Establecimiento, multiplicación y enraizamiento in vitro ...· Establecimiento, multiplicación y

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  • VIERAEA Vol. 36 73-79 Santa Cruz de Tenerife, octubre 2008 ISSN 0210-945X

    Establecimiento, multiplicacin y enraizamiento in vitro de

    Bencomia exstipulata, planta endmica de las islas

    Canarias en peligro de extincin

    (Magnoliopsida, Rosaceae)

    ZENEIDA TACORONTE, JUAN FELIPE PREZ-FRANCS1, EMMA SUREZ1 &FRANCISCO VALDS1

    1 Grupo de Biologa Vegetal Aplicada, Departamento de Biologa Vegetal

    (Fisiologa Vegetal). Facultad de Farmacia, Universidad de La Laguna,

    C/ Astrofsico Francisco Snchez s/n, 38206 La Laguna, Tenerife, Islas

    Canarias. Espaa. E-mail: jfrances@ull.es.

    TACORONTE, Z., J. F. PREZ-FRANCS, E. SUREZ & F. VALDS (2008). Establishment,multiplication and in vitro rooting of Bencomia exstipulata, an endemic andendangered plant of the Canary Islands. VIERAEA, 36: 73-79.

    ABSTRACT: Bencomia exstipulata is an endemic plant in danger of extinction fromTenerife and La Palma. We decided to resort to the micropropagation techniquesdue to the difficult that in many cases exist for sexual multiplication and by stemcutting of these plants. Axillary and apical buds were cultured in a MS (Murashigeand Skoog, 1962) culture medium with 0.5 mg/l benciladenine (BA) obtained a 77%of buds development. The immersion of the basal end of the microcuttings in a 1g/l indole butyric acid (IBA) solution and a reduction in the strength of macronutrientsin the medium produced a 95.45% of vitroplants rooted. This method might be agood alternative for Bencomia exstipulata propagation.Key words: Bencomia exstipulata, micropropagation, in vitro plant tissue culture

    RESUMEN: Bencomia exstipulata es una planta endmica de las islas de Tenerifey La Palma que se encuentra en peligro de extincin. Debido a la dificultad que existeen algunos casos para la multiplicacin sexual y por esquejes de estas plantas sedecidi recurrir a las tcnicas de micropropagacin. Se sembraron in vitro yemasaxilares y apicales, obtenindose un 77% de yemas desarrolladas en un medio decultivo MS (Murashige and Skoog, 1962) enriquecido con benciladenina (BA) 0.5mg/l. La aplicacin de pulsos de cido indolbutrico (IBA) 1 g/l sobre la base de losmicroesquejes y la reduccin de sales del medio de cultivo produjo un 95.45% devitroplantas enraizadas. Este mtodo podra ser una buena alternativa para lapropagacin de Bencomia exstipulata.Palabras clave: Bencomia exstipulata, micropropagacin, cultivo in vitro detejidos vegetales

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    INTRODUCCIN

    Un amplio grupo de especies vegetales se encuentran en elevado peligro de extin-cin, contando tan solo con un nmero reducido de poblaciones que presentan ademsun escaso nmero de individuos. El tamao crtico de las poblaciones y su escasa capa-cidad natural de crecimiento dan lugar a la necesidad de aumentar los efectivos poblacio-nes mediante distintas actuaciones con el fin de asegurar la supervivencia de estas espe-cies. En muchos casos, los mtodos tradicionales de propagacin vegetativa (esquejes,acodos areos, etc.) no han mostrado una gran eficacia. La conservacin ex situ en ban-cos de semillas constituye una alternativa muy utilizada. Sin embargo, en muchos casossurgen problemas de propagacin o conservacin que impiden o dificultan el uso dedicha solucin.

    En las islas Canarias existe actualmente un nmero muy elevado de flora amenazaday en peligro de extincin, siendo uno de los principales motivos de esta situacin laalteracin de sus hbitats naturales.

    Esta situacin hace realmente difcil adquirir un conocimiento exhaustivo de la espe-cie as como su conservacin ex situ en bancos de semillas. El cultivo in vitro de tejidosvegetales se muestra como un mtodo alternativo a la hora de conservar y multiplicarestas especies para ser utilizadas en programas de reintroduccin, ya que no es necesariosacrificar plantas enteras sino simplemente porciones de stas permitiendo la supervi-vencia del material que se encuentra en su hbitat natural.

    El cultivo in vitro de plantas puede definirse como el cultivo de clulas, tejidos,rganos, embriones y plantas enteras, en condiciones aspticas, dentro de recipientesadecuados conteniendo un medio nutritivo y en un ambiente controlado (Prez Francs,2006). De esta forma, es posible obtener plantas genticamente idnticas a partir de cier-tas partes aisladas de la planta madre, de forma rpida y masiva. Sin embargo, este mtodono puede ser aplicado si las poblaciones de las que se recolecta el material presentanenfermedades que hagan imposible el aislamiento in vitro en ausencia de patgenos.

