ESTANDARIZACION DEL PROTOCOLO DEL ENSAYO DEL …
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ESTANDARIZACION DEL PROTOCOLO DEL ENSAYO DEL COMETA NEUTRO ANA CAMILA MURILLO UNIVERSIDAD DE LOS ANDES DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS STA FE DE BOGOTA 2002
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ESTANDARIZACION DEL PROTOCOLO DEL ENSAYO
DEL COMETA NEUTRO
ANA CAMILA MURILLO
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
STA FE DE BOGOTA
2002
TRABAJO DE TESIS PARA OPTAR POR EL TITULO
DE BIOLOGA
ESTANDARIZACION DEL PROTOCOLO DEL ENSAYO
DEL COMETA NEUTRO
ANA CAMILA MURILLO
DIRECTORA
HELENA GROOT DE RESTREPO
CO-DIRECTORA
DIANA SICARD SUAREZ
1
TABLA DE CONTENIDO
1 RESUMEN ...............................................................................................................3 2 INTRODUCCIÓN Y JUSTIFICACIÓN.................................................................6 3 MARCO TEÓRICO...............................................................................................11
3.1 EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR ................................................................11
3.2 PRUEBAS DE GENOTOXICIDAD..............................................................16
3.2.1 Tipos de Daño en el ADN .....................................................................18
3.2.1.1 Agentes Químicos...........................................................................18
3.2.1.2 Agentes Físicos...............................................................................19
3.2.2 Pruebas In Vitro / In Vivo ......................................................................21
3.3 GENERALIDADES DEL ENSAYO DEL COMETA ..................................22
3.4 ENSAYO DEL COMETA NEUTRO............................................................30
3.5 BLEOMICINA .................................................................................................34
3.6 ETOPÓSIDO (VP16).....................................................................................36
4 OBJETIVOS ..........................................................................................................39 4.1 OBJETIVO GENERAL ..................................................................................39
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................................39
5 MATERIALES Y METODOS ..............................................................................41 5.1 DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIONES Y EXPOSICIÓN A BLM
.................................................................................................................................42
5.1.1 Separación de Linfocitos.......................................................................42
5.1.2 Exposición a Distintas Concentraciones de BLM ............................43
5.1.3 Conteo de Viabilidad..............................................................................44
5.1.4 Exposición a BLM...................................................................................45
5.2 ESTANDARIZACIÓN DEL ENSAYO DEL COMETA NEUTRO............45
5.2.1 Solución de Lisis de Trabajo................................................................46
5.2.2 Desproteinización...................................................................................46
5.2.2.1 Utilización de NaOH para desproteinización..............................47
5.2.2.2 Utilización de buffer de electroforesis para desproteinización47
2
5.2.3 Determinación de Voltaje y Tiempo de Electroforesis......................47
5.3 PRUEBAS ESTADÍSTICAS .........................................................................49
6 RESULTADOS......................................................................................................51 6.1 PRUEBAS DE VIABILIDAD PARA LA EXPOSICIÓN A BLEOMICINA51
6.2 SOLUCIÓN DE LISIS....................................................................................53
6.3 ELIMINACIÓN DE PROTEÍNAS RESIDUALES.......................................55
6.4 TIEMPO Y VOLTAJE DE LA ELECTROFORESIS..................................57
6.5 LECTURA DE LAS LÁMINAS .....................................................................59
6.5.1 Análisis de Morfología...........................................................................60
6.5.2 Análisis de Longitud de la Cola del Cometa......................................63
7 DISCUSIÓN...........................................................................................................67 7.1 PRUEBAS DE VIABILIDAD PARA LA EXPOSICIÓN A BLEOMICINA67
7.2 SOLUCIÓN DE LISIS....................................................................................69
7.3 ELIMINACIÓN DE PROTEÍNAS RESIDUALES.......................................71
7.4 TIEMPO Y VOLTAJE DE LA ELECTROFORESIS..................................73
7.5 DIFERENCIA ENTRE ENSAYO DEL COMETA ALCALINO Y NEUTRO
.................................................................................................................................75
7.6 LECTURA DE LAS LÁMINAS .....................................................................76
8 CONCLUSIONES .................................................................................................80 9 RECOMENDACIONES........................................................................................82 10 BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................84 Anexo # 1 Clasificación de morfología celular según Anderson (1994).90 ANEXO # 2 PROTOCOLO DEL ENSAYO DEL COMETA NEUTRO...........91
3
1 RESUMEN
La epidemiología molecular se basa en la utilización de biomarcadores en la
investigación de posibles factores que pueden potenciar el desarrollo de
enfermedades a nivel individual o poblacional. Las pruebas de genotoxicidad
son una herramienta útil para la epidemiología molecular, permiten dilucidar
daños y alteraciones del material genético. Una de las pruebas utilizadas
comúnmente es el ensayo del cometa.
El ensayo del cometa es una prueba útil, sencilla y rápida para la evaluación
de agentes genotóxicos en células eucariotas procedentes de muestras
biológicas. En su versión alcalina, el ensayo del cometa detecta
rompimientos de cadena sencilla de ADN y sitios lábiles al álcali. Sin
embargo mediante esta técnica no es posible detectar rompimientos de doble
cadena de ADN; estos solo pueden detectarse en la versión neutra del
ensayo. Los rompimientos de doble cadena de ADN son ocasionados por la
agentes físicos como la radiación ionizante y la radiación ultravioleta (UV);
también pueden ser ocasionados por agentes químicos radiomiméticos como
la bleomicina y el VP16 entre otros. Algunos de estos agentes han sido
4
estudiados en el Laboratorio de Genética Humana utilizando el ensayo del
cometa en condiciones alcalinas.
Para estandarizar el protocolo del ensayo del cometa es necesario hacer una
investigación exhaustiva de los protocolos empleados anteriormente por
diferentes investigadores. Se deben determinar los aspectos uniformes y
variables de los protocolos para poder establecer una metodología que
permita evaluar los rompimientos de doble cadena posteriores a la
exposición con agentes genotóxicos. Posteriormente, se determinan las
variables que permiten un estudio confiable y reproducible.
El objetivo de este trabajo es establecer el protocolo del ensayo del cometa
neutro, para su utilización en pruebas de genotoxicidad en el laboratorio de
genética humana. De esta manera se podrán evaluar sustancias que
ocasionan rompimientos de doble cadena y evaluar la reparación de estos
daños, al igual que individuos que presenten alteración en la capacidad de
reparación de estos daños.
Todos los días estamos expuestos a agentes físicos que ocasionan
rompimientos de doble cadena de ADN. Muchos tratamientos
quimioterapéuticos utilizan drogas que ocasionan este tipo de daño. La
5
susceptibilidad individual determina el grado de riesgo para el desarrollo de
enfermedades ocasionadas por exposición a agentes genotóxicos. Este
protocolo servirá como una herramienta útil para evaluar la capacidad de
reparación de individuos y de esta manera conocer si son susceptibles o no a
la utilización de drogas o de compuestos que ocasionen este tipo de daño.
6
2 INTRODUCCIÓN Y JUSTIFICACIÓN
La epidemiología molecular usa marcadores biológicos en la investigación de
las enfermedades humanas; identificación de su origen, de las poblaciones
en alto riesgo de padecer una enfermedad en particular y su prevención. El
uso de marcadores biológicos le permite el investigador estudiar individuos
que han sido expuestos a agentes xenobióticos e identificar aquellos que
potencialmente pueden desarrollar una enfermedad aunque esta todavía no
presente síntomas clínicos (Schulte & Perera, 1993). No todas las personas
que han estado expuestas a agentes xenobióticos desarrollan enfermedades
asociadas a ellas, esto se debe a diferencias en su susceptibilidad; para la
epidemiología molecular es un reto encontrar estos marcadores (Schulte &
Perera). De esta manera, estas investigaciones pueden mejorar la
capacidad de determinar los riesgos de padecer enfermedades tanto en
poblaciones como en individuos Schulte & Perera, 1993).
Cada año millones de personas son diagnosticadas con algún tipo de cancer,
es la enfermedad que mas vidas cobra en el mundo. Estudios demuestran
7
que hay factores ambientales e individuales que afectan las probabilidades
de padecer la enfermedad. La incorporación de biomarcadores en el estudio
de la prevención del cancer es de especial utilidad ya que mejora el
entendimiento de los factores que contribuyen la variabilidad interindividual
en la respuesta a agentes cancerígenos (Perera & Whyatt, 1994). Esta
variabilidad está determinada por diferencias en la actividad metabólica,
mecanismos de detoxificación, capacidad de reparación de ADN, mutaciones
heredadas y niveles de micronutrientes (Perera & Whyatt, 1994); es
mediante la utilización de la epidemiología molecular que se pueden
reconocer marcadores que nos indiquen la variabilidad.
Las causas que pueden ocasionar una enfermedad son múltiples, por esta
razón es importante utilizar todas las disciplinas que estén al alcance para su
detección, prevención y manejo (Schulte & Perera, 1993). Las pruebas de
genotoxicidad permiten el estudio de efectos y respuesta temprana a agentes
genotóxicos. Con estas pruebas es posible encontrar daños y alteraciones en
el material genético de células individuales. Las pruebas de gentoxicidad han
sido ampliamente utilizadas para investigar daños ocasionados por agentes
ambientales (químicos y físicos) como alquilaciones, cruzamientos,
rompimientos de cadena, daño de bases y azucares (Friedberg et al, 1995).
El ensayo del cometa es una prueba de genotoxicidad que permite el estudio
8
de rompimientos de cadena de ADN; con la versión alcalina se pueden
observar los rompimientos de cadena sencilla y con la versión neutra los
rompimientos de doble cadena.
El ensayo del cometa es utilizado como un marcador biológico que no solo
permite el estudio de químicos xenobióticos (Valverde et al, 1999), sino que
nos indica la susceptibilidad y capacidad de reparación individual (Alapetite,
1998; Rojas et al, 1999, Valverde et al, 1999). La gran mayoría de los
estudios usan la versión alcalina del ensayo cometa ya que permite el
estudio de una mayor variedad de daños ocasionados al ADN entre ellos los
rompimientos de cadena sencilla y lugares lábiles al alcalí. Aunque es cierto
que el porcentaje de rompimientos de doble cadena de ADN (estudiados
mediante el cometa neutro) es menor al de cadena sencilla, no debemos
ignorar la importancia de su estudio. La importancia del ensayo del cometa
en su versión de acidez-alcalinidad neutro radica en que podría ser una
herramienta muy útil en la prevención y manejo del cancer. Las alteraciones
en la capacidad de reparación de rompimientos de doble cadena son
considerados como factores de riesgo para el desarrollo de un cancer. El
estudio de la capacidad de reparación de este tipo de daño le puede indicar a
un individuo si se tiene mayor o menor riesgo a desarrollar un cancer.
9
Además, puede ayudarle a la persona a escoger un tratamiento anti-tumoral
que se ajuste a su capacidad física de reparación.
El ensayo del cometa es un protocolo que permite observar fragmentos de
ADN que han sido separados del núcleo. Existen hasta el momento tres
versiones que permiten observar rompimientos de cadena sencilla y sitios
lábiles al álcali (versión alcalina), solo rompimientos de cadena sencilla (pH
12.3) o rompimientos de doble cadena (versión neutra). El protocolo consiste
en la suspensión de células en un gel de agarosa sobre una lámina
portaobjeto. Estas láminas son colocadas en una solución de lisis que rompe
las membranas celulares y permite la migración de los fragmentos de ADN.
Luego, se le hace una electroforesis a las láminas para que los fragmentos
migren hacia el ánodo. Las láminas son teñidas con un colorante
fluorocromado para su observación en un microscopio de fluorescencia.
Cada individuo tiene una capacidad propia para mantener su genoma
íntegro, esta capacidad determina la susceptibilidad que tendrá a los efectos
carcinogénicos a los que se expone a diario. Existe gran variedad de
enfermedades hereditarias poco comunes que afectan esta capacidad de
reparación. El ensayo cometa es un examen rápido, sencillo y económico
que podría ser de gran beneficio a familias con enfermedades hereditarias
10
asociadas a daños en la reparación del ADN (Alapetite, 1998). Una prueba
le puede indicar a un individuo (o familia) que defectos específicos de
reparación tiene, de esta manera el individuo puede saber que agentes
presentan mayor peligro para su salud. También es útil en la determinación
de tratamientos para el cancer; existen asociaciones entre la genética y la
respuesta a un tratamiento de quimioterapia (Alapetite, 1998; Jaloszynski et
al, 1997). Aunque, es imposible determinar si una persona va a padecer de
esta enfermedad o no, es un arma poderosa para la prevención y manejo de
la enfermedad.
El cometa neutro también es una prueba muy efectiva para la determinación
de la toxicidad de los químicos. No solo nos puede indicar los tipos de daño
que potencialmente puede ocasionar un agente, sino que nos permite
estudiar la línea celular que se ve a ver mas afectada ante la exposición a
este.
