ELISA

ELISA

Ctedra: Inmunologa Especial

Catedrtico: Mag. T.M. Efran Montes Hjar

PRESENTADO Por:

HERRERA ESPINOZA, GUSTAVO

El ELISA se basa e el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica.

Al estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato especifico.

El cual al actuar la enzima, producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro o un colormetro. ELISA (ENSAYO POR INMUNOABSORCIN LIGADO A ENZIMAS)

ELISA DE PRIMERA GENERACIN: Primeros ensayos usaban lisados de VIH purificado, a menudo les faltaba sensibilidad y especificidad.

ELISA DE SEGUNDA GENERACIN: Los ensayos mejorados basados en protenas recombinantes y/o los pptidos sintticos, que tambin permitieron la produccin de VIH 1 y 2 combinados.

ELISA DE TERCERA GENERACIN: tipo sndwich, usan un antgeno marcado como conjugado, muy sensibles, pptidos recombinantes sintticos de VIH-1, 2, 0.

ELISA DE CUARTA GENERACIN: detectan antgenos y anticuerpos, reducen el perodo de ventana, y que adems de detectar anticuerpos detecta el antgeno p24del VIH-1 mediante la introduccin de anticuerpos monoclonales en el soporte slido.

ELISA (ENSAYO POR INMUNOABSORCIN LIGADO A ENZIMAS)

Alta especificidad del anticuerpo por el antgeno.

El ELISA es una tcnica que permite detectar antgenos o anticuerpos en muy baja concentracin en una gamma de muestras biolgicas (suero, LCR, Sangre, Saliva).

Los ELISA ms aplicados son los ELISA Indirecto, ELISA directo, ELISA competitivo y ELISA tipo sndwich.

ELISA

LAS PRUEBAS DE ELISA ESTN BASADAS:

Alta especificidad del anticuerpo por el antgeno.

Amplificacin de reacciones qumicas llevadas acabo por enzimas.

El procedimiento consiste en una reaccin inmunolgica y enzimtica indicadora de la presencia o ausencia de reacciones antgeno anticuerpo.Los antgenos usados en esta prueba son derivados de protenas, lpidos, polisacridos, cidos nucleicos, etc.

FUNDAMENTOAG o AC fijado a una fase solidaAG o AC en la muestraConjugado: AC unido a ENZIMASUTRATOCAMBIO DE COLOR

DISPOSITIVOS EMPLEADOS EN ELISA

Fase solida

Los lectores ELISA son espectrofotmetros

Se han desarrollado mltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificacin de un antgeno en solucin, la deteccin de un anticuerpo en una solucin por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales, o la determinacin de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuacin se describen los ms comunes. La versin ms comn de ELISA es el ensayo sandwich.

TIPOS DE ENSAYO DE ELISA

ELISA DIRECTO:

Fijacin al soporte insoluble con antgenos del paciente que se quieren detectar. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados.

Adicin de anticuerpos marcados (conjugados) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antgenos, el complejo quedar solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.

Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

ELISA

ELISA INDIRECTO

Es el mtodo ms utilizado para la determinacin de anticuerpos. Bsicamente, consiste en la inmovilizacin a la placa de ELISA del antgeno (en los Kits ya viene fijado) del que queremos conocer si en el suero problema existen anticuerpos especficos.El sistema de deteccin emplea dos anticuerpos:Uno primario contra el antgeno, Uno secundario marcado contra el primario.La deteccin tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificacin de seal debida a la unin de dos o ms anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo ms popular.

ELISA

Fases de la tcnica Elisa indirecto. (1) El antgeno se pega a la placa (2) Se aade el suero problema. (3) posteriormente, el conjugado. (4) y por ltimo, el sustrato.

ELISAELISA COMPETITIVO:

En este sistema tambin es muy utilizado para la deteccin de anticuerpos especficos. Se parte de un anticuerpo (monoclonal o policlonal), frente a un antgeno conocido, que previamente ha sido inmovilizado en la placaEn este mtodo, el anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado (anticuerpo marcado con una enzima) por un nmero limitado de sitios de unin del antgeno.Habr ausencia de color en una muestra reactiva debido a que el sustrato no encontrar a la enzima, porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra

Fijacin de anticuerpos especficos al soporte anticuerpos,

Adicin en concentracin conocida de una mezcla de antgenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados con una enzima y antgenos desconocidos (objeto de estudio).

Al mismo tiempo, aadir nicamente antgenos del anticuerpo usado en el paso anterior, marcados con una enzima, lavar.

