Ingeniería en biotecnología

Alumno: José Francisco Pinedo Garcíaviernes, 13 de marzo de 2015

Docente: Dra. Mayra Judith García RoblesMicrobiología Aplicada

Ensayo conservación de microorganismos, ventajas y desventajas

Introducción Desde tiempos remotos los microorganismos han sido empleados como materiales esenciales de trabajo en la obtención de medicamentos (antibióticos, vitaminas y aminoácidos), elaboración de alimentos (pan, queso, leche, bebidas y licores) y fabricación de solventes y reactivos, entre otras aplicaciones. El creciente uso de estos materiales biológicos en la biotecnología y la protección medioambiental han fortalecido la necesidad de mantener los cultivos microbianos de manera que las propiedades que los hacen importantes permanezcan estables.

La preservación de cepas microbianas no es tarea fácil y debe garantizar la viabilidad, pureza y estabilidad genética de los cultivos, características que coinciden con los objetivos de un buen método de conservación. El conocimiento de las peculiaridades de las disímiles técnicas de preservación existentes para su correcta aplicación, así como el seguimiento continúo de las propiedades de las cepas, propician su empleo como inóculo confiable en la industria, la docencia y la investigación.

Con frecuencia la elección de la técnica más adecuada para conservar cultivos microbianos resulta difícil, pues deben tomarse en consideración los criterios de viabilidad y pureza de las cepas, cambios poblacionales y genéticos, número y valor de los cultivos, costo, suministro y transporte de cepas, así como la frecuencia del uso de los cultivos.

El método de conservación que se elija debe garantizar la supervivencia de al menos el 70 % de las células por un período considerable de tiempo, de forma tal que la población sobreviviente se asemeje a la original como sea posible, conserve las propiedades de importancia de los cultivos y minimice la ocurrencia de los eventos genéticos. De igual manera debe reducir al mínimo el riesgo de contaminación y permitir que la pureza del cultivo permanezca inalterable.

Existen diversas tecnologías para conservar los cultivos entre ellas esta:

Continuo crecimiento Deshidratación Almacenamiento congelando

Todos los métodos para conservar cultivos tienen un protocolo esencial similar:

Chequeo de la pureza del cultivo Preparación de las ampollas Crecimiento del cultivo Suspensión de las células en preservación Dosificación de las células en las ampollas Preservación Unidades almacenadas de ampollas Actualización de la reserva de las ampollas Prueba y recuperación de las ampollas

Desarrollo Existen diversos métodos para conservas cultivos, sin embargo, no existe un método universal, por eso es importante conocer cada uno de los métodos disponibles, sus ventajas y desventajas, para así poder elegir el más adecuado.

Subcultivo regularEl primer método es la transferencia periódica a medio fresco y estériles. Según las literaturas los cultivos conservados de esta manera se mantiene por ciclos alternados de crecimiento. El Subcultivo es una técnica familiar para todos practicantes microbiólogos; se le conoce por las habilidades básicas de asepsia y por ser una técnica sin ningún equipo especial. La frecuencia de transferencia varía con el organismo. Por ejemplo, un cultivo de E. coli tiene que ser transferido a intervalos mensuales. Después de crecimiento durante 24 horas a 37 ° C, los tubos inclinados se pueden almacenar a baja temperatura durante 20-30 días. Para mantener los cultivos viables, es necesario utilizar un medio de cultivo adecuado y una temperatura de almacenamiento adecuada.

Ventajas: Simple, bajo costo, equipamiento requerido bajo

Desventajas: Secado del agar, baja estabilidad genética, riesgo contaminación

Método de parafinaEl segundo método es muy simple y económico para preservar cultivos de bacterias y hongos durante más tiempo a temperatura ambiente.

En este método, parafina líquida estéril se vierte sobre la inclinación del cultivo de los microbios y es almacenado en posición vertical a temperatura ambiente. La capa de parafina evita la deshidratación del medio y asegura condiciones anaeróbicas. Se frena la actividad metabólica por la reducción el crecimiento mediante la reducción de la tensión de oxígeno.