    En el presente trabajo se estudia el comportamiento in vitro de Bencomia exstipulata,(Rosaceae), una planta endmica de las cumbres de las islas de Tenerife y La Palma,donde se encuentra en enclaves puntuales. Esta especie est incluida en el Catlogo deEspecies Amenazadas de Canarias en la categora en peligro de extincin, as como enel Catlogo Nacional de Especies Amenazadas con la misma categora. Por ello, desde elParque Nacional de la Caldera de Taburiente se le plante al Departamento de BiologaVegetal de la Universidad de La Laguna la posibilidad de realizar un estudio de recupera-cin de esta especie por tcnicas de micropropagacin, un sistema de propagacinvegetativa que utiliza las tcnicas de cultivo in vitro (Prez Francs, 2006).

    El protocolo seguido ha sido: esterilizacin, establecimiento del material in vitro,multiplicacin y enraizamiento de los microesquejes obtenidos.

    MATERIAL Y MTODOS

    Nuestro trabajo se centr en las tres fases previas a la aclimatacin de las plantasobtenidas: Fases de establecimiento, multiplicacin y enraizamiento in vitro.

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    1.-Fase de Establecimiento in vitro

    1.1-Esterilizacin del material vegetal. Se emple como material de partida, ramasrecolectadas de plantas adultas enviadas desde el Parque Nacional de La Caldera deTaburiente y que fueron suministradas por ngel Palomares Martnez, Director Conser-vador de dicho Parque. Se llev a cabo una seleccin visual de las plantas y se realiz lapoda de las porciones no aptas para, a continuacin, esterilizar y sembrar las ramasseleccionadas.

    Como fase previa al proceso de esterilizacin se realiz un lavado con agua y Tween80, durante 30 minutos, renovando el agua de forma regular. A continuacin, se sometie-ron las ramas a un tratamiento fungicida con una solucin acuosa de Cekudazim (2gr/l)cuya materia activa es Carbendazima 50% (P/P). El material permaneci 30 minutos sumer-gido en esta solucin en agitacin. A continuacin se procedi a enjuagarlo con aguacorriente abundante para eliminar restos del fungicida, realizndose posteriormente unlavado de cinco segundos en etanol al 70%. Tras la eliminacin de este ltimo con agua,las ramas se introdujeron en el agente esterilizante, en este caso, hipoclorito clcico (Ca(ClO)

    2). En nuestro trabajo hemos ensayado dos concentraciones de hipoclorito, 3% y 5%

    (P/V), dependiendo de las condiciones que presentaba el material. Para mejorar la efecti-vidad, el hipoclorito se emple en condiciones de vaco y en agitacin continua, aadin-dose adems unas gotas de Tween 80. Finalizado el proceso anterior, se procedi a elimi-nar la solucin esterilizante mediante 3 lavados en agua destilada esterilizada. El primerode 5 minutos y los dos restantes de 10 minutos de duracin.

    1.2-Siembra del material. A partir de las ramas seleccionadas y esterilizadas, se pro-cedi a la diseccin de los explantes destinados a la siembra in vitro. Estos consistieronen yemas apicales y axilares que fueron aisladas con la ayuda de pinzas y bisturs en elambiente estril de la cmara de flujo laminar. La tcnica ms importante enmicropropagacin es la proliferacin de meristemos, tanto axilares como apicales, con elfin de obtener mltiples plantas sin la formacin previa de callo (Pati et al., 2006).

    1.3-Medios de cultivo. Para el establecimiento del material en condiciones in vitro,se ensayaron los medios basales de Murashige & Skoog (1962) (MS) y el Woody PlantMedium (WPM) de Lloyd & McCown (1981). El medio MS se ha empleado tanto al 100como al 50% de su fuerza inica.

    1.4-Tratamientos de choque con 6-benciladenina. En algunos ensayos, se incubel material en BA a concentraciones elevadas en periodos cortos. Este tipo de tratamientose realiz despus de la esterilizacin y consisti en dejar durante 2 horas y en agitacinlas yemas sumergidas en una solucin con sacarosa y BA a dos concentraciones diferen-tes: 100 y 200 mg/l de BA.

    1.5-Tratamientos para prevenir la necrosis del material durante la fase de estableci-miento. En este trabajo se emplearon varias sustancias antioxidantes para prevenir lanecrosis de los explantos debido a su alto contenido en fenoles. Tras el corte de losmismos, los compuestos polifenlicos son oxidados pudiendo ser luego exudados almedio de cultivo o bien permanecer en las clulas, provocando a corto plazo la necrosisde los tejidos y por tanto la muerte de los explantos. Las sustancias que hemos empleadopara reducir la oxidacin de los fenoles han sido adicionadas al medio de cultivo;polivinilpirrolidona soluble (PVP) 1g/l y una solucin compuesta por cido ctrico (1500mg/l) y cido ascrbico (100mg/l).

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    2.-Fase de multiplicacin

    El objetivo de esta fase es obtener el mayor nmero de nuevas yemas axilares en elmenor tiempo posible, pero evitando siempre que se produzca variacin gentica en elmaterial vegetal. Por este motivo las concentraciones de hormonas que se emplearonfueron bajas, nicamente con la intencin de inducir el desarrollo de los meristemosaxilares preexistentes. Se emple, como en la fase de establecimiento, BA a bajas concen-traciones. Asimismo se estudi el nmero de yemas viables desarrolladas a partir de unanica yema (tasa de multiplicacin).

    3.-Fase de enraizamiento

    Para cualquier protocolo de micropropagacin el enraizamiento satisfactorio de losmicroesquejes es un pre-requisito importante para faci