EFECTO DE POLIAMINAS EXÓGENAS EN LA EMBRIOGÉNESIS … · Científica de Yucatán, A.C., y que a...
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::; CICY ( POSGRADO EN ) CIENCIAS ( BIOLÓGICAS Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. Posgrado en Ciencias Biológicas EFECTO DE POLIAMINAS EXÓGENAS EN LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DE CHILE HABANERO (Capsicum chinense Jacq.) Tesis que presenta STEPHANIE LÓPEZ EROSA En opción al título de MAESTRO EN CIENCIAS (Ciencias Biológicas: Opción Bioquímica y Biología Molecular) Mérida, Yucatán, México 2012
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( POSGRADO EN
) CIENCIAS ( BIOLÓGICAS
Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.
Posgrado en Ciencias Biológicas
EFECTO DE POLIAMINAS EXÓGENAS EN LA
EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DE CHILE
HABANERO (Capsicum chinense Jacq.)
Tesis que presenta
STEPHANIE LÓPEZ EROSA
En opción al título de
MAESTRO EN CIENCIAS
(Ciencias Biológicas: Opción Bioquímica y Biología Molecular)
Mérida, Yucatán, México
2012
•
CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA DE YUCA TÁN, A. C.
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
CICY
RECONOCIMIENTO
./
. CIENCIAS BIOLÓGICAS
Por medio de la presente, hago constar que el trabajo de tesis titulado EFECTO DE
POLIAMINAS EXÓGENAS EN LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DE CHILE HABANERO
(Capsicum chinense Jacq.) fue realizado en los laboratorios de la Unidad de Bioquímica y
Biología Molecular de Plantas del Centro de Investigación Científica de Yucatán , A.C. bajo
la dirección de la Dra. Nancy Santana Buzzy, dentro de la opción de Bioquímica y Biología
Molecular de Plantas, perteneciente al Programa de Posgrado en Ciencias Biológicas de
este Centro.
Atentamente,
Dr. Osear A. Moreno Valenzuela
Director Académico
Mérida, Yucatán, México, 13 de junio de 2012.
•
DECLARACIÓN DE PROPIEDAD
Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos
Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las
actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó para
desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación
Científica de Yucatán, A.C. , y que a razón de lo anterior y en contraprestación de los
servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados, dicha información, en términos
de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, le pertenece
patrimonialmente a dicho Centro de Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya
manifestado, reconozco que de igual manera los productos intelectuales o desarrollos
tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo correspondiente a dicha información, le
pertenecen patrimonialmente al Centro de Investigación Científica, A.C. , y en el mismo
tenor, reconozco que si derivaren de este trabajo productos intelectuales o desarrollos
tecnológicos, en lo especial, éstos se regirán en todo caso por lo dispuesto por la Ley
Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, en el tenor de lo
expuesto en la presente Declaración.
Firma:_fi=....L........J._
Nombre: Biol. Stephanie López Erosa
•
DEDICATORIAS
A mis padres
Al término de esta etapa de mi vida, quiero expresar un profundo agradecimiento a
quienes con su ayuda, apoyo y comprensión me alentaron a lograr esta hermos'a realidad.
Por todo el tiempo que les robé pensando en mí. Porque gracias a su apoyo y consejo he
llegado a realizar la más grande de mis metas, la cual constituye la herencia más valiosa
que pudiera recibir y con la promesa de seguir siempre adelante.
Con amor y respeto .
AGRADECIMIENTOS
•:• A mi buen Dios, por su gracia , amor y perdón inmerecidos y por darme fortaleza en los momentos difíciles.
•:• A mis padres Antonia Erosa y Eduardo López, a mis hermanos, Keila y Eduardo así como a mi cuñado Tiburcio Hernández y mi sobrinito Edrick por su · ayuda, apoyo, comprensión y amor.
•:• A mis tíos: Luisa Palomino y Eliseo Erosa.
•:• A la Dra . Nancy Santa Buzzy por su asesoría, apoyo y dirección durante este proceso de realización profesional.
•:• A los técnicos: Adriana Canto Flick, Eduardo Balam Uc y Francisco Javier García Villalobos por su ayuda en el trabajo técnico.
•:• A los miembros de mi comité tutorial : Dr. Manuel Robert, Dr. Neftalí Ochoa Alejo, Dr. José Luis Casas por sus comentarios, sugerencias y críticas para el enriquecimiento de este trabajo.
•:• A los miembros de mi comité evaluador: Dra. lleana Echevarría Machado, Dr. Manuel Robert, Dr. Manuel Martínez Estévez, Dr. Neftali Ochoa Alejo.
•:• A mis compañeros del laboratorio: Alejandrina Pereira Patrón, Emily Elizabeth Marín Collí, Susana Avilés Viñas, Daniela Salís Marroquín , Raúl Enrique Valle Gough, Carlos Alberto Lecona Guzmán, Cristina Castillo Gutiérrez, Mario Puc Chan , ltzamná Salas por sus consejos, amistad y apoyo moral , y en especial a la Dra. Eunice Gómez Uc, Dr. Jericó Jabín Bello Bello y al M.C. Carlos Fernando Regla Márquez por su inmensa ayuda en los detalles finales a mi documento.
•:• Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por otorgarme la beca para concluir mis estudios de maestría (Becario: 240239).
