EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA. Técnicas Histológicas.

EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIAEQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIA

EQUIPO UTILIZADO EQUIPO UTILIZADO EN HISTOLOGIAEN HISTOLOGIA


Técnicas Técnicas HistológicaHistológica

ss


INTRODUCCION AL ESTUDIO INTRODUCCION AL ESTUDIO DE LA HISTOLOGIADE LA HISTOLOGIA

HISTOLOGIA “estudio del tejido”HISTOLOGIA “estudio del tejido”

Es la rama de la Anatomía que estudia los tejidos de los Animales y las Plantas

ANATOMIA MICROSCOPICAANATOMIA MICROSCOPICA


PROCEDIMIENTOSPROCEDIMIENTOS INMEDIATO O VITALES

MEDIATO O POSVITALES


ES EL CONJUNTO DE PROCEDIMIENTOS ES EL CONJUNTO DE PROCEDIMIENTOS

REALIZADOS PARA OBTENER UN REALIZADOS PARA OBTENER UN

PREPARADO HISTOLOGICOPREPARADO HISTOLOGICO

TECNICA HISTOLOGICATECNICA HISTOLOGICA


CÉLULAS,CÉLULAS,

TEJIDOS Y TEJIDOS Y

ORGANOSORGANOS

CELULAR: se alteran las membranas, lo que CELULAR: se alteran las membranas, lo que produce que los elementos internos produce que los elementos internos difundan hacia el exterior.difundan hacia el exterior.

QUÍMICO: desciende el pH y se activan los QUÍMICO: desciende el pH y se activan los sistemas hidrolíticos que provocan sistemas hidrolíticos que provocan alteraciones marcadas en los tejidos.alteraciones marcadas en los tejidos.

SU FINALIDAD ES PREPARAR:SU FINALIDAD ES PREPARAR:

conociendo la anatomía, debemos dirigirnos conociendo la anatomía, debemos dirigirnos directamente a los órganos que nos directamente a los órganos que nos interesan estudiar. En el caso de que estos interesan estudiar. En el caso de que estos sean varios, es conveniente extraer primero sean varios, es conveniente extraer primero los que más fácilmente se descomponen, los que más fácilmente se descomponen, estos son el páncreas y la porción inferior estos son el páncreas y la porción inferior del tubo digestivo. del tubo digestivo.


PREPARADO HISTOLOGICO:PREPARADO HISTOLOGICO:

Es una rebanada de tejido colocada sobre una Es una rebanada de tejido colocada sobre una lámina lámina

portaobjetos, coloreada y cubierta por una lámina portaobjetos, coloreada y cubierta por una lámina

cubre-objetos.cubre-objetos.



ETAPAS DE LA TECNICA HISTOLOGICAETAPAS DE LA TECNICA HISTOLOGICA

1.1. OBTENCION DEL MATERIAL2.2. FIJACION3.3. OBTENCION DEL BLOQUE DE PARAFINA4.4. CORTE5.5. COLORACION6.6. MONTAJEMONTAJE



PROBLEMAS DE INTERPRETACION PROBLEMAS DE INTERPRETACION

al visualizar los cortes con el Microscopioal visualizar los cortes con el Microscopio


A.- ARTEFACTOS:Cambios estructurales inducidos por las

técnicas histológicas.

B.- CONCEPTUALES


PROBLEMAS DE INTERPRETACIONPROBLEMAS DE INTERPRETACION


A.- ARTEFACTOS:

•DE FIJACION Precipitación de las proteínas.

•DE DESHIDRATACION Y ACLARAMIENTO Espacios opticamente vacíos

•DE LOS CORTES cortes de diferente grosor

•DEL MONTAJE pliegues

•DEGENERACION POSTMORTEN

FINAL


GRACIASGRACIAS


TOMA DE MUESTRAS TOMA DE MUESTRAS TECNICA HISTOLOGICATECNICA HISTOLOGICA

HISTOLOGIAHISTOLOGIA TEJIDOS NORMALESTEJIDOS NORMALESANATOMIA PATOLOGICAANATOMIA PATOLOGICA TEJ. PATOLOGICOS TEJ. PATOLOGICOS

Las muestras pueden ser obtenidas por:- Las muestras pueden ser obtenidas por:-

Frotis. Frotis.