11
3 MARCO TEÓRICO
3.1 EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR
Epidemiología es el estudio de las epidemias o enfermedades en las
poblaciones humanas; identificación de las causas potenciales de las
enfermedades, identificación de poblaciones en alto riesgo, y de esta manera
determinar medidas necesarias para prevenir su propagación. La
epidemiología molecular es el uso de marcadores biológicos (biomarcadores)
en la investigación epidemiológica (Schulte & Perera,1993), complementando
métodos utilizados anteriormente. Los biomarcadores pueden contribuir en
estudios epidemiológicos en una gran variedad de formas (Schulte & Perera,
1993):
♦ Delineación de eventos continuos desde una exposición hasta la
enfermedad resultante.
♦ Identificación de exposición a bajas dosis de xenobióticos y permite la
reconstrucción dosis recibidas en exposiciones pasadas .
12
♦ Identificación de eventos tempranos en la historia natural de
enfermedades clínicas que en el futuro permiten enfocar en los eventos
pre-clínicos y no los clínicos (enfermedad en si) y de esta manera
identificar individuos asintomáticos de alto riesgo.
♦ Disminución en la clasificación errónea de variables dependientes e
independientes.
♦ Indicación de los mecanismos por los cuales una exposición y una
enfermedad están relacionados.
♦ Permite diferenciar la variedad en la respuesta de un huesped,
particularmente por factores genéticos, a un agente y así determinar su
susceptibilidad.
♦ Mejoras en la estimación de riesgos a escala grupal e individual.
Los biomarcadores utilizados en estudios epidemiológicos incluyen eventos
bioquímicos, moleculares, genéticos, inmunológicos o físicos de sistemas
biológicos (Schulte & Perera, 1993). Es importante notar que pueden existir
marcadores aunque no haya pruebas que los identifiquen, es un reto para
investigadores desarrollar nuevas pruebas que sean sensibles en su
detección. El mayor problema que representan los biomarcadores en
laboratorios de investigación es que no siempre se pueden manejar en
grandes cantidades para estudios epidemiológicos debido a su alto costo de
13
manejo y dificultad de procesamiento (Schulte & Perera, 1993), además
puede haber marcadores con gran diferencias inter e intraindividual.
Muchas disciplinas emplean el uso de la epidemiología molecular para su
investigación (Schulte & Perera, 1993); ellas son: bacteriología, inmunología
e epidemiología de enfermedades infecciosas; patología y química clínica;
carcinogénesis y oncología; medicina ocupacional y toxicología;
epidemiología cardiovascular; genética, biología molecular y epidemiología
genética; y la epidemiología tradicional y bioestadística. La disciplina de
mayor relevancia en este estudio es la de carcinogénesis y oncología.
El uso de la epidemiología molecular ha sido amplio en el estudio del cancer.
Existe hoy en día un concepto de que el cancer es proceso de múltiples
etapas, y por la tanto se han hecho grandes esfuerzos por encontrar
marcadores que permitan determinar la susceptibilidad de individuos en cada
uno de estos pasos. Los biomarcadores utilizados en el estudio de cancer y
mutación incluyen (Perera & Whyatt, 1994):
♦ Dosis Interna: mide la cantidad de carcinógeno o su metabolito presenta
en células, tejidos o líquidos corporales.
14
♦ Dosis Biológicamente Efectiva: indica la cantidad de carcinógeno que ha
interactuado con macromoléculas celulares en lugares blancos. Solo
refleja exposiciones recientes.
♦ Marcadores de Efecto Biológico: muestran daño irreversible resultado de
interacción tóxica, en un órgano específico donde se conoce o se
sospecha que está patológicamente ligado al cancer.
♦ Marcadores de Susceptibilidad: miden diferencias individuales que
pueden modular la respuesta a un agente genotóxico. Estas diferencias
pueden hallarse en la capacidad de reparación de ADN, niveles de
micronutrientes y mutaciones heredadas.
Los Biomarcadores también han sido utilizados en estudios etiológicos
(Perera & Whyatt, 1994) para encontrar relaciones entre exposición a
agentes genotóxicos y niveles de biomarcadores como en estudios de
fumadores, de exposición laboral, de exposición ambiental (polución). Los
biomarcadores han sido útiles en el estudio de casos-controles donde se
busca encontrar la relación entre ciertos biomarcadores como factores de
carcinogénesis; ayudan a sugerir la relación directa entre un carcinogénico
específico y un órgano blanco específico.
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Otra de las grandes utilidades de los biomarcadores es la aproximación a
estimar los riesgos de un individuo o un grupo ha desarrollar ciertas
enfermedades (Perera & Whyatt, 1994). Este riesgo se puede evaluar al
calibrar las dosis biológicamente efectivas en un órgano blanco de un
humano con aquellas de animales de laboratorio donde se conozca la
incidencia de tumores. Contribuye de esta manera, a la prevención del
cancer ya que un individuo en alto riesgo de desarrollar un tumor puede
tomar medidas necesaria para su prevención (por ejemplo, dejar de fumar).
Por último, los biomarcadores son una gran herramienta para estudios de
intervención quimioterapeútica ( Perera & Whyatt, 1994; Schulte & Perera,
1993) ya que permiten estudiar la eficacia de un tratamiento con
quimioterapia y/o radioterapia. Los biomarcadores pueden indicarle a un
paciente la posible respuesta de su cuerpo a un tratamiento; se han
encontrado diversos biomarcadores relacionados a la capacidad de
reparación de tejidos y de material genético que indiscutiblemente juegan un
papel muy importante en la remisión de un cancer.
El uso de biomarcadores en los laboratorios debe ser validado antes de
poder dar resultados definitivos (Perera & Whyatt, 1994). Primero, es
necesario estandarizar un proceso para que este sea sensible a pequeñas
de dosis de exposición y los resultados de la prueba deben ser
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reproducibles. Segundo, se debe tener un entendimiento de los factores que
determinan el efecto de los genotóxicos sobre poblaciones humanas: tipo de
genotóxico, modo de exposición, mecanismos de integración, tiempos de
exposición, entre otros. Por último, sería óptimo poder determinar la relación
dosis-respuesta y las diferencias inter e intra individuales en el
procesamiento de agentes genotóxicos.
3.2 PRUEBAS DE GENOTOXICIDAD
Las pruebas de genotoxicidad utilizan células de organismos que han estado
expuestos a agentes xenobióticos y buscan daños o alteraciones en su
material genético; tales como mutación de genes o estructura y número de
cromosomas. En el LGH tres pruebas de genotoxicidad son utilizadas
regularmente: intercambio de cromátides hermanas (ICH), micronúcleos y el
ensayo del cometa (discutido en detalle mas adelante).
La prueba de ICH es utilizado para evaluar daños citogenéticos causados por
agentes químicos o físicos. El intercambio de cromátides hermanas se
presenta por sobrecruzamiento entre cromátides hermanas durante la
meiosis o la mitosis. Muchos mutágenos químicos inducen este tipo de daño
a bajas concentraciones ya que a altas concentraciones ocasionan
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aberraciones mayores. Las células pueden ser tratadas con compuestos
que causan lesiones que persisten durante la división celular y así se
presenta el intercambio, también se pueden utilizar células de organismos
que se sospechen estuvieran expuestos a estos químicos. En la prueba los
cromosomas son tratados para que cada cromátide hermana tenga su propia
tinción. Esto se logra al cultivar las células en presencia de un análogo de
timidina, bromodeoxyuridina (BrdU). Después de dos ciclos de replicación un
cromosoma tendrá una cromátide donde una hebra de ADN ha sido
sustituido por BrdU , y otra cromátide donde ambas hebras son sustituidas.
Al observar las metafases los intercambios son visualizados ya que habrá
una tinción diferencial.
La prueba de micronúcleos es utilizado en el estudio de agentes
clastogénicos (que rompen cromosomas), para el estudio se utilizan linfocitos
de sangre periférica. La prueba se basa en que células que tienen
rompimientos de cromosomas presentaran disturbios en la distribución de
cromatina durante la anafase de la mitosis. Después de la telofase la
cromatina será desplazada del núcleo de las células hijas y se observará
como un micronúcleo. Las células cultivadas deben ser tratadas con un
agente que promueva la mitosis celular, pero al mismo tiempo se debe inhibir
la citocinesis de manera que al hacer la tinción se observaran células
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binucleadas, en aquellas donde hay rompimientos cromosómicos se
observará la pequeña fracción de cromosoma cercano a los núcleos.
3.2.1 Tipos de Daño en el ADN
El ADN puede sufrir daños por alteraciones espontáneas que ocurren
durante su metabolismo normal o por agentes ambientales. Estos agentes
ambientales pueden ser físicos o químicos. Las pruebas de genotoxicidad
se utilizan principalmente en el estudio de los daños ocasionados por
agentes ambientales.
3.2.1.1 Agentes Químicos
Existe una gran variedad de agentes químicos que causan daños al material
genético. Estos se pueden dividir por el tipo de daño que ocasionan sobre el
material genético (Friedberg et al, 1995):
♦ Agentes Alquilantes: Son compuestos que tienen una afinidad hacia el
centro nucleofílico de macromoléculas orgánicas. Estas sustancias
pueden tener un o dos sitios activos que reaccionan con el ADN. Gran
variedad de estos químicos han probado ser carcinogénicos.
♦ Agentes que causan cruzamientos: Estos agentes tienen dos sitios
activos donde reaccionan con el ADN. El cruzamiento se puede observar
entre las dos hebras del ADN o dentro de una misma hebra. Los
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cruzamientes entre dos hebras distintas impiden la separación de las
hebras de ADN y por lo tanto bloquea los procesos de replicación y
trascripción.
♦ Químicos activados metabólicamente: al igual que los agentes
alquilantes estos químicos interactúan con los centros nucleofílicos del
ADN. Muchos de estos químicos tienen potenciales mutagénicos y
carcinogénicos. La activación metabólica de estos compuestos se lleva a
cabo en la célula afectada debido a uso de enzimas que inicialmente la
protegían de agentes citotóxicos. Estas enzimas se unen a los tóxicos
para volverlos hidrosolubles y fácilmente excretables pero, el tóxico se
vuelve electrofílico y altamente reactivo con el ADN. Para su activación
metabólica requieren de NADPH y oxígeno.
3.2.1.2 Agentes Físicos
Existen dos agentes físicos que ocasionan daños en el material genético: la
radiación ionizante y la radiación UV. La radiación ionizante causa daño a
varios componentes celulares y ocasiona una gran variedad de daños en el
ADN (Friedberg et al, 1995). La radiación puede ocasionar daños
directamente sobre el ADN o por indirectamente al activar moléculas que
afectan la integridad del material genético. Los daños sobre el ADN incluyen
daño de bases, daño de azucares y rompimientos de cadena. La acción
20
directa de la radiación ionizante sobre las bases ocasiona la pérdida de un
electrón de la posición no-saturada C5-C6 que lo deja activa y así interactuar
con iones hidroxilos. Aunque los daños en los azucares son muchos
menores que los daños a bases son de gran importancia ya que estos daños
generalmente conllevan a rompimientos de cadena sencillos y dobles (SSB y
DSB, respectivamente). La radiación ionizante también causa rompimientos
de cadena directamente. Los rompimientos de cadena sencilla se inician por
la formación de radicales en la deoxyribosa seguido por la pérdida de un
átomo de hidrógeno. Detalles de la secuencia de reacciones que llevan a la
formación de los rompimientos de cadena no están claramente establecidos.
De la misma manera, no se conoce si la formación de los DSB es
ocasionado por transferencias de radicales en la hebra complementaria o por
consecuencia de múltiples ataques de radicales libres. Si los SSB ocurren
en lugares cercanos de la hebra por lo general, el resultado serán los DSB.
La radiación UV ha sido ampliamente utilizada en el estudio de daño y
reparación de ADN a través de los años ya que reproducirla en condiciones
artificiales en un laboratorio es muy fácil (con una lámpara germicida)
(Friedberg et al , 1995). Se han observado una gran variedad de daños
ocasionados por la radiación UV: dímeros de pirimidina, fotoproductos de
21
pirimidina-pirimidona, lesiones complejas en purinas, e hidratados de
pirimidinas, cruzamientos de ADN y rompimientos de cadena entre otros.
3.2.2 Pruebas In Vitro / In Vivo
Las pruebas de genotoxicidad se pueden realizar de dos maneras: utilizando
muestras biológicas recolectadas de organismos vivos y haciendo
exposiciones controladas en un laboratorio (in vitro) o haciendo una
exposición directa en un organismo vivo (in vivo). El primer tipo de prueba
tiene usos ilimitados ya que en un laboratorio se pueden realizar todo tipo de
pruebas variando gran cantidad de factores (Tice et al, 2000). En las
pruebas in vitro una muestra de tejido se obtiene de un animal y se expone a
la sustancia que se conoce o sospecha como agente genotóxico. Las
pruebas in vivo inician discusiones entre la comunidad científica ya que
algunos no están de acuerdo con la utilización de animales vivos para
investigación, sin embargo este tipo de examen se aproxima mas a las
condiciones reales de un organismo vivo.