•
ÍNDICE
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 1
CAPÍTULO 1 ..................•.•..••••••..........................................•.•..•..•••••.•..•••••••••..................... 3
ANTECEDENTES ... . ...... . .. ... .... ... .. ... .... .. .... .. ..... .... ...... ... .. ... .. ... ... .. ... . .... .. ............ ...... . .................. 3
1.1 GÉNERO CAPSICUM .. .... .. .. .................. ................ .... .. ............ .. .................................... .. ........... 3
1.2 CHILE HABANERO (CAPSICUM CHINENSE JACQ.) . .. .... .. .. ..................................... . . . .... . .... . ... . 3
1.2.1 TAXONOMÍA. ...... .. ........ .................. .... .. .. .. .. .... .... .... ............................. ............................. 4
1.2.2 CARACTERÍSITCAS BOTÁNICAS ..... ............... .................... ................. ..... .. ..... .... .. ............... 5
1.2.3 USOS E IMPORTANCIA ECONÓMICA. .. .. .. ...... ........ .. ............................................................ . 5
1.2.4 PROBLEMÁTICA DEL CULTIVO ..... .. .. .. ............ .. .......... .... .. ........ ............ .. ...... .... ................ ... 6
1.3 CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES ........ .. .... .. .. .... .. .. .. .... .. ........ .. ...................... .. ........ .. .. ... 6
1.3.1 PRINCIPIOS BÁSICOS DEL CULTIVO DE IN VITRO . ...... .. .. ...... .... ... ..... ... . ... .. . ............ ...... 7
1.3.2 EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA ..... .. ............. .. .. ... ..... ..... .. .. ........... ... . . . . . ......... .. . . ....... ... . . .. 8
1.3.2.1 TIPOS DE EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA .. .. .......... .. .. .. ............ .. ................................ .. ...... 9
1.3.2.2 ETAPAS DE LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA ........... .. .................................................... . 9
1.4 POLIAMINAS ........... .......... .. ........ ............. ... ..... ... .. ... .. . ... .... .. . . , .......... .. ........................ . ....... 1 O
1.4.1 GENERALIDADES EN PLANTAS .. .. .. ............. .... .. . ................ .. .......... .. ...... ....................... .. .. 10
1.4.2 TIPOS DE POLIAMINAS ..... .... .... .. ...................... .. .. .. ........ ... ........ .. ................................... .. 12
1.4.3 POLIAMINAS INUSUALES O POCO COMUNES .................. ................. .. ................... .............. 14
1.4.4 FUNCIONES DE LAS POLIAMINAS ..... .. .. ....... .. . .... .. . ... .. ............ .. ... . . .... . . ... ... ... . . ....... . ... . 14
1.4.5 B IOSÍNTESIS Y METABOLISMO ............ .. .................... .. .......... .. .. .. ............ .... .... .. ........... .... . 16
•
ÍNDICE
1.4.5.1 BIOSÍNTESIS DE PUTRESCINA . ... .. . .. ..... .. ..... .. .... .................... ..... .... .. . ... ... .... ............. .. 16
1.4.5.2 BIOSÍNTESIS DE LA ESPERMIDINA Y ESPERMINA ........... .... ..... .... ... ....... .. ............. ... .... .. 17
1.4.5.3 CATABOLISMO ···· ·· ······ ···· · ······ ····· ··· ·· ··· ·· ······· ··· ···· ·· ·· ···· ···· ·············· ·········· ········· ·· ······· 18
1.4.6 INHIBIDORES DE LA BIOSÍNTESIS DE POLIAMINAS ...... .... .... ..... ...... . .... .. .. ...... ........ .. ...... .. .. .. 19
1.4.7 ANTECEDENTES DE POLIAMINAS EN LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA.
... .... .. ... ...... .... .. ....... ......... ... ..... ...... .. ...... ... .. ...... ... .. ... .. .... .. ...... .... .... ...... ... .. ..... . ... .... ........ 21
1.4.8 ANÁLIS IS DEL CONTENIDO ENDÓGENOS DE POLIAMINAS ... ..................... ....... ... .. ... .... .. ....... 22
HIPÓTESIS ...... ... .. ...... . ... ... ... .... .. ... ...... ....... . ..... ....... .. ... ........ ... ... .... .. .... ....... .............. . .. .. .. ... ..... . 25
OBJETIVO GENERAL. . .. .. ... ........ .. .. .... ..... ..... .... ......... .............. ..... ........................ .... .. .. .. .......... 25
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... .... .... .. ..... .. .... .... .... .. ..... .... ....... ... ... ... ...... .. .. ... ... ............... ........... 25
JUSTIFICACIÓN . ....... ...... ...... .... ..... .. ... .. .... ....... .. .. .. .... .. ........ .. ...... ............... . ............ ... .... ... .. ..... 26
ESTRATEGIA EXPERIMENTA L ... ...... .. .... . ...... .. ...... ... ..... ... .. ..... ... .... ... .. ...... .... ...... .... ........ ..... .. 27
BIBLIOGRAFÍA ... . ..... ..... .... .. ... .... ... .. .. ... .. .... .. ... ....... .. . .... ... ..... ........ .. .. .... ...... .. .... ... . .... ... .. ... .... .. .. 28
CAPÍTULO 11 ............... ................................................... .. ...... ............. ........ .................... 37
EFECTO DE LA APLICACIÓN EXÓGENA DE POLIAMINAS SOBRE LA EFICIENCIA DE LA EMBRIOGÉNESIS
SOMÁTICA DE CHILE HABANERO ...... ... ... .... .. .. .... .. .. .. .. ... . ..... ... ...... ..... ......... ... ... .. ........ ........ .... .... ..... 37
2.1. INTRODUCCIÓN . ........... .... .... .. .... ...... ...... .. .. ...... .. ........ . .... .. ...... ... ... .. .. ... ... .... .. .. .......... .. 37
2.2. MATERIALES Y MÉTODOS . ..... .. .... ... ..... ...... ... .. ..... ..... ....... . .. ....... . . ..... .. .. .... ........ ....... .. 38
2.2.1 LUGAR EXPERIMENTAL. .. ............. .. .. . ....... ... ............ .... . ............... ... ..... .... ... ... . .... ... ........ 38
2.2.2 FUENTE DE EXPLANTES . ... ... . ...... . .. ... .... ... .. ....... .... ...... . .... ....... ....... .. .. .. ..... ... .......... .. .... . 38
2.2.3 DESINFECCIÓN DE LAS SEMILLAS .. ..... .. ....... .. ... .... ... .. ... .... ... .... ........... ..... .. ..... .... ........... 38
2.2.4 INDUCCIÓN DE LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA . ... ... ....... ... ... .. ... .. ...... .. ... .. .... ..... .. ... .. ... .. .. 39
