1

1. INTRODUCCIÓN

1.1 Epidemiología Desde que fue descubierta en Brasil (1909) por Carlos Chagas, la enfermedad que lleva el

nombre de su descubridor, se ha demostrado su presencia en casi toda Latinoamérica, por

lo cual también es conocida como tripanosomiasis americana.

Las zonas endémicas más importantes son Brasil, Argentina y Colombia. Según el informe

de la OMS (2002), entre 16-18 millones de personas se encuentran afectadas por este

padecimiento y más de 100 millones están en riesgo de contraer la infección.

La enfermedad de Chagas ha sido catalogada como una de las enfermedades causadas

por parásitos más serias de Latinoamérica, teniendo un impacto socio-económico

considerablemente mayor que el causado en conjunto por otro tipo de parásitos (OMS,

1991). La fase crónica de la enfermedad puede durar años, pues los parásitos invaden los

órganos internos y provocan lesiones irreversibles del corazón y los intestinos. La

enfermedad es muy difícil de tratar con los medicamentos existentes. En algunas partes de

América Latina es la principal causa de defunción cardiaca en los adultos jóvenes. En

Santa Cruz (Bolivia) se han reportado tasas de seroprevalencia del 50% de la sangre en

los bancos (OMS, 1999).

En México existen también regiones endémicas como son los estados de: Morelos,

Oaxaca, Nayarit, Yucatán y Chiapas, en este último estado se han presentado reportes de

comunidades con hasta el 30% de la población infectada (Guzmán, 2001).

En términos globales, la literatura reporta casos de infección en todos los Estados de la

República. En distintas encuestas epidemiológicas que se han realizado hasta el 2004 a lo

largo del territorio nacional, de una muestra total de 288,634 personas, se han encontrado

16,979 seropositivos, lo que representa una tasa de prevalencia de 5.8%, (Figura1, Cruz y

Pickering, 2005).

Figura 1. Casos de reportados de la enfermedad de Chagas en la Republica Mexicana hasta el 2004 (Cruz y Pickering, 2005).

Estudio comparativo del efecto tripanomicida de los ésteres etílico y bencílico del ácido N-propil oxámico.

2

1.2 Enfermedad de Chagas o tripanosomiasis americana La enfermedad de Chagas es una enzootia cuyo agente etiológico es Trypanosoma

(Schizotrypanum) cruzi, un protozoario hematoflagelado (familia Trypanosomatidae, orden

Kinetoplastida); los organismos que entran dentro de esta clasificación son uniflagelados y

presentan un pequeño cinetoplasto que corresponde a una red fibrilar de DNA contenido

dentro de un único mitocondrion (Tyler y Engman, 2001). El análisis de isoenzimas, la

actividad del promotor del RNA ribosomal y secuencia de genes mini-exon han

proporcionado evidencias de que T. cruzi no pertenece a una sola especie, sino que

corresponde a dos subgrupos genéticos altamente divergentes, designados el linaje I y II

(Briones et al., 1999). El linaje I se encuentra predominantemente relacionado al ciclo de

vida doméstico, mientras que el linaje II esta relacionado al ciclo de vida salvaje. El ciclo de

vida del parásito, involucra el paso de un insecto de las familias Reduvidae y Hemiptera

(conocidas comúnmente como chiches hociconas), como Triatoma infestans, Rhodinus

prolixus, Pastronylus megistus (Zeledón, 1997), y un vertebrado que generalmente es un

mamífero, presentando diferentes estadios en ambos huéspedes:

El tripomastigote (la forma circulante flagelada que penetra a las células del huésped) es

ingerido por el insecto vector. Éste se diferencia en su forma proliferativa de epimastigote

al llegar al intestino y más tarde se transforma a tripomastigote metacíclico (Hoare y

Wallace, 1966). Esta última es la forma infectiva transmitida al vertebrado con la

consecuente diferenciación a amastigote, el cual es intracelular y de forma esférica que

mediante varios ciclos reproductivos se convierte de nuevo en tripomastigote; la forma

responsable de la diseminación de la infección (CDC, 2004).

1.2.1 Transmisión La transmisión de la enfermedad ocurre en la mayoría de los casos mediante el vector (80-

90%), en menor proporción por transfusión sanguínea (5-20%); en México entre 1994 y

1996 se detectó una prevalencia de infección chagásica en los centros estatales de

transfusión de México igual a 1.5% (Guzmán et al., 1998) y por ruta congénita (0.5-8%)

(Días, 2000).

Se han colectado ejemplares de 30 especies de triatominos (comprendidas en 7 géneros)

de vectores en todos los Estados de la República Mexicana. De estas especies, al menos

en 21 se ha identificado la infección por T. cruzi, la figura 2 muestra la distribución

geográfica de las especies de triatominos que se han reportado hasta 2004 a lo largo de la

Republica Mexicana (Cruz y Pickering, 2005).

3

Figura 2. Distribución geográfica de las especies de vectores transmisores de la enfermedad

de Chagas, reportados en la República Mexicana (Cruz y Pickering, 2005).

1.2.2 Manifestaciones clínicas

En humanos después de la infección y un subsiguiente período de incubación empiezan a

presentarse las manifestaciones clínicas. Se distinguen tres fases de la enfermedad bien

diferenciadas:

a) Fase aguda cuya duración es de 2-4 meses y aproximadamente sólo el 5% de los

infectados manifiestan sintomatología. La mortalidad durante esta fase de la

infección está entre un 10-20% en su mayoría de niños y ancianos

b) Fase indeterminada o infección subclínica, se distingue porque los pacientes

cursan asintomáticos, lo que hace difícil el diagnóstico durante esta fase. Se

presenta en un 50-60% de los casos y progresa durante periodos largos, e incluso

el paciente puede permanecer en esta fase durante toda su vida (Cruz y Pickering,

2005).

c) Fase crónica afecta sobre todo la calidad de vida del paciente debido al deterioro

en el funcionamiento de los tejidos afectados por la infección como son: corazón,

intestino y sistema nervioso central; se presenta en un periodo de 10-20 años

después de la infección. Aproximadamente 30-40% de los casos presentan esta

fase, de los cuales un 60-70% mueren repentinamente (Brain, 1992; Becerril,

1999).

4

Después de la inoculación del parásito son frecuentes el signo de Romaña (inflamación de

los párpados de un ojo) y el chagoma de inoculación (edema o roncha en la piel). El

parásito invade al huésped y destruye las células de tejido muscular cardiáco, fibra

muscular lisa y células del sistema fagocitario mononuclear (macrófagos). El periodo inicial

de infección está caracterizado por parasitemia intensa; los signos y síntomas son

transitorios debido a la respuesta inmune del huésped y por un cuadro febril (Tay et al.,

1993). En la fase aguda, los síntomas pueden ser moderados o ausentes, se observan

más en los niños que en los adultos; dos o tres semanas después se presenta linfadenitis y

edema generalizado, dolor muscular, vómito y diarrea, bronquitis y miocarditis de

intensidad variable: La fiebre es alta (intermitente, remitente o continua), puede haber

hepato-esplenomegalia, mialgias y rash eritematoso (Cruz y Pickering, 2005).

Los exámenes de laboratorio muestran anemia, linfocitosis, monocitosis e incremento de

los niveles de anticuerpos IgM. La fase aguda de la Enfermedad de Chagas termina en

pocas semanas con la recuperación del paciente, o bien comienza con el estado crónico

de la infección e inclusive la muerte. La fase indeterminada se caracteriza por positividad

serológica, en individuos asintomáticos con electrocardiograma (ECG) y radiología normal

para corazón, esófago y colon, aunque pueden presentarse periodos variables de

remisión, exacerbación marcada por la fiebre y la aparición de tripomastigotes en la

sangre. La forma clínica en la fase crónica se caracteriza por cardiopatía, formación de

“megas”: megaesófago (esofagopatía) y megacolon (colopatía), se presentan alteraciones

del sistema nervioso central y bronquioectasias (dilatación crónica de los bronquios). La

glomerulonefritis por T. cruzi, es el resultado de depósitos de complejos inmunes en las

membranas basales de los túbulos renales (Cruz y Pickering, 2005).

No se sabe que T. cruzi produzca toxinas o factores citotóxicos por lo que la mayoría de

las consecuencias de la infección se deben a la reacción inmunitaria del huésped. (Stein et

al., 1992)

1.2.3 Mecanismos de evasión del sistema inmunológico empleados por Trypanosoma cruzi.

El sistema inmunológico del huésped, juega un papel muy importante en la protección

contra enfermedades parasitarias. Sin embargo, para T. cruzi se han reportado

mecanismos generales que les confieren a estos parásitos, la capacidad de evadir los

efectos letales del sistema inmunológico del huésped (Hall y Joiner, 1991).

