CITOGENÉTICA EN EL MIELOMA MÚLTIPLECITOGENÉTICA EN EL MIELOMA MÚLTIPLE

Esperanza Such Lab. Citogenética

Introducción

El mieloma múltiple es una neoplasia caracterizada:

• por la acumulación incontrolada de células plasmáticas clonales en MO, y

• por una gran heterogeneidad en cuanto a las alteraciones genéticas que presentan.

Cabe pensar que bajo este termino se engloben enfermedades diferentes.

Se van a revisar los conocimientos más destacados que han dado lugar a las técnicas de análisis genéticos y a su papel en el diagnostico.

• Diversos estudios moleculares indican que la célula clonogénica es una célula B madura que ha pasado por el centro germinal del folículo linfoide.

• Estas células han sufrido un proceso de hipermutación somática o un cambio del gen de la cadena pesada de las inmunoglobulinas.

•

Introducción

El linfocito migra a la médula ósea donde puede permanecer durante largo tiempo como célula plasmática.

• Un % importante de pacientes con MM tienen una

fase preclínica de MGUS en la que la clona maligna

permanece estable durante años hasta que, por

causas desconocidas, escapa a los mecanismos

reguladores que limitaban su crecimiento, y se

produce la transformación maligna.

• Los datos actuales sugieres que el MM aparece como

consecuencia de diferentes pasos oncogénicos.

Introducción

Hallek et al, 1998

Posiblemente el evento inicial consiste en

translocaciones del gen de la cadena pesada de las

inmunoglobulinas (IgH) situado en 14q32 debidas a:

• Errores durante el proceso de recombinación de IgH

• Errores durante la fase de hipermutación somática en

el centro germinal del folículo linfoide.

Bergsagel el al, 2004

Introducción

Introducción

Ciclo celular

• Se ha revisado recientemente por la posibilidad de

que haya dos vías en la patogénesis del MM:

– Hiperdiploide.

– Hipodiploide o diploide.

• Entre el 55-60% de los mielomas presentan anomalías

clonales en el contenido de DNA (aneuploidías)

generalmente hiperploidías.

• El ciclo celular

– Se mide por citometría de flujo.

– Permite distinguir anomalías en el contenido de

DNA en poblaciones celulares.

HIPERDIPLOIDES:

• Se generan clones menos agresivos que implican un mejor pronóstico

• Están presentes desde las primeras fases de la enfermedad

– Se observa en las MGUS donde el porcentaje de aneuploidías es del 73%.

• Se pueden usar para estudios de EMR con una sensibilidad de 10-4

Ciclo celular

• Valor pronóstico:

– Permite determinar el porcentaje de células plasmáticas en las diferentes fases del ciclo celular.

– El % de células plasmáticas en fase S (DNA mayor a 2n y menor a 4n) es un parámetro directamente relacionado con la actividad proliferativa del clon tumoral.

Ciclo celular

– Los pacientes con un mayor porcentaje de células plasmáticas en fase S (3%) tienen una supervivencia más corta.

Ciclo celular

Mateo et al, 2005

Ciclo celular

CITOGENÉTICA CONVENCIONAL

• El análisis cromosómico mediante citogenética

convencional, que ha generado información de primer

orden en otras hemopatías malignas, se ha visto

limitado en el caso del MM.

– Bajo índice proliferativo de las células mielomatosas

– Infiltración desigual y, generalmente, escasa de la

MO.

– Reducido número de metafases analizables que, en

buena parte, proceden de las células mieloides de la

MO.

• Los pocos cariotipos que se encuentran suelen ser

complejos y con múltiples alteraciones numéricas y

estructurales.

• El porcentaje de los cariotipos descritos suele ser muy

variable, raramente supera el 30% en las distintas

publicaciones.

• Impide detectar anomalías estructurales más importantes.

CITOGENÉTICA CONVENCIONAL

• Sin embargo proporciona una visión global del genoma y es una buena herramienta para determinar la ploidía del MM.

CITOGENÉTICA CONVENCIONAL

CITOGENÉTICA CONVENCIONAL

Cambios numéricos

Ganancias: 3,5,7,9,11,15,18,19,21

Perdidas: 8,13,14,16,22,X,Y

Cambios estructurales

1q Trisomias parciales

1p Delecciones

14q t(11;14)(q24;q32)

8q t(8;14)(q24;q32)

t(8;22)(q24;q11)

t(2;8)(p12;q32)

11q t(11;14)(q13;q32)

Ganancias

6q Deleciones

16p ó 16q t(1;16)(q11;q11)

22q11 Deleciones

19q y 19p Traslocaciones

CITOGENÉTICA CONVENCIONAL

FISH

• La introducción de la fluorescencia en los últimos 20 años ha supuesto un avance extraordinario en el campo de la citogenética.