¡¡
ÍNDICE
2 .2.5 ADICIÓN DE POLIAMINAS E INHIBIDORES DE BIOSÍNTESIS DE POLIAMINAS AL MEDIO DE
CULTIVO ... .... .. ..... ... .. .. ..... .... ...... .. . .. .. ... ........ .. ... .. ... . .... .. .. .. ... .. ... ... .......... ............. ... ........ .. .. ... 39
2 .2 .6 EFECTO DE PAS EXÓGENAS SOBRE LA EFICIENCIA DE LA ES DE CHILE HABANERO .. .. .. .... 40
2 .3 RESULTADOS . ... ........ .... .. .......... .......... . .... .. .. .. ..... .. .. . ...... . ....... . .... ................................ . 41
2 .3 .1 INDUCCIÓN DE LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA. ···· ··· ························· ·· ·· ·· ····· ·; ················· 41
2 .3 .2 EFECTO DE POLIAMINAS EXÓGENAS SOBRE LA EFICIENCIA DE LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA
DEL CHILE HABANERO .... . ... ...... .. . ..... .. ... ..... ... ......... ... .. ..... .. .......... .............. ................ ..... ...... 42
2 .3 .3 EFECTO DE INHIBIDORES DE LA BIOSÍNTESIS DE POLIAMINAS SOBRE LA EFICIENCIA DE LA
EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DE CHILE HABANERO . .... ..... .. ......... ....... .... .. ..... ............ ... ....... ... .... 48
2.4 DISCUSIÓN . ........................................... ..... .. ...... .. .. .. .. .... ..................... ........ .. .. ... .... ... . .. . 49
2 .5 BIBLIOGRAFÍA ................ ... ....................... .. ......... ........ ..... ........ .. ...... ............................. 52
CAPÍTULO 111 ............................................................................................ ...................... 55
COMPORTAMIENTO DE LAS POLIAMINAS ENDÓGENAS EN EMBRIONES SOMÁTICOS DE CHILE HABANERO
TRATADOS CON POLIAMINAS EXÓGENAS .... .. .. .. .. ... . .. .... .. .. .. . ..... ..... ......... .. .. ...... . ... ... .... ... ......... ....... 55
3 .1 . INTRODUCCIÓN ..... ...... ........ .. ... ... .... .... .. .. ......... . ... .... ...... .. . ...... ........ ... .............. ........... 55
3 .2 . MATERIALES Y MÉTODOS ..... ..... ..... . .... .. .... . .... ... .... ...... .... .. ... ..... . ... ... .................... .... . 56
3 .2 .1 CONDICIONES GENERALES .... .... ......... ... .. ... ....... .. .... .... .. ............. .. .. .......... .. ... ............... 56
3 .2.2 OBTENCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL ...................... ... .. : ... ..... .. ............. ................ ......... 56
3 .2 .31NDUCCIÓN DE LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA. .. . ... ......... .. ... .. .. ... .. .... ............................. 56
3 .2.4 ANÁLISIS DE ESTÁNDARES DE POLIAMINAS ....... ........ . ... ..... .......... ... .. ............. . ..... .......... 56
3 .2.5 ADICIÓN DE POLIAMINAS AL MEDIO DE CULTIVO ....... . .. .. ... .. ... ..... ......... .. ...... .................... 57
3 .2 .6 GERMINACIÓN DE EMBRIONES SOMÁTICOS ................ .. .... ... .. .. ........... .. ............. .......... .. 57
3.2.7 EFECTO DE LAS POLIAMINAS EN LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA .... ... .. ..... ....... ........... .. .... 58
¡¡¡
ÍNDICE
3.2.8 CUANTIFICACIÓN DE POLIAMIANAS ENDÓGENAS EN LOS EMBRIONES SOMÁTICOS ..... ... ..... 59
3.2.9 PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE POLIAMINAS ... ...... ... ... .. .... .. ... ...... ... 59
3.3 RESULTADOS ... ... ............. ... ..... ....... ..... ... ...... ........ ... .... ... ...... ... ... ..... .. .. ..... .. .... ..... .. ...... 62
3.3.1 ANÁLISIS DE ESTÁNDARES DE POLIAMINAS ....... ...... ...... ....... .. ... .................. ...... ... ...... ... 62
3.3.2 EFECTO DE PUT EN EL CONTEN IDO DE PAS TOTALES DE ESS DE CHILE HABANERO . ...... .. 64
3.3.3 EFECTO DE SPD EN EL CONTENIDO DE PAS TOTALES DE ESS DE CHILE HABANERO ......... 66
3.3.4 EFECTO DE SPM EN EL CONTENIDO DE PAS TOTALES DE ESS DE CHILE HABANERO ....... 68
3.3.5 EFECTO DE PAS EXÓGENAS EN LA GERMINACIÓN DE LOS ESS DE CHILE HABANERO ....... . 70
3.3.6 EFECTO DE LOS INHIBIDORES DE LA BIOSÍNTESIS DE PAS EN EL CONTENIDO ENDÓGENO DE
PASEN ESS DE CHILE HABANERO ............... .. ........ .. .. .. ... .. ............... ........ ... .................. .. ....... 71
3.4 DISCUSIÓN ... .. .. .... ..... . .... ................................. .............. .................. ..... .. .... .... .... ... ... .... .... 73
3.5 BIBLIOGRAFÍA . . ...... .. ... .. . ... ... .... .. ....... .. ... .. ... .... .......... .. ................ ................... ......... .......... 77
CAPÍTULO IV .................................................................................................................. 83
4.1 DISCUSIÓN GENERAL .......... .. ..... ... .... .. ... ... ...... .. ...... ...... ... .. .... ...... ..... ........ ................... .. .... 83
4.2 CONCLUSIONES ............ .. ... .. .... ... ... ... ......... .... ...... .. ................. ... .. ...... ........... .. .... .. ... .... ..... 87
4.3 PERSPECTIVAS . .. .... .. .... .. ... ... .. .. .... . ............... ..... ........... ................ ........... ........... .. ...... ...... 88
4.4 BIBLIOGRAFÍA. .......... .. ..... .. ...... . ......... .. . .... ...... .. ............. ............... .. . ... ..... ............ ... .......... 89
IV
•
ÍNDICE
LISTADO DE FIGURAS
Figura 1.1 Principios básicos del CTV y comportamiento de los cultivos ........................... 8
Figura 1.2 Estructura química de las PAs más comunes ... .. ............ .. .. .. .......................... 11
Figura 1.3 Biosíntesis de la cadaverina. ......... ........ ........ .. .... .. .. .. .. ................ .. ...... .. .......... 12
Figura 1.4 Biosíntesis de las PAs . .... .. .. ...... .. .............. .... .... .. .... .. .. .. .. ............................... 18
Figura 1.5 Vía de biosíntesis y catabolismo de las PAs en las plantas ........ .. .................. 19
Figura 1.6 Reacción del cloruro de dansilo con ami nas . .... .. ...... .. .. ........................ ........ .. 23