1. Los tripomastigotes de T. cruzi producen moléculas que regulan la fijación del

complemento. Estos parásitos producen una proteína (Complement regulatory

protein; CRP) que mimetiza el efecto de una familia de proteínas CRP que emplea

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el huésped para prevenir la lisis de sus propias células por la fijación del

complemento (Hall y Joiner, 1991). T. cruzi ha desarrollado este mecanismo que

les confiere la capacidad de evitar la lisis (muerte) mediada por fijación del

complemento (Fuhram y Joiner, 1989). Lo anterior se ha demostrado plenamente

ya que la transfección de epimastigotes (sensibles a la lisis por fijación del

complemento) utilizando un plásmido conteniendo el gen específico para CRP

presente en tripomastigotes, les confiere resistencia a la lisis por fijación del

complemento (Norris, 1998). Esto demuestra que CRP es uno de los factores

responsables de la virulencia de T. cruzi.

2. Otro factor que contribuye a la disminución de la respuesta inmune por los

tripomastigotes es la liberación de proteínas, especialmente, una trans-sialidasa

(TS) la cual tiene la capacidad de matar las células del sistema inmunológico,

activando o acelerando su mecanismo de muerte celular programada o apoptosis.

(Leguizamon et al., 1999).

3. La infección de ratones con T. cruzi conduce a una infección aguda, caracterizada

por una severa depresión del sistema inmunológico, (Ouaissi y Ouaissi, 2005),

debido a que estos parásitos liberan al medio moléculas solubles que actúan como

inmunosupresores que les permiten sobrevivir y proliferar (Ouaissi y Ouaissi, 2005).

Afortunadamente esta depresión del sistema inmunológico decrece notablemente

cuando el huésped pasa a la fase crónica, ya que esta depresión inmunológica

pone en riesgo al paciente de otras infecciones oportunistas.

Es muy probable que esta inmunosupresión temporal ayude al parásito para entrar

a las células y alcanzar los compartimentos celulares, lo cual permite el

establecimiento de la fase crónica, tanto en animales como en humanos (Hall y

Joiner, 1991). En el caso de T. cruzi, esta fase se caracteriza por la diferenciación

de los tripomastigotes en amastigotes, la cual es la fase replicativa en el huésped

vertebrado.

1.2.4 Diagnóstico

El diagnóstico en: a) la fase aguda se establece por la alta parasitemia, incrementos de

anticuerpos, anti T. cruzi tipo IgM detectados por inmunofluorescencia, detección del

parásito en sangre en un frotis de gota gruesa, búsqueda de amastigotes en ganglios y

músculo estriado, xenodiagnóstico, entre otros; b) el diagnóstico en la fase indeterminada

se establece solamente por serología positiva, de cuando menos dos técnicas:

hemaglutinación indirecta, ELISA, Western blot, inmunofluorescencia y PCR; y c) la fase

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crónica se diagnostica, mediante las técnicas mencionadas aunadas a estudios

electrocardiográficos, radiológicos y ecografía para demostrar cardiopatía, colopatía y

esofagopatía (Cruz y Pickering, 2005).

1.2.5 Quimioterapia

Se han probado numerosos fármacos para el tratamiento de la enfermedad de Chagas,

pero hasta ahora ninguno ha resultado absolutamente eficaz. Estos fármacos se pueden

clasificar en los siguientes grupos:

a) fármacos con utilidad clínica reconocida: Nifurtimox y Benznidazol; b) fármacos

efectivos en modelos experimentales in vivo, sin aplicación clínica generalizada:

Ketoconazol, itraconazol, alopurinol; c) fármacos efectivos en modelos experimentales

con actividad clínica previsible: inhibidores de las vías bioquímicas del T. cruzi d)

tripanomicidas in vitro: cristal violeta (Stoppani, 1999).

1.2.5.1 Nifurtimox y Benznidazol

El Nifurtimox ó 5–nifurtan (3-metil-4-(5’-nitrofurfuril idenamino)tetrahidro-4H-1,4-tiazida-

1,1dióxido y el Benznidazol (N-bencil-2-nitroimidazol acetamida), son comercializados con

los nombres de Lampit y Radanil, respectivamente.

El mecanismo de acción del Nifurtimox implica la generación del radical nitro-anión

mediante la acción de nitro-reductasas que en presencia de oxígeno promueven la

formación de intermediarios reactivos (como H2O2 y radicales libres) para los cuales el

sistema de detoxificación de T. cruzi es ineficiente (DoCampo y Moreno, 1986). Por otro

lado, el efecto del Benznidazol está más bien relacionado con la unión covalente o algunas

otras interacciones de los intermediarios de la nitroreducción (que no se encuentran en

concentraciones lo suficientemente altas como para matar al parásito) con componentes

del parásito como DNA, lípidos y proteínas (Diaz de Toranzo et al., 1988). Las estructuras

químicas del Benznidazol y del Nifurtimox se muestran en la figura 3.

A B

N

N

O2NO

NH

OO2NN O

O

SN

CH3 Figura 3. Estructuras química del Benznidazol (A) y Nifurtimox (B).

Los resultados obtenidos con ambos medicamentos varían de acuerdo a la fase de la

enfermedad, el periodo de tratamiento, la dosis, edad y el origen geográfico de los

7

pacientes. Sin embargo, se han mostrado resultados favorables en la fase aguda de la

infección o en la fase crónica temprana (OMS, 2002). Algunos de los efectos colaterales

del tratamiento con Nifurtimox son la anorexia, la pérdida de peso, náusea, vómito, cólicos

intestinales y diarrea. La comercialización de Nifurtimox fue descontinuada en Brasil y

Argentina desde los años 90´s por presentar efectos tóxicos sobre todo durante el

tratamiento crónico de la enfermedad (DoCampo, 1990).

Las reacciones adversas del Benznidazol pueden ser clasificadas en tres grupos: i)

hipersensibilidad, dermatitis y erupciones cutáneas, dolor articular y muscular; ii) púrpura

trombocitopénica y granulomatosis; iii) polineuropatía (Coura y de Castro, 2002).Existen

también reportes de actividad mutagénica y carcinogénica debido al Benznidazol, sobre

todo en tratamientos crónicos (Teixeira et al., 1994).

1.2.5.2 Fármacos sin utilidad clínica reconocida

Otros compuestos que han sido probados para el tratamiento de este padecimiento son el

alopurinol, el cual bloquea la síntesis de novo de nucleótidos de purina (Marr, 1991) debido

a que T. cruzi es incapaz se sintetizar estos nucleótidos, sino que debe utilizar purinas

preformadas en el organismo del huésped.

Los azoles que se utilizan como antimicóticos, los cuales modifican el contenido de

esteroles, en particular de ergosterol (esterol cuya presencia en T. cruzi es sobresaliente y

que es indispensable para la proliferación y viabilidad de este parásito), como el

ketoconazol, itraconazol y fuconazol (Brener et al., 1993) y antineoplásicos como el Taxol

(Dantas, 2000). Sin embargo aún no se han encontrado compuestos lo suficientemente

efectivos y selectivos contra el parásito. Además, el tratamiento de este padecimiento es

prolongado por lo que muchas cepas de T. cruzi se han hecho resistentes a los fármacos

(Andrade et al., 1985).

1.2.5.3 Blancos bioquímicos prometedores para la quimioterapia de la

enfermedad de Chagas

Como consecuencia en el incremento en el conocimiento de la bioquímica y fisiología del

agente etiológico de la enfermedad de Chagas, se han buscado blancos bioquímicos que

permitan el desarrollo de nuevos agentes quimioterapéuticos para el tratamiento de esta

enfermedad, dentro de los que se encuentran:

a) inhibidores de la tripanotiona reductasa, la cual representa el sistema único

presente en el orden Kinetoplastida para el balance redox de los grupos tiol dentro

de la célula (Fairlamb, 1999).

b) Inhibidores de cistein-proteasas. La cruzipaina es una catepsina (cistein-proteasa

de tipo L) responsable de la mayor actividad proteolítica en todos los estadios del

ciclo de vida de T. cruzi (Stoppani, 1999).