Aspiración y/o lavadoAspiración y/o lavado

punción aspiración con aguja finapunción aspiración con aguja fina

improntaimpronta

biopsiabiopsia

punción con trocar, o autopsia.punción con trocar, o autopsia.


SI LA MUESTRA DE TEJIDO

NO SE FIJA SE FIJA

AUTOLISIS CONSERVA LASCARACTERISTICAS



2.2. FIJACION:FIJACION:

Es la fase en la cual se preserva la morfología y la composición química de los tejidos evitando la AUTOLISISAUTOLISIS



Preservar el tejidoPreservar el tejidoNo producir artificiosNo producir artificiosNo dificultar el tratamiento ulteriorNo dificultar el tratamiento ulterior

Poder y velocidad de penetraciónPoder y velocidad de penetración

CONDICIONES DE UN BUEN FIJADORCONDICIONES DE UN BUEN FIJADOR::

SOLUCION AL 40% DE ALDEHIDO SOLUCION AL 40% DE ALDEHIDO FORMICOFORMICO

FORMOL AL 10%FORMOL AL 10%USOUSO



Para la Para la FIJACIÓN DE PROTEINASFIJACIÓN DE PROTEINAS es necesario evitar su es necesario evitar su

hidrólisis, bloqueando los lugares susceptibles de hidrólisis hidrólisis, bloqueando los lugares susceptibles de hidrólisis

mediante:mediante:

- - Reticularización o desnaturalizaciónReticularización o desnaturalización,, creando redes estables creando redes estables

empleando aldehidos como empleando aldehidos como formaldehidoformaldehido , ,verver actuación del actuación del

formol , que se usa en solución acuosa al 2 % (formalina) para formol , que se usa en solución acuosa al 2 % (formalina) para

microscopía óptica, y glutaraldehidomicroscopía óptica, y glutaraldehido que se empleaque se emplea al 2% en al 2% en

tampón, para microscopia electrónica.tampón, para microscopia electrónica.

- - Formación de sales insolublesFormación de sales insolubles, mediante productos como el. , mediante productos como el.

acido picricoacido picrico empleado en la confección del empleado en la confección del fijador de Bouinfijador de Bouin. El . El

cloruro de mercurio (muy tóxico) y el dicromáto potásico.cloruro de mercurio (muy tóxico) y el dicromáto potásico.

- - Cambios en el estado coloidal,Cambios en el estado coloidal, mediante el calor (no mediante el calor (no

recomendable).recomendable).

- - Modificación del punto isoeléctricoModificación del punto isoeléctrico, con ácido acético., con ácido acético.


Para la Para la FIJACIÓN DE LOS HIDRATOS DE CARBONOFIJACIÓN DE LOS HIDRATOS DE CARBONO es es necesario evitar que se disuelvan en agua, para ello hay necesario evitar que se disuelvan en agua, para ello hay que extraer el agua mediante fijadores cuya avided por que extraer el agua mediante fijadores cuya avided por el agua sea mayor que ellos, asi se emplea alcohol el agua sea mayor que ellos, asi se emplea alcohol etilico (alcohol etílico al 70% en agua), y acetona. etilico (alcohol etílico al 70% en agua), y acetona. Tienen el inconveniente que retraen los tejido y los Tienen el inconveniente que retraen los tejido y los endurecen para el procesamiento posterior.endurecen para el procesamiento posterior.