Figura 2.1 Embriones somáticos de chile habanero en diferentes estad íos ........ ............ . 41
Figura 2.2 Efecto de la Put exógena sobre la eficiencia de la ES de C. chinense en un litro
de medio de cultivo .... .. ... .... ..... .... ....... .... ..... .. .. ......... ... ........ .. ... .... ................................. 42
Figura 2.3 ESs de los tratamientos con Put. .... .. .... .... ...... .. .. .... .. .. .. .. .. .... .......... ............ .. .. 43
Figura 2.4 Efecto de la Spd exógena sobre la eficiencia de la ES de C. chinense en un
litro de medio de cultivo .. ...... .. .. .... .. .... ...... .... ...... .. ...... .. .. .. ............................................... 44
Figura 2.5 ESs de los tratamientos con Spd .... ........ ...... .... .. .... .. .... .................... ...... ...... .. 45
Figura 2.6 Efecto de la Spm exógena sobre la eficiencia de la ES de C. chinense en un
litro litro de medio de cultivo .................... .. ...... .. .. .... .. .. ........ .. .. .............................. .. ...... .. 46
Figura 2. 7 Desarrollo de los ESs con Spm exógena . .................... .. ...................... ........ ... 4 7
Figura 2.8 Efecto de los inhibidores de la biosíntesis de PAs sobre la eficiencia de la ES
de C. chinense en un litro de medio de cultivo ........ .............. .. ............ .. ........................... 48
Figura 3.1 Perfil de elución de la mezcla de estándares de PAs .......... .... .......... ............ .. 62
Figura 3.2 Curva de calibración de las PA a distintas concentraciones .............. ...... ........ 63
V
•
ÍNDICE
Figura 3.3 Contenidos totales de Put, Cad, Spd y Spm en ESs de chile habanero tratados
con Put exógena a distintas concentraciones .......... .... .... ........................ 00 .. 00 00 00 00 00 00 .... 00. 64
Figura 3.4 Contenido de PAs unidas, conjugadas y libres en los ESs tratados con Put a
diferentes concentraciones ....... ... ...... ................. ....... .. ... .. ............. ................. ...... ....... .. .. 65
Figura 3.5 Contenidos totales de Put, Cad, Spd y Spm en ESs de chile habanero tratados
con Spd exógena a distintas concentraciones ... 00 00 00 00 .. .. 00 00 .. 00 .. 00 .. 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 .. 00 .. 00 00 66
Figura 3.6 Contenido de PAs unidas, conjugadas y libres en los ESs tratados con Spd a
diferentes concentraciones ...................... ............. .... .. ....... .................... ............. ..... ..... .. . 67
Figura 3.7 Contenidos totales de Put, Cad, Spd y Spm en ESs de chile habanero tratados
con Spm exógena a distintas concentraciones. 00 00 00 00 00 00 00 .... 00 00 00 00 .. 00 00 00 00 .. 00 00 .. 00 00 00 00 00 00 00 00 00. 68
Figura 3.8 Contenido de PAs unidas, conjugadas y libres en los ESs tratados con Spm a
diferentes concentraciones .. ...... .... ............ .. ......... .. ......... .. .. ... .... ......................... .... ... ..... 69
Figura 3.9 Germinación de los ESs de chile habanero. 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 .. 00 00 00 0000 00. 70
Figura 3.1 O Contenidos totales de putrescina, cadaverina, espermidina y espermina en
ESs de chile habanero tratados con inhibidores de la biosíntesis de PAsoo .. ooooooooooooooooooo· 71
Figura 3.11 Contenidos de PAs unidas, conjugadas y libres en los ESs tratados con los
inhibidores de la biosíntesis de PAs. 00 00 00 0000 00 00 00 00 00 00 00 00 00 0000 00 0000 00 00 00 00 .. 00 00 00 .. 00 00 00 00 00 00 00 000 00 00 00 72
vi
ÍNDICE
LISTADO DE CUADROS
Cuadro 1.1 PAs libres más comunes ... .... .... ... ........... .. ..... ........ ...... ... .... ....... ................. .. 13
Cuadro 3.1 Tratamientos de PAs e inhibidores de la biosíntesis a evaluar .. ...... .. ......... ... 58
vii
ÍNDICE
viii
•
ABREVIATURAS
ADC
AIH
Cad
CHA
DFMA
DFMO
ES
ESs
LDC
MGBG
CPA
ODC
PAs
Put
SAM
SAMd
SAMDC
Spd
SPDS
Arginina descarboxilasa
Agmantina iminohidrolasa
Cadaverina
Ciclohexilamina
Difluorometilarginina
Difluorometilornitina
Embriogénesis somática
Embriones somáticos
Lisina descarboxilasa
Metilglioxal-bis-guanilhidrazona
N-carbamoil putrescina aminohidrolasa
Ornitina descarboxilasa
Poliaminas
Putrescina
S-adenosilmetionina
S-adenosilmetionina descarboxilada
S-adenosil metionina descaboxilasa
Espermidina
Espermidina sintasa
ix
Spm
SPMS
•
Espermina
Espermina sintasa
X
RESUMEN
Se llevaron a cabo estudios sobre el efecto de las poliaminas (PAs) en la embriogénesis
somática (ES) del chile habanero (Capsicum chinense Jacq.). En una primera etapa del
trabajo se determinaron los efectos de la putrescina (Put), la espermidina (Spd) y la
espermina (Spm) (0.01, 0.1 y 1.0 mM de cada una) sobre la eficiencia de la ES,. que se
observó no fueron significativos; solamente con la Spd hubo una tendencia a disminuir el
número de ESs conforme aumentó la concentración añadida. Con los tratamientos con la
Spm se observó un mejor desarrollo de los ESs. También se evaluó el efecto de PAs
exógenas así como de inhibidores de la biosíntesis de las mismas sobre su contenido
endógeno. Solamente se detectaron Put y Cad en los tratamientos; sin embargo , los
contenidos fueron menores con respecto al tratamiento control. También se observó que
las PAs se encontraron mayormente en su forma unida, y estando ausentes en su forma
libre. Los inhibidores de poliaminas ciclohexilamina (CHA) y aminoguanidina (AG) (0.1 y
1.0 mM), inhibidores de la biosíntesis y catabolismo de las poliaminas, redujeron el
número de ESs producidos cuando fueron comparados con el control. Durante la
germinación de los ESs tratados con PAs, principalmente con Spm, éstos emitieron sus
cotiledones así como también se notó una armonía en la parte apical y radical , y un
cambio en su coloración tornándose verde. Este comportamiento puede estar relacionado
con el rol de las enzimas de la biosíntesis de las poliaminas en la actividad fotosintética .