En el ensayo de cometa ambas técnicas han sido ampliamente utilizadas.
Para pruebas in vitro se debe tener en cuenta que muchos agentes
genotóxicos necesitan de una activación metabólica, en este caso se puede
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utilizar S9 proveniente de hígado de ratas. Se debe tener cuidado especial
para evitar condiciones asociadas con citotoxicidad ya que se verían
reflejadas como resultados positivos falsos (Tice et al, 2000).
La consideración especial que se debe tener en cuenta al realizar el ensayo
del cometa en condiciones in vivo es que el investigador debe asegurarse de
que el agente genotóxico esté teniendo efectos directamente sobre el órgano
blanco y se debe evitar metodologías que causen daños en el ADN tales
como necrosis y apoptosis que den resultados positivos falsos.
3.3 GENERALIDADES DEL ENSAYO DEL COMETA
Desde su aparición en 1984, el ensayo del cometa o “single cell gel
electroforesis” (SCGE) ha sido ampliamente utilizado para el estudio de
daño y reparación de ADN. En el momento, existen tres protocolos básicos:
el primero desarrollado por Östling y Johanson en 1984, el segundo
presentado por Sing et al en 1988 y por último aquel presentado por Olive et
al en 1990 (Bauch et al, 1999). Anteriormente, daños causados por
rompimientos de cadena de ADN se podían cuantificar mediante protocolos
como la velocidad de sedimentación en gradiente de sacarosa, la elusión por
filtro y la electroforesis de campo pulsado; los resultados de estas pruebas
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mostraban el promedio de la respuesta de una gran cantidad de células ante
algún tratamiento determinado (Euclid Análysis).
Una de las grandes ventajas del ensayo del cometa es precisamente su
sensibilidad ya que estudia la respuesta de cada célula y por lo tanto se
puede medir la heterogeneidad dentro de una línea celular y distinguir
subpoblaciones (Alapetite, 1998). Otras ventajas del protocolo son: requiere
de muy poca muestra biológica, su habilidad de evaluar daño de ADN en
células que no están proliferando, se puede usar cualquier tipo de población
celular, su reproducibilidad, su simplicidad, su rapidez para obtención de
resultados, es altamente sensible a niveles de bajo daño de ADN, su
economía, su flexibilidad y confiabilidad (Alapetite, 1998; Bauch et al, 1999;
Rojas et al, 1999; Speit & Hartmann, 1999; Tice & Vazquez, 1998: Tice 2000,
Valverde et al, 1999).
Una de las contribuciones mas importantes del ensayo del cometa es su
utilidad en la evaluación de la actividad genotóxica de un químico (Tice et al,
2000) tanto en condiciones in vitro como in vivo. Dada la gran versatilidad
de este método se han podido realizar pruebas de genotoxicidad en varias
especies de animales y plantas; incluso en una gran variedad de poblaciones
celulares tanto normales como transformadas (Rojas et al, 1999). Como se
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mencionó anteriormente el hecho de que requiera de una muestra celular tan
pequeña hace que sea ideal para ensayos donde no se pueda obtener una
biopsia de tejido de gran tamaño. Cada vez se analiza la genotoxicidad de
una gran variedad de agentes químicos tales como metales, pesticidas,
opiatos, nitrosaminas, y drogas antineoplásicas entre otros con la ventaja de
que se pueden complementar estos estudios con la observación de cuales
son los tejidos mas afectados por cada químico (Rojas et al, 1999).
En el biomonitoreo ambiental también a tenido gran acogida el SCGE ya que
permite determinar el efecto de la polución y accidentes químicos entre
diversas especies propias de el lugar específico de estudio (Rojas et al,
1999). Nuevamente, se puede realizar estudios sobre el efecto tanto en
especies animales como vegetales.
En estudios de monitoreo humano ha sido de gran ayuda para observar
efectos en poblaciones ambientalmente y ocupacionalmente expuestos a
diversos agentes genotóxicos. Existen tres tipos de marcadores biológicos;
un marcador de exposición (el xenobiótico en sí), un marcador de
susceptibilidad (heredado o inducido) y un marcador de efecto donde puede
ser ampliamente utilizado el SCGE (Valverde et al, 1999) en etapas
tempranas. Estos estudios pueden ayudar a establecer normas y leyes de
25
seguridad en el trabajo y en el medio ambiente. También es de gran utilidad
para determinar los efectos de la vida cotidiana tales como el ejercicio, el
consumo de cigarrillo, las costumbres alimenticias, etc (Alapetite, 1998;
Valverde et al, 1999) donde se ha podido observar como varía la longitud de
la cola, sobretodo en linfocitos según los hábitos.
A escala clínica la utilidad del ensayo cometa es ilimitada. Cada individuo
presenta una sensibilidad propia al daño y reparación del ADN que puede
verse afectada por condiciones genéticas o inducidas. Se han asociado
cierto tipos de enfermedades hereditarias con aumentado riesgo a desarrollar
procesos cancerígenos ya sea por exposición a radiación UV o ionizante
(Alapetite, 1998) o agentes químicos (Rojas et al, 1999). Mediante pruebas
se podría determinar no solo el riesgo de una persona a desarrollar algún
tipo de cáncer sino el tratamiento terapéutico óptimo (tanto por quimioterapia
como por radioterapia) para su enfermedad. La capacidad de reparación del
ADN de un individuo puede ser determinada en menos de 48 horas
(Alapetite, 1998) de manera que es un método particularmente bueno para la
observación seguida de la respuesta de una persona ante algún tratamiento
(Rojas et al, 1999). Por ejemplo, el SCGE ha sido ampliamente utilizado
para el estudio de los efectos de la radiación ionizante y hoy en día se sabe
que la reparación total debe presentarse entre 2 horas (Alapetite, 1998) o 3
horas (Benitez-Bribiesca & Sánchez-Suárez, 1999) después de la exposición.
26
Aunque el SCGE sirva para observar la velocidad de reparación de ADN la
prueba no detecta la calidad de esa reparación (Alapetite, 1998), por lo tanto
para tener un conocimiento completo sobre la capacidad de reparación de un
individuo es necesario hacer mas pruebas.
En la actualidad el ensayo del cometa se puede llevar a cabo en tres
condiciones de acidez-alcalinidad distintas que permiten observar distintos
tipos de daño en el ADN. En condiciones neutras (solución de lisis y/o buffer
de electroforesis) se observan los rompimientos de doble cadena de ADN
(DSB), a pH 12.3 se pueden detectar rompimientos de cadena sencilla de
ADN (SSB), y a pH 13 o mayor se observan tanto SSB como sitios lábiles al
álcali (Rojas et al, 1999, Speit & Hartmann, 1999). En general, el protocolo
es parecido en las tres condiciones mencionadas anteriormente y sus
diferencias radican principalmente en las soluciones de lisis y en el
tratamiento previo a la electroforesis. Células individuales son embebidas en
gel de agarosa de bajo punto de fusión (LMA) sobre una lámina portaobjetos,
y colocadas en una solución de lisis que sirve como detergente durante 1
hora. Luego, las láminas se colocan en una cámara de electroforesis y en
condiciones frías se lleva a cabo la electroforesis donde los residuos y
fragmentos de ADN migran por efecto del campo eléctrico hacia el ánodo.
27
Una vez terminada la electroforesis las láminas son neutralizadas y secadas,
para su observación se utiliza un colorante flourocromado.
Cada paso del proceso tiene un objetivo específico y es importante que se
sigan los pasos metódicamente para asegurarse que los resultados
obtenidos sean de mayor confiabilidad y reproducibilidad (Tice et al, 2000).
Al hacer los geles se puede usar 3 métodos distintos(Tice et al, 2000): uno
donde el LMA con las células son colocados directamente sobre una lámina
esmerilada para dar soporte al gel, otro método donde la lámina inicialmente
es recubierta por una delgada capa de agarosa de punto de fusión normal,
se deja secar y luego se coloca el LMA con las células sobre él, por último
algunos investigadores prefieren colocar una última capa de LMA
únicamente sobre la anterior formando un “sanduche” que da mayor
protección a las células.
El propósito de la solución de lisis es la de lisar la membrana nuclear para
permitir la migración de los fragmentos de ADN. Es recomendado dejar la
solución de lisis 1 hora a 4ºC previo a la inmersión de las láminas para
asegurar la estabilidad de la agarosa (Bauch et al, 1999; Tice et al, 2000) y
en la medida de lo posible tratar de que el pH siempre sea el mismo (Bauch
et al, 1999).
28
Al someter las células a la corriente eléctrica, los fragmentos mas pequeños
ADN fraccionado migran mas rápido y se desprenden del núcleo lo que le da
la apariencia de cometa a la célula y de ahí el nombre de la prueba.
Cuando se está haciendo una prueba de genotoxicidad de alguna sustancia
química es importante utilizar un control positivo y uno negativo. Para el
control positivo es necesario utilizar una sustancia que sea conocida por
causar migración de ADN a una concentración determinada (Tice et al,
2000). También es indispensable hacer pruebas de citotoxicidad, aunque
hasta el momento no se ha establecido un porcentaje exacto de viabilidad es
aceptado que por debajo del 70%-80% ya no es confiable.
La lectura de las láminas presenta mayores debates entre los investigadores,
ya que no hay un acuerdo aceptado por todos de cuantas células se deben
observar por lámina y que aspecto se debe observar en las células. En los
últimos años se ha venido aceptando la lectura de 50 células por lámina
escogidas azarosamente (Miyamae et al, 1998; Speit & Hartmann, 1999;
Valverde et al, 1999,) sin embargo algunos recomiendan leer 100 (Tice &
Vazquez, 1998) y hasta 200 (Benitez-Bribiesca & Sánchez-Suárez, 1999)
células por lámina. Otro tema que ha generado gran debate es que
29
parámetro tener en cuenta al observar la célula para poder determinar el
grado del daño en el ADN. Existen, hasta el momento, 4 maneras de hacer
la evaluación (Speit & Hartmann, 1999; Tice et al, 2000):
a) Medir el porcentaje de células con cola y sin ella.
b) Calificación visual de la célula en 5 categorías. A con menor daño
hasta E con daño total (Anderson et al, 1994).
c) Medición de la longitud de la cola usando una escala calibrada
d) Medición del “momento” de cola (= longitud de la cola X cantidad de
ADN en la cola) (Olive et al, 1990)
El problema de basar el análisis en la longitud de la cola radica en que a
medida que aumenta la dosis, la longitud de la cola aumenta linealmente
hasta llegar a una meseta después de cierta dosis, en cambio al medir el
“momento” de la cola hay una tendencia lineal pero esta parece no tener
tendencia a formar una meseta (Kent et al, 1995). Otros estudios muestran
que en pruebas midiendo la variación interelectroforética y interexperimental
se observa menos variación entre los resultados donde se observa el
porcentaje de ADN en la cola (De Boeck et al, 2000) además tiene la ventaja
de que es un modo de clasificación sensible y mas rápido (Diem et al, 2002).
Muchos investigadores usan sistema de análisis de imágenes
computarizados que puede recolectar mas de un tipo de dato y hacer
conversiones a sistemas métricos, este es el método mas utilizado.
30
3.4 ENSAYO DEL COMETA NEUTRO
Desarrollado por Olive et al en 1990, la versión neutra del ensayo del cometa
es una prueba que nos permite observar los rompimientos y reparación de
DSB en el ADN. Cuando el protocolo se realiza en condiciones neutras, no
hay “unwinding” y denaturación de moléculas ADN; por lo tanto solo permite
la detección de DSB. Sin embargo, hay autores que no han evidenciado
diferencias en los resultados de la prueba al variar el pH de la solución de
lisis y el buffer de electroforesis (Bauch et al, 1999). Igualmente, el protocolo
neutro es aceptado como una prueba de determinación de DSB. La revisión
bibliográfica muestra que el ensayo cometa en condiciones neutras presenta
gran variedad en su protocolo; hay marcadas diferencias en las condiciones
bajo las cuales se lleva a cabo el protocolo tanto en la solución de lisis
utilizado, la temperatura a la cual se efectúan los distintos pasos, condiciones
de electroforesis incluso hay muchos autores que si utilizan un baño de
“unwinding” antes de la electroforesis. Esto posiblemente se deba a que la
visualización de DSB son mas difíciles de ver que los SSB por varios motivos
que se discutirán a continuación. Estas diferencias también contribuyen a
diferencias en la morfología de la cola del cometa entre una prueba alcalina y
neutra donde es mucho mas sólida (Klaude et al, 1996).