Los cultivos también se pueden mantener cubriendo los tubos en pico de flauta con una capa de aceite mineral estéril alrededor de la mitad pulgada por encima de la superficie de la inclinación. Algunos microorganismos se han conservado satisfactoriamente durante más de 15-20 años por este método. Mientras se conservan los cultivos en aceite hay puntos que deben ser considerados:

§ A menos que el aceite está muy por encima del nivel superior de la medio, el medio tiende a secarse, separarse de la pared del tubo y flotar en la superficie de la pared, en la que incluso los organismos se encuentran generalmente muertos.

§ La calidad del aceite es muy importante, ya que cualquier ranciedad o sustancia tóxica es dañino para los organismos.

§ Es preferible esterilizar el aceite en un horno de aire caliente a 150ºC a 170 ºC durante una hora; pues durante la esterilización con autoclave, la humedad se mezcla con el aceite, dándole una apariencia lechosa.

Ventajas: Bajo costo, equipamiento requerido bajo,

Desventajas: Trabajo moderado, baja estabilidad genética

Almacenamiento en el sueloExisten varios hongos tales como Fusarium, Penicillium, Alternaria, Rhizopus, Aspergillus etc. En los cuales resultó de forma exitosa su almacenamiento en suelo estéril. Este método de almacenamiento en el suelo implica la inoculación de 1 ml de suspensión de esporas en el suelo (el cual ha sido tratado en la autoclave dos veces) y la posterior incubación en cuarto de temperatura por 5-10 días. En este período inicial de crecimiento permite al hongo utilizar la humedad disponible gradualmente hacerse inactivo. Las botellas que los contienen se almacenan en el refrigerador. Y para recuperar el cultivo solo basta con rociar unas pocas partículas en el suelo.

Ventajas: Bajo costo de almacenamiento, tratamiento sencillo, forma fácil de recuperar el cultivo, equipo común.

Desventajas: Estabilidad genética regular, bastantes días para poder almacenarlos, útil solo con hongos.

Almacenamiento en gel de síliceExiste otro método que permite conservar tanto bacterias como levaduras, las cuales se pueden almacenar en polvo de gel de sílice a baja temperatura durante un período aproximado de 1-2 años. En este método, un polvo fino, esterilizado, se enfría, sílice en polvo se mezcla con una suspensión espesa de las células y se almacena a baja temperatura. Esta técnica tiene un principio básico que es la desecación rápida a baja temperatura, que permite que las células permanezcan viables durante un largo período.

Ventajas: Bajo costo de reactivos, metodología sencilla, no requiere equipos muy costosos, viables de cuatro a cinco años, previene todo crecimiento fúngico y disminuye el metabolismo por falta de agua.

Desventajas: el hongo puede continuar su crecimiento, pueden nacer mutantes capaces de crecer bajo las condiciones adversas

Almacenamiento en refrigeradorLos cultivos vivos que se encuentran sembrados en un medio de cultivo pueden ser almacenados de forma exitosa utilizando refrigeradores o cuarto fríos, siempre y cuando la temperatura se mantenga a 4°C. Debido a que en las células a esta temperatura el metabolismo se ve ralentizado de una manera considerable, pero no se detienen por completo.

Como es de esperar la bacteria sigue viva pero es muy lento su metabolismo y por esto solo utilizara unos pocos nutrientes. Sin embargo este método no puede ser utilizado por periodos prolongados ya que el organismo sigue produciendo metabolitos tóxicos los cuales se acumularían en el medio llevando a la muerte a nuestro organismo de interés. Por tanto los refrigeradores se utilizan para conservar organismos por periodos de corta duración.

Ventajas: Reactivos casi nulos, equipo accesible, regular estabilidad genética, sin procesos extensos.

Desventajas: Solo es viable por periodos cortos, riesgo de contaminación,

Almacenamiento por congelaciónUn método de almacenamiento muy utilizado que tiene una viabilidad considerable es el de la congelación. En este método suspensiones bacterianas pueden ser congeladas a una temperatura de -30°C. En este método al igual que el anterior la actividad metabólica se reduce pero de una manera mucho mayor, y en casos extremos donde se utiliza el nitrógeno líquido congelando los organismos a -196°C se dice que el metabolismo se reduce a cero.

El proceso de congelación y descongelación es una técnica conocida por ser disruptores de las células. Un punto a considerar es el agua intracelular, la cual es removida durante la congelación como hielo, provoca que los electrolitos se concentren cada vez más en el agua congelada, lo que es perjudicial por que las concentraciones muy diferentes de electrolitos fuera de la célula a las del interior conduce al estrés osmótico.