En los tratamientos con los inhibidores de la biosíntesis, se pudo observar que a
diferencia del control solamente se detectó la diamino Put a niveles significativamente
menores a los del tratamiento control. Con AG (0.1 y 1.0 mM), los contenidos endógenos
de Put tendieron a disminuir conforme aumentaron las concentraciones evaluadas.
Cuando se comparó el control con el tratamiento con CHA, se observó que en este último
disminuyeron los niveles endógenos de Put. Las PAs en su forma conjugada fueron las
más comunes, específicamente Put, ya que como se mencionó anteriormente, fue la
única PA detectada en los tratamientos.En conclusión, podemos mencionar que las
poliaminas en chile habanero son compuestos importantes en diversas etapas de la ES ya
que se observó que la adición de Spm (0.01, 0.1 y 1.0 mM) mejoró el desarrollo de los
ESs, así como también la germinación de los mismos. También se evidenció que la Cad
es una PA característica de esta especie.
ABSTRACT Studies were conducted on the effect of polyamines (PAs) in somatic embryogenesis (SE)
of the Habanero pepper (Capsicum chinense Jacq.). In a first stage of this work, the effect
of the putrescine (Put) , spermidine (Spd) and spermine (Spm) (0.01 , 0.1 and 1.0 mM of
each) on the efficiency of the SE, was investigated and no significant differences were
observed ; only Spd showed a trend to decrease the number of SEs with in<(reasing the
added concentration. With the Spm treatments a better development of SEs was achieved .
We also evaluated the effect of exogenous PAs and inhibitors of the biosynthesis and
catabolism of the PAs biosynthesis on the endogenous content. Just Put and cadaverine
(Cad) were detected in the treatments; however, the contents were lower compared with
the control. lt was also noted that the PAs were found mostly in the bound form, and being
absent in its free form. Polyamine inhibitors like cyclohexylamine (CHA) and
aminoguanid ine (AG) (0.1 and 1.0 mM) reduced the number of SEs produced when
compared to control. In the germination of SEs issued their PAs treated cotyledons was
noted as well as harmony in the apical and radical a change in color turns green. This
behavior may be related to the role of enzymes in the biosynthesis of polyamines in the
photosynthetic activity.
In the treatments with inhibitors of the biosynthesis, it was observed that unlike the control
was detected only diamino Put at significantly lower levels to the control treatment. With
AG (0.1 and 1.0 mM), the endogenous Put content tended to decrease with increased
concentrations. CHA decreased endogenous levels of Put when compared with the
control. The PAs in conjugated form were the most common , namely Put, because as
mentioned earlier, was the only PA detected in the treatments. In conclusion , the
polyamines are important compounds at various stages of the SE in Habanero pepper
since it was observed that the addition of Spm (0.01 , 0.1. and 1.0 mM) enhanced the
development of SEs as well as the germination process. lt was also found that Cad was
the PA characteristic of this species.
INTRODUCCIÓN
Estudios recientes muestran el efecto de las PAs exógenas sobre la ES de especies tales
como Araucaria angustifolia (Steiner et al., 2007) Momordica charantia L. (Paul et al.,
2009), Coffea canephora y arabica (Calheiros et al., 1994), Panax ginseng (Kevers et al. ,
2000) entre otras. En chile habanero se cuenta con un reporte de la influencia de las PAs
en inducción de brotes y regeneración de plantas de Capsicum frutescens Mili realizado
por Kumar et al. (2007); sin embargo, no se encontraron reportes sobre el estudio de las
PAs en la ES en C. chinense, hasta que Regla-Márquez (2011) realizó una
caracterización de estos compuestos nitrogenados en los embriones somáticos (ESs) .
El presente trabajo está enfocado a estudiar el efecto de la adición de las PAs al medio de
cultivo durante el desarrollo de los ESs de chile habanero.
2
CAPÍTULO 1 ANTECEDENTES
1.1 Género Capsicum
CAPÍTULO 1
El género Capsicum, fue descrito por Nikolaus Joseph von Jacquin, pertenece a la familia
Solanaceae e incluye de 20 a 30 especies. Esta familia es originaria de Sudamérica
teniendo dos centros de domesticación, uno en América Central y otro en la región Andina
de Sudamérica (Paran et al., 2007).
Al menos cinco de sus especies son cultivadas a nivel mundial. Sin embargo, la mayor
producción de chiles está dada por Capsicum annuum L. Los estudios taxonómicos
coinciden en que son cinco las especies domesticadas: Capsicum baccatum, C. chinense,
C. pubescens, C. frutescens y C. annuum. Este último agrupa la mayor diversidad de
chiles, silvestres o cultivados.