• En el MM la técnica citogenética más usada es la hibridación in situ fluorescente (FISH).

FISH

• Resuelve la mayoría de los problemas inherentes a la citogenética convencional

– No necesita metafases

– Elevada resolución permite detectar translocaciones crípticas.

• Su objetivo son las alteraciones específicas.

• Debido a la baja infiltración, se debe realizar siempre sobre células mielomatosas purificadas

FISH

• Inicialmente se creía que sólo el 30% de los MM

presentaban alteraciones citogenéticas.

• Ahora, gracias a la FISH se sabe que el porcentaje es

aproximadamente del 60%.

• Las anomalías más frecuentes son las translocaciones

del 14q32 (40% de los pacientes) que provoca la

yuxtaposición del gen de la cadena pesada de las Ig

frente a diversos genes.

En el MM la translocación (Tx) de IGH se clasifican:

• Primarias (40%): Consideradas un proceso inicial en la patogénesis.

– Son consecuencia de errores en los procesos de remodelación del DNA específico de las células B.

– Los puntos de rotura ocurren en las regiones adyacentes a las regiones de cambio de IGH

IGH

IGH

Secundarias (20%): implicadas en la progresión

– Podrían estar mediadas por otros tipos de

mecanismos de recombinación no dirigidos a las

regiones recombinantes de IgH.

• El resto de los pacientes (40%) no presentan

alteraciones de IgH.

IGH

• A diferencia de otros síndromes linfoproliferativos B, en MM hay una marcada diversidad de loci cromosómicos implicados en Tx de IGH (60%).

• En un 40% está implicados los siguientes genes:

GEN IMPLICADO TRANSLOCACIÓN FRECUENCIA

CCND1 t(11;14)(q13;q32) 20%

FGFR/MMSET t(4;14)(p16;q32) 15%

CMAF t(14;16)(q32;q23) 5-10%

CCND3 t(6;14)(p21;q32) 3%

MAFB t(14;20)(q32;q11) bastante rara

IGH

• Las más frecuentes son:

Δ13

• Tiene una frecuencia del 40-50% • Se trata de la perdida de material genético más

frecuente en el MM.• Presenta una fuerte asociación con otras anomalias

genéticas:– 80% de los MM con t(4;14) o t(14;16)– 65% de los casos con add(1q)– 70% de las deleciones p53– 65% de los hipodiploides

• La variabilidad de clonas existente con Δ13

iría a favor de que es un evento secundario

Δ13

• Clásicamente la monosomía se ha asociado a con un

pronóstico adverso independiente de la técnica

utilizada (cariotipo o FISH)

• Según algunos autores (grupo de Arkansas) la

influencia negativa de la monosomía no es tan

marcada cuando se detecta únicamente por FISH.

• Estudios más recientes no encuentran una

disminución en la supervivencia de los pacientes que

sólo tienen monosomía 13.

Δ13

p53

• Está localizado en el cromosoma 17p13, está implicado en el control de la proliferación, diferenciación y apoptosis celular.

• La progresión tumoral depende de la inactivación de este gen o de pérdidas alélicas.

•

Tiene una incidencia menor que Δ13 (5-10%) pero se perfila como una alteración de pronostico desfavorable.

CCND1 t(11;14)• Incidencia del 15-20%.

• Implica al gen CCND1 provocando una sobreexpresión de la proteína ciclina D1.

• Esta ciclina tiene un papel clave en la regulación del ciclo celular particularmente en la progresión de las células de la fase G1 a S.

• Se había asociado a un curso agresivo de la enfermedad pero en la actualidad se ha demostrado que la supervivencia es similar o mayor que los que no la tienen.

• La amplificación del gen de la ciclina D1 puede estar producida por otros mecanismos que aumentan su incidencia al 30%.

FGFR/MMSET t(4;14)

• Incidencia del 15%

• Es indetectable por citogenética convencional.

• Como consecuencia de la translocación se desregulan dos genes prooncogénicos situados en der(4):

– FGFR3 (fibroblast growth-factor receptor 3)

– MMSET (multiple myeloma SET domail)

• Se asocia con IgA y del(13), con elevada actividad proliferativa y niveles aumentados de B2-microglob, asociados con mal pronostico y con supervivencias cortas.

