusoff, Makpol, & Yusof, 2011),
(Aljadi & Yusoff, 2003), (Andrade, Ferreres, & Amaral, 1997), (Ferreres et al., 1994),
(Pyrzynska & Biesaga, 2009), quienes realizaron estudios sobre mieles de
diferentes origenes geográficos (como Colombia, España y Malasaia) e identificaron
a través de técnicas instrumentales como HPLC-UV, DAD y MS los compuestos
característicos de cada una de sus mieles con sus respectivos tiempos de retención,
problamente los compuestos mencionados en la Tabla 3-1 pueden estar presentes
en las muestras de mieles analizadas, a excepción de los flavonoides Crisina y
Galangina, ya que los tiempos de retención en los que se hallaron fueron en
promedio 46.256 y 44.77 min respectivamente; y en el estudio en mención luego de
tr = 33 min no se registraron señales en ninguna de las muestras.
76
Tabla 3-1.Tiempos de retención reportados en estudios de miel de abejas para diferentes compuestos fenólicos
Partiendo de los datos reportados en la tabla anterior y relacionando los tiempos de
retención, posiblemente las señales obtenidas en los perfiles cromatográficos de las
mieles estudiadas pertenecen a los compuestos relacionados en la Tabla 3-2 y
Figura 3-11.
Tabla 3-2.Posibles compuestos para las señales obtenidas en los perfiles cromatográficos
77
Figura 3-11.Estructuras de los posibles compuestos presentes en las muestras de mieles.
Sin embargo, lo que sí se puede afirmar teniendo en cuenta que se utilizó la técnica
de HPLC-UV, es que los componentes detectados poseen grupos cromóforos que
podrían derivarse de ácidos fenólicos o flavonoides (Pimentel, da Costa,
Albuquerque, & Junior, 2013), y basados en la usual absorción UV de los
flavonoides, donde la mayoría muestran dos bandas principales de absorción, la
banda I entre el rango de 320-385 nm representa absorción del anillo B y la banda
II en el rango 250-285 nm representa absorción del anillo A (Robards, Prenzler,
Tucker, Swatsitang, & Glover, 1999), las mieles estudiadas presentan los
flavonoides descritos en la Tabla 3-3, de acuerdo a las longitudes de onda usadas
en el análisis de cromatografía.
Tabla 3-3.Absorción espectral de varias clases de flavonoides
Tipo de flavonoide Banda ll Banda l
Flavonas 240-280 Intensa 305-350
Flavanonas, Flavanonoles Intensa 270-295 300-330
Flavonoles 270-280 -------------
Isoflavonas 245-270 300-340
Fuente: Robards et al.,(1999)
78
A partir de lo anterior, se puede inferir la presencia de estos compuestos en las
mieles, ya que en la mayoría de los cromatogramas se reflejaron picos de absorción
hacia el lado derecho de éste (Figura 3-2), que es donde suelen presentarse las
bandas del anillo B de los flavonoides. Sin embargo, la abundancia de éstos es
mínima en la mayoría de las mieles, a excepción de F, FT, C, CT, B y BT, lo que
confirma el bajo contenido de flavonoides obtenidos en el capítulo anterior.
3.4. CONCLUSIONES
Los tiempos de retención de un compuesto dependen de un gran número de
variables, como el sistema de fases que se escoge, el gradiente a utilizar y el tiempo
de análisis, por lo que la identificación de los compuestos fenólicos a partir de la
comparación entre los tiempos de retención no es muy precisa, debido a que es
muy difícil reproducir exactamente las mismas condiciones de análisis.
La identificación de los compuestos presentes en matrices complejas como la miel
mediante un análisis de HPLC-UV, es una técnica que permite identificar la cantidad
de compuestos presentes en una mezcla, pero para poder identificar de forma
precisa dichas estructuras y su naturaleza, es indispensable hacer uso de técnicas
complementarias, como HPLC-MS-DAD.
A través del análisis HPLC-UV fue posible determinar picos comunes en la mayoría
de las muestras, como el compuesto D reportado hacia un tiempo de retención de
12 min, sin embargo y de acuerdo a los resultados obtenidos en el análisis
espectrofotométrico, dicho compuesto o compuestos sugieren que la capacidad
antioxidante es relativamente alta en comparación con otras mieles, pero su valor
relativo tiene baja significancia en la actividad biológica.
Mediante la comparación de los cromatogramas obtenidos, se evidenció la
importancia del compuesto I registrados en un tiempo de retención de 15-18 min,
ya que únicamente en las muestras de Falan se registró con mayor abundancia
relativa, al igual que sus demás picos, lo que está en concordancia con un mejor
contenido de compuestos fenólicos, flavonoides y capacidad antioxidante.
79
REFERENCIAS
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80
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81
CONCLUSIONES GENERALES Y RECOMENDACIONES
El presente estudio de mieles colectadas en diferentes departamentos de Colombia,
permitió estimar las propiedades antioxidantes y el contenido fenólico a nivel
general. Se observaron diferencias marcadas entre muestras colectadas en lugares
silvestres, en apiarios supervisados por el hombre, así como en sectores cálidos,
medios y templados, demostrándose que las mieles presentan mejores
comportamientos como antioxidantes naturales cuando provienen de lugares
cálidos, como se pudo evidenciar con las muestras de Cartagena y Falan. Esto esta
soportado y en concordancia con estudios anteriores realizados en Santa Marta y
en las costas de Brasil, donde se obtuvieron resultados altamente promisorios.
El análisis físico de las mieles mostró que éstas viran de color blanco a marrón,
dependiendo del lugar en donde se colectaron, siendo las muestras de climas
cálidos las más oscuras en tonalidad, propiedad que es directamente proporcional
al alto contenido fenólico y por ende a los mejores resultados obtenidos en términos
de capacidad antioxidante.
El tratamiento térmico que generalmente es realizado para comercializar la miel, en
éste estudio no arrojó diferencias significativas para el contenido de polifenoles
totales, flavonoides y la capacidad antioxidante entre las muestras de mieles
colectadas en diferentes regiones de Colombia, y sus respectivas muestras
sometidas a éste tratamiento.
A la presente investigación le queda completar la identificación mediante el análisis
de HPLC-MS-DAD, para así precisar sobre los compuestos fenólicos presentes, sus
estructuras e identificar claramente cuáles son los que aportan mejores propiedades
a las muestras de mieles.
También, se considera pertinente conocer la especie de abeja que fabrica la miel
como el origen vegetal del néctar, es decir un estudio melisopalinológico, de tal
forma que se puedan realizar mayor cantidad de variables a comparar y los
82
resultados se puedan utilizar como marcadores de fuentes florales para la
producción de miel.
Finalmente, para facilitar la detección de los compuestos presentes en las muestras
es necesaria la medición de patrones de referencias con el mismo sistema y
gradiente trabajado y/o la implementación de técnicas como HPLC-MS que permita
una alta selectividad, sensibilidad y universalidad en el análisis de diversos
componentes polifenólicos en matrices complejas, como es el caso de la miel, dado
que el tipo de componentes fenólicos y su concentración pueden variar en gran
medida.
83
ANEXOS
Capítulo 2:
Tabla de anexos 2-1.Ubicación y fecha de colecta de las muestras de mieles
84
Tabla de anexos 2-2.Datos totales de CFT, CF, FRAP, ABTS y DPPH