La propiedad química que separa al género Capsicum de otros grupos vegetales, es un
alcaloide denominado capsaicina, una sustancia cristalina potente y acre, que no existe
en ningún otro género. La cantidad de capsaicinoides presentes en los chiles varía
considerablemente de especie a especie. La habilidad de producir capsaicinoides está
determinado por un único gen C dominante, también conocido como Pun1 (Paran et al.,
2007). Los factores medioambientales hacen que las condiciones bioquímicas de las
células del chile sean alteradas dando origen a la variación en la cantidad de
capsaicinoides de manera individual en cada fruto.
1.2Chile habanero (Capsicum chinense Jacq.)
El origen del chile habanero proviene de las tierras bajas de la cuenca Amazónica y
posteriormente se fue dispersando a Perú durante la época prehispánica (González
Estrada et al., 2006).
El estado de Yucatán cuenta con la mayor diversidad de chiles criollos en el país, en
donde se encuentra el chile habanero (Capsicum chinense Jacq.) . La mayoría de las
plantaciones comerciales de chile habanero están localizadas en la península de Yucatán,
en donde se cosechan alrededor de 1 ,500 toneladas anuales, pero también se pueden
3
CAPÍTULO 1
encontrar en la parte norte y centro de México, Belice y algunas islas del Caribe. 1
El cultivo de chile habanero en el estado de Yucatán ocupa el segundo lugar de
importancia en cuanto a la superficie de siembra de hortalizas, después del j itomate
(Solanum lycopersicum) debido a que en la actualidad se establecen entre 800 y 1,000
hectáreas. La mayor superficie del cultivo se encuentra en la parte norte del estado y
contribuye con más del 90% del volumen de producción estatal , que en su mayor parte se
comercializa y se consume en fresco, y solo una pequeña parte se utiliza en la ihdustria
como materia prima para la elaboración de salsa picante (Trujillo et al. 2004).
El chile habanero es uno de los chiles de mayor pungencia o picor (registra de 200,000 a
500,000 unidades Scoville) debido a su alto contenido del alcaloide capsaicina, por lo que
es muy apreciado en el mundo (Curry et al., 1999). El contenido nutricional del chi le es
alto, es fuente de vitaminas, particularmente de la C, y en los tipos pungentes secos de
vitamina A (Tun Dzul , 2001 ).
1.2.1 Taxonomía
De acuerdo al Código Internacional de Nomenclatura Botánica la taxonomía de chile
habanero se describe como sigue:
Reino: Plantae
Subreino: Embriophyta
Clase: Angiosperma
Subclase: Dicoti ledónea
Superorden: Sympétala
Orden: Tubiflorae
Familia: Solanaceae
Género: Capsicum
Especie: C. chinense Jacq.
4
•
CAPÍTULO 1
1.2.2 Características botánicas
El chile habanero, biológicamente, es una planta perenne, pero dependiendo del manejo
agronómico puede alcanzar hasta 12 meses de vida. Su altura es variable, pero en los
cultivares comerciales puede oscilar entre 75 y 120 cm. Las semillas son lisas, ovaladas y
pequeñas (2.5 a 3.5 mm); tienen testa de color café claro o café oscuro y su período de
germinación varia entre 8 y 15 días.
Tiene raíz pivotante y un sistema radicular bien desarrollado. Su tallo es grueso, erecto,
glabro y robusto (Tun Dzul, 2001 ). Las hojas son simples, lisas y de forma lanceolada, de
tamaño variable. Pueden ser glabras o pubescentes con un tamaño superior a los 15 cm
de longitud y de ancho. Las flores son de color blanco; su tamaño varía entre 1.5 y 2.5 cm
de diámetro de la corola, pueden presentar racimos de hasta 6 flores, dando lugar a un
promedio de 3 frutos.
Los frutos se clasifican como una baya poco carnosa; son huecos y tienen entre tres,
cuatro o más lóculos; las semillas se alojan en placentas blancuzcas y secas, que no
están envueltas por mucosas, y las membranas de los lóculos generalmente no se
prolongan hasta el centro. Los frutos suelen ser de tamaño y forma variables, su sabor
siempre es picante, aunque el grado de pungencia depende de la variedad (Tun Dzul,
2001 ).
1.2.3 Usos e importancia económica
El chile habanero tiene gran importancia, especialmente en la Península de Yucatán, ya
que es uno de los mayores productores de este cultivo , y fuente de empleo y sustento
económico para muchas familias. Este cultivo se emplea como materia prima en diversas
industrias; en la industria alimenticia, por ser uno de los chiles de mayor pungencia o
picor, es consumido en fresco en las comidas típicas de la región así como también para
la elaboración de salsas, conservas, curtidos, entre otros. Otra importancia es que del
chile habanero se pueden extraer pigmentos como carotenoides y antocianinas que se
emplean para dar color a cosméticos, pinturas y alimentos. El uso industrial más
innovador es la extracción de la oleorresina de la cual se obtiene la capsaicina pura la
cual se util iza de igual forma en la alimentación humana y animal, en la medicina y en la
5
•
CAPÍTULO 1
seguridad personal para la elaboración de gas lacrimógeno. Otros usos del chile habanero 1
son para recubrimiento de sistemas de riego o eléctricos para protección contra roedores
y, por su alta capacidad corrosiva como componente en pintura para barcos (Paran et al.,
2007).
1.2.4 Problemática del cultivo
Actualmente, el cultivo de chile habanero atraviesa por una serie de circunstancias
adversas, entre las cuales están: carencia de semillas certificadas que aseguren una
producción de calidad , problemas al establecer cultivos de calidad homogénea, problemas
fitosanitarios, así como polinización cruzada, factores medioambientales adversos, falta
de asesoría técnica, etc. (Latounerie et al., 2006). El mejoramiento y propagación
convencional han contribuido significativamente al mejoramiento genético de plantas; sin
embargo, uno de los principales retos que se tienen es, por un lado, la necesidad de
incrementar la productividad, y por otro disminuir los costos de producción (Monda! et al.,
2004).