8

c) Alquil-lisofosfolipidos (ALP): Estos compuestos bloquean selectivamente la

biosíntesis de fosfatidilcolina en estos parásitos, sin embargo, el mecanismo de

acción por el cual ejercen su actividad tripanomicida no ha sido completamente

elucidado (Lira et al., 2001).

d) Inhibidores del metabolismo del pirofosfato. Tanto el pirofosfato como los

polifosfatos son compuestos de alta energía y en T. cruzi son mas abundantes

incluso que el ATP, por lo que se sugiere que estos compuestos pueden jugar un

papel primordial en la sobrevivencia el parásito (Moreno et al., 2000).

e) Inhibidores de la α-hidroxiácido deshidrogenasa (α-HADH) isoenzima II. Los

inhibidores de esta enzima juegan un papel fundamental en el abatimiento del

metabolismo energético de T. cruzi (Elizondo, 2003), el cual se abordará a detalle

más adelante.

1.3 Trypanosoma cruzi.

1.3.1 Ciclo de vida.

Trypanosoma cruzi cambia de morfología durante su ciclo de vida y en la transmisión del

insecto al humano. Presenta tres formas generales, que pueden se identificables por

microscopia óptica en preparaciones teñidas con Giemsa: tripomastigote (metacíclico y

sanguíneo), amastigote y epimastigote (Figura 4). Debido a su cambio de forma, éste

parásito puede adecuarse a medios hostiles y evadir la respuesta inmunológica.

Los tripomastigotes metacíclicos son la forma infectiva que pasan del intestino del insecto

a través de la orina o materia fecal y atraviesan la piel o mucosas por medio de abrasiones

o soluciones de continuidad (Brener, 1973).

Figura 4. Ciclo de vida de T. cruzi incluyendo sus huéspedes y las fases en que es factible hacer un diagnóstico (CDC, 2004).

9

La infección comienza con la penetración de los tripomastigotes metacíclicos en los

macrófagos que se encuentran en los tejidos subcutáneos y la dermis. El parásito

sobrevive a la fagocitosis de los macrófagos ya que escapa del fagosoma antes de la

fusión con el lisosoma (Lanzer et al., 1997). Dentro de las células, los tripomastigotes

pierden su flagelo y se redondean formando los amastigotes, también conocidos como

esferomastigotes o micromastigotes (Ley et al., 1990). Los amastigotes son el estadio

intracelular, esférico de 1.50 a 5 μm de diámetro donde el cinetoplasto se observa como un

cuerpo oscuro cercano al núcleo. Estos carecen de flagelo y se replican mediante fisión

binaria. Cuando los amastigotes casi llenan la célula toman una forma intermedia,

conocida como tripomastigote procíclico, en el cual el cinetoplasto se localiza en la parte

anterior al parásito y el flagelo se encuentra libre sin membrana ondulante. Los cuales al

lisarse la célula son liberados a los espacios intersticiales y al torrente sanguíneo (Tay et

al., 1993). Los tripomastigotes sanguíneos presentan el cinetoplasto posterior al núcleo

que usualmente ésta localizado en la zona más posterior del parásito, de aquí sale el

flagelo y se dobla hacia adelante a lo largo del cuerpo del parásito, formando una

membrana ondulante y emerge en forma libre en su extremo anterior. Su longitud oscila

entre 5-25 μm y 2 μm de ancho (Tay et al., 1993). Esta forma flagelada promueve la

infección de una célula a otra del huésped hasta colonizar músculo o el tejido neural donde

se enquistan y forman los amastigotes, repitiéndose indefinidamente el ciclo de infección

(Tay, 1993) como se representa en la figura 4. La forma de tripomastigote también puede

obtenerse de la fase estacionaria de crecimiento en cultivos axénicos y en la fase líquida

de cultivos celulares (Ley et al., 1990).

Los tripomastigotes circulantes son adquiridos por las chinches durante la ingestión por

sangre contaminada. Estos tripomastigotes viajan a través del intestino del insecto donde

se convierten en epimastigotes, los cuales, a diferencia de los tripomastigotes presentan

un flagelo unido a la parte central del cuerpo del parásito, un núcleo central y un

cinetoplasto (Hoare y Wallace, 1966). Estos miden entre 1-2 μm de longitud, pero

aumentan su tamaño hasta veinte veces más, conforme viajan a través del intestino del

insecto hasta que adoptan de nuevo la forma metacíclica de tripomastigote. Este cambio

de forma en el insecto tarda entre 16 -17 días y el parásito parece no causar un daño a la

chinche (Tyler y Engman, 2001). Los epimastigotes también se encuentran al final de la

fase intracelular, cuando el amastigote se transforma en tripomastigote o viceversa (Ley et

al., 1990). Las diferentes morfologías que toma T. cruzi durante su ciclo de vida, la

localización del núcleo y el cinetoplasto se muestran en la figura 5.

10

Figura 5. Estadios morfológicos de Trypanosoma cruzi (Guzmán et al., 1998). Las letras significan; B: blefaroblasto, F: flagelo, M: mitocondrion, G: aparato de golgi, V: vacuola, Mo: membrana ondulante, I: inclusión limdica, K: cinetoplasto, C: citoplasma, R: ribosomas, N: núcleo, RE: retículo endoplásmico, Mt: microtubulos.

1.3.2 Metabolismo energético de T. cruzi.

La fuente principal para la obtención energía de los tripanosomas es la glucosa

(Opperdoes, 1985), por lo que la glicólisis juega un papel muy importante. El conjunto de

reacciones de esta ruta se muestra en la figura 6. El metabolismo anaeróbico de los

carbohidratos requiere de un balance de la coenzima NAD+ la cual actúa como agente

oxidante (en la ausencia de oxígeno), sin embargo la cantidad de NAD+ en cualquier célula

es limitado, por lo tanto el metabolismo se detendrá tan pronto como todo el NAD+ sea

reducido a NADH + H+. Sin embargo, existe un mecanismo para la reoxidación del

nucleótido de nicotinamida reducido. En la glicólisis, esta reoxidación ocurre cuando el

piruvato es reducido a lactato. El NAD+ transporta los electrones en ausencia de oxígeno

(Conn y Stumpf, 1976).

En consecuencia, el paso determinante para que la glicólisis pueda continuar de manera

ininterrumpida es la regeneración de NAD+ el cual es utilizado como cofactor por la enzima

gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, enzima involucrada en la conversión del

gliceraldehído-3-fosfafo en bisfosfoglicerato. El reciclaje de este cofactor oxidado se logra

mediante la acción de la enzima lactato deshidrogenasa que convierte el piruvato, último

intermediario de la ruta glicolítica en lactato, utilizando el NADH como cofactor, liberando

NAD+ (ambas reacciones se encuentran señaladas en la figura 6).

EPIMASTIGOTE TRIPOMASTIGOTE AMASTIGOTE

11

Figura 6. Ruta glicolítica (Metzler, 2001).

Esto es lo que ocurre en mamíferos, pero en T. cruzi, no es la LDH la que realiza la

reoxidación del NADH sino la α-hidroxiácido deshidrogenasa isoenzima II (Coronel et al.,

1981).

1.3.3. α-hidroxiácido deshidrogenasa isoenzima II

T. cruzi posee un análogo de la lactato deshidrogenasa de humanos que puede utilizar

como sustrato a un gran número de α–cetoácidos además del piruvato, es por esta razón

que se le ha denominado como α-hidroxiacido deshidrogenasa (α-HADH). Esta enzima

presenta dos isoenzimas: la tipo I que utiliza como sustrato el piruvato y el butirato, y la tipo

II que utiliza como sustratos a una gran cantidad de α-cetoácidos. (Coronel et al., 1981)

En la figura 7 se muestra una representación de los aminoácidos involucrados en la unión

al sustrato así como el sitio de unión al cofactor NAD+ para una enzima similar a la α-

HADH de T. cruzi que utiliza α-cetoácidos como sustratos.

2 NAD+ 2 NADH +2H+

Figura 7. Sitio de unión al sustrato de la D-hidroxi-isocaproato deshidrogenasa (D-HicDH) de L. casei enzima similar a la α-HADH. (Chizuka et al., 2003).

12

La α-hidroxiácido deshidrogenasa isoenzima II, puede localizarse tanto en el citoplasma

como en la mitocondria, lo que permite que los α-cetoácidos producidos por la

transaminación de algunos aminoácidos como la isoleucina, puedan ser reducidos por el

NADH utilizando su versión citoplasmática. Los α–hidroxiácidos formados penetran en la

mitocondria y son reoxidados por la α-hidroxiácido deshidrogenasa mitocondrial

transfiriendo los electrones al NAD+ y de aquí a la cadena respiratoria. Este mecanismo

actúa como una lanzadera donde se pueden reoxidar en la mitocondria equivalentes

reductores (NADH) generados en el citoplasma como se muestra en la figura 8 (Montamat

et al., 1987).