• Se considera uno de los factores pronósticos independientes con mayor peso

CMAF t(14;16)

• Incidencia del 5-10%

• Aumenta la expresión de C-MAF que es un factor de

transcripción involucrado en procesos celulares

básicos incluidos proliferación, diferenciación y

respuesta IL6.

• Recientemente se ha descrito otro gen, WWOX, que

también se encuentra en la región 16q23.

• Los pacientes con esta alteración presentan

características muy similares a los que tienen la

t(4;14) y una supervivencia corta.Fonseca et al, 2003

• Son ganancias del brazo largo del cromosoma 1.

• Es una de las alteraciones mas recurrentes en el MM.

• No se había estudiado el impacto en la supervivencia hasta que el grupo de Arkansas demostró:

– el aumento de la expresión del gen CKS1B localizado en 1q21

– imparte mayor agresividad al curso clínico de la enfermedad y una reducción significativa de la supervivencia.

Add(1q)

• El resto de alteraciones son poco frecuentes (5%) pero la presencia de un cariotipo aberrante o hipodiploide se asocia a mal pronostico.

Las alteraciones citogenéticas son muy frecuentes en el MM y claves en el pronóstico, por lo que se considera un estudio obligado en todo paciente con MM.

FISH

Los pacientes con translocaciones de IGH, RB o deleciones de p53 tienen menor supervivencia y tiempo de progresión en pacientes con ATSP.

NC Gutierrez et al, 2007

NC Gutierrez et al, 2007

La deleción de RB no tiene valor pronóstico negativo si no va asociado a otras alteraciones

NC Gutierrez et al, 2007

Los reordenamientos de t(4;14) son de mal pronostico independientemente

de las alteraciones adiccionales presentes.

NC Gutierrez et al, 2007

La t(11;14) y deleciones de RB no tienen valor pronóstico.

p53 tiene valor pronóstico desfavorable.

NC Gutierrez et al, 2007

El 62% de los pacientes con reordenamientos de IGH presentan del de RB.

El 79% de los pacientes con t(4;14) presentan del RB.

Conclusión

TRANSLOCACIÓN FRECUENCIA PRONÓSTICO

Δ13 40-50% NO INFORMATIVO

p53 5-10% DESFAVORABLE

IGH t(14; x): 60% -

t(11;14)(q13;q32)bcl1 20% FAVORABLE

t(4;14)(p16;q32)fgfr3 15% DESFAVORABLE

t(14;16)(q32;q23)maf

5-10% DESFAVORABLE

Add(1p) - DESFAVORABLE

•Citogenética convencional•Estudio del Ciclo Celular•FISH

Línea vertical de Neoplasias HematologicasRed de Mieloma y Linfoma

PLAN ESTRATÉGICO Y GRUPOS PARTICIPANTES

La clave del éxito de esta red ha radicado en su doble planteamiento:

La existencia de un grupo clínico-terapéutico nacional (GEM/PETHEMA) que engloba a más de 100 hospitales con dos laboratorios que centralizan nuevas técnicas de diagnóstico biológico y una serie de laboratorios de investigación básica alrededor.

Un modelo de investigación traslacional basado en la continua interacción entre laboratorios básicos y grupos clínicos (ej: los estudios sobre mecanismos de acción de nuevos fármacos llevan a ensayos fase I/II)

El plan estratégico actual es mantener y desarrollar este modelo.

En función de la nueva estructura de la Red de Cáncer se establecen:

a) Tres plataformas horizontales

Programas 2 y 4: Diagnóstico Molecular, Citogenético e Inmunofenotípico: Centralizado en tres laboratorios para todos los hospitales de grupo GEM y coordinados desde las plataformas horizontales correspondientes.

• Laboratorio del Hospital 12 de Octubre (Dr. JJ. Lahuerta)

• Laboratorio del Hospital Clínico de Salamanca (Dr. San Miguel)

• Laboratorio del Hospital la Fe de Valencia (Dr M.A. Sanz)

* Actuará como apoyo el laboratorio del CIMA (Pamplona): (Drs. Odero/Calasanz)

Citogenética

• Separación de células CD138+ mediante esferas magnéticas.

• Obtenemos una pureza del 70-90%.

• Este método no distingue entre células normales y plasmáticas tumorales.

PANEL DE FISH