ELECTROFORESIS

Electroforesis

Electroforesis Es la separacin de las distintas especies se basa en sus diferencias de comportamiento bajo la influencia de un campo elctrico aplicado

Electroforesis Reglas que describen los factores de la electroforesis.Los iones negativos tienden a migrar hacia el voltaje mas alto (positivo) los iones positivos migran hacia el voltaje mas bajo (negativo)

La velocidad promedio de migracin de una especie de analito es proporcional a la carga promedio del in

La velocidad promedio de migracin de una especie de analito es proporcional al voltaje promedio que se aplica

La velocidad de desplazamiento promedio de un in es inversamente proporcional a su seccin transversal promedio

Electroforesis Reglas que describen los factores de la electroforesis.La electroforesis separa los iones segn sus diferentes relaciones de carga con respecto al tamao

La calidad de las electroseparaciones en lquidos mejora cuando se mantiene constante la temperatura en el curso de todo el experimento

Los mtodos analticos en la clasificacin de electroseparaciones se aplican para separar y cuantificar analitos de 100 108 de peso molecular

ElectroforesisReglas que describen los factores de la electroforesis.La primera informacin que se requiere antes de llevar a cabo una separacin electrofortica es estimar las cargas de la matriz

Las molculas adquieren diferente carga neta en funcin de pH de la solucin amortiguadora.

Es probable que a un pH distinto las movilidades inicas se modifiquen y se logre una mejor separacin.

Los puntos isoelctricos permite la separacin de una mezcla de protenas

Movilidad electroforticaEs un proceso en el que un gradiente de potencial produce el transporte de las partculas cargadasFelec = Froz Z e WE = Fv

= v/E = Z E/f = movilidad electroforticaZ = numero de cargas de unidadE = valor del campo elctrico V = velocidad de las partculas F = coeficiente de rozamiento

Electroforesis La movilidad electroforetica de una molcula depende directamente de sus carga e inversamente del coeficiente de rozamiento, que depende directamente del tamao, forma de la molcula y la viscocidad del medio.

La migracin de las partculas depende del pH del medio en que estn, ya que su carga neta depende del pH

ElectroforesisEl amortiguador ejerce dos funciones Lleva la carga elctricaDetermina la carga neta de las molculas

Cuanto mayor es la fuerza inica, mas estrechas son las bandas de separacin

ElectroforesisSeparacin electrofortica en gel

Los geles que se emplean son redes tridimencionales de cadenas de polmeros y los espacios entre las cadenas estn llenos de lquido.Las redes polimricas actan como tamices que retrasan e inclusive bloquean la migracin de analitos de gran tamao, sin embargo, los iones pequeos pueden moverse con libertad

Electroforesis Geles de agarosa

Geles de poliacrilamida

Electroforesis Gel de agarosa es un polisacarido de alta pureza, polmeros de azucar que se refina a partir del agar.Se prepara a una concentracin de 0,4 a 2 % p/v gelifica a 40 C Concentraciones mas bajas presentan canales de mayor tamao. Estos geles son bastantes frgiles.

ElectroforesisGel de poliacrilamidaLa poliacrilamida es ms resistente que la agarosa y se forma irreversiblemente por un proceso de polimerizacin de radicales libres El monmero de acrilamida se enlaza covalentemente para formar cadenasCon la N,N- metilen-bis- acrilamida, la cual enlaza a dos cadenas de polmero

Gel de poliacrilamida

ElectroforesisLos geles de agarosa y poliacrilamida tienen caracteristicas comunes

Son fciles de moldear, en tubos de diametro de 5 mm (geles de tubo o de disco).En capilares de 0,5 mmEn placas Los geles estn libres de carga inicas

ElectroforesisLa fabricacin de geles de buena calidad es una destreza muy apreciada, hay que controlar tantos detalles al fabricar el gel que se requiere mucha prctica, adems, deber utilizarse estnderes internos en los anlisis por electroforesis en gel.

Electroforesis en tabique en gel

ElectroforesisElectroforesis de acetato de celulosa

Las membranas de acetato de celulosa tiene la ventaja de ser qumicamente ms homogenea y poder transportarse, una vez teida o reveladas las sustancias que se separan, podrn cuantificarse por densitometria de transparencia

ElectroforesisElectroforesis capilar

La velocidad de separacin como la resolucin de los componentes mejora a medida que se incrementa el campo elctrico aplicado.