La aplicación de las modernas técnicas biotecnológicas, por medio del cultivo de tejidos
vegetales, puede resolver mucho de estos problemas, ya que es posible propagar
plántulas en forma masiva a través de la micropropagación. Estas técnicas requieren
sistemas óptimos de regeneración in vitro. Actualmente, ya se tiene un protocolo de ES
directa de alta eficiencia en medio líquido para la regeneración in vitro de chile habanero
(Avilés-Viñas, 2007). Sin embargo, en éste y otros trabajos en el que también se emplean
otras rutas morfogenéticas, se constata que el genero Capsicum es recalcitrante a la
morfogénesis in vitro, por lo que se están realizando estudios histológicos, bioquímicos y
moleculares para determinar la causas de este fenómeno.
1.3 CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
El cultivo de tejidos vegetales (CTV) es el conjunto de técnicas que permite el
establecimiento, mantenimiento y desarrollo de cualquier parte de una planta, desde una
célula hasta un organismo completo, bajo condiciones artificiales, axénicas y controladas.
Esta poderosa herramienta permite la propagación de grandes volúmenes de plantas en
menor tiempo; así como el manejo de las mismas en espacios reducidos (Pérez Molphe
6
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CAPÍTULO 1
Balch et. al., 1999). La base biológica que ,ha determinado el desarrollo de esta
herramienta biotecnológica es la totipotencia celular vegetal , característica que
teóricamente tienen todas las célu las vegetales para desarrollar nuevos individuos a partir
de la planta de procedencia.
1.3.1 Principios básicos del cultivo de tejidos in vitro
Pérez Molphe Balch et al. (1999) mencionan los principios básicos del CTV, de cuya
comprensión y manipulación depende el éxito o fracaso de cualquier trabajo (Figura 1.1)
estos son los siguientes:
1) Elección del explante. Se llama explante al órgano, tejido o segmento de tejido
vegetal que va ser utilizado para iniciar el cultivo. En teoría cualquier segmento de
tejido vegetal que contenga células vivas puede ser utilizado como explante. Entre
más joven y menos diferenciado sea un tejido, más fácil será su adaptación y
respuesta al cultivo in vitro.
2) Elección del medio y condiciones de cultivo. El medio de cultivo consiste en dos
grupos de componentes. Los primeros son los esenciales, es decir aquellos que
satisfacen los requerimientos nutricionales básicos del tejido cultivado (nutrientes
minerales, fuente de carbono y algunas vitaminas) . El segundo grupo de
compuestos son los llamados opcionales, a este grupo pertenecen las fitohormonas
o reguladores de crecimiento vegetal.
3) Condiciones asépticas. Evitar la contaminación con microorganismos es un
aspecto básico que se debe tener en cuenta para el éxito, no solamente en el
establecimiento de los cultivos si no es su posterior incubación y manipulación.
La respuesta de un tejido al cultivo in vitro depende de la interacción entre el explante, el
medio y las condiciones de cultivo. Esta respuesta se puede dar como organogénesis
(formación de órganos adventicios como raíces y brotes), ES (formación de embriones a
partir de células somáticas), formación de tejido calloso o simplemente desarrollo del
tejido.
7
•
-Expl•nte
Ralees Adventfci•s
T 0116AHOGENESIS
DIIIKTA
1 t t Brotes
Adventicias
1
RfSPUlSTA
Condiciones Aciptic ..
Medios de cultivo
Desarrollo
CAPÍTULO 1
, ~Tejido ,
/ C•lloso \
Ofi(;AHOGENESIS INOIIIKTA
Figura 1.1 Principios básicos del CTV y comportamientos de los cultivos (Pérez Molphe Balch et
al. , 1999).
1.3.2 Embriogénesis somática
Una de las características más notables del CTV es que ciertas células y bajo ciertas
condiciones in vitro, tienen la capacidad de formar embriones mediante un proceso muy
similar a la embriogénesis cigótica (EC). A este proceso se le denomina embriogénesis
somática (ES) y es una de las pruebas más notables de la totipotencialidad celular (Pérez
Molphe Balch et al., 1999).
Los embriones somáticos tienen, al igual que los cigóticos, la capacidad de formar una
nueva planta después de la germinación , con la diferencia que la somática es asexual, por
lo tanto, las plantas obtenidas serán igual a la planta donadora de la célula inicial (Pérez
Molphe Balch et al., 1999).
La ES no es un proceso que suceda únicamente en cultivos in vitro, de hecho es común
en familias de plantas y se conoce como apomixis. La ES es el proceso por el cual las
células somáticas se dividen formando estructuras bipolares y sin conexión vascular al
tejido materno, pasando por una serie de etapas características a la EC, pero sin que
ocurra fusión de gametos (William y Maheswaran , 1996).
8
•
CAPÍTULO 1
1.3.2.1 Tipos de embriogénesis somática
Existen dos tipos de ES in vitro, la directa y la indirecta.
• En la ES directa, los embriones aparecen directamente sobre el explante original.
• En la ES indirecta es necesario obtener un tejido calloso o bien una suspensión
celular embriogénica a partir del cual se obtendrán los embriones somáticos
(Pérez Molphe Balch et al., 1999).
1.3.2.2 Etapas de la embriogénesis somática
La ES pasa por una serie de etapas en la que cada una de ellas requiere estímulos y
fenómenos diferentes. Estas . etapas son: la inducción, la histodiferenciación, la
maduración, la germinación y la conversión del embrión, las cuales se describen a
continuación (Pérez Molphe Balch et al., 1999):
Inducción. Es el proceso de conversión de una célula somática a una célula
proembriogénica. Se considera que los factores determinantes para que suceda el
proceso de inducción son: genotipo de la planta, grados de diferenciación de las células
del explante, presencia de auxinas y aislamiento celular.