Para la Para la FIJACIÓN DE LOS LIPIDOSFIJACIÓN DE LOS LIPIDOS es necesario evitar es necesario evitar su oxidación o enranciamiento bloqueando los lugares su oxidación o enranciamiento bloqueando los lugares donde existen enlaces - CH=CH - mediante sutancias donde existen enlaces - CH=CH - mediante sutancias como como tetróxido de osmiotetróxido de osmio (acido osmico),ver actuación (acido osmico),ver actuación del osmio, es el fijador ideal para microscopía del osmio, es el fijador ideal para microscopía electrónica, pues se fija en los dobles enlaces de las electrónica, pues se fija en los dobles enlaces de las cadenas laterales de los lípidos de las membranas cadenas laterales de los lípidos de las membranas plasmáticas, y además el Os es un metal opaco a los plasmáticas, y además el Os es un metal opaco a los electrones (sirve de tinción).electrones (sirve de tinción).


3. OBTENCION DEL BLOQUE DE PARAFINA

DESHIDRATACION

ACLARAMIENTO

IMPREGNACION

INCLUSION EN PARAFINA



3. OBTENCION DEL BLOQUE DE PARAFINA

TEJIDOS (Ricos en agua)

TEJIDOS RICOS EN ALCOHOL

DESHIDRATACION

TEJIDOS RICOS EN XILOL

ACLARAMIENTO

IMPREGNACION EN PARAFINA



Luego de la Impregnación se Incluye en parafina, en pequeños cubos que forman el

BLOQUE DE PARAFINA



TECNICA DE CORTE.TECNICA DE CORTE. - La obtención de rebanadas (cortes) de cuerpos - La obtención de rebanadas (cortes) de cuerpos

sólidos, tiene por objeto el observar secciones sólidos, tiene por objeto el observar secciones translucidas de sus estructuras inernas. Los cortes translucidas de sus estructuras inernas. Los cortes demasiado gruesos permiten observar mas demasiado gruesos permiten observar mas estructuras, pero con menos definición pues se estructuras, pero con menos definición pues se superponen unas a otras. Los cortes finos pèrmiten superponen unas a otras. Los cortes finos pèrmiten ver menos estructura, pero con mas definición y ver menos estructura, pero con mas definición y finura.finura.

- Para obtener cortes del cuerpo solido, se necesita - Para obtener cortes del cuerpo solido, se necesita que este posea un grado de dureza minimo, y que este posea un grado de dureza minimo, y proporcional a la finura de la rebanada que deseemos proporcional a la finura de la rebanada que deseemos obtener: mas duro = mas fino. obtener: mas duro = mas fino. - Como la mayoría de los tejidos corporales son - Como la mayoría de los tejidos corporales son blandos, es necesario blandos, es necesario endurecerlos endurecerlos mediante las mediante las siguientes estrategias:siguientes estrategias:


1ª- Fijación en glutaraldehido: Ideal para cortes 1ª- Fijación en glutaraldehido: Ideal para cortes

gruesos a mano alzada, mediante el microtomo de gruesos a mano alzada, mediante el microtomo de

mano y navaja barbera (0,5- 3 mm de grosor), o mano y navaja barbera (0,5- 3 mm de grosor), o

mediante vibratomo.(0,5- 1 mm de grosor).mediante vibratomo.(0,5- 1 mm de grosor).

2ª- Congelación en microtomo: -2 a -5 ºC. Ideal para 2ª- Congelación en microtomo: -2 a -5 ºC. Ideal para

hacer preparaciones rápidas, p.e. peroperatorias en hacer preparaciones rápidas, p.e. peroperatorias en

antequirógfano.(50-100 micras de grosor)antequirógfano.(50-100 micras de grosor)

3ª- Congelación en criostato: -15 a -30 ºC. Ideal para 3ª- Congelación en criostato: -15 a -30 ºC. Ideal para

cortes finos en histoquímica.(5-20 micras de grosor)cortes finos en histoquímica.(5-20 micras de grosor)


4ª- Inclusión en Parafina: Ideal para trabajo de 4ª- Inclusión en Parafina: Ideal para trabajo de cortes en serie y de alta estabilidad. Rutina de cortes en serie y de alta estabilidad. Rutina de laboratorio.(5-20 micras). Los cortes se realizan laboratorio.(5-20 micras). Los cortes se realizan en un aparato llamado microtomo de parafina en un aparato llamado microtomo de parafina (imagen derecha), La la pieza, en amarillo, se (imagen derecha), La la pieza, en amarillo, se coloca en un brazo que se desliza verticalmente coloca en un brazo que se desliza verticalmente sobre una cuchilla, en azul, recubierta por un sobre una cuchilla, en azul, recubierta por un antirroll (antienrrollamiento) en azul mas claro.antirroll (antienrrollamiento) en azul mas claro.