α-HADH α-HADH

Figura 8. Esquema del metabolismo energético de Trypanosoma cruzi (Gerez de Burgos et al., 1978). Indica el sito de la inhibición de la α-hidroxiácido deshidrogensa isoenzima II de T.cruzi (α-HADH). Proponemos entonces que la inhibición de esta enzima conducirá a una inhibición en el metabolismo energético de T. cruzi Por este motivo, un inhibidor de la α-HADH bloqueará tanto la glicólisis (evitando

reoxidación del NADH) como el mecanismo de lanzadera descrito. Así que esta enzima se

ha propuesto como un blanco prometedor para el diseño de nuevos fármacos con actividad

tripanomicida. Algunos de los α-hidroxiácidos que tienen gran afinidad y las reacciones

que cataliza la α-HADH, se muestran en la figura 9.

C H 3

C H 2

C H 2

C H 2

C O

C O O H

CH3

CH2

CH2

CH2

C

COOH

OHH

CH3

CH2

C

COOH

CH CH3

O

CH3

CH2

C

COOH

OH

CH CH3

H

α-cetocaproico α-hidroxicaproico α-cetoisocaproico α-hidroxi–isocaproico

Figura 9. Reacciones catalizadas por la α-hidroxiacido deshidrogenasa de Trypanosoma cruzi isoenzima II, utilizando como sustrato el α-cetocaproico (A) y α-cetoisocaproico (B).

NADH NAD+

α-HADH α-HADH

NADH NAD+

A B

13

1.4 Antecedentes

En la búsqueda de compuestos análogos a estos sustratos que funcionen como

inhibidores de la α-hidroxiácido deshidrogenasa isoenzima II se han diseñado y sintetizado

derivados del ácido oxámico (Chena et al., 2004) como el ácido N-propil oxámico y el ácido

N-isopropil oxámico, con base en que los sustratos con mayor afinidad por esta enzima

son el ácido α-cetocaproico y el α-cetoisocaproico. Estos resultaron ser excelentes

inhibidores selectivos y competitivos de la α-hidroxiácido deshidrogenasa isoenzima II en

ensayos enzimáticos (Elizondo, 2003). Sin embargo, cuando se probaron estos oxamatos

N-sustituidos tanto in vitro sobre cultivos de T. cruzi, como in vivo, sobre la parasitemia en

animales de laboratorio, no resultaron tener actividad tripanomicida a pesar de presentar

un buen efecto inhibidor de la α-HADH isoenzima II de T. cruzi; en tanto que Nifurtimox y

Benznidazol si presentan efecto tripanomicida debido a que estas sustancias son poco

polares. Se consideró entonces que debido a la polaridad de los oxamatos N-sustituidos,

estos son incapaces de atravesar las membranas celulares e inhibir la enzima (Elizondo,

2003). Por esta razón se optó por la síntesis de los ésteres etílicos, de menor polaridad

que pudieran atravesar las membranas celulares y una vez dentro del tripanosoma fueran

hidrolizados por las carboxiesterasas intracelulares que ya se han reportado para T. cruzi

(Aldunate, 1987) y liberaran los oxamatos N-sustituidos con actividad biológica (Chena et

al., 2004). En la figura 10 se muestra la similitud estructural entre el ácido α-cetocaproico,

el ácido N-propil oxámico y ésteres derivados de este ácido.

O

O

OH

O

OHN

O

Ácido α-cetocaproico éster bencílico del NPOx

NOH

O

OH

O

OHN

O

Ácido N-propil oxámico éster etílico del NPOx

En el caso del éster bencílico del ácido N-propil oxámico (NPOx-B) el cual es el objeto de

estudio de este trabajo, el mecanismo que se propone para que ejerza el efecto

tripanomicida se esquematiza en la figura 11.

El NPOx-B al ser una sustancia altamente hidrofóbica, podrá atravesar las membranas

celulares con mayor facilidad que los ésteres etílicos y una vez dentro ser hidrolizado por

las carboxiesterasas presentes en T. cruzi, como producto de la hidrólisis se obtendrían el

Figura 10. Estructuras químicas del ácido α-cetocapróico, sustrato de la α-HADH-II de T. cruzi y sus análogos estructurales; el acido N-propil oxámico (NPOx), y sus ésteres bencílico y etílico

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N-propil oxamato y el alcohol bencílico. Este último podría potenciar la actividad

tripanomicida ya que presenta actividad microbicida (Karabit et al., 1986).

Figura 11. Mecanismo propuesto para el posible efecto inhibitorio que ejercerá el éster bencílico del ácido N-propil oxámico sobre la α-HADH isoenzima II de T. cruzi. Se espera que el efecto tripanomicida se vea incrementado por el efecto microbicida del alcohol bencílico.

2. JUSTIFICACIÓN La ausencia de una vacuna y de un tratamiento efectivo contra la enfermedad de Chagas

aunado a la falta de interés de los laboratorios farmacéuticos para producir fármacos

contra esta enfermedad, hace de gran interés el tratar de desarrollar nuevos agentes

tripanomicidas para el tratamiento de la enfermedad de Chagas.

La finalidad de este trabajo es sintetizar el éster bencílico el ácido N-propil oxámico como

profármaco para probar su efecto inhibidor sobre la α-hidroxiácido deshidrogenasa

isoenzima II de Trypanosoma cruzi. Se espera que este compuesto al ser hidrolizado por

las carboxiesterasas intracelulares liberará el ácido N-propil oxámico y alcohol bencílico.

Con este compuesto se pretende inhibir el metabolismo energético de Trypanosoma cruzi

ya que este parásito requiere una gran cantidad de energía para el funcionamiento de su

sistema motriz; movimiento de la membrana y flagelo. Por otro lado la baja polaridad del

compuesto y la presencia del alcohol bencílico (Prindle, 1983), el cual posee efecto

microbicida, probablemente incrementen el efecto tripanomicida del ácido N-propil

oxámico.

NPOx- B (Profármaco, no polar)

MEDIO EXTRACELULAR

MEDIO INTRACELULAR

NO

O

OH

-

OH NPOx -B N-propil alcohol oxamato bencílico

(Tripanomicida ) (Microbicida)

Esterasas

O

OHN

O

O

OHN

O

15

3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo general

Sintetizar y estudiar el efecto tripanomicida ex vivo e in vitro del éster bencílico del ácido N-

propil oxámico.

3.2 Objetivos particulares

Sintetizar y caracterizar fisicoquímicamente el éster bencílico del ácido N-propil

oxámico (NPOx-B).

Determinar el efecto ex vivo en tripomastigotes sanguíneos e in vitro en cultivos de

epimastigotes, sobre la motilidad y sobrevivencia de las cepas INC-5 y NINOA de T.

cruzi.

Comparar el efecto tripanomicida del éster bencílico del ácido N-propil oxámico con el

éster etílico del ácido N-propil oxámico y los fármacos utilizados para el tratamiento de

este padecimiento, Nifurtimox y Benznidazol.

4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 Compuestos químicos El éster etílico del ácido N-propil oxámico fue sintetizado en el Laboratorio de Enzimología

del Depto. de Bioquímica de ENCB-IPN (Chena et al., 2004). Lampit ® (Nifurtimox)

BAYER. Lote 477580. Comprimidos de 120 mg. Rochagan ® (Benznidazol) ROCHE. Lote

110878. Comprimidos 100 mg.

4.2 Material biológico

a) T. cruzi cepa INC-5. Fue aislada en el año de 1997 a partir de una paciente de 58 años

de edad, con cuadro crónico de la enfermedad. La paciente era procedente de la localidad

Congregación del estado de Guanajuato, México.

b) T. cruzi cepa NINOA. Fue aislada en el año de 1986 a partir de una paciente de 8 años

de edad, con cuadro agudo de la enfermedad. La paciente era procedente del estado de

Oaxaca. Estas cepas han sido conservadas en el departamento de Parasitología de la

ENCB-IPN.

Los epimastigotes de la cepa INC-5 y NINOA fueron cultivados en medio BHI

suplementado con solución Locke (NaCl 0.7 M, KCl 0.05 M, Na2HPO4 0.4 M, glucosa 0.1

M) al 10%, hemina 50 mg/L, suero bovino fetal 1% y antibióticos (penicilina 100 UI/ml y

estreptomicina 100 μg/ml). Se utilizaron cultivos en la fase logarítmica de crecimiento para

los estudios del efecto de los compuestos sobre la viabilidad de epimastigotes.