31
En primer lugar, la observación de los DSB mediante la utilización del ensayo
del cometa en su versión neutra está afectada por la fase mitótica en la que
se encuentra la célula (Olive & Banath, 1993). Durante la interfase de la
mitosis, se reconocen tres estadíos: G1, S y G2. Durante G1 la célula tiene
alta actividad metabólica, la gran mayaría de las células se encuentran en
este estadío, la célula esta entre una división mitótica y otra. Al comenzar
La fase S, la célula comienza la división celular, el primer paso siendo la
síntesis de ADN para la célula hija. Por último, en la fase G2, la célula ha
parado la síntesis de ADN y solo sintetiza moléculas necesarias para la
división celular. Estudios hechos por Olive han demostrado que durante la
fase S se observa dos a tres veces menos daño celular que durante las otras
dos fases de la interfase. Esta marcada diferencia se deba posiblemente a
diferencias en la estructura del ADN durante esta fase ya que la cantidad de
proteínas residuales que comúnmente afectan la migración siempre se
mantiene igual durante todas la etapas.
El mayor problema que se presenta durante la realización del ensayo del
cometa neutro es la interferencia de artefactos que no permite la migración
de los fragmentos de ADN. La gran mayaría de la interferencia viene por
parte de proteínas residuales pero la presencia de RNA también puede crear
artefactos (Rojas et al, 1999). Se puede observar la rigidez de estas uniones
32
cuando se realizan dos electroforesis seguidas, la segunda cambiando en
90° la dirección de la corriente (Klaude et al, 1996), de haber libertad de
movimiento los fragmentos de ADN migrarían formando un patrón parecido
a una “L” invertida. En condiciones neutras las colas no cambien su patrón
de migración al dar un giro de 90°.
Para reducir la interferencia de estas proteínas durante la electroforesis
muchos investigadores recomiendan el uso de Proteinasa-K en la solución
de lisis (Olive & Banath, 1993; Rojas et al, 1999). Otros, recomiendan hacer
un baño con buffer de electroforesis anterior, incluso recomiendan NO usar
PK ya que es posible que esta tenga residuos de nucleasa que afectarían el
nivel de daño en el ADN (Wojewódzka et al, 2002). A diferencia del ensayo
del cometa alcalino, las láminas son incubadas a altas temperaturas (40-
50°C) durante 4-5 horas según el protocolo Olive et al; pero este método
también es fuertemente criticado ya que aumenta el número de fragmentos
debido a rompimientos en sitios lábiles al calor (Wojewódzka et al, 2002) que
se podrían malinterpretar como DSB. También existen debates entre los
investigadores en la composición de la solución de lisis; algunos utilizan SDS
(Benitez-Bribiesca & Sánchez-Suárez, 1999; Fernandez et al, 2001; Rojas et
al, 1999;), otros DMSO y en un estudio realizado por Klaude & Hartmann
(1996) ninguno de los dos fue utilizado. La única variable constante es que
33
todos los investigadores coinciden en decir que la alta salinidad en la
solución de lisis contribuye a mayor migración de fragmentos.
El ensayo cometa neutro ha sido de gran utilidad para estudios de radiación
y químicos radiomiméticos (Rojas et al, 1999). Cuando se van a exponer
células a radiación es necesario que sea a dosis altas ya que los DSB son
25-50 veces menos frecuentes que SSB (Fernández et al, 2001). Se ha
observado que hay una tendencia lineal entre la dosis de radiación y la
longitud de la cola, pero esta línea alcanza una meseta a dosis elevadas
(Benitez-Bribiesca & Sánchez-Suárez1999; Olive et al, 1991). La razón por
la cual el ensayo cometa neutro tiene aplicaciones especiales en el estudio
del cancer es que es un protocolo perfecto para el estudio de daños
causados por radiación. La radiación causa daños por la producción de
radicales libres de oxigeno utilizado para tratamientos antineoplásicos; pero a
su vez puede causar mutagénesis y carcinogénesis (Benitez-Bribiesca &
Sánchez-Suárez, 1999). Cada vez se cuestiona mas la efectividad de la
radioterapia como tratamiento al cancer. Los estudios muestran que las
dosis de radiación utilizadas en el tratamiento contra el cancer no son lo
suficientemente altas como para generar apoptosis celular de las células
cancerosas, con el agravante de que si estimulan el crecimiento de mas
células con mutaciones (Benitez-Bribiesca & Sánchez-Suárez,1999).
34
La última modificación que se le ha practicado al ensayo cometa neutro es la
aplicación de DNA breakage detection-flourescence in situ hybridization
(DBD-FISH). La metodología consiste en realizar un ensayo del cometa
neutro y posteriormente el DBD-FISH; esta prueba permite la observación
simultánea de SSB y DSB. Para la estimación del daño se mide la
intensidad de flourescencia para indicar SSB y el área de superficie como
indicador de DSB (Fernández et al, 2001). Esta prueba es de gran utilidad
cuando la muestra es muy reducida y se deben estudiar ambos tipos de daño
ya que solo requiere pocos µl de muestra.
3.5 BLEOMICINA
La Bleomicina (BLM) es un antibiótico utilizado en tratamientos
antitumorales. Su actividad antitumoral se basa en su habilidad de introducir
diversos tipos de rompimientos de cadena en el ADN, tales como SSB y DSB
(Benitez-Bribiesca & Sánchez-Suárez, 1999). El mecanismo de acción sobre
el ADN tiene dos pasos importantes para causar los DSB. Inicialmente,
causa SSB en las bases pareadas G-C (mutational hot spots) y formación de
sitios apurínicos/apirimidínicos en el residuo C. Este se conoce como el sitio
primario de acción, el secundario se da sobre la cadena complementaria el
cual rara vez es una secuencia G-C y donde por lo general no hay tendencia
35
ha formación de SSB. Los daños en el sitio secundario solo ocurren en
presencia de daños en el sitio primario y no necesariamente se forman aún
en su presencia, el resultado final es un DSB. Para causar estos DSB la
BLM es activada dos veces sin separarse de la cadena de ADN; la primera
para causar los SSB, necesita de la activación con Fe para formar Fe(III)-
BLM; y la segunda para el clivaje en la cadena complementaria formando los
DSB (Charles & Povirk, 1998; Hoehn et al, 2001; Steighner & Povirk, 1990).
Los daños AP no conllevan a formación de DSB. (Steighner & Povirk, 1990;
Zhao, 2001).
La BLM es usado principalmente en pacientes con cancer testicular, linfomas
no Hodgkin y Hodgkin, y canceres de cabeza y cuello. Los pacientes
pueden sufrir efectos secundarios después del tratamiento tales como: fiebre
y escalofrío, irritaciones cutáneas, pérdida del apetito, úlceras y llagas en la
boca, nauseas, vómito, pérdida de cabello (USP DI, 1995). El efecto
secundario de mayor gravedad es la fibrosis pulmonar. No es claro porque la
BLM conlleva a esta condición, pero estudios han mostrado que 1-2% de los
pacientes tratados con esta droga mueren por esta causa. Se cree que la
BLM induce la producción de interleukinas por parte de macrófagos y esto
ocasiona un proceso inflamatorio que lleva a la fibrosis (Zhao, 2001).
36
La BLM ha sido ampliamente utilizada en estudios de genotoxicidad que
utilizan el ensayo del cometa. Esto se debe a que la BLM es un químico
radiomimético que induce a los mismos daños que la radiación ionizante.
Dado que tanto la radiación ionizante como la BLM son comúnmente
utilizados en tratamientos clínicos de pacientes con canceres, la mayoría de
los estudios tienen por objetivo hacer un monitoreo de su uso y posibles
implicaciones en los pacientes. En el ensayo del cometa su respuesta es
dependiente a la dosis (Benitez-Bribiesca & Sánchez-Suárez, 1999; Hoehn et
al, 2001; Diem et al, 2002) y no necesita el uso de altas concentraciones.
3.6 ETOPÓSIDO (VP16)
El etopósido (VP16) es otra droga antitumoral cuya acción primordial es la
inhibición de la topoisomerasa II que ocasiona la no-reparación de DSB
(Fleming et al, 1998) que llevan a la muerte apoptótica de células tumorales
(Facompre et al, 2000; Montecucco et al; 2001). La topoisomerasa II tiene
actividad ligasa, al ser inhibida los rompimientos ocasionados en el ADN no
pueden ser reparados. En estudios in vitro se observa mayor número de
DSB ocasionados por VP16 luego de una incubación durante 1 a 2 horas
(Long et al, 1985). Además, se ha demostrado que el VP16 promueve la
dispersión de proteínas necesarias para la replicación (Montecucco et al;
37
2001). La droga actúa principalmente en el estadío S y G2 del ciclo celular
inhibiendo la síntesis de ADN. El mecanismo por el cual el etopósido puede
llevar a la apoptosis celular no es tan claro (Kaufmann, 1998), se sabe que
hay tres pasos claves: el primero, los sitios de clivaje de ADN normales de la
replicación se vuelven rompimientos de cadena sin reparar; luego, la célula
se percata de estos daños y se activan señales de estrés en la célula que
impiden la terminación del ciclo celular; y por último se activan enzimas que
catalizan la cascada de muerte celular programada (apoptosis); sin embargo
hace falta la investigación detallada de cada uno de estos pasos para
conocer a fondo el potencial del VP16.
Esta droga no solo tiene efectos en el funcionamiento del ADN, estudios
recientes muestran que también ocasiona alteraciones en el potencial de
membrana de la mitocondria; a bajas dosis la aumenta, a altas dosis
ocasiona muerte una celular masiva (Facompre et al, 2000).
El VP16 es utilizado como agente neoplásico en tratamientos contra el
cancer testicular y cancer del pulmón. Los efectos secundarios del VP16
son: alteración temporal del funcionamiento de la médula ósea, pérdida de
cabello, nauseas y vómito, diarrea, pérdida del apetito, alteraciones
38
temporales en el gusto, úlceras en la boca, irritación en la piel, reacciones
alérgicas, insomnio, dolor de cabeza y confusión (USP DI).
Al igual que la BLM, el etopósido es una droga cuyos efectos genotóxicos
son estudiados utilizando el ensayo del cometa (Godard et al, 1999; Salti et
al, 2000). Además, es ampliamente en estudios de la inducción de DSB
ocasionados por inhibidores de la topoisomerasa II y su reparación (Salti et
al, 2000).
39
4 OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Establecer la metodología del ensayo del cometa en condiciones neutras de
potencial de hidrógeno (pH 7-8.5) para el monitoreo eficiente de rupturas de
cadena doble en el ADN y reparación de las mismas.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Elaborar una revisión bibliográfica que refleje el estado actual en cuanto a
la utilización del ensayo del cometa en condiciones de acidez-alcalinidad
neutras.
2. Realizar una comparación eficiente entre el más popular ensayo del
cometa en condiciones alcalinas frente al ensayo del cometa en condiciones
acido-básicas neutras.
40
3. Determinar las ventajas y desventajas eventuales de esta técnica frente a
la de uso mas popular en condiciones alcalinas.
4. Establecer las composiciones y modo de preparación de las soluciones
utilizadas en esta metodología.
5. Determinar las posibles dificultades técnicas y conceptuales relacionadas
con la metodología y discutirlas en un ámbito científico técnico.
6. Sentar las bases técnicas de una metodología de gran utilidad para
ensayos de genotoxicidad, propios de los proyectos del Laboratorio de
Genética Humana de la Universidad de los Andes.
7. Observar el daño hecho por agentes genotóxicos conocidos como VP16
(etopósido) y Bleomicina por medio de la comparación con controles
negativos (sangre sin exposición a tales agentes).
41
5 MATERIALES Y METODOS
Determinación de Concentraciónde Bleomicina
con DMSO sin DMSO
Solución de Lísis
NaOH Desenrollamientode ADN
en TBE 1X
Desproteinización
25 V25 mA
x3
5min
10min
15min
30min
70 V57 mA
Voltaje
Establecer Var iables
Aspectos Uniformesen la Bibliografía
Estandarización delEnsayo de Cometa Neutro
Revisión Bibliográfica
El diagrama de flujo anterior muestra los pasos principales que se siguieron
para estandarizar el protocolo del ensayo cometa neutro en el LGH. En
primer lugar, para establecer la metodología utilizada en este proyecto era
42
importante hacer una revisión bibliográfica completa para saber que pasos
seguir. Dado que la utilización de la BLM para el ensayo del cometa no se
había hecho anteriormente en el LGH, era necesario determinar como debía
ser su exposición a las células. La única manera de poder estandarizar un
protocolo tal como el ensayo del cometa neutro es el estudio de otras
investigaciones donde el protocolo ha sido utilizado. Para todas las pruebas
se utilizó sangre periférica de un solo donante.
5.1 DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIONES Y EXPOSICIÓN A BLM
Para determinar la concentración a la que se deben exponer las células al
agente genotóxico es necesario hacer pruebas de viabilidad a distintas
concentraciones. Las pruebas de viabilidad se realizan en linfocitos, no en
sangre total. Una vez determinada la concentración a la que se exponen las
células se determina el método de exposición.
