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ADN y RNA estructura - estabilidad
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ADN y RNA
estructura - estabilidad
Objetivos
propiedades físicas, químicas y biológicas(función) del
ADN plasmídico y genómico
Interacción con el entorno y otras moléculas
condiciones de ruptura celular, extracción, purificación y
detección específicas
Aplicación de los conceptos integrados:
Identificación de genes (Southern Blot), amplificacion de
genes (PCR, DNA recombinante)
q(-) es su superficie
ptes de H y empaquetamiento
hidrofóbico en su interior
gran capa de hidratación en
torno a P
sensible a sales
caotrópicas
Desnaturalización y
renaturalización cooperativa
Abs. a 260 nm (efecto
hipercrómico)
la alta cte dielectrica del H2O impide la formación de
enlaces iónicos estables
el agregado de ALCOHOLES de menor constante
dielectrica → precipitación
¿Qué efecto tiene el
agregado de
alcoholes en la
estabilidad?
Efecto del PH
El enlace fosfodiester y el enlace N-glicosídico son inestables a
pH muy ácidos (pH 1 o menor) y temperatura ambiente. A pH
alrededor de 4 el enlace N-glicosidico de las purinas se rompe
(depurinización).
Efecto del PH
A pH alcalinos el DNA es estable hasta pH 11 pero el RNA se
hidroliza a pH superiores a 7.5.
Unión a colorantes
Bromuro de etidio
Agente intercalente: diferente distorsión según el tipo de DNA
Unión a colorantes
Efecto del PH
Efecto del ph sobre los puentes de H
La urea y formamida compiten por los ptes de H entre
bases…pero como hacen para interaccionar con estas?
las bases que se separan en el eq. no se vuelven a aparear
Constante ruptura y formación de los ptes de H entre bases por equilibrio térmico
por ptes de H esto permite la competicion de
Efecto hipercrómico
Fusión y enfriamiento de DNA
Cooperatividad:
la estimulacion (o inhibicion) de un evento posterior a la
ocurrencia del mismo evento en otra parte de la
macromolecula
Por qué el DNA se comporta de este modo??
Cuál es el evento que se repite??
Zipper model o modelo de cremallera
Fusión y enfriamiento de DNA
Zipper model o modelo de cremallera
El grado de cooperatividad depende
de la relación entre el ∆Gnucleacion y
∆Gpropagacion
Fusión y enfriamiento de DNA
Diferente estructura del mitad-
fundido resp. al mitad-renaturalizado
doble cadena (estabilizado por ptes de H y apilamiento de bases)
simple cadena (favorecido entrópicamente y por repulsión de fosfatos)
→ proceso dependiente de la temperatura y la [sales] (dependencia de TM
con [sales] )
contraiones
aumento de la
estabilidad con el
agregado de sales
+
+
+
+
+
+
Fusión y enfriamiento de DNA
La fusión de DNA se piensa generalmente en términos de ruptura de ptes de H pero lo que
se obs. es la perdida del apilamiento de bases por absorción
→ TM mide el desapilamiento
El desapilamiento tb. desestabiliza pares de bases apareados adyacentes a otro
desapareado.
Fusión y enfriamiento de DNA
Generalmente asoc. al pte de H extra
La estabilidad del DNA depende de la estabilidad de c/par de bases.
La fundición se inicial en zonas T∙A
Fusión y enfriamiento de DNA
La renaturalización es bimolecular
tambien depende de la estabilidad de c/par de bases, mas probable en G∙C .
La nucleación puede unir segmentos que no estén unidos en el DNA final !!
Muestreo de un gran número de combinaciones previas.
Si el enfriamiento es rápido, el sist queda atrapado en intermediarios de alta energía.
Si la [cadenas simples] es muy baja → peligro de formacion de pares INTRAmoleculares.
La renaturalización ( diferencia de la fusión)
muestrea muchos estados
termodinámicamente degenerados
→ aumenta S de estos estados.
El DNA medio-fundido representa una
distribución angosta de estructuras, pero el
DNA medio-renaturalizado tiene una
composición más heterogenea
→ la cooperatividad de TM es > que la de TA
La renaturalización depende de la concentración
La renaturalizacion del ADN sigue una cinética de
segundo orden
Etapa determinante
c/c0 vs c0t (curvas “cot”)
Curvas “cot” de distintas fuentes
Complejidad Número de
nucleótidos en
sequencias no-
repetidas
c0t es proporcional a la complejidad
Curva “cot” de DNA humano
horquillas
cruciforme
(palindromes)
DNA altamente
repetitivo
DNA medianamente
Repetitivo (genes que RNAt y RNAr, etc)
DNA de copia
unica (mayoria de los
genes que
codifican proteina)
La cinética de reasociación tiene una T optima
1. El DNA se corta en fragmentos de aproximadamente 450bp (por
ejemplo por sonicación)
2. El tamaño de los fragmentos se puede chequear por electroforesis.
3. Una determinada concentración de DNA se dispone en tubos
4. Se desnaturaliza el DNA
5. A una temperatura entre 20 y 25 grados menor a Tm, y en forma
lenta se procede a la reasociación
6. Se calcula el % de ssDNA para determinar el valor de Cot
tubo con
ADN
calentamiento
Incubar a Tm - 25C
Dilución para frenar
la reasociación
todo el ADN se
une Eluye el ssDNA
Eluye el dsDNA
Se puede determinar la complejidad de un genoma
Tomando como referencia la complejidad de otro
