ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)Prueba Inmunoadsorbente Ligado a Enzimas

Mayela Lpez

M. Fernanda RodrguezAlexander Romero

ELISA HISTORIA1959 Yalowy Berson, precursor de los ensayos inmunoenzimticos que fueron descritos originalmente en 1971 por Engvall y Perlmann, y Van Wemeny y Schuurs.El uso de material radiactivo ha limitado el uso del radioinmunoensayo, y a la ves a popularizadp el empleo del inmunoensayo enzimtico (EIA), del que hay dos tcnicas principales: El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas El ensayo inmunolgico multiplicado por enzimas.

ELISALa prueba de ELISA se basa en la reaccin antgeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser de reactividad conocida. El color se genera por la interaccin de un sustrato cromognico y una enzima que ha sido acoplada al anticuerpo detector. Si debe medirse el anticuerpo, se coloca el antgeno en la fase slida, como una capa de captura. Despus de la reaccin del antgeno con el suero del paciente, la capa de deteccin puede ser un reactivo antiinmunoglobulina clase especfica (IgM o IgG) para detectar respuesta de anticuerpos clase especficos

ELISALos mtodos de ELISA dependiendo de la actividad enzimtica se dividen en dos tipos: Competitivos No competitivos

ELISAELISA COMPETITIVO: En este mtodo, el anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado por un nmero limitado de sitios de unin del antgeno. Habr ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrar a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.

ELISAELISA NO COMPETITIVO: Consiste en enfrentar la muestra con el antgeno o anticuerpo que est en la fase slida. Si una muestra es positiva se formar el complejo antgeno-anticuerpo y al agregar el conjugado reaccionar con el respectivo sustrato desarrollando color

ELISADentro de los no competitivos tenemos: Los directos que detectan antgenos Los indirectos que detectan anticuerpos.

ELISAPasos generales de un ELISATapizado del pocillo con el antgeno o anticuerpoAdicin de la muestra problema con la mezcla de antgenos o anticuerposUnin del antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o antgeno tapizado en el posillo.Lavado del pocillo para eliminar el exceso de anticuerpo o antgeno no unidoAdicin del anticuerpo secundario marcado con la enzimaUnin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpoLavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unidaAdicin del sustratoUnin del sustrato a la enzimaDesarrollo del color

ELISA Competitiva (1)

ELISA Competitiva (2)

ELISA Competitiva (3)

ELISA Competitiva (4)

ELISA Competitiva (5)

ELISA Competitiva (6)

ELISA Competitiva (7)

ELISA Competitiva (1)

ELISA Competitiva (9)

ELISA Competitiva (10)

Ejemplos

Dengue Virus Es un virus de ARN de cadena simple con un dimetro de 50 nm. Pertenece a la familia de los Flaviviridae Se distinguen cuatro grupos serolgicos: DEN- 1DEN-2 DEN-3 DEN-4

DENGUE...La infeccin con un serotipo no produce inmunidad para los otros. El Aedes aegypti constituye el principal vector del dengue.

Dengue...Imgenes clnicas: Periodo de incubacin de 1 a 2 semanas con escalofros. Dolores de cabeza Dolores de miembros y msculos.

Dengue...Dengue hemorrgico: Petequias Fuertes hemorragias nasales Vmito de sangre Melena Hematuria La agravacin de la enfermedad deriva en el Sndrome de Shock.

Utilizacin de la prueba El inmunoensayo se utiliza para la determinacin cualitativa y semicualitativa de anticuerpos IgG especficos contra Dengue- Virus en suero o plasma humano.

Principio del Ensayo Las tiras de micropocillos (fase slida) estn recubiertas con antgenos especficos del Dengue- Virus. Los anticuerpos presentes en la muestra se unen a los antgenos inmobilizados en la placa.

Principio...El conjugado de anticuerpos IgG anti humano con peroxidasa del rbano, se une a los complejos antgeno anticuerpo en muestras positivas. Despus de incubarse, los complejos muestran una coloracin azul, al incubarlos con TMB.

Principio...Finalmente, se aade cido sulfrico para detener la reaccin ( azul - amarillo); la densidad se mide con un lector de ELISA a 450 nm.

ProcedimientoReparticin y Posicin de las muestras. Se Grada la incubadora a 37+1 C. Se pipetean 100 ul de controles y muestras en los pocillos respectivos. Se recubren las tiras con los autoadhesivos. Se incuba 1h + 5 min. Despus de incubar, se retira el autoadhesivo y se realiza el lavado.

Procedimiento...Pipetea 100 ul del conjugado anti IgG. Se incuba 30 min a temperatura ambiente. Repetir el lavado. Se pipetea 100 ul de sustrato de TMB. Incuba 15 min en oscuridad a temperatura ambiente. Se aade la solucin de paradaSe mide la extincin de la solucin con 450/620nm por 30 min.

ETI- LKM1 y ETI mitocondrial Permite la determiacin cualitativa de autoanticuerpos dirigidos contra el citocromo P450 (LKM1) y las enzimas mitocondriales (M2A/M2C) en suero humano.

Principio del Ensayo Los pocillos de la microplaca se recubren con los antgenos. Al aadir las muestras, , el anticuerpo se une a los pocillos recubiertos. En estos se incub IgG conjugada con la enzima peroxidasa del rbano contra IgG humano. Se aada cromgeno y se lee con el espectrofotmetro.

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