5.1.1 Separación de Linfocitos
1. Se toma 5 ml de sangre en tubo Vacutainer con heparina (tapa verde) y
se le adiciona 5 ml de PBS en un tubo de centrífuga.
43
2. De la solución anterior se toman 5 ml y se colocan con mucho cuidado
sobre 3 ml de Ficoll-Hypaque en un tubo de centrífuga. Es muy
importante hacer este paso con mucho cuidado para no romper el
gradiente.
3. Se centrifuga a 1800 rpm durante 20 minutos.
4. Se retira el anillo de interfase (anillo blanco que contiene los linfocitos) y
se pasa a 1 ó 2 tubos eppendorf y se completa hasta 1 ml con PBS libre
de Ca y Mg.
5. Se centrífuga a 5000 rpm durante 3 minutos.
6. Se descarta el sobrenadante y se suspende el pellet con PBS libre de Ca
y Mg hasta 1 ml.
7. Nuevamente se centrífuga a 5000 rpm durante 3 min.
8. Se descarta el sobrenadante y se resuspende en PBS libre de Ca y Mg
hasta 1 ml. Se agita la muestra en el vortex.
9. Se realiza un conteo de viabilidad para asegurarse de la viabilidad de las
células por una parte y conocer la concentración de células.
5.1.2 Exposición a Distintas Concentraciones de BLM
A partir de la solución stock de BLM con concentración de 3000µg/ml se
prepararon soluciones de trabajo con concentraciones de 1000 µg/ml, 500
44
µg/ml, 300 µg/ml y 100 µg/ml. Estas soluciones fueron utilizadas para
obtener concentraciones finales entre 20-100 µg/ml. Al mezclar los linfocitos
con la BLM se debe agitar el tubo eppendorf en el vortex y dejar en
incubación a 37ºC durante 10 minutos. Nuevamente, se agita la muestra en
el vortex y se realiza un conteo de viabilidad.
5.1.3 Conteo de Viabilidad
1. Se hace una dilución de 1:10 de los linfocitos en azul de tripán (10 µl de
linfocitos y 90µl de azul de tripán). Se agita la muestra en el vortex.
2. Se hace el montaje en la cámara de Neubauer (aproximadamente 15µl
de la solución anterior).
3. Se hace el conteo de células en los cuatro cuadrantes externos (cada
uno con 16 cuadrantes de menor tamaño).
4. Para calcular el número de células se utiliza la siguiente formula:
# total de células X 10 (dilución) X 104
0.4
En el conteo de viabilidad se tiene en cuenta el porcentaje de células
muertas sobre el número total de células.
45
5.1.4 Exposición a BLM
La BLM utilizada fue suspendida en agua destilada estéril hasta obtener una
concentración inicial de 3 mg/ml (3000 µg/ml), esta fue diluida para dar
soluciones de trabajo con agua destilada estéril en alícuotas de 700 µg/ml.
Cada 30 µl de sangre son suspendidos en 1ml de RPMI en tubo Falcon para
centrífuga de 15 ml, a este se la agrega la BLM para obtener una
concentración final 70 µg/ml mediante una dilución de 1:10. Se incuba
durante 10 minutos a 37ºC. Inmediatamente se realiza un baño de hielo y
centrifugación a 4ºC durante 30 min. a 1500 rpm para inhibir la acción de la
droga. Se desecha el sobrenadante e inmediatamente se procede con el
montaje de los “sanduches”.
5.2 ESTANDARIZACIÓN DEL ENSAYO DEL COMETA NEUTRO
El ensayo del cometa neutro utiliza algunas soluciones y metodologías
iguales a las utilizadas por la versión alcalina que se lleva a cabo en el LGH.
A continuación solo se presentan aquellas exclusivas a la estandarización del
ensayo del cometa neutro; la elaboración de la solución de lisis de trabajo,
metodologías de desproteinización, y determinación de voltaje y tiempo de
voltaje. En el Anexo # 3 está el Protocolo final del ensayo del cometa neutro
46
donde se explica detalladamente cada paso y como elaborar todas las
soluciones.
5.2.1 Solución de Lisis de Trabajo
Para preparar 100 ml
Solución stock 89 ml
Agua destilada o DMSO 10 ml
Tritón X-100 1ml
La solución se coloca en jarros coplin y se refrigera por mínimo 60 minutos
antes de ser utilizado para almacenar las láminas con gel.
5.2.2 Desproteinización
Para eliminar proteínas que impiden la migración de fragmentos de ADN se
utilizaron dos metodologías; la primera donde previo a la electroforesis se
hace un baño alcalino y la segunda utiliza un baño en buffer de
electroforesis.
47
5.2.2.1 Utilización de NaOH para desproteinización
(Recomendado por Tice 2001 en comunicación directa)
1. Sacar las láminas de solución de lisis y lavar con TBE 1X durante 5 min.
Se repite 3 veces.
2. Dejar las laminas reposando en NaOH 0.5X durante 30 min.
3. Lavar las laminas con solución neutralizante durante 5 min.
4. Colocar las láminas en la cámara de electroforesis.
5.2.2.2 Utilización de buffer de electroforesis para desproteinización
(Recomendado por Rojas et al, 1999)
1. Sacar las láminas de solución de lisis y hacer un lavado con TBE 1X .
2. Dejar las laminas reposando en TBE 1X durante 60 min.
3. Colocar las láminas en la cámara de electroforesis.
5.2.3 Determinación de Voltaje y Tiempo de Electroforesis
1. Colocar la cámara de electroforesis con láminas en la nevera y debajo de
ésta poner hielo para mantener la temperatura constante.
48
2. Adicionar el buffer de electroforesis con cuidado hasta que las láminas
queden totalmente cubiertas.
3. Prender la fuente de poder y cuadrar al voltaje y amperaje deseado.
4. Dejar correr la electroforesis por tiempo deseado.
5. Apagar la fuente de poder, desconectar y retirar el buffer de
electroforesis. Sacar la cámara de la nevera.
6. Sacar las láminas con cuidado de la cámara y colocarlas en una bandeja.
7. Adicionar solución neutralizante durante 15 min.
8. Dejar secar las láminas, una vez secas sumergirlas en metanol y
nuevamente dejarlas secar a temperatura ambiente.
9. Guardar las laminas en incubadora a 30ºC para evitar que se hidraten.
Los voltajes y amperajes utilizados fueron de 25V, 25mA; y 70V, 57mA el
amperaje estaba determinado por la capacidad del buffer de electroforesis y
se mantuvo constante durante todos los ensayos. El tiempo de electroforesis
tiene relación directa con el voltaje; a menor voltaje mayor será el tiempo de
electroforesis. Las electroforesis que se hicieron a 25V tuvieron tiempos de
corrida de 15 y 30 minutos, las que se hicieron a 70V tuvieron tiempos de 30,
15, 10 y 5 minutos.
49
5.3 PRUEBAS ESTADÍSTICAS
Al observar las láminas se tuvieron en cuenta dos criterios: la morfología
según Anderson (ver Anexo # 1), y la longitud de la cola del cometa. En la
clasificación de Anderson, las células se dividen por la cantidad de ADN en
sus colas: A (sin daño) <%5, B (bajo daño) 5-20%, C (daño medio) 20-40%,
D (alto daño) 40-95%, y E (daño total) >95%. Para la lectura de la longitud
de las colas, se coloca la primera línea de la reglilla sobre el centro del
núcleo y se observa hasta que línea llega el último fragmento de ADN, luego
se hace la conversión a µm. En cada electroforesis se leyeron tres láminas
de cada control. Cada criterio se estudio por aparte, pero a los dos se les
realizaron las mismas pruebas. Inicialmente se realizó una prueba de
normalidad de Shapiro-Wilk para determinación de distribución normal. Para
determinar la homogeneidad de las réplicas (cada lámina) dentro y entre los
tratamientos (cada electroforesis) se realizó una prueba de Kruskal-Wallis de
una vía y comparación de los rangos medios. Utilizando el programa Statistix
7. El diagrama de flujo muestra las pruebas estadísticas empleadas.
50
Morfología
Prueba de Homogeneidadde láminas de B LM
en cada E lec trof oresis
Prueba de Homogeneidadde láminas de V P16
en cada Elec trofores is
P rueba de Homogeneidadde lám inas de controlen cada Elect rofores is
Prueba de Homogeneidadde láminas de B LM
ent re Electroforesis I , I I, y II I
Prueba de Homogeneidadde láminas de V P16
ent re E lec troforesis I, I I, y III
P rueba de Homogeneidadde lám inas de control
entre El ec trof ores is I, I I, y I II
Prueba de Homogeneidadentre controles pos itivos
y negativos
P rueba de Homogeneidadde l ám inas de BLM
en cada Elect roforesi s
Prueba de Hom ogeneidadde láminas de VP16en cada E lectroforesis
Prueba de Homogeneidadde láminas de cont rolen cada E lec trof oresis
Prueba de Hom ogeneidadentre controles posit ivos
y negativos para cadaEl ec trof ores is
Longit ud de Cola
Est ablecerVariables de Salida
51
6 RESULTADOS
6.1 PRUEBAS DE VIABILIDAD PARA LA EXPOSICIÓN A BLEOMICINA
Para determinar la exposición de la muestra a Bleomicina era necesario
determinar la concentración de BLM que se iba a utilizar y el tiempo de
exposición. Una prueba preliminar fue hecha usando tres concentraciones:
30µg/ml, 50 µg/ml, 100µg/ml durante dos tiempos, 10 y 20 minutos, los
resultados se muestran en la Tabla # 1.
Tabla # 1: Porcentaje de mortalidad de linfocitos expuestos a BLM 30µg/ml 50µg/ml 100µg/ml
10 minutos 31.5% 14.5% 32%
20 minutos 9.8% 31% 33%
La mortalidad inicial era de 13.5%, una proporción elevada que reflejaba mal
manejo de la muestra, posiblemente debido al tratamiento utilizado durante la
separación de linfocitos. La mortalidad de los linfocitos expuestos a 30µg/ml
de BLM durante 10 y 20 minutos muestran que ahí también existe un error
52
grande en el experimento. Sin embargo, se pudo determinar que la
exposición durante 20 minutos causaba alta mortalidad en las células, se
decidió que para la siguiente prueba de viabilidad las células se expondrían
solo durante 10 minutos.
En la segunda prueba de viabilidad, se utilizaron concentraciones de
20µg/ml, 30µg/ml, 40µg/ml, 60µg/ml, 70µg/ml, y 80µg/ml, los resultados se
observan en la Tabla # 2.
Tabla # 2: Porcentaje de mortalidad de linfocitos expuestos a BLM durante 10 minutos 20 µg/ml 30 µg/ml 40 µg/ml 60 µg/ml 70 µg/ml 80 µg/ml
5.22% 4.75% 7.27% 9.31% 13.1% 18.81%
La mortalidad inicial era de 3.89%, indicando que la separación de linfocitos
se había hecho de manera correcta y por lo tanto los resultados de esta
prueba eran mucho mas confiables que la primera. Según la literatura, a
mayores concentraciones de BLM aumentarán los DSB, se optó por utilizar
concentraciones de 70µg/ml, ya que esta es la mayor concentración posible
sin que haya una alta mortalidad. Aunque es preferible que la mortalidad no
sea mayor al 20%, usar concentraciones de 80µg/ml era muy cercano a este
valor.
53
En la gráfica # 1 se observa como la mortalidad aumenta exponencialmente
con el aumento de la concentración de BLM.
Pruebas de Viabilidad
0.00%
4.00%
8.00%
12.00%
16.00%
20.00%
20 40 60 80Concentración BLM (µg/ml)
Porc
enta
je d
e M
orta
lidad
Gráfica # 1: Mortalidad de linfocitos expuestos a BLM es dosis dependiente.
6.2 SOLUCIÓN DE LISIS
Se utilizaron dos soluciones de lisis durante el experimento, su diferencia era
la utilización de DMSO en una y la otra no. Se realizaron 14 experimentos
utilizando DMSO y 21 experimentos con agua destilada en vez de DMSO. Al
observar las láminas tratadas con DMSO en su solución de lisis se observó
54
un muy alto daño en el ADN celular; incluso las láminas que no habían sido
expuestas a agentes tóxicos presentaban una alta mortalidad (Figura # 1).
Figura # 1: Célula puesta en solución de lisis con DMSO. Morfología “E” (daño total)
Por otro lado, las láminas que no estuvieron expuestas a DMSO durante lisis
tenían mucha mayor viabilidad. Los controles negativos (sin exposición a
agentes tóxicos) tenían daño moderado en su ADN propio de la
manipulación de las células. Por esta razón, para el protocolo final no se
utilizó DMSO en la solución de lisis.
55
6.3 ELIMINACIÓN DE PROTEÍNAS RESIDUALES
El mayor problema del ensayo cometa neutro es la interferencia de
proteínas que no permiten la migración del ADN al ser expuesto a una
corriente eléctrica. Se llevaron a cabo 8 experimentos usando la misma
metodología sin tratamiento previo a la electroforesis, al observar las láminas
al microscopio no se observaba migración del ADN fracturado, este
permanecía adherido al núcleo dando la apariencia de un “sol”. Dos
métodos fueron utilizados para eliminar estas proteínas; el primero haciendo
baños con TBE 1X, seguido por un baño en NaOH, el segundo haciendo un
baño prolongado en TBE 1X.