5ª- Inclusión en celoidina: Ideal para grandes 5ª- Inclusión en celoidina: Ideal para grandes piezas: p.e. Pulmon entero. Cerebro entero, etc.piezas: p.e. Pulmon entero. Cerebro entero, etc.(100-200 micras)(100-200 micras)

6ª- Inclusión en resinas epoxi: araldit, vestopal, 6ª- Inclusión en resinas epoxi: araldit, vestopal, etc Ideal para microscopía electerónica (20-40 etc Ideal para microscopía electerónica (20-40 nm) y corte de objetos extremadamente duros: nm) y corte de objetos extremadamente duros: hueso y diente. Se corta en el hueso y diente. Se corta en el ultramicrotomo.mediante cuchillas de vidrio ultramicrotomo.mediante cuchillas de vidrio odiamante..odiamante..


4.4. EL CORTEEL CORTE

A.- Se corta en el microtomo

C.- Se monta el corte en la lámina Portaobjetos

B.- Se coloca en el Baño de María

EJEMPLOS


5. COLORACION:

COLORANTEES UNA SUSTANCIA CAPAZ DE COMUNICAR SU COLORACION A OTROS CUERPOS

HEMATOXILINA - EOSINA


La coloración más usada es


BATERIA DE COLORACIONBATERIA DE COLORACION



5.5. COLORACIONCOLORACION


EOSINAEOSINAColorante ACIDO, Colorante ACIDO,

tiñe detiñe deRosado o Rojo Rosado o Rojo

elementos elementos básicosbásicos

Ej. CitoplasmaEj. Citoplasma

HEMATOXILINAColorante BÁSICO

tiñe deAzul o púrpura,

elementos ácidosEj. El Núcleo


PASOS DE LA COLORACIONPASOS DE LA COLORACION

DESPARAFINARDESPARAFINAR REHIDRATARREHIDRATAR HEMATOXILINAHEMATOXILINA DIFERENCIARDIFERENCIAR EOSINAEOSINA ALCOHOLALCOHOL XILOLXILOL



TECNICA DEL PAS TECNICA DEL PAS ( Peryodic Acid Schiff) Para detectar ( Peryodic Acid Schiff) Para detectar enlaces 1-2 glicol (mucopolisacaridos) enlaces 1-2 glicol (mucopolisacaridos) Y AZUL ALCIANY AZUL ALCIAN (mucopolisacaridos ácidos). - (mucopolisacaridos ácidos). -Ver Ver actuacionactuacion del PAS del PAS.-.-1º.- Desparafinar e hidratar los cortes.1º.- Desparafinar e hidratar los cortes.

2º.- 2º.- Solución de azul Solución de azul alcianalcian.-------------------------------10 min. .-------------------------------10 min. 3º.- Lavar en Agua destilada .3º.- Lavar en Agua destilada .4º.- 4º.- Sol. de ácido Sol. de ácido peryódicoperyódico .-----------------------------10 min .-----------------------------10 min5º.- Lavado con Agua destilada.5º.- Lavado con Agua destilada.6º.- 6º.- Solución Solución dcdc SchiffSchiff.------------------------------------30 min.------------------------------------30 min7º.- Lavado con 7º.- Lavado con agua sulfurosaagua sulfurosa 1 mm., agua destilada- 1 mm. 1 mm., agua destilada- 1 mm.

y repetir varias veces.y repetir varias veces.8º.- Lavar con agua corriente hasta que tome color rojo -- 30 8º.- Lavar con agua corriente hasta que tome color rojo -- 30

min.min.9º.- Teñir con Hernatoxilina (contraste de núcleos)----------2 min.9º.- Teñir con Hernatoxilina (contraste de núcleos)----------2 min.10º.- Lavar, deshidratar, aclarar y montar. 10º.- Lavar, deshidratar, aclarar y montar.