16

Para el estudio del efecto de los compuestos sobre tripomastigotes sanguíneos se

inocularon ratones (hembras) de entre 18-20 g de peso de la cepa CD-1 y se determinó el

máximo de la parasitemia en sangre mediante el método de Filardi y Brener (el cual

considera como viables sólo a los parásitos móviles) (Filardi, 1984) combinado con el

reportado por Pizzi el cual se describe con detalle más adelante (Pizzi, 1957), para ambas

cepas las curvas obtenidas se muestran en las gráficas 1 y 2. Posteriormente, se extrajo la

mayor cantidad de sangre posible de los ratones por punción cardiaca utilizando como

anticoagulante EDTA 1%.

4.3 Método de Pizzi 1. Tomar 5 μl de sangre.

2. Depositar la sangre en un portaobjetos limpio, cuidando que no se extienda.

3. Colocar un cubreobjetos limpio y homogeneizar la muestra.

4. Contar los parásitos en 25 campos al microscopio con un aumento de 40X.

5. Determinar el número de tripomastigotes/ml.

4.4 Síntesis del éster bencílico del ácido N-propil oxámico

La formación de amidas secundarias se produce por la reacción entre un éster y una

amina primaria donde los grupos carbonilo del éster son susceptibles al ataque nucleofílico

de aminas para formar las amidas correspondientes. Por esta razón se plantea la siguiente

reacción para la obtención de éster bencílico del ácido N-propil oxámico:

O

C O

C O

O

C H2

C H2

CH3

CH2

CH2

NH2

CH3

CH2

CH2

NH

C

C

O

CH2

O

O

CH2-OH

Dibenciloxalato Propilamina éster bencílico del alcohol bencílico

ácido N-propil oxámico

17

Utilizando como reactivo el dibenciloxalato en presencia de propilamina se formó el éster

bencílico del ácido N-propil oxámico (figura 12), el cual posteriormente se sujetó a una

hidrólisis para obtener el ácido N-propil oxámico como se describe a continuación:

Se pesaron 5.9 g de propilamina correspondientes a 0.1 mol, se disolvieron en 50 ml de

éter etílico. A la solución anterior se le añadió, gota a gota y con agitación constante sobre

una solución de 29 g (0.1 mol más un exceso del 10%) de dibenciloxalato disueltos en 100

ml de éter etílico. Transcurridas dos horas se detuvo la agitación y la reacción se mantuvo

a temperatura ambiente durante 24 h. Del matraz de reacción se separó un producto

cristalino el cual fue sometido a filtración. El sobrenadante fue destilado a bajas

temperaturas y el residuo se fraccionó al vacío. Se pesó el producto obtenido y se

determinó el rendimiento de la reacción y el punto de fusión.

Posteriormente se pesó la cantidad correspondiente a 0.05 mol de N-propil oxamato de

bencilo y se agitó con 50ml de hidróxido de sodio (1N) durante 30 min. Se extrajo con éter,

la fase acuosa se separó y se acidificó con ácido clorhídrico (2N). Se extrajo con éter y se

recristalizó con cloroformo. Se pesó el producto obtenido y se determinó el rendimiento de

la reacción y el punto de fusión.

Figura 12. Esquema de la síntesis del éster bencílico del ácido N-propil oxámico (N-propiloxamato de bencilo).

CO

CO

NH CH2 CH2 CH3

CH2O

N-propiloxamato de bencilo

NH2

CH2CH2CH3

Propilamina

Dibenciloxalato

CO

CO

O

O

CH2

CH2

18

4.5 Caracterización fisicoquímica del éster bencílico del ácido N-propil oxámico. Al producto obtenido se le realizaron las determinaciones: punto de fusión, espectroscopía

en el infrarrojo, resonancia magnética nuclear de hidrógeno y resonancia magnética de

carbono, para confirmar su estructura química.

Para corroborar la estructura química del compuesto sintetizado en los espectros

obtenidos por resonancia magnética nuclear, fueron comparados con los obtenidos con el

programa ACD*predictor (Advanced Chemistry Development), este programa se encarga

de realizar el posible espectro o un espectro hipotético de RMN (de carbono o hidrógeno)

de una determinada estructura (Brian, 2005). Y al existir concordancia entre él y el

espectro obtenido podemos confirmar la estructura química del compuesto sintetizado.

4.6 Estudio del NPOx-B, NPO-Et, Nf y Bz sobre la viabilidad de tripomastigotes sanguíneos

Se parasitaron ratones CD-1 de entre 18-20 g de peso con 0.2 ml de sangre que contenían

1X106 tripomastigotes/ml. Se obtuvo la sangre de ratones infectados con tripomastigotes

en el máximo de la parasitemia. La sangre fue ajustada con solución salina isotónica (NaCl

0.85%) para ajustar a una concentración de 2X106 tripomastigotes/ml. Posteriormente, en

placas de 96 pozos se colocaron 195 μl de sangre y 5 μl del tratamiento, en cada uno de

los pozos. Los tratamientos consistían en un control negativo que contenía dimetil sulfóxido

(DMSO 2.5%) y los compuestos, NPOX-B, NPOX-Et, Benznidazol y Nifurtimox disueltos en

DMSO a las siguientes concentraciones; 0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM, 2 mM, 4 mM y 8 mM.

Por último, se utilizó como control positivo de la lisis de los tripomastigotes, cristal violeta

(1mg/mL) y como testigo pozos que contenían 200 μl de sangre sin recibir algún

tratamiento. Cada concentración se probó por duplicado.

Una vez adicionados los compuestos tras ser homogenizado con la sangre, las placas se

incubaron a 4°C durante 24 h (Oliveira et al., 2003; Paveto et al., 2004). Transcurrido el

tiempo de incubación, se tomó una alícuota de 5 μl de cada pozo, se colocó entre un porta

y un cubreobjetos y se contaron los tripomastigotes viables utilizando el método de Brener

complementado con el de Pizzi (Brener ,1973; Pizzi, 1957).

Se realizó el calculó del número de tripomastigotes viables por ml de sangre y obtuvieron

los porcentajes de sobrevivencia tomando como 100% al control negativo.

Para comparar los resultados de viabilidad obtenidos con los diferentes compuestos a las

concentraciones probadas contra el control, se analizaron estadísticamente mediante

ANOVA y la prueba post-ANOVA para comparaciones múltiples de Dunnett, utilizando un

nivel de significancia (α) de 0.05.

19

4.7 Evaluación del daño citológico de los tripomastigotes sanguíneos después de la evaluación de la viabilidad.

Posterior a la evaluación ex vivo de la viabilidad de los tripomastigotes sanguíneos debida

a la presencia de los diferentes compuestos, se procedió a realizar frotis por triplicado de la

sangre tratada y homogenizada, dichos frotis se tiñeron con Giemsa (1:10 de la solución

madre) durante 60 min, posteriormente se eliminó el exceso de colorante, se secaron y se

observaron al microscopio en un aumento de 100X en la búsqueda de alteraciones

morfológicas.

4.8 Estudio in vitro del NPOx-B, NPO-Et, Nf y Bz sobre la viabilidad de epimastigotes en cultivo.

Para monitorear la viabilidad in vitro de epimastigotes se cosecharon por centrifugación a

3000g durante 5 min. El paquete celular se resuspendió en medio BHI suplementado para

obtener una suspensión de 2x106 epimastigotes/ml. Los epimastigotes fueron expuestos

por separado a los siguientes compuestos: NPOx-B, NPOx-Et, Nifurtimox y Benznidazol en

un rango de concentraciones de 0.25 - 8 mM utilizando un control negativo de DMSO

2.5% durante 60 min a temperatura ambiente La viabilidad se monitoreó por medio de una

tinción con diacetato de fluoresceína (FDA) y yoduro de propidio (PI). La solución patrón de

FDA se preparó al disolver 5 mg/mL de acetona. El FDA es un éster no polar que pasa a

través de las membranas celulares y es hidrolizado por esterasas intracelulares

produciendo fluorescencia. La fluoresceína es un compuesto polar que se acumula dentro

de las células, al pasar muy lentamente a través de la membrana de las células vivas y

exhibe una fluorescencia verde cuando es excitada por luz azul. Por otro lado, el PI se

intercala en los ácidos nucleicos para formar un complejo fluorescente rojo brillante (Jones

y Senft, 1985). La membrana no es permeable a este compuesto, por lo que el PI solo

puede atravesarla cuando ésta ha perdido su permeabilidad, es decir cuando la célula ya

no es viable. Así, los epimastigotes viables se observaron verdes y los muertos o no

viables, rojos.