Inicialmente, después de la primera electroforesis usando la metodología de
NaOH se pudo observar una pequeña migración de los fragmentos de ADN.
El tiempo de duración de la electroforesis fue de 15 minutos razón por la cual
se decidió aumentar el tiempo de electroforesis para las siguientes pruebas.
Se realizaron 17 experimentos mas, donde se aumentó el tiempo de
electroforesis a 30 minutos, sin embargo, aunque había migración de
fragmentos de ADN se observaba que todavía había fragmentos adheridos al
núcleo y las células presentaban una morfología intermedia entre “soles” y
56
“cometas” (Figura # 2). Esporádicamente se encontraban células con
morfología de cometa, pero no sumaban 50 células por lámina.
Según la bibliografía, para la desproteinización usando TBE1X, era necesario
un baño prolongado de 1 hora hasta 16 horas. En un principio se hicieron
dos experimentos para determinar el tiempo de baño, unas láminas se
dejaron sumergidas durante 1 hora, mientras que las otras estuvieron 8
horas. Al observar al microscopio, los dos tratamientos probaron ser
efectivos ya que todas las células presentaban gran migración de ADN en
forma de “cometa”. Dada la economía en el tiempo se decidió dejar las
láminas sumergidas durante 1 hora para el protocolo final.
Figura # 2: Célula bañada con NaOH anterior a la electroforesis presenta mala migración del ADN.
57
6.4 TIEMPO Y VOLTAJE DE LA ELECTROFORESIS
Los tiempos de electroforesis son dependientes del voltaje utilizado durante
el corrido. A mayores voltajes, menor será el tiempo de electroforesis
necesitado. Las primeras 10 electroforesis fueron hechas a 25 volts y 25 mA
durante 15 minutos, pero no se podía determinar si estos valores eran los
ideales ya que las células no presentaban migración de ADN debido a la
interferencia de proteínas. Las 16 electroforesis siguientes se hicieron
utilizando el mismo voltaje y amperaje, pero aumentando el tiempo al doble,
30 minutos, pero en el microscopio no se observaba una buena migración del
ADN (Figura # 3). Por esta razón se aumentó el voltaje hasta 70 (aprox.
2V/cm) y 57mAmp. Las primeras 2 electroforesis tuvieron un tiempo de
corrida de 30 minutos, al observar al microscopio en un aumento de 40X las
longitudes de la cola del comenta eran tan grandes que salían del campo
visual. Se hicieron, entonces, electroforesis con un periodo de duración de
22, 15, 10 y 5 minutos. Aunque con un tiempo de electroforesis de 5 minutos
se observaron longitudes de cola bastantes elevados ya era posible su
lectura con un aumento de 40X (Figura # 4).
58
Figura # 3: Electroforesis llevada a cabo con 25V y 25 mA, no presenta buena migración de ADN.
Figura # 4: Célula con morfología “D” (alto daño), presenta buena migración. La célula tuvo un baño en TBE 1X previa a la electroforesis que se llevo a cabo con 70V y 57mA.
El protocolo final del ensayo del cometa neutro se observa en el Anexo # 2.
En el se utiliza una solución de lisis de trabajo sin DMSO, para la
desproteinización se sumergen las láminas en buffer de electroforesis
durante una hora antes de la electroforesis que se realiza a 70V y 57 mA
durante 5 minutos. En la tabla # 3 se observan las principales diferencias
59
entre los protocolos del ensayo del cometa alcalino y neutro que se practican
en el Laboratorio de Genética Humana.
Tabla # 3: Diferencias en los protocolos para el ensayo del cometa neutro y alcalino utilizados en el Laboratorio de Genética Humana de la Universidad de los Andes. Ensayo cometa alcalino
LGH
Ensayo Cometa
Neutro
Solución de lisis 10% DMSO Sin DMSO
Voltaje/ Amperaje 25V/300mAmp 70V/57mAmp
Tiempo “unwinding” 30 minutos 60 minutos
Lugar “unwinding” Cámara de electroforesis Bandeja
Tiempo electroforesis 30 minutos 5 minutos
6.5 LECTURA DE LAS LÁMINAS
Una vez determinado el protocolo a seguir para la observación de DSB
mediante el ensayo cometa neutro, se realizaron tres electroforesis para
establecer su estandarización. En cada electroforesis, se utilizó un control
negativo (sangre sin exposición a agente genotóxico), y dos controles
positivos (sangre expuesta a agentes genotóxicos conocidos: VP16 y BLM).
De cada control se leyeron tres láminas. Para la lectura de las láminas se
tuvieron en cuenta dos criterios, la morfología de la célula según los
60
parámetros de Anderson, y la longitud de la cola del cometa medido con la
reglilla del ocular del microscopio de fluorescencia Ziess PHOMI 3 con filtro
BP546.
A cada lámina se le realizó una prueba de normalidad de Shapiro-Wilk para
determinación de distribución normal para determinar el uso de pruebas
paramétricas o no-paramétricas. Las pruebas mostraron que los datos, tanto
para morfología como longitud de la cola del cometa, no presentaban
distribución normal al ser su P menor a 0.05. Por lo tanto todas las pruebas
estadísticas realizadas fueron hechas usando la prueba no-paramétrica de
Kruskall-Wallis de 1 factor (ver Tabla # 4).
6.5.1 Análisis de Morfología
Para todas las electroforesis se observó que las láminas de un mismo
tratamiento eran homogéneas (Tabla # 4), por lo tanto los datos de las tres
láminas se podían unir para manejarlas como un mismo tratamiento. De
esta manera se juntaron todos los datos de Control negativo, VP16 y BLM
para determinar si los tratamientos eran homogéneos para las tres
electroforesis. Esta prueba también mostró que los datos eran homogéneos
(Tabla # 5), por lo tanto ya se juntaron todos los datos para cada control y así
61
determinar si existían diferencias significativas entre los dos controles
positivos (VP16 y BLM) y el control negativo.
Tabla # 4: Valores H de la prueba Kruskall-Wallis para determinar homogeneidad de láminas dentro de cada electroforesis. Al ser el valor de H calculado mayor al H teórico = 5.991 (α = 0.05, 3g.l) se rechaza la Ho: el daño observado en las células es igual en las tres láminas.
Morfología Longitud de Colas
BLM 1.7562 1.9926
Control (-) 4.0119 14.3829 Electroforesis I
VP16 0.5289 2.6536
BLM 0.6195 0.1152
Control (-) 0.8134 1.3795 Electroforesis II
VP16 1.3244 22.9949
BLM 0.0667 0.0253
Control (-) 0.5384 6.7490 Electroforesis III
VP16 0.7385 2.3500
Tabla # 5: Valores H de la prueba Kruskall-Wallis para determinar homogeneidad de las láminas entre las tres electroforesis. Al ser el valor de H calculado mayor al teórico =5.991 (α = 0.05, 3g.l) se rechaza la Ho: el daño observado en las células es igual en las nueve láminas.
H calculado
BLM 4.9008
Control (-) 5.2744
VP16 3.2787
62
Al realizar estas pruebas se pudo determinar que existían diferencias
estadísticamente significativas entre ambos controles positivos y el control
negativo (Tabla # 6 y Gráfica # 2). Para los dos casos, el control negativo
presenta un promedio de daño muy inferior al daño encontrado en los
controles positivos (Tabla # 7).
Tabla # 6: Valores H de la prueba Kruskall-Wallis para determinar homogeneidad del daño observado en los tres controles. Al ser el valor de H calculado mayor al teórico =3.841 (α = 0.05, 2g.l) se rechaza la Ho: el daño observado en las células es igual en los tres controles.
H calculado
BLM vs. Control (-) 509.3853
VP16 vs. Control (-) 509.3857
Tabla # 7: Porcentaje de células en cada grupo según clasificación morfológica de Anderson (1994).
Morfología BLM SUERO VP16
A 0 0 0
B 0 2.67 0
C 0 77.33 0.22
D 76.44 15.11 71.56
E 23.56 4.89 28.22
63
Gráfica # 2: Promedio del daño, según parámetro morfológico de Anderson, en células expuestas a agentes genotóxicos (BLM, VP16) y el control negativo (Suero).
6.5.2 Análisis de Longitud de la Cola del Cometa
Nuevamente, se realizó una prueba de homogeneidad entre las tres láminas
de cada tratamiento ara cada electroforesis. Los resultados se observan en
la Tabla # 4. La prueba demuestra que existen diferencias significativas
entre las tres láminas observadas del control negativo para la primera y
tercera electroforesis, al igual que entre las tres láminas de VP16 de la
segunda electroforesis. Al comparar los valores del rango medio para cada
lámina se puede determinar cuales láminas son homogéneas entre sí, los
resultados se observan en la Tabla # 8.
64
Tabla # 8: Comparación de los valores del rango medio para determinar homogeneidad entre las tres láminas de cada tratamiento en cada electroforesis. Los números corresponden a las láminas homogéneas entre sí.
Control Negativo VP16 BLM
Electroforesis I 1,3 1,2,3 1,2,3
Electroforesis II 1,2,3 1,2 1,2,3
Electroforesis III 2,3 / 1,3 1,2,3 1,2,3
Dado que no todas las láminas muestran homogeneidad, es decir, existen
diferencias estadísticamente significativas entre las réplicas, no es posible
unir los resultados de las tres electroforesis para determinar diferencias entre
los tratamientos. Se determinó las diferencias entre los tratamientos para
cada electroforesis (Tabla # 9). Para la Electroforesis I, se analizaron los
datos de la lámina 1 y 3 (ya que estas no presentan diferencias
significativas), para la Electroforesis II se analizaron los datos de las láminas
1 y 2, y para la Electroforesis III se analizaron los datos de las láminas 2 y 3.
Tabla # 9: Valores H de la prueba Kruskall-Wallis para determinar homogeneidad del largo de la cola observado en los tres controles en cada electroforesis. Al ser el valor de H calculado mayor al teórico =3.841 (α = 0.05, 2g.l) se rechaza la Ho: el daño observado en las células es igual en los tres controles. Electroforesis I Electroforesis II Electroforesis III
BLM vs. Control (-) 126.9590 86.2456 72.4431
VP16 vs. Control (-) 121.3378 64.4940 69.5199
65
En cada electroforesis se pudo observar que existían diferencias
estadísticamente significativas entre los dos controles positivos y el control
negativo. Nuevamente, se observa que el daño en las células expuestas a
agentes genotóxicos es mucho mayor que el encontrado en las células sin
exposición (Gráficas # 3, 4, 5). En cada gráfica se puede observar una caja y
dos líneas verticales; la caja representa la mitad central de los datos, la línea
horizontal muestra la media. Cada línea vertical muestra el rango “típico” de
los datos, los valores extremos están representados por * y °.
Gráfica # 3: Valores medios de la longitud de la cola de los tres controles (BLM y VP16 son positivos, y suero negativo) en la primera electroforesis.
66
Gráfica # 4: Valores medios de la longitud de la cola de los tres controles (BLM y VP16 son positivos, y suero negativo) en la segunda electroforesis.
Gráfica # 5: Valores medios de la longitud de la cola de los tres controles (BLM y VP16 son positivos, y suero negativo) en la tercera electroforesis.
67
7 DISCUSIÓN
7.1 PRUEBAS DE VIABILIDAD PARA LA EXPOSICIÓN A BLEOMICINA
Resulta evidente que la primera prueba de viabilidad realizada no era
confiable ya que la muerte celular inicial era del 13.5%. Las pruebas de
viabilidad deben realizarse sobre linfocitos y no sangre total por su lectura en
las cámaras de Neubauer ya que los glóbulos rojos al ser tan numerosos
interfieren con la lectura apropiada. Desafortunadamente, la separación de
linfocitos sobre sangre total es un proceso delicado ya que las células son
vulnerables a cualquier agente. Es muy probable que la mortalidad tan alta
que se obtuvo inicialmente se deba al manejo incorrecto de la muestra por
parte del investigador. El porcentaje de mortalidad inicial no es el único que
parece incorrecto; el porcentaje de mortalidad al exponer las células a
30µg/ml durante 10 minutos también es muy alto, mientras que la mortalidad
a esa misma concentración pero con el doble tiempo de exposición es muy
bajito, incluso menor que la mortalidad inicial.
68
La decisión de utilizar una concentración de 70ug/ml parece correcta ya que
permite la observación de daño a las células sin aumentar mucho el
porcentaje de mortalidad lo cual es importante al realizar el ensayo del
cometa. Como en cualquier experimento donde se trabaje con muestras
biológicas in vitro existe un alto riesgo de causar daños, en el ensayo del
cometa las muestras tienen bastante manipulación por lo tanto se le puede
hacer gran daño a las células. Por esta razón, no es aconsejable trabajar
con muestras que tengan una mortalidad mayor al 20% (Tice et al, 2000).