El acido peryódico El acido peryódico (I04H) (I04H) reaciona con los reaciona con los enlaces 1-2 glicol (-CHOH-OHHC-) enlaces 1-2 glicol (-CHOH-OHHC-) transformándolos en aldehídos (-COH HOC-) transformándolos en aldehídos (-COH HOC-) donde se fija el reactivo se Schiff donde se fija el reactivo se Schiff F(SO3H)2F(SO3H)2El ácido peryódico no actúa cuando los grupos El ácido peryódico no actúa cuando los grupos glicol están bloqueados por radicales ácidos glicol están bloqueados por radicales ácidos

Solución de azul alcian:Solución de azul alcian:AzulAzul alcian---------- 1 gr. alcian---------- 1 gr. Acido acético------- 3 c.c Acido acético------- 3 c.c Agua destilada----- 97 c.cAgua destilada----- 97 c.c

Solución de AcidoSolución de Acido IO4H -------------- 1 gr.IO4H -------------- 1 gr.Agua destilada.-- 100 ml. Agua destilada.-- 100 ml.

Solución de SchiffSolución de Schiff: : Hervir 100 c.c. de agua destilada, apartarla del fuego y Hervir 100 c.c. de agua destilada, apartarla del fuego y añadir 1 gr. de fucsina básica. A los 5 mm. añadir 1,5 gr. de añadir 1 gr. de fucsina básica. A los 5 mm. añadir 1,5 gr. de metabisulfito sódico potásico Na2O3S2 y 3 c.c. de CIH metabisulfito sódico potásico Na2O3S2 y 3 c.c. de CIH normal, tapar el recipiente y dejar reposar durante 24 horas. normal, tapar el recipiente y dejar reposar durante 24 horas. en oscuridad. Depurar con carbón y filtrar. Si toma color en oscuridad. Depurar con carbón y filtrar. Si toma color

paja, tira.rpaja, tira.r

Agua sulfurosa:Agua sulfurosa: Metabisulfito sódico, SO3HNa, ----0,5 Metabisulfito sódico, SO3HNa, ----0,5 gr.gr.AD------------------------------ 100 ml. AD------------------------------ 100 ml. CIH-----------------------------3-4 gotas CIH-----------------------------3-4 gotas


CORTES HISTOLOGICOSCORTES HISTOLOGICOS

HEMATOXILINA-EOSINA


Hematoxilina y Eosina.Hematoxilina y Eosina. 1º.- Las láminas ya hidratadas se cubren con la 1º.- Las láminas ya hidratadas se cubren con la

Solución de hematoxilinaSolución de hematoxilina durante 5 minutos. durante 5 minutos.2º.- Se lavan varias veces con agua durante un total 2º.- Se lavan varias veces con agua durante un total de 15 minutos como mínimo. de 15 minutos como mínimo. 3º.- Se cubren con la 3º.- Se cubren con la Solución de eosinaSolución de eosina durante 5 durante 5 mm.mm.4º.- Lavar rápidamente.4º.- Lavar rápidamente.5º.- Deshidratar con alcoholes de concentraciones 5º.- Deshidratar con alcoholes de concentraciones crecientes 70%, 90%, 100% (deshidratar).crecientes 70%, 90%, 100% (deshidratar).6º.- Aclarar en xilol y montar cl cubre con bálsamo del 6º.- Aclarar en xilol y montar cl cubre con bálsamo del Canadá (aclarar y montar).Canadá (aclarar y montar).

RESULTADOSRESULTADOSLa cromatina nuclear y compuestos basófilos aparecen en La cromatina nuclear y compuestos basófilos aparecen en

azul por la hematoxilina.azul por la hematoxilina. El citoplasma, colágeno y compuestos acidófilos se tiñen El citoplasma, colágeno y compuestos acidófilos se tiñen en rosa o rojo por la eosina.en rosa o rojo por la eosina.