La seccin transversal de la solucin en el aparato de electroforesis capilar se reduce drsticamente efectuando dicho proceso en el interior de un tubo capilar de un dimetro de 0,1 mm y longitud de 50 cm hasta 1 metro. EZC

Electroforesis capilar

ElectroforesisElectroforesis capilar

La tcnica tiene un alto poder de resolucin se han desarrollado mtodos que permite efectuar electroforesis de molculas neutras no inicas

Eficiencia Resolucin

Electroforesis capilar

Aplicacin de la muestra

Se aplica la muestra por.

Inyeccin de alto voltajeInyeccin de presin

Electroforesis capilar

Inyeccin de alto voltajeCon el voltaje desconectado, se cambia el recipiente del amortiguador en el electrodo positivo por otro que contiene la muestra y se introduce este aplicando brevemente el voltaje. A continuacin, tras desconectar de nuevo el voltaje, se sustituye el recipiente del amortiguador, se aplica otra vez el voltaje y comienza la separacin

Electroforesis capilar

Inyeccin a presin

En la inyeccin de presin, se separa el capilar del recipiente positivo del amortiguador y se inserta en la muestra. Este se introduce en el capilar aplicando presin y luego se lleva el capilar al recipiente positivo del amortiguador y se aplica el alto voltaje.

Electroforesis capilar

Detectores

Los detectores principales que se utilizan son:Absorcin en el ultravioleta/ visibleFluorescencia ConductividadEspectrometria de masas

Electroforesis capilar

Los lmites de deteccin son de unos 0.00000001 M en el Ultravioleta y visible. Utilizando la fluorescencia se obtienen limites mejores, y con lseres a lmites de10-16 M

Electroferograma

Aplicaciones ELECTROFORESIS DE ZONA Las protenas son separadas casi exclusivamente sobre la base de su carga elctrica superficialEs inerte y no impide ni estimula el flujo de las molculas en el campo elctricoSolucin amortiguadora (alcalino)Suero humano

Aplicaciones PERFIL ELECTROFORETICOAcetato de celulosaAgarosa Poliacrilamida Las protenas migran entre 60 a 90 minutos con una diferencia potencial de de 2-3 V/cmAlbuminaAlfa 1 globulinaAlfa 2 globulinaBeta globulinaGamma globulina

Aplicaciones INMUNOELECTROFORESIS Es una tcnica que combina la especificidad de las reacciones de inmunoprecipitacin con la separacin de molculas por electroforesis en un medio de cribado molecular Lleva el antigeno desde el posillo de aplicacin en una suspencin homogenea del anticuerpo en el gel Produce una migracin unidireccional del antigeno esto proporciona una sensibilidad mayorSe utiliza como procedimiento cualitativo cuantitativo para identificar protenas

Aplicaciones Fases de la inmunoelectroforesis IEP

Primera fase.- Se separan por electroforesis, de acuerdo a su carga, las sustancias antignicas en el medio que se analiza.

Segunda fase.- Caracterizacin inmunolgica de cada una de las protenas separadas, se deja que se difunda un antisuero, general o especfico para la proteina que quiera identificarse

Aplicaciones PERFIL ELECTROFORETICOAl difundirse el suero por el gel, se produce la reaccin antigeno anticuerpo, produciendose el precipitado de complejos inmunitarios

Aplicaciones SUERO NORMALHIPERGAMMAGLOBULINEMIAHIPOGAMMAGLOBULINEMIAMACROGLOBULINEMIA

Aplicaciones Inmunoensayos competitivosInmunoensayos no competitivosHormonas endocrinasInmunoensayos homogeneos y heterogeneosIndicadores de lesin cardiovascular Hepatitis

Aplicaciones Marcadores tumoralesIndicadores de lesin cardiovascularMonoclonales PoliclonalesInmunoanalisis mediadas por enzimasDeterminacion de plasmidosAislamiento de plasmidos quimericosConstruccion de genes anti sens

Aplicaciones Amplificacin por PCRAmplificacin por RTPCRHibridaciones Secuenciacin de genes Western blotHibridacin in situDeterminacin de acidos nucleicos