Otros investigadores (Benitez-Bribiesca & Sánchez-Suárez, 1999) han
trabajado con concentraciones de BLM, de 300µg/ml – 600 µg/ml, ya que a
esas concentraciones elevadas han observado un incremento del doble en la
cantidad de DSB, pero reportan que la viabilidad se disminuye al 50% y la
observación al microscopio muestra gran número de células necrosadas.
Una mortalidad así de elevada no dará resultados confiables, si se tiene en
cuenta que experimentos previos han mostrado que utilizando
concentraciones tan bajas como 10µg/ml se pueden observar daños (Item &
Burkatt, 1995), y la gran mayoría de los investigadores usan rangos entre
30µg/ml – 70µg/ml (Jaloszynski et al, 1997; Miyamae et al, 1998; Östling &
Johanson, 1987), parece contraproducente utilizar concentraciones tan
elevadas con el fin de asegurar mayor número de DSB, corriendo el riesgo
de invalidar una prueba.
69
7.2 SOLUCIÓN DE LISIS
Es evidente que la utilización del DMSO para la solución de lisis causó daño
y muerte celular en las múltiples pruebas llevadas a cabo. Aunque la gran
mayoría de investigadores (Klaude et al, 1996; Miyamae et al, 1998; Rojas et
al, 1999; Speit & Hartmann, 1999; Tice & Vazquez, 1998; Valverde et al,
1999) utiliza DMSO en su solución de lisis, existen otros autores que no lo
recomiendan para el ensayo del cometa neutro (Bauch et al, 1999; Benitez-
Bribiesca & Sánchez-Suárez, 1999; Olive et al, 1991) por su alta toxicidad,
ellos generalmente lo reemplazan por SDS. Sin embargo, hay
investigadores (Wojewódzka et al, 2002) que trabajan con DMSO aún en el
ensayo del cometa neutro. Igualmente, el propósito del DMSO en la solución
de lisis es la de minimizar los daños que puedan causar los iones de hierro
liberados por la hemoglobina (Tice & Vazquez, 1998), y para todos los
experimentos llevados a cabo, las láminas no permanecían en solución de
lisis por mas de dos días máximo, generalmente no mas de uno.
Es difícil determinar si el DMSO debe ser utilizado o no para el ensayo del
cometa, durante la estandarización de este protocolo su uso resultó en daños
elevados a las células, en las láminas se observaba gran número de células
necrosadas; pero, cuando se usa la misma solución de lisis para el ensayo
cometa alcalino (misma muestra y mismas condiciones antes de la
70
electroforesis) no se observa tanto daño en las láminas basales. Esta
interrogante sigue sin responderse.
Una vez determinado el protocolo para el ensayo del cometa neutro, se
hicieron unas electroforesis para determinar que la prueba fuera
reproducible. Durante estas electroforesis se observó un daño casi total en
todas las células. Para poder determinar la fuente de la mortalidad celular se
repitieron las electroforesis cambiando una variable a la vez; se prepararon
soluciones nuevas (TBE, agarosa LMP, PBS libre de Ca y Mg, buffer
neutralizante y solución de lísis stock). Finalmente, cuando se utilizó la
solución de lisis nueva, los resultados mostraron que era esta la que estaba
causando la alta mortalidad ya que el daño celular disminuyó
considerablemente tanto en el control negativo como en los positivos. La
solución stock inicial que había causado la alta mortalidad se había
preparado según el protocolo, la única explicación que se le pudo dar a la
causa del problema era que los reactivos utilizados debían estar vencidos.
La solución de lisis nueva se preparó a partir de reactivos nuevos y no se
volvieron a presentar problemas. Esto muestra la alta sensibilidad de las
células a la solución de lisis, y lo cuidadoso que se debe ser en su
preparación. Tampoco es recomendable dejar las láminas sumergidas en
ella por periodos prolongados.
71
7.3 ELIMINACIÓN DE PROTEÍNAS RESIDUALES
El mayor problema para la estandarización del ensayo del cometa neutro fue
la no-migración de los fragmentos de ADN debido a la interferencia de las
proteínas. Aunque se dice que el ensayo del cometa neutro no necesita un
tiempo de “unwinding”, este resultó ser el mejor método para que el ADN
fracturado pudiera liberarse de proteínas asociadas al ADN que no permite
su migración.
Investigadores (Bauch et al, 1999; Fernández et al, 2001) han obtenido
cometas en condiciones neutras simplemente haciendo lavados en el buffer
de electroforesis previos a la electroforesis. Tice recomienda que si los
lavados no son suficientes, se debe hacer un baño en condiciones alcalinas
ya que esto ayudará a desnaturalizar las proteínas. El baño alcalino si
mejoró la migración de los fragmentos de ADN, pero no de la manera
esperada. En todas las electroforesis utilizando este protocolo se empleó
NaOH 0.5X, excepto en dos donde la concentración era 1X. El aumento de
la concentración no ayudó a la migración. El tiempo del baño siempre fue de
media hora, ya que la exposición durante mas tiempo podía ser perjudicial
para las células. Aunque esta metodología no era eficiente para la
liberación de proteínas, se observó que al comparar las láminas sumergidas
72
en NaOH y aquellas sin sumergir el “ruido”de fondo era mucho menor.
Aquellas tratadas con NaOH presentaban un fondo mas negro, la agarosa no
interfería en la observación de la célula; mientras que en las lámina sin
tratamiento con NaOH uno observaba mas interferencia en el gel de
agarosa. Posiblemente se debe a que durante lisis bastantes proteínas son
liberadas de la célula y estas se adhieren a la agarosa y durante el baño en
NaOH son fácilmente desnaturalizadas.
Sin duda alguna, el protocolo del ensayo del cometa neutro presentado aquí
necesita de un tiempo de “unwinding”. Esto concuerda con la literatura
(Bauch et al, 1999; Benitez-Bribiesca & Sánchez-Suárez, 1999; Fernández et
al, 2001; Rojas et al, 1999; Wojewódzka et al, 2002) donde los baños en
buffer de electroforesis duran de 1 hasta 16 horas. Todos los autores
concuerdan en decir que este tiempo es necesario para liberar fragmentos de
ADN de proteínas asociadas. Este protocolo también presenta la ventaja de
que los resultados mostraron que con 1 hora de baño es suficiente para
obtener una buena migración; mientras que con el protocolo utilizando el
baño de NaOH, el tratamiento antes de la electroforesis dura 50 minutos el
investigador debe estar lavando las láminas mas seguido lo cual en últimas
resulta en un tiempo mas prolongado y además no permite que se puedan
llevar a cabo mas de un experimento a la vez. A diferencia del ensayo del
73
cometa alcalino, el baño en buffer de electroforesis no se hace en la misma
cámara de electroforesis, antes de colocar las láminas sobre la cámara es
necesario dejar que el buffer escurra un poco.
Al observar las láminas en el microscopio, las células presentan una
morfología típica de cometa, ya no se observan fragmentos unidos al núcleo.
Como se mencionó anteriormente, la única desventaja de esta metodología
es que el gel presenta un poco de ruido, pero no lo suficiente como para
interferir en la lectura de la lámina.
7.4 TIEMPO Y VOLTAJE DE LA ELECTROFORESIS
La corriente eléctrica tiene un efecto directo sobre la migración del ADN,
entre mayor sea la corriente y el tiempo, mayor migración se podrá observar.
Al utilizar 25 V para la electroforesis se pudo observar que el tiempo de
corrido no influía mucho sobre la migración de las colas. Este voltaje se
utilizó en los dos protocolos empleados para la remoción de proteínas, en
ambos casos la longitud de cola era muy corta. En las pruebas en las que
se lavaron las láminas en buffer TBE 1X durante 1 y 8 horas se podía
observar que los fragmentos de ADN no estaban adheridos al núcleo y sin
embargo, la migración era deficiente semejando una “nube” y no un cometa.
74
En las electroforesis donde el voltaje era de 70V la migración de cola
mejoraba significativamente. Incluso, en las láminas tratadas con NaOH
para la remoción de proteínas, los fragmentos migraban mucho mas. En
estas láminas, las colas de los cometas tenían una morfología distinta a las
demás cometas observadas porque los fragmentos no se distribuían
homogéneamente detrás del núcleo, sino que son mucho mas delgadas. Los
fragmentos estaban todos muy cercanos a la línea media, como se describen
en el estudio realizado por Klaude et al (1996).
Aunque la morfología de estos cometas era buena, se seguía observando
demasiados fragmentos cercanos al núcleo significando que todavía no se
habían logrado separar de las proteínas residuales. Por esta razón, este
protocolo no se continuo utilizando. Una vez mas queda en evidencia que el
factor mas importante para el ensayo cometa neutro es la liberación de
proteínas ya que ellas son las que tienen mayor influencia en la migración del
ADN.
75
7.5 DIFERENCIA ENTRE ENSAYO DEL COMETA ALCALINO Y NEUTRO
En un comienzo parecía que hubiera grandes diferencias entre un protocolo
y el otro, pero al comparar con la literatura, se puede concluir que las
diferencias no son tan marcadas. Si se compara el protocolo estandarizado
para el ensayo del cometa neutro con el protocolo de ensayo del cometa
alcalino empleado en el LGH, inmediatamente se observa que las grandes
diferencias, aparte del pH del buffer de electroforesis, son la solución de lisis
de trabajo, el voltaje y amperaje de corrido, y el tiempo de “unwinding” y
electroforesis (ver Tabla # 3).
La mayor variación entre protocolos se encuentra durante la electroforesis
(Rojas et al, 1999), los voltajes utilizados van desde 0.5 – 5 V/cm, los
tiempos de electroforesis van desde 2 – 60 minutos, existen protocolos con
DMSO, SDS o ninguno de los dos; todas estas variaciones se presentan
tanto en protocolos para ensayos neutros como alcalinos. Las únicas
diferencia marcadas son en el tiempo de “unwinding”, para el cometa alcalino
los tiempos varían de 20 – 60 minutos, mientras que en el cometa neutro la
variación es de 0 – 16 horas; y la temperatura a la que se realizan las
pruebas ya que en la mayoría de los protocolos para el cometa neutro se
usan altas temperaturas para la lisis y temperaturas ambiente para la
76
electroforesis, mientras que el cometa alcalino se usan bajas temperaturas
(4°C) para todos los pasos.
Para la estandarización de este protocolo se usaron varios protocolos de
diversos laboratorios; al leer la literatura es común ver que casi ningún
laboratorio utiliza exactamente el mismo que otro. Todos los protocolos son
modificaciones de los tres protocolos básicos desarrollados por Östling y
Johanson, Sing et al y por Olive et al.
La importancia del ensayo cometa en su versión neutra es que es una
metodología que permite un estudio específico sobre los DSB, mientras que
la versión alcalina es un estudio que nos permite observar mayor diversidad
de daños en el ADN.
7.6 LECTURA DE LAS LÁMINAS
Los dos parámetros utilizados para la lectura de las láminas mostraron que,
como era esperado, hay diferencias significativas entre controles positivos y
negativos. Esto demuestra la sensibilidad de la prueba para detectar daños
en el ADN de cada célula utilizando una prueba rápida y efectiva. La gran
interrogante sigue siendo cual de los parámetros es mas efectivo y
77
reproducible que el otro. Al analizar las pruebas estadísticas es claro que el
análisis de la morfología parece ser mas homogéneo y reproducible que el
análisis de la longitud de la cola. Mientras que todas las réplicas para cada
tratamiento se podían unir al comparar la morfología (dentro y entre las
electroforesis), las réplicas de un mismo tratamiento (dentro de la
electroforesis) no siempre eran homogéneas al considerar la longitud de la
cola. Esto se debe a la gran variación en la medida de la longitud de la cola,
el error interno de cada réplica es significativamente elevado. Esta longitud
no solo varía de una electroforesis a otra, sino dentro de una misma lámina.
La migración de la cola puede verse afectada por el tamaño de los
fragmentos de ADN, por la cantidad de fragmentos, y por la corriente
eléctrica a la cual es sometida.
Dado que todas las réplicas de una electroforesis reciben el mismo
tratamiento, y la acción de la droga no tiene porque variar, uno no esperaría
encontrar diferencia en la cantidad y tamaño de los fragmentos de ADN si las
réplicas se hicieron con el mismo individuo y bajo las mismas condiciones.
La otra fuente de cambio sería en la corriente eléctrica, esto es posible si la
corriente no es homogénea dentro de la cámara. Para determinar si esta era
la causa de las diferencias se observó la posición de la lámina dentro de la
cámara durante la electroforesis.
78
Las láminas que no eran homogéneas con las demás réplicas mostraban
medias de migración mas elevadas. A continuación (Figura # 5) se muestra
la posición de las láminas dentro de la cámara de electroforesis.