Los cultivos se pueden preservar de manera muy eficaz si se congela en presencia de un crioprotector, que reduce el daño por los cristales de hielo. El glicerol o dimetilsulfóxido (DMSO) son comúnmente utilizados como crioprotectores. La forma más sencilla de preservar una cultivo es agregar 15% (v / v) de glicerol al cultivo y luego almacenarlo a -20ºC o -80ºC en un congelador.

El uso de almacenamiento criogénico en ultra-baja temperatura obtenida por la congelación en nitrógeno líquido a -196ºC ha demostrado ser un simple técnica estandarizada para la conservación de una amplia gama de microorganismos y células de mamífero. Unas de las ventajas de almacenamiento con nitrógeno líquido incluyen poca pérdida de viabilidad, la reanimación rápida, fácil disponibilidad como una suspensión de estar y la velocidad de preparación.

Ventajas: Equipamiento requerido bajo, buena estabilidad genética, viabilidad buena, supervivencia alta y poco riesgo de contaminación.

Desventajas: Requiere protectores, Alto costo de freezer (-80ºC). Células pueden ser sensibles al O2, Suministro regular de Nitrógeno líquido

Almacenamiento por liofilizaciónLa congelación seca es la técnica más utilizada para el mantenimiento cultivos bacterianos, por su gran viabilidad y el gran número de organismos e incluso proteínas que se pueden conservar con este método. La congelación seca es también llamada liofilización.

Los cultivos o suspensiones de bacterias o virus se secan y se mantienen en estado seco, son las condiciones adecuadas. Porque si los mismos se secan desde un estado líquido, sucede que una alta concentración de sal se produce en una etapa tardía del secado, con

esto se lleva a una desnaturalización de las proteínas, posteriormente la muerte del organismo y con ello el deterioro del medio.

La liofilización mediante la cual el cultivo o el suero se seca rápidamente en vacío desde el estado de congelación evita en gran medida el problema.

En la liofilización se tienen que realizar múltiples etapas, las cuales se tiene que seguir al pie de la letra para poder asegurar que el organismo sobreviva y pueda ser recuperado en un futuro, las estepas son; comienza con la congelación, una parada temporal de la actividad metabólica, y luego continúa con la eliminación de agua sin descongelar (sublimación), y termina con una producto seco. El producto seco se sella ya sea al vacío o bajo un gas inerte, se pueden almacenar a temperatura ambiente sin más actividad metabólica hasta que el agua y los nutrientes se restauran.

Ventajas: Bajo riesgo de contaminación, buena a regular estabilidad genática, promedio de almacenamiento 20 años, gran número de organismos y sustancias que se pueden almacenar.

Desventajas: Alto costo de equipamiento, se requiere personal calificado y equipo sofisticado, algunos organismos no resisten el proceso.

ConclusiónEs frecuente encontrar que una técnica de preservación resulte más efectiva para un grupo microbiano que para otro, lo que indica que además de considerar los aspectos anteriores es necesario revisar la literatura disponible sobre los microorganismos en cuestión y las alternativas de mantenimiento utilizadas, y adecuarlas a la situación real de la organización. Podemos entonces resaltar que no existe una técnica universal para conservar adecuadamente todos los microorganismos.   

Al analizar la información y los métodos puedo concluir que:

Para conservar un organismo es necesario conocer sus necesidades Para elegir un método adecuado para la preservación es necesario considerar

diversos factores tales como: el organismo, la infraestructura, el personal, cada cuando se pretende utilizar el organismo o como se transportara, entre otros.

Cada método tienes sus ventajas que en algún momento los hace únicos, por lo que puedo decir que ningún método es mejor que otro, sino que depende de las necesidades.

Algunos métodos sin embargo son muy difíciles de realizar debido a que requieren equipos costosos y sofisticados por lo que no todos los laboratorios los pueden usar.

Si se utilizara un método de corto plazo es muy recomendable siempre tener un respaldo con otro método, ya que los métodos a este plazo siempre tienen una viabilidad y estabilidad genética baja.

También es necesario siempre hacer pruebas de calidad para no descuidar las cepas guardas y también siempre es bueno tener en cuanta cuantas cepas tenemos y su tiempo que tienen para así tener un control completo y no cometer errores.