EquipoDr Salamone DanielDr Gibbons AlejandroDra Cueto MarcelaDr Rafael Fernández y MartínDr Pereyra Bonnet Federico

Laboratorio de Biotecnología Animal-Facultad de AgronomíaUniversidad de Buenos Aires, Argentina

Laboratorio de Rumiantes Menores-UE BarilocheInstituto Nacional de tecnología Agropecuaria

ANIMALES TRANSGENICOS

Como fabricar una Como fabricar una proteína humana?proteína humana?

Por ejemplo: la insulina se usa para tratar Por ejemplo: la insulina se usa para tratar la diabetes. la diabetes.

Como podemos producir toda la insulina Como podemos producir toda la insulina que se necesita para tratar a 400 millones que se necesita para tratar a 400 millones

de pacientes en el mundo?de pacientes en el mundo?

Con una BACTERIACon una BACTERIA

PRODUCCIÓN DE UNA PROTEÍNA

PlásmidoPlásmido(vector de ADN)(vector de ADN)

Plásmido Plásmido pCX-EGFPpCX-EGFP

Animales Transgénicos

Otros sistemas

• Plantas transgénicas

• Animales transgénicos

Animales Transgénicos

ADN humano

Gen de la Insulina

“Vacas que expresan insulina en la leche”

(25 vacas para demanda mundial)

Ovulo de vaca

Introducción

Como?Como?Promotor de las glándulas mamariasPromotor de las glándulas mamarias

Gen de la InsulinaGen de la Insulina

Direccionamos la expresión!!!

Animales Transgénicos

Recolección de los ovocitos

• Obtención de ovocitos a partir de animales sacrificados para consumo

- Progreso genético mínimo - Garantía sanitaria escasa - Uso en Investigación

Aspiración de los folículos antrales Complejos cúmulus-ovocito Lavado de ovarios

Cultivo in vitroCultivo in vitro

=

Animales Transgénicos

Microagujas

Equipo de laboratorioEquipo de laboratorio

Animales Transgénicos

Transgénicos por microinyección de pronúcleos

Gordon et al., 1980 (PNAS)

Transgénesis por microinyección de pronúcleos

Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA

Gordon y col., 1980 (PNAS)

(-)-Mosaicismo-Baja eficiencia (0,003 % Bovino)-Inserción del transgén al azar

(+)-Ampliamente usada

Introducción

Wilmut et al., 1997 Nature 385,810–813.

Clonación oveja Dolly

75 Day Fetus

Tissue cultureFetal cells

FIBROBLAST

oocyte

EXTRACCION DE NUCLEOEnucleated oocyte

FUSIÓN CELULAROVULO ACTIVADO CONNUCLEO DE FIBROBLASTO

7 Days embryo

Recipient cow

Embryo transfer 278days

Cloned calf

PASOS DE LA CLONACIÓNPASOS DE LA CLONACIÓN

ENUCLEACIÓNENUCLEACIÓN

Fotos CyagraFotos Cyagra

PASOS DE LA CLONACIÓNPASOS DE LA CLONACIÓN

TRANSFERENCIA NUCLEARTRANSFERENCIA NUCLEAR

Fotos CyagraFotos Cyagra

Transgénesis por clonación (SCNT )

Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA

Cibelli y col., 1998 (Science)

(+)-Ampliamente usada-Identificar integración del transgén in vitro

(-)-Impronta-Eficiencia 1-3%-Inserción del transgén al azar-Consumo de tiempo

TRANSGENESIS MEDIADA POR TRANSGENESIS MEDIADA POR ESPERMATOZOIDESESPERMATOZOIDES

Además del ADN paterno (función natural), el Además del ADN paterno (función natural), el espermatozoide lleva ADN exógenoespermatozoide lleva ADN exógeno

Ovocito Gen exógenoEspermatozoide

espermatozoide llevando el gen exógeno al interior

del ovocito

ESQUEMA DE LA TECNICAAnimales Transgénicos

Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA

CoincubaciónCoincubación

PlásmidosPlásmidos

EspermatozoidesEspermatozoides

Incubación espermatozoides/plásmidos

ICSI

Pipeta de holding

1er. CP

Espermatozoide

Transgénesis por Espermatozoides

ICSI

Lugar de deposición

Transgénesis por Espermatozoides

ICSI

Sin espermatozoide

Transgénesis por Espermatozoides

Transgénesis mediada por espermatozoides

Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA

(+)-Sencilla-Alta eficiencia

(-)-No ha sido usada en rumiantes-Inserción del transgén al azar-Mosaicismo en embriones