S1 (III)
V3 (II)
S2 (I)
(+) (-) Figura # 5: Disposición de láminas en la cámara de electroforesis.
Dos de las láminas que mostraron diferencias significativas están situadas en
la misma columna (S1 III y V3 II), la tercera lámina (S2 I) está en otra
columna y en una fila bastante alejada. Es posible que la corriente eléctrica
sea mas fuerte en la esquina superior izquierda, en ese caso las láminas
colocadas en esa esquina tendrían tendencia a migrar mas que las demás.
Al comparar la longitud media de otras láminas colocadas en esa esquina y
sus réplicas se observa que mientras en unos casos si presentan mayor
79
media de longitud, en otros la media es menor. Se puede concluir que la
corriente eléctrica dentro de la cámara no muestra una tendencia clara a ser
mas fuerte en un lado que en otro.
Otra desventaja de la utilización de la longitud de la cola es que cuando hay
muerte celular no se observan cometas, sino el núcleo con fragmentos de
ADN que ya han empezado a ser digeridos y estos no migran. Esto genera
mas fuentes de error en el estudio estadístico.
Al igual que las tendencias recientes, el análisis estadístico demuestra que la
variable mas confiable para determinar el grado de daño de una muestra es
la clasificación morfológica de cada célula ya que esta variable es mas
homogénea dentro y entre réplicas.
80
8 CONCLUSIONES
1. El ensayo cometa neutro es una prueba rápida, confiable y sensible en la
determinación de DSB, siendo muy útil en estudios que hagan énfasis en
este tipo de lesión.
2. En el protocolo final para el ensayo cometa neutro se utiliza una solución
de lisis sin DMSO ya que la utilización de esta ocasiona muerte celular.
3. El factor con mayor influencia sobre el éxito del ensayo del cometa en su
versión neutra es la remoción de proteínas residuales que impiden la
migración de fragmentos de ADN, lo que se logró con la utilización de un
baño en buffer TBE 1X durante 1 hora antes de la electroforesis.
4. La electroforesis debe hacerse utilizando voltajes altos (2V/cm) y tiempos
cortos para lograr una migración óptima.
5. La metodología del ensayo cometa causa cierto daño en las muestras
celulares, por lo tanto no se deben utilizar altas concentraciones de
agentes genotóxicos ya que aumentan la mortalidad celular y esto
conlleva a la disminución en la confiabilidad de la prueba.
81
6. El VP16 y la BLM son agentes genotóxicos que causan daño
considerable en células al ser comparados con un control negativo.
7. La morfología de la célula es el parámetro mas apropiado para la
determinación de daño en el ADN en muestras biológicas ya que su
variación dentro y entre electroforesis es mucho menor.
8. Existe gran varianza en la metodología del ensayo cometa en todas sus
condiciones de acidez-alcalinidad, la mejor manera de estandarizar un
protocolo es hacer una revisión literaria completa y así poder determinar
cual varianza es la que mas conviene para cada factor.
82
9 RECOMENDACIONES
♦ La observación de las láminas se dificulta por “ruido” en el gel, para
disminuir la interferencia se puede probar mayores tiempos de
neutralización o hacerle una modificación al protocolo usando un baño de
NaOH antes de la electroforesis.
♦ Se pueden utilizar agentes que no causen DSB tales como H2O2 o
anticuerpos monoclonales específicos para SSB para confirmar la de
observación DSB únicamente.
♦ En estudios donde se necesite un control positivo para DSB es
recomendable utilizar VP16 ya que la exposición de células a esta droga
es mucho mas sencilla y la vida media de la droga es mucho mayor que
la de BLM.
♦ El nivel de daño en células que no han sido expuestas a agentes
genotóxicos es elevado, es necesario determinar que esta causando este
daño tal como el manejo de la muestra, las condiciones de esterilidad (la
elaboración de “sanduches” no se hace en condiciones estériles), la
calidad de las soluciones de trabajo, entre otros.
83
84
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90
Anexo # 1 Clasificación de morfología celular según Anderson (1994).
Diem, E., Ivancsits, S., Rüdiger, H.W. 2002. Basal Levels of DNA Strand
Breaks in Human Leukocytes Determined by Comet Assay. Journal of Toxicology and Environmental Health. 65: 641-648.
91
ANEXO # 2 PROTOCOLO DEL ENSAYO DEL COMETA NEUTRO
MONTAJE DE LA TÉCNICA
PREPARACIÓN DE LAS LÁMINAS BASE
Sumergir láminas portaobjetos esmeriladas (76 X 26 mm) nuevas en un
recipiente con suficiente agarosa de punto de fusión normal al 1% (NMA)
caliente (este se puede calentar en el microondas), de tal manera que las
láminas queden cubiertas con una capa delgada de agarosa por el lado
esmerilado. Se colocan sobre la estufa a temperatura baja por unos minutos
para secarlas. Una vez secas las láminas, se guardan en el horno a 30ºC
para evitar la hidratación de la agarosa.
EXPOSICIÓN DE CÉLULAS A AGENTES GENOTÓXICOS
La sangre utilizada para este protocolo se obtiene mediante venopunción con
Vacutainer con heparina (tapa verde). La exposición se hace
inmediatamente sea obtenida la muestra.
Exposición a VP16
92
La solución stock de VP16 con concentración inicial de 5 mg/ml (5000 µg/ml)
es diluida en dimetilsulfóxido (DMSO) a una solución de trabajo 500 µg/ml.
La solución final de VP16 utilizada es de 50 µg/ml, de manera que se debe
diluir con la sangre en una proporción 1:10. La sangre se debe incubar
durante 1 hora a 37ºC e inmediatamente se procede a hacer el montaje en el
gel sobre la las láminas.
Exposición a BLM
La BLM utilizada fue suspendida en agua destilada estéril hasta obtener una
concentración inicial de 3 mg/ml (3000 µg/ml), esta fue diluida para dar
soluciones de trabajo con agua destilada estéril en alícuotas de 700 µg/ml.
Cada 30 µl de sangre son suspendidos en 1ml de RPMI en tubo Falcon para
centrífuga de 15 ml, a este se la agrega la BLM para obtener una
concentración final 70 µg/ml mediante una dilución de 1:10. Se incuba
durante 10 minutos a 37ºC. Inmediatamente se realiza un baño de hielo y
centrifugación a 4ºC durante 30 min. a 1500 rpm para inhibir la acción de la
droga. Se desecha el sobrenadante e inmediatamente se procede con el
montaje de los “sanduches”.
93
MONTAJE DE LA TÉCNICA (SANDUCHES)
1. Mezclar 10µl de sangre con 90µl de agarosa de punto de fusión baja al
0.5% (LMA) a 37ºC por cada lámina que se vaya a preparar.
2. Colocar esta mezcla sobre la lámina base y cubrir con una laminilla.
3. Colocar las láminas en la nevera por 5 min. aproximadamente, hasta que
el gel se solidifique.
4. Sacar las láminas de la nevera y retirar la laminilla con cuidado.
5. Adicionar 100µl de LMA a 37ºC y cubrir con una laminilla.
6. Nuevamente se coloca en la nevera hasta que el gel se solidifique,
aproximadamente 5 min.
7. Colocar las láminas en solución de lisis.
ELECTROFORESIS
1. Sacar las láminas de solución de lisis y hacer un lavado con TBE 1X .
2. Dejar las laminas reposando en TBE 1X durante 60 min en una bandeja.
3. Colocar las láminas en la cámara de electroforesis. Colocar la cámara de
electroforesis con láminas en la nevera y debajo de ésta colocar hielo
para mantener la temperatura constante.
94
4. Adicionar el buffer de electroforesis con cuidado hasta que las láminas
queden totalmente cubiertas.
5. Prender la fuente de poder y cuadrar a 70V y 57mA.
6. Dejar correr la electroforesis por 5 minutos.
7. Apagar la fuente de poder, desconectar y retirar el buffer de
electroforesis. Sacar la cámara de la nevera.
8. Sacar las láminas con cuidado de la cámara y colocarlas en una bandeja.
9. Adicionar solución neutralizante durante 15 min.
10. Dejar secar las láminas, una vez secas sumergirlas en metanol y
nuevamente dejarlas secar a temperatura ambiente.
11. Guardar las laminas en incubadora a 30ºC para evitar que se hidraten.
Se realiza en cuarto oscuro con luz amarilla.
LECTURA LÁMINAS
Las láminas se observan en un microscopio de fluorescencia. Para la
visualización del ADN se utiliza 50 µl de Bromuro de Etidio (agente
intercalante) y se cubre con una laminilla. Se mide la migración celular de 50
células por lámina. La lectura de la lámina es una prueba ciega ya que el
observador realiza la lectura de la lámina sin saber que tratamiento a
recibido.
95
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES USADAS EN EL PROTOCOLO
♦ PBS libre de Ca y Mg
NaCl 8.0 grms/litro
KCl 0.2 grms/litro
KH2PO4 0.2 grms/litro
Na2HPO4•7H2O 2.3 grms/litro
La preparación del PBS se realiza en agua desionizada. Se debe almacenar
en alícuotas de 50 o 100 ml y almacenar en la nevera a 4ºC.
♦ Agarosa Punto de Fusión Normal (NMP) Para preparar 30 ml
Pesar 0.30 g de NMA y agregar a 30 ml de PBS libre de Calcio y Magnesio.
Guardar en vaso de vidrio pirex y disolver calentando en el horno microondas
aproximadamente durante 2 min.
♦ Agarosa Punto de Fusión Bajo (LMP)
Para preparar 10 ml
96
Pesar 0.5 g de LMA y agregar a 10 ml de PBS libre de Calcio y Magnesio.
Guardar en vaso de vidrio pirex y disolver calentando en el horno microondas
aproximadamente durante 2 min. o al baño Maria.
♦ Solución Lisis Stock Para preparar 1000 ml:
NaCl 2.5 M 146.1 gramos
EDTA 100 mM 37.2 gramos
Tris 10 mM 1.2 gramos
Se agregan los reactivos a 700 ml de agua destilada aproximadamente y se
dejan mezclar durante 5 minutos. Luego se agrega 12 g de NaOH lentejas y
se deja disolver la mezcla. Se ajusta a pH 10.5 ya sea con mas lentejas de
NaOH o con HCl concentrado. Una vez este lista esta solución se adiciona
10 g de Lauryl Sarcosinato de Sodio y se deja disolver (este paso puede ser
demorado). Una vez haya aclarado la mezcla se ajusta a pH 10 con HCl o
NaOH sea el caso y se completa hasta 1000 ml con agua destilada. La
solución debe ser esterilizada mediante filtración, se almacena a temperatura
ambiente y debe ser utilizada en menos de 15 días.
♦ Solución Lisis de Trabajo
Para preparar 100 ml
Solución stock 89 ml
97
Agua destilada 10 ml
Tritón X-100 1ml
La solución se coloca en jarros coplin y se refrigera por mínimo 60 minutos
antes de ser utilizado para almacenar las láminas con gel.
♦ Preparación Buffer TBE (5X) Stock Para preparar 1000 ml
EDTA 0.5 M 3.72 g
Tris 54 g
Ac. Bórico 27.5 g
Se agregan los reactivos a 700 ml de agua destilada y se ajusta el pH (8.0 –
8.5) con HCl concentrado. Se completa hasta 1000 ml con agua destilada.
Esta solución debe utilizarse en menos de 15 días.
♦ Preparación Buffer TBE (1X) de Trabajo
Para preparar 2000 ml
Solución stock 400 ml
Agua destilada 1600 ml
Antes de utilizar el buffer es importante asegurarse de que el pH este dentro
del rango de trabajo (8.0-8.5), preferiblemente 8.3 (Bauch, 1999; Benitez-
Bribiesca etal, 1999, Wojewódzka etal, 2002)
98
♦ Buffer Neutralizante
Para preparar 1000 ml
Pesar 48.5 g de Tris y agregar a 800 ml de agua destilada, ajustar a pH 7.5
con HCl y completar a 1000 ml con agua destilada. Guardar a temperatura
ambiente.
♦ Colorante Solución Stock
Pesar 10 mg en 50 ml de agua destilada y almacenar a temperatura
ambiente en frasco oscuro cubierto con papel aluminio.
♦ Colorante Solución de Trabajo
Se toma 1 ml de la solución stock y se agrega 9 ml de agua destilada. Se
almacena en un recipiente protegido de la luz (preferiblemente se cubre con
papel aluminio) y que cierre en forma hermética.
CALIBRACIÓN DE REGLILLA MICROMÉTRICA
La reglilla del ocular de microscopio se calibra con una laminilla LEITZ-
GMBH (WETZLAR) de 2mm de longitud y con 10 divisiones de 1 micra (µ).
Se alinean las dos reglas en el punto de inicio de ambas, se observa donde
99
coinciden exactamente las dos siguientes líneas. Se cuenta el número de
líneas entre la línea de inicio y la línea donde coinciden y se hace una
conversión.