La solución de trabajo de FDA se preparó en fresco al adicionar 0.04 mL de la solución

patrón en medio de cultivo BHI suplementado. Un miligramo de PI se disolvió en 50 mL de

BHI suplementado. Para teñir los epimastigotes, se adicionaron 0.1 mL de la solución de

trabajo de FDA (2 μg) y 0.03 mL (0.6 μg) de PI directamente a la suspensión de

epimastigotes. Las células fueron teñidas por 3 min a temperatura ambiente.

Posteriormente se tomó una alicuta de 5 μl y se colocó en un portaobjetos y cubreobjetos

limpios, para ser observado en el microscopio equipado con epi-fluorescencia, con lámpara

de halógeno de 100 W y filtro de excitación de 450-490 nm (azul). Este filtro permitió que

los epimastigotes con fluorescencia verde y roja pudieran ser vistos simultáneamente. Se

20

contó el número de epimastigotes viables y no viables en 25 campos, con una aumento de

40X para determinar el número de epimastigotes viables por ml y obtener el porcentaje de

viabilidad. Tomando como 100% el control de DMSO. Los resultados se analizaron

estadísticamente mediante ANOVA y la prueba post-ANOVA para comparaciones múltiples

de Dunnett, utilizando un nivel de significancia (α) de 0.05.

5. RESULTADOS

5.1 Síntesis y caracterización fisicoquímica del éster bencílico del ácido N-propil oxámico

De la síntesis del éster bencílico del ácido N-propil oxámico se obtuvo un producto puro

blanco cristalino con un punto de fusión de 50-55°C. La reacción presentó un rendimiento

del 85%. La hidrólisis posterior de este producto, produjo el ácido N-propil oxámico con un

rendimiento de 82% y un punto de fusión de 105-106 ºC.

El espectro de IR del éster bencílico del ácido N-propil oxámico muestra los grupos

funcionales del compuesto que corresponden a los picos más significativos. Los espectros

RNM de hidrógeno y de RMN de carbono fueron interpretados y para corroborar la

presencia del compuesto deseado se compararon con los espectros hipotéticos obtenidos

utilizando el software ACD/predictor. En estos últimos, podemos observar que a los

hidrógenos o carbonos presentes en la molécula se les asigna un número, los cuales nos

ayudan a visualizar sus picos representativos en el espectro.

Las comparaciones de ambos espectros pueden observarse en la tabla 1 y 2 las cuales

corresponden tanto al los espectros experimentales como hipotéticos obtenidos para

RMNH y RMNC, respectivamente. Como podemos observar en estas tablas, los espectros

obtenidos experimentalmente concuerdan en su totalidad con los hipotéticos, es decir,

presentan los picos representativos del compuesto en las mismas zonas del espectro, de

lo cual podemos concluir que el compuesto fue correctamente sintetizado y con alto grado

de pureza ya que no hay señales que nos indiquen la presencia de algún contaminante.

5.2 Determinación del máximo de parasitemia de las cepas INC-5 y NINOA de T. cruzi

La determinación del máximo de parasitemia se realizó con la finalidad de obtener el día

donde se presenta la concentración más alta de tripomastigotes sanguíneos para realizar

los ensayos de viabilidad y para la conservación de la cepa. Se monitoreó la concentración

de tripomastigotes sanguíneos tomando una alícuota de 5 μl de sangre a partir de la vena

caudal de la cola del ratón parasitado, cada 3 días durante 75 días. Se obtuvieron

diferentes comportamientos en la parasitemia para cada cepa. El máximo de la parasitemia

21

para la cepa NINOA se detectó a los 23 días (Gráfica 1) y para la cepa INC-5, el máximo

se presentó en el día 26 (Gráfica 2), es notorio que la cepa NINOA la cual proviene de un

caso en fase aguda los niveles de parasitema son aproximadamente del doble que la cepa

INC-5 que proviene de un aislado en fase crónica. La tabla 3 resume las características

que presenta cada cepa en su curva de parasitemia.

5.3 Estudio del NPOx-B, NPOx-Et, Nf y Bz sobre la viabilidad de tripomastigotes sanguíneos

El efecto del NPOx-B sobre la viabilidad de tripomastigotes sanguíneos para la cepa

NINOA y INC-5 se muestra en la gráfica 3 y 4, respectivamente, así como su comparación

con el efecto producido por el NPOx-Et y los fármacos de referencia Benznidazol y

Nifurtimox. Como podemos observar, la cepa que resultó más sensible a todos los

compuestos fue la cepa NINOA. El NPOx-B alcanza su mayor efecto tripanomicida a la

concentración más alta utilizada en este estudio (8 mM) produciendo la muerte de los

tripomastigotes en prácticamente un 100%. Este efecto es proporcional a la concentración

siendo de 64%, 42%,33 %, 21%, 14.3% para las concentraciones de 4m M ,2m M, 1m M,

0.5 mM, 0.25 mM respectivamente. Se observan prácticamente los mismos porcentajes de

viabilidad debido al efecto del NPOx-Et: 96%, 59%, 45%, 42%, 33% y 10% en un rango de

concentraciones de 0.25-8 mM, respectivamente. Resultados similares se obtuvieron para

la cepa INC-5, pero esta cepa resultó ser menos susceptible a los compuestos probados.

Se comparó el efecto de los compuestos a las diferentes concentraciones mediante un

análisis de varianza.

En lo que se refiere a la movilidad de los tripomastigotes, ésta se ve afectada, sobre todo

en aquellos tratados con la concentración 4 mM del NPOx-B, lo que no sucede en el caso

con el Benznidazol y Nifurtimox. Los tripomastigotes tratados con NPOx-B reducen

considerablemente la movilidad del flagelo en comparación con el control. Otro aspecto es

la morfología de los tripomastigotes, la cual se ve modificada sobre todo a la concentración

de 4 mM como se puede observar en la figura 13 junto con la aparición de vacuolas,

mientras que los tripomastigotes que fueron sometidos a los tratamientos con Nifurtimox y

Benznidazol no presentaron ningún cambio en su morfología (resultados no mostrados), se

obtuvieron resultados similares para ambas cepas y la figura 13 nos muestra fotografías

representativas de esta evaluación.

22

Tabla 1. Tabla comparativa de las señales obtenidas en el espectro de resonancia magnética nuclear de hidrógeno (RMNH) experimental y el obtenido por el programa ACD predictor, para la corroboración de la estructura química del éster bencílico del ácido N-propil oxámico. En la tabla se muestra el intervalo en el que aparecen las

señales y el grupo funcional al que pertenece cada una de estas señales. R corresponde al

fragmento restante de la estructura química del NPOx-B y R1 ≠ R2.

Rango de señales en el espectro de RMN de hidrógeno (ppm)

Espectro experimental

Espectro obtenido con el programa ACD/predictor

Protones correspondientes

7.32-7.37

7.32-7.38 H

HH

H

R

H

5.27

5.28 R

H

H

3.25-3.27

3.22-3.26 NH R2R1

H

H

1.51-1.56

1.48-1.56 CH3

H

HR

0.86-1.0

0.89-0.93 H

H

HR

23

Tabla 2. Tabla comparativa de las señales obtenidas en el espectro de resonancia magnética nuclear de carbono (RMNC) experimental y el obtenido por el programa ACD predictor, para la corroboración de la estructura química del éster bencílico del ácido N-propil oxámico. En la tabla se muestra el

intervalo en el que aparecen las señales y el grupo funcional al que pertenece cada

una de estas señales. R corresponde al fragmento restante de la estructura química

del NPOx-B y R1 ≠ R2.

Rango de señales en el espectro de RMN de carbono (ppm)

Espectro experimental

Espectro obtenido con el programa ACD/predictor

Carbonos correspondientes

156.4-160.7

157.4-159.9

R1R2

O

O

128.8-134.5

127.9-134.5 R

68.6

68.6 CH2

R

41.7

40.56 CH2

R2NH

R1

22.5 22.4

R1 CH2

R2

11.38 11.35

CH3

R

Tabla 3. Caracterización biológica de las cepas de T. cruzi empleadas en las pruebas de evaluación de los compuestos.

CARACTERISTICA NINOA INC-5

Curvas de

parasitemia en

ratón

Periodo prepatente 13 días 12 días

Pico máximo de parasitemia 23 días 26 días

Periodo patente 63 días 64 días

24

0 10 20 30 40 50 60 70 800.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Tiempo (días postinoculación)

Trip

omas

tigot

es s

angu

íneo

s/ m

l (X1

07 )(p

aras

item

ia)

Gráfica 1. Curva de parasitemia de ratones infectados con la cepa NINOA. El máximo de la parasitemia es el señalado por una flecha, el cual se encontró en el día 23. n=3

0 10 20 30 40 50 60 70 800.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

Trip

omas

tigot

es s

angu

íneo

s/m

l (X1

06 )(p

aras

item

ia)

Tiempo (días postinoculación)

Gráfica 2 Curva de parasitemia de ratones infectados con la cepa INC-5. El máximo de la parsitemia es el señalado por una flecha, el cual se encontró en el día 26. n=3.