Brinster y col., 1981 (PNAS)

Microscopía confocalMicroscopía confocal

Plásmido marcado color verde (FITC)

Núcleo espermático

color rojo (IP)

Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA

(1000x)

Microscopía confocal de ovocito inyectado

Espermatozoide con ADN exógeno

Núcleo ovocito

Ovocito

Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA

(400x)

qPCR

Copias del plásmido

3x105 moléculas por espermatozoide.

91% GFP tratamiento corto y 91% GFP tratamiento corto y 66% GFP tratamiento largo.66% GFP tratamiento largo.

Caballos 29%

Gatos 26%(Med Vet J. Jarazo)

Vacas 23%

Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA

Cerdos 60%(R. Olivera)

MosaicismoMosaicismo20-60%20-60%

Modificación

Modificación genética a Modificación genética a realizarrealizar

Cutícula (cutina)

Hongo fitopatógeno Fusarium solani

CUTINASA

Sintetizar el gen de la cutinasa con un promotor de glándulas salivales

Transferirlo a una Oveja para que exprese

cutinasa en saliva y aproveche mejor la

oferta forrajera

Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA

Esperanza 1 (25/04/08)

Esperanza 2 (04/08/09)

Dinastía ESPERANZADinastía ESPERANZA

Negativos para el transgén por PCR y Southern blot.Negativos para el transgén por PCR y Southern blot.

Confirmación de paternidad por microsatélites.Confirmación de paternidad por microsatélites.

Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA

Papers y Reconocimientos

Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA

2009 Medalla de Oro OMPI

SBTE 2007 INNOVAR 2008

Leche humanizada de vacaLeche humanizada de vacaINTA Balcarce y Univ. de San MartínINTA Balcarce y Univ. de San Martín

RositaIsaRositaIsa

Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA

GanaderíaGanadería

Bovinos resistentes a la Bovinos resistentes a la “vaca loca”“vaca loca”

Richt y col., 2006.Richt y col., 2006.

Nació Pampa, la primera ternera clonada en la Argentina El proyecto, que duró seis años y tuvo una inversión de 2 millones de dólares, busca obtener

medicación para humanos; el país se ubica entre los nueve países del mundo que fueron

capaces de clonar vacunos

Lunes 12 de agosto de 2002 |

Transgénicos por Clonación

Medicamento producido por animales Medicamento producido por animales transgénicos autorizado por la FDA.transgénicos autorizado por la FDA.

Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA

ATryn® antitrombina humana

GTC Biotherapeutics, Massachusetts.GTC Biotherapeutics, Massachusetts.

Ratones: Modelos de Enfermedades Ratones: Modelos de Enfermedades o para Investigacioneso para Investigaciones

Laboratorio de BiotecnologíaAnimal, FA-UBA

Producción de órganos para xenotransplante:

- Producción cerdos que expresan proteínas humanas que bloquean la acción del complemento (ej. CD59).

- Transplantes de corazón o hígado en forma temporaria hasta la obtención de donante compatible.

1796 Edward Jenner, descubre de la “vacuna” antivariólica. Viruela: Causante en el Siglo XVIII de 60 millones de muertes

Siglo XX: En Mayo de 1980, la OMS declara oficialmente la erradicación mundial de la viruela humana

PasadoLas Vacunas: Primer ejemplo de la utilidad

de los animales de granja en la salud humana.

Animales Transgénicos

PresenteFermentador como bioreactor para producir

vacunas y proteínas recombinantespara la salud humana

Animales Transgénicos

•En el siglo XVIII y en oposición a la tecnología de Jenner, se dijo:

“Existen informes fidedignos de niños que habían empezado a mugir y andar en cuatro patas y de gente con cuernos” por haber sido vacunados.

La realidad demostró lo contrario, ¿hoy en el Siglo XXI, escuchamos comentarios similares?

Siempre se escuchan las voces de los detractores del desarrollo científico

Animales Transgénicos

Futuro