Agregar un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

ELISA SANDWICH:

En esta forma, la placa suele ya venir con un anticuerpo fijado al soporte (monoclonal policlonal) frente al antgeno problema, sobre el que se aadir segundo anticuerpo marcado con la enzima que se une al antgeno. Por ltimo, se aade el substrato para revelar la reaccin. Se genera un producto coloreado, que puede cuantificarse mediante una curva patrn o en un lector de ELISA.

ELISA

Fases de la tcnica Elisa Sandwich. (1) Un anticuerpo monoclonal o policlonal anti antgeno suele estar ya unido a la placa. (2) se incuba con la muestra problema. (3) se aade el conjugado. (4) por ltimo el sustrato

Estas enzimas son utilizadas en la etapa de deteccin, las cuales unen de manera covalente a mAbs (anticuerpos monoclonales), sin afectar la capacidad de unin a antgenos del anticuerpo, o bien, sin inhibir la actividad de la enzima.

Una gran variedad de sustratos se puede incubar con estas enzimas para generar productos de color susceptibles de cuantificacin mediante espectrofotmetros con placas de microtitulacin.

Las enzimas ms comunes empleadas en la etapa de deteccin son peroxidasa de suero de caballo y la fosfatasa alcalina. A continuacin se describe la preparacin de las enzimas ms comunes:

ENZIMA SUSTRATO TAMPONHRP (peroxidasa de rbano). AP (Fosfatasa alcalina). TMB (tetrametil benzidina).

Durante determinadas reacciones qumicas, la luz generada por este fenmeno constituye una alternativa conveniente y muy sensible para las mediciones de absorbancia en ELISA.

Los tipos de ELISA que recurren a la quimioluminiscencia utilizan un sustrato que genera luz, en lugar del sustrato cromgeno de las reacciones ELISA ordinarias.

Tales son los casos de la oxidacin del compuesto luminol por perxido de hidrgeno y la enzima peroxidasa de rbano (HRP), que producen luz.

La luz que se genera en dichas reacciones puede detectarse gracias a su capacidad de sensibilizar una pelcula fotogrfica. La medicin cuantitativa de la emisin de luz puede hacerse mediante el uso de un luminmetro.

QUIMIOLUMINISCENCIA

La ventaja de las pruebas de quimioluminiscencia sobre las cromgenas es la mejora de la sensibilidad. En general, el lmite de deteccin puede aumentarse al menos diez veces si se cambia un sustrato cromgeno por uno que emita luz, y ms de doscientas veces cuando se adicionan agentes potenciadores.

Una variante de la prueba ELISA, llamada ELISPOT, es capaz de detectar cuantitativamente el nmero de clulas en una poblacin productora de anticuerpos especficos contra un antgeno determinado o un antgeno contra el que se dispone de un anticuerpo especfico.

PRUEBA ELISPOT

Las placas se recubren con el antgeno reconocido por el anticuerpo de inters o con el anticuerpo especfico para el antgeno cuya produccin se valora. se aade a las placas recubiertas una suspensin de la poblacin celular que se investiga e incuba.

Las clulas se disponen en la superficie de la placa, y las molculas secretadas reactivas a las molculas de captura son unidas en la cercana de las clulas secretoras, producindose un anillo de complejos antgeno-anticuerpo alrededor de cada clula que sintetiza la molcula de inters.

Despus, la placa se lava y un anticuerpo unido a enzima especfico para el antgeno secretado, o para la especie de anticuerpo secretado, se aade y deja que se unan.

El posterior revelado del ensayo mediante adicin de un sustrato cromgeno o emisor de luz adecuado indica la posicin de cada clula productora de anticuerpo (o de antgeno) como un punto de color o luz.

Deteccin de antgenos o anticuerpos: Virus, Hongos, Parsitos, Bacterias.Deteccin de auto anticuerpos: IgG (Factor reumatoideo), DNA, Protena del ncleo.Medicin de Hormonas: Progesterona, estrgenos, cortisol, insulina, testosterona, gonadotropina corinica humana, TSH.Deteccin de antgenos tumorales: Antgeno prosttico Alfa-fetoprotena, Antgeno carcinoembrionario.

APLICACIONES DEL ELISA

La tcnica de ELISA es utilizada en estudios serolgicos, hematolgicos, endocrinolgicos, oncolgicos, en los trasplantes, la medicina forense y la antropologa.

Con propsitos mdicos se han aplicado en la determinacin de hormonas y protenas plasmticas, antgenos tumorales, drogas, Ag y Ac de microorganismos (parsitos, hongos, bacterias, virus).

Los resultados aportan elementos diagnsticos, informacin de una enfermedad y coadyuvan en la planificacin del tratamiento.

CONCLUSIONES

GRACIAS!!!POR SU ATENCIN