25

a b c d0

20

40

60

80

100

(a) NPOx-B(b) NPOx-Et

(d) Bz(c) Nf

Control

****

**

**

***

a b c d a b c d a b c d a b c da b c d0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0

Concentración (mM)

Via

bilid

ad±

DS

(%)

Grafica 3. Efecto de diferentes compuestos sobre la viabilidad de tripomastigotes sanguíneos de la cepa NINOA, después de 24 h de incubación * p < 0.05, **p < 0.001, n=4.

0

20

40

60

80

100(a) NPOx-B(b) NPOx-Et

(d) Bz(c) Nf

Control

**

****

**

* **

a b c d a b c d a b c d a b c d a b c d a b c d

0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0

*

Concentración (mM)

Viab

ilida

d±

DS

(%)

Grafica 4. Efecto de diferentes compuestos sobre la viabilidad de tripomastigotes sanguíneos de la cepa INC-5 tras 24 h de incubación.* p < 0.05, **p < 0.001, n=4.

26

CONTROL NPOx-B 4mM Figura 13. Morfología de tripomastigotes sanguíneos de la cepa NINOA. Es notorio la perdida de la morfología característica acompañada de un incremento en el volumen y la formación de vacuolas (señaladas con flechas) en los tripomastigotes sanguíneos tratados con NPOx-B durante 24 h. Observación al microscopio óptico un aumento de 100X. Resultados similares se obtuvieron para ambas cepas.

5.6 Estudio in vitro NPOx-B, NPOx-Et, Nf y Bz del sobre la viabilidad de epimastigotes en cultivo.

Para la determinación de la viabilidad de epimastigotes sanguíneos después del

tratamiento con NPOx-B, NPOx-Et Nifurtimox y Benznidazol se utilizó la técnica de doble

tinción de FDA y PI que permite visualizar simultáneamente células viables (verde) y

células no viable (rojo). En la figura 14 se muestran algunas fotos representativas del

efecto del NPOx-B sobre la viabilidad de epimastigotes de la cepa INC-5, donde podemos

observar la doble tinción con FDA y PI. La figura 14A pertenece al control, los

epimastigotes que se observan en el campo sólo han sido teñidos por el FDA lo que indica

que se encuentran viables. En la figura 14B se pueden observar epimastigotes viables y

aquellos que han sido teñidos por el PI, los cuales son no viables, estos fueron sometidos

a un tratamiento con NPOx-B a una concentración de 1 mM. Por último, figura 14C cuyo

tratamiento fue de 8 mM de NPOx-B los epimastigotes que se observan en el campo se

encuentran no viables.

A B

CONTROL NPOx-B 1mM

C

27

NPOx-B 8mM Figura 14. Efecto del NPOx-B sobre la viabilidad de epimastigotes de la cepa INC-5 después 30 min. de tratamiento a temperatura ambiente. Se utilizó la tinción de diacetato de fluoresceína (FDA) / yoduro de propidio (PI). (A) control de DMSO, (B) tratamiento con NPOx-B 1mM y (C) tratamiento con NPOx-B 8 mM. Observaciones en el microscopio de epi-fluorescencia, con lámpara de halógeno de 100 W y filtro de excitación de 450-490 nm (azul), a un aumento de 40X Los resultados del efecto de los compuestos sobre la viabilidad de epimastigotes se

muestran en la gráfica 5 para la cepa NINOA y gráfica 6 para la cepa INC-5, como

podemos observar la viabilidad de los epimastigotes disminuye conforme aumenta la

concentración de los compuestos, siendo el compuesto más efectivo sobre ambas cepas el

NPOx-B y el que presentó un menor efecto el Benznidazol. Como sucedió con los

tripomastigotes sanguíneos, la cepa más susceptible sobre todo al NPOx-B fue la cepa

NINOA. Se comparó el efecto de los compuestos a las diferentes concentraciones. La cepa

INC-5 resultó menos sensible a los fármacos de referencia, pero no al NPOx-B un análisis

de varianza (ANOVA) y la prueba post-ANOVA de Dunnett para comparaciones múltiples

contra un control, tomando un α=0. 05.

0

20

40

60

80

100

Control(a) NPOx-B

(c)Nf(d)Bz

(b) NPOx-Et

** **** ** ** **

a b c d a b c d a b c d a b c d a b c d a b c d0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0

Concentración (mM)

Viab

ilida

d±

DS

(%)

Grafica 5. Efecto de diferentes compuestos sobre la viabilidad de epimastigotes de la cepa NINOA tras 60 min de incubación. * p < 0.05, **p < 0.01, n=4.

28

0

20

40

60

80

100

Control(b)NPOx-B

(c)Nf(d)Bz

0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0

*

** ** ** ****

(a)NPOx-Et

a b c d a b c d a b c d a b c d a b c d a b c d

Concentración (mM)

Via

bilid

ad±

DS

(%)

Grafica 6. Efecto de diferentes compuestos sobre la viabilidad de epimastigotes de la cepa INC-5 tras 60 min de incubación.* p < 0.05, **p < 0.01, n=4. 6. DISCUSIÓN

Los estudios sobre el posible efecto tripanomicida del NPOx-B se llevaron a cabo en forma

comparativa con el Nf, Bz y NPOx-Et un profármaco con efecto tripanomicida previamente

obtenido en nuestro laboratorio (Chena et al., 2004).

El efecto sobre la viabilidad de tripomastigotes sanguíneos fue proporcional a la

concentración del NPOx-B y NPOx-Et sobre las cepas INC-5 y NINOA en un intervalo de

concentraciones de 0.25 a 8 mM. La cepa NINOA fue la más sensible al tratamiento con

NPOx-B, NPOx-Et y Nf ya que con la concertación más alta (8 mM) el efecto tripanomicda

fue prácticamente del 100%. Por otro lado, la efectividad del Bz fue la más baja comparada

con los otros compuestos, incluso a la concentración más alta (8 mM).

Es importante mencionar que tanto el Nifurtimox como el Beznidazol presentan efectos

altamente tóxicos en periodos prolongados de administración (Teixeira et al., 1994),

además de la resistencia natural de algunas cepas a estos fármacos que se ha sugerido

como un factor importante para la baja efectividad de estos compuestos en un alto

porcentaje de pacientes chagásicos (Tsuhako et al., 1991). Algunos aspectos como

variaciones en la absorción y metabolismo de fármacos como el Bz y Nf están implicados

en la resistencia de algunas cepas de T. cruzi a los efectos quimioterapéuticos de estos

fármacos, de acuerdo con Brener la resistencia de este parásito a estos fármacos varia del

0% al 100% y la efectividad del tratamiento en pacientes chagásicos depende

primordialmente de la cepa (Brener, 1984). La cepa INC-5 fue menos sensible a los

compuestos utilizados, observándose que los efectos del Nifurtimox fueron los más bajos y

29

el compuesto más efectivo para la disminución en la viabilidad de los tripomastigotes

sanguíneos fue el NPOx-B, cabe señalar que los efectos terapéuticos del Nf y el Bz a las

infecciones chagásicas humanas, presentan diferencias notables, en gran parte, por la

existencia de cepas de T. cruzi con distinta susceptibilidad o resistencia a los fármacos.

(Neal y van Bueren, 1988)

En cuanto al efecto tripanomicida del NPOx-B, éste se ve también reflejado en la

disminución de la movilidad de los tripomastigotes lo que indica una reducción

considerable en la producción de energía debida a la inhibición de la α-HADH II. Esta

disminución en la movilidad de los tripomastigotes ya habían sido reportados para

Trypanosoma brucei al ser sometido a la presencia de un inhibidor de otra enzima de la

ruta glicolítica; la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, ya que al igual que T. cruzi, este

obtiene casi toda su energía de la glicólisis (Aronov et al., 1999). Las implicaciones que

presenta la disminución en la movilidad del parásito van desde la disminución en el grado

de invasión, la locomoción intracelular, la colonización de tejidos hospederos, la

diseminación del parasito dentro del hospedero, hasta la movilidad dentro del tracto

digestivo del vector para la proliferación del parásito (Hill, 2003) por lo que, un compuesto

que intervenga en la inhibición del metabolismo energético, presentaría un alto potencial

para el tratamiento de la enfermedad de Chagas.