CORTES HISTOLOGICOSCORTES HISTOLOGICOS

SUDAN

Tejido adiposo con distintas coloraciones


SUDAN ROJO PARA TEÑIR LIPIDOS SIMPLES.SUDAN ROJO PARA TEÑIR LIPIDOS SIMPLES. 1º.- Cortes obtenidos por congelación (La inclusión en 1º.- Cortes obtenidos por congelación (La inclusión en

parafina disuelve las grasas).parafina disuelve las grasas).

2º.- Introducir los cortes en la mezcla a partes iguales 2º.- Introducir los cortes en la mezcla a partes iguales de de Sudan IIISudan III (saturación en Alcohol de 70º.)(saturación en Alcohol de 70º.) y y Rojo EscarlataRojo Escarlata (saturación en (saturación en

alcohol de 70º .)alcohol de 70º .) (filtrado). 24 horas. (filtrado). 24 horas. 3º.- Lavar en agua destilada.3º.- Lavar en agua destilada. 4º.- Teñir los nucleos con 4º.- Teñir los nucleos con Hematoxilina de Groat-Hematoxilina de Groat--2 -2

minutos.minutos.

5º.- Lavar y secar con papel de filtro.5º.- Lavar y secar con papel de filtro. 6º.- Montar en Plasdona. 6º.- Montar en Plasdona.

Hematoxilina de Groat Hematoxilina de Groat Una parteUna partede: de:

Acido sulfurico concentrado--------0.8 ml.Acido sulfurico concentrado--------0.8 ml.Alunbre Férrico-------- 1 gr.Alunbre Férrico-------- 1 gr.Agua destilada --------- 50 ml. Agua destilada --------- 50 ml.

Dos partes Dos partes de: de:

Hematoxilina--0.5gr.Hematoxilina--0.5gr.Alcoholde 95º- 50ml Alcoholde 95º- 50ml


COLORACIONES ESPECIALESCOLORACIONES ESPECIALES

IMPREGNACION ARGENTICA


COLORACIONES ESPECIALESCOLORACIONES ESPECIALES

GIEMSA

AZAN MODIFICADO


6.6. MONTAJEMONTAJE


Con un pegamento especial se coloca el Cubreobjeto sobre el tejido que se

encuentra en el portaobjeto


Finalmente, cubrimos los "portas" con una Finalmente, cubrimos los "portas" con una delgada lámina de vidrio (cubreobjetos) en delgada lámina de vidrio (cubreobjetos) en la cual colocamos una gota de medio la cual colocamos una gota de medio adhesivo. adhesivo.


La parafina se coloca en una estufa a 70º C, con lo que se licua, introduciendo en ella la pieza que ha permanecido en benzol.

Se deja toda la noche en la parafina

A la mañana siguiente sacando la pieza de la estufa con parafina líquida y se confecciona el bloque, dejándole solidificar a temperatura ambiente


Una vez que el bloque se ha endurecido se adhiere sobre un taco de madera, por medio de espátula caliente


MICRÓTOMOMICRÓTOMO

El bloque endurecido se instala en el micrótomo de parafina, procediéndose al corte (Fig. N° 5).


Los cortes obtenidos, se extienden con ayuda de un pincel sobre el agua de un baño con agua caliente, pescándolo sobre un porta que se introduce por debajo


Una vez que han sido extraídos del baño María, se proceden a montar en el portaobjetos.


Los portas con los cortes se introducen inclinados en la estufa de 70º C para que se licue la parafina sobrante y escurra.

Se introducen en un recipiente con

xilol para que la parafina se

disuelva.

El corte libre de parafina es

necesario hidratarlo para que se

pueda proceder a su coloración.

La hidratación sigue un proceso inverso a la deshidratación.

Se pasa por alcoholes de concentraciones decrecientes, terminando en agua igual que en el proceso de corte por congelación


ACTUACION


Fijador de Bouin

Aciclo pícrico a saturación-----------1.000 ml.. Acetato de cobre----------------------- 25 gr. Formalina (formol comercial al 10%---- l00 c.c


ACTUACION

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