Al tratar los tripomastigotes con NPOx-B también observamos cambios morfológicos como

aumento en el tamaño de los tripanosomas y una gran vacuolización, que se interpreta

como una evidencia de la entrada del NPOx-B, el cual al ser hidrolizado en el

correspondiente ácido, debido a la polaridad de este último tampoco podrá salir del

parásito, por lo tanto se acumulará, presentando un efecto osmótico con la consecuente

entrada de agua, que se ve reflejado en un aumento del volumen de los tripomastigotes.

Este tipo de fenómenos que se presentan cuando el parásito esta sujeto a un medio

hiposmótico han sido anteriormente descritos para T. cruzi particularmente en el paso del

parasito del insecto vector al hospedero vertebrado (Rohloff et al., 2003). Además este

efecto del NPOx-B pone de manifiesto la hidrólisis del compuesto por esterasas

previamente descritas en este parásito por otros investigadores (Aldunate et al., 1987),

Cabe mencionar que durante el tratamiento con NPOx-Et también se han informado

cambios de morfología de tripomastigotes sanguíneos (Zaragoza, 2005). De igual modo, al

inhibir una enzima crucial de la glicólisis en T, brucei se presentan también cambios

morfológicos evidentes en la forma circulante de T. brucei (Aronov et al., 1999)

Comparando el efecto tripanomicida del NPOx-B con el del NPOx-Et, es mayor el

producido por el éster bencílico sobre todo en la cepa INC-5 lo que puede deberse a que

30

este producto por ser más hidrofóbico, probablemente atraviesa más fácilmente las

membranas por difusión simple y al existir más moléculas en el interior del parásito

aumentará el efecto tripanomicida. En cuanto a la polaridad de este compuesto también se

pueden mencionar algunas ventajas, ya que los compuestos menos polares son mas

difícilmente eliminados del organismo, con lo cual, aumentara la vida media del compuesto

(Goodman y Gilmans, 2001). Probablemente al disminuir la polaridad también sea mas

factible que el compuesto llegue a los amastigotes intracelulares que se presentan en la

fase crónica de la enfermedad de Chagas (Tanowitz et al., 1992) y que son uno de los

factores que impiden que la quimioterapia existente sea efectiva en esta fase, ya que los

fármacos han sido diseñados para ser mas efectivos sobre tripomastigotes sanguíneos

que sobre otros estadios (Urbina, 2002). Por otro lado existen reportes del efecto del

NPOx-Et sobre nidos de amastigotes en músculo cardiaco y esquelético en un modelo

murino (Zaragoza, 2005), en ese trabajo el compuesto se administró a los ratones por vía

oral y se presentó una reducción en la presencia de nidos de amastigotes en ambos tipos

de músculo, como el NPOx-B fue mejor agente tripanomicida que el NPOx-Et, se esperaría

que el NPOx-B, presente un mejor efecto tripanomicida sobre amastigotes intracelulares.

Es importante mencionar que las carboxiesterasas se clasifican en dos grandes grupos (A

y B). Las carboxiestrasas de tipo A presentan actividad preferentemente sobre ésteres

aromáticos, mientras que las de tipo B lo hacen sobre ésteres alifáticos (Bergmeyer, 1984).

Probablemente el NPOx-B se estén hidrolizando por ésterasas de tipo A y el NPOx-Et por

las de tipo B y la actividad de estas esterasas presentes en T. cruzi sea diferente, lo que

explicaría porque se obtiene resultados diferentes con estos dos compuestos sobre la

viabilidad de tripomastigotes sanguíneos.

En el caso de los epimastigotes podemos observar que el NPOx-B fue mas efectivo

reduciendo la viabilidad de los epimastigotes de ambas cepas, incluso fue mas potente que

sobre los tripomastigotes sanguíneos. En los epimastigotes el efecto tripanomicida de los

fármacos de referencia Bz y Nf fue muy limitado y este efecto no aumenta con la

concentración del compuesto sino que presenta un máximo, este efecto puede deberse a

que este compuesto que es capaz de atravesar la membrana por difusión simple en ambos

sentidos, sin embargo, este flujo depende del gradiente de concentración y en cuanto la

concentración intracelular del fármaco se nivela con la extracelular, el efecto tripanomicida

llegará a un máximo, mientras que en el caso de los ésteres derivados del ácido oxámico ,

al ser hidrolizados dentro del parásito recuperan su polaridad, la concentración intracelular

del ácido N-propil oxámico irá en aumento, con el consecuente aumento del efecto

tripanomicida, conforme aumenta la concentración del compuesto.

31

Las diferencias entre la disminución de la viabilidad en epimastigotes debida a la presencia

de algunos fármacos, comparada con la producida en tripomastigotes ya ha sido

ampliamente reportada, para una gran cantidad de compuestos y extractos o fracciones,

de plantas, aunque los datos son variables, la mayoría de los reportes sugiere que los

epimastigotes necesitan concentraciones mas altas de un determinado compuesto para

que se presente el mismo efecto tripanomicida (Jímenez et al., 2005; Faundez et al., 2005;

Abe et al., 2005).

Las diferentes respuestas de T. cruzi a los fármacos sugieren la existencia de diferencias

moleculares entre distintas cepas de este parásito, entre estas propiedades moleculares se

encuentran las dependientes de isoenzimas y marcadores genéticos (Nirde et al., 1995).

Se debe agregar que las poblaciones silvestres de T. cruzi pueden contener formas

susceptibles y resistentes a los quimioterapéuticos antichagásicos, de manera que la

destrucción de las formas susceptibles por los fármacos lleva a la producción de formas

resistentes (Murta et al., 1998). Los epimastigotes resistentes, transmiten esta propiedad a

su vez a los amastigotes, de esta manera la resistencia al fármaco se hace extensiva a

todos los parásitos infectantes (Nozaki et al., 1996).

Por otro lado las diferencias de polaridad entre los compuestos utilizados, sobre todo

NPOx-B y NPOx-Et, de los cuales el segundo es menos hidrofóbico que el primero,

aunado a las diferencia en la composición de lípidos de la membrana plasmática de los

parásitos en diferentes estadios del ciclo de vida de T. cruzi e incluso las diferencias en el

mismo estadio entre diferentes cepas (Kaneda et al., 1986; De Souza et al., 1978),

probablemente sea un factor determinante para las diferencias en la actividad

tripanomicida de estos compuestos entre epimastigotes y tripomastigotes o entre

diferentes cepas en un mismo estadio.

7. CONCLUSIONES • Los estudios in vitro sobre la viabilidad de tripomastigotes sanguíneos de la cepa INC-5

demuestran que el éster bencílico del ácido N-propil oxámico presenta un significativo

efecto tripanomicida, incluso mayor que los producidos por los fármacos de referencia,

Benznidazol y Nifurtimox y el éster etílico del ácido N-propil oxámico. • Los estudios in vitro del éster bencílico del ácido N-propil oxámico sobre la viabilidad

de tripomastigotes sanguíneos de la cepa NINOA demuestran que, esta cepa es más

sensible a este compuesto en comparación con la cepa INC-5 y la disminución en la

viabilidad de esta cepa es también mayor que la producida por Benznidazol.

• El efecto tripanomicida del NPOx-B se ve reflejado no sólo en la disminución de la

movilidad sino también en el aumento de tamaño y probablemente en la formación de

32

vacuolas de los tripomastigotes sanguíneos de la cepa INC-5 y NINOA, lo cual es un

indicio de que el profármaco penetra y es hidrolizado dentro del parásito

• En los epimastigotes el éster bencílico del ácido N-propil oxámico también mostró un

excelente efecto tripanomicida en las cepas estudiadas (INC-5 y NINOA), incluso

mayor que el producido el éster etílico del ácido N-propil oxámico y los producidos por

los fármacos de referencia, Nifurtimox y Benznidazol

• Las diferencias en el efecto tripanomicida encontrado para epimastigotes y

tripomastigotes debidas tanto al el éster bencílico del ácido N-propil oxámico, como el

el éster etílico del ácido N-propil oxámico, Nifurtimox y Benznidazol, se pueden deber a

factores tan diversos como propiedades fisicoquímimicas del compuesto, diferencias

en la composición de lípidos de membrana en cada uno de los estadios de T. cruzi,

hasta divergencia genética entre cepas.

• En virtud de los resultados obtenidos sobre el efecto tripanomicida in vitro el éster

bencílico del ácido N-propil oxámico, es imperativo continuar con los ensayos in vivo ya

que se perfila como un posible fármaco mas efectivo que los existentes para el

tratamiento de la enfermedad de Chagas.

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