Histodiferenciación. Las masas de células proembriogénicas, que se formaron en la
inducción, se diferencian formando embriones somáticos, mediante una división y una
diferenciación celular simultáneas. Para que estas células cesen su multiplicación y pasen
a una fase de diferenciación se requiere la eliminación de las auxinas exógenas. Uno de
los fenómenos in iciales en esta etapa es el establecimiento de una polaridad en las
masas de células pro-embriogénicas. Durante la etapa de histodiferenciación, los
embriones somáticos pasan por una serie de estadios intermedios muy similares a los que
ocurren en la embriogénesis cigótica . En las dicotiledóneas estos estadios son: globular,
de corazón, y de torpedo, mientras que en las monocotiledóneas son: globular coleoptilar
y escutelar (Pérez Molphe Balch et al., 1999).
Maduración. En esta etapa del proceso, el ácido abscísico reprime la embriogénesis
somática y reduce la frecuencia de anormalidades de desarrollo. Se caracteriza por la
deposición de sustancias de almacenamiento en las células pro-embriogénicas, represión
de la germinación y adquisición de tolerancia a la desecación (Thorpe, 1995).
Germinación. Es el proceso de elongación y reactivación metabólica de un embrión
somático maduro para convertirse en una plántula. Para que esto suceda se requieren
9
•
CAPÍTULO 1
estímulos como la luz, el ácido giberélico o citocininas. Como estos embriones carecen de
tejidos de reserva, su germinación sólo ocurre in vitro en donde el medio de cultivo aporta
nutrientes.
1.4 POLIAMINAS
1.4.1 Generalidades en plantas
Las poliaminas (PAs) son cationes orgánicos nitrogenados de bajo peso molecular
encontrados en todas las células eucarióticas e íntimamente involucrados y requeridos
para distintas funciones biológicas (Tabor y Tabor, 1984; Jian-Ying y Robert, 2006). Su
principal característica es la de poseer a lo largo de su esqueleto carbonado varios grupos
amino (Carmona, 1997). Para conocer su función han sido estudiadas en animales y
bacterias por más de 50 años para conocer su función .
Por su carácter policatiónico pueden unirse y formar complejos con moléculas
polianiónicas, como proteínas, fosfolípidos, pectinas , ADN, ARN, entre otras (Galston
1983; Galston y Kaur-Shawney, 1987). Debido a estas características, las PAs afectan la
actividad celular, y como consecuencia están involucradas en una amplia gama de
procesos fisió logicos que van desde el crecimiento y desarrollo vegetal hasta la protección
contra el estrés biótico y abiótico (Guye et al., 1986; Evans y Malmberg, 1989; Bais y
Faust y Wang 1992; Ravishankar, 2002).
Las principales PAs que se encuentran en los seres vivos son la putrescina (Put) (butano-
1, 4 diamina) , espermidina (Spd) [N-(3-aminopropil) butano 1-4 diamina] y espermina
(Spm) [NN' -bis- (3-aminopropil) butano 1 ,4 diamina] (Evans y Malmberg, 1989; Galston
Kaur-Shawney, 1990) (Figura 1.2).
10
•
Putrescina
HzN~N~NHz H
Espermidina
H HN~N~N~NHz
2 H
Espermina
CAPÍTULO 1
Figura 1.2 Estructura química de las PAs más comúnes (Jiang-Ying y Robert, 2006).
La cadaverina (Cad) (C5H14N2) también conocida como 1 ,5-diamino
pentametilenodiamina, pentano-1 ,5 diamina, es una diamina no común en plantas, que se
obtiene por la descomposición del aminoácido lisina. Se encuentra en la materia orgánica
muerta (cadáveres) y es parte del fuerte olor a putrefacción . Sin embargo, en las plantas
superiores se ha encontrado en varios géneros de la familia Leguminoseae y sólo
esporádicamente en algunos miembros de otras familias como Crasulaceae y Araceae.
Recientemente se detectó por primera vez la presencia de esta poliamina en raíces
transformadas de una especie de Datura; los autores plantean que la ocurrencia de esta
PA en las raíces puede ser una consecuencia de la transformación o una respuesta a
estrés (Echevarría , 2003).
La Cad se forma por la descarboxilación de la lisina, reacción catalizada por la enzima
lisina descarboxilasa (LDC, EC 4.1 .1.18) como se muestra en la Figura 1.3.
11
•
coo
H2N~NH2 Lisina
LOC
Cadaverina
Figura 1.3 Biosíntesis de la cadaverina.
CAPÍTULO 1
Para conocer la función de las PAs se necesita saber cuál es su concentración en la
célula . Ésta se encuentra influida por diversos eventos tales como: nivel de síntesis y
degradación de las mismas, su compartamentalización , si se transporta o no a través de
la planta, así como su conjugación con otros compuestos en la célula. Estos procesos
regulan los niveles de PAs libres en la célula, los que a su vez regulan el crecimiento y
desarrollo vegetal (Echevarría, 2003).
La biosíntesis de las PAs está estrechamente relacionada con la del regulador del
crecimiento etileno, ya que la S-adenosii-L-metionina (SAM) es un intermediario común en
ambas rutas metabólicas (Tabor y Tabor, 1984).
1.4.2 Tipos de poliaminas
Las PAs pueden presentarse en forma libre o conjugadas a compuestos fenólicos del tipo
del ácido cinámico y sus derivados (Martin-Tanguy, 1985), a otros compuestos de bajo
peso molecular (péptidos, ácidos grasos) o a macromoléculas tales como proteínas,
ligninas y ácidos nucleicos (Galston y Sawhney, 1990). A continuación se describen
ambos tipos:
a) Libres. Las principales PAs celulares, las PAs alifáticas, adoptan una estructura
lineal pero flexible, lo que es la base para algunas de sus propiedades (Cuadro
1.1 ).
12
•
CAPÍTULO 1
Cuadro 1.1 PAs libres más comunes (Evans et al., 1989).
Fórmula desarrollada Nombre Abreviatura
HzN-(CHzh-NH-(CHzkNH-(CHzh-NHz Espermina Spm
HzN-(CHzkNH-(CH2)3-NHz Espermidina Spd
HzN-(CHzkNHz Putrescina Put
HzN-(CHzh-NHz Diaminopropano Dap
HzN-(CHz)s-NHz Cadaverina Cad
b) Conjugadas. En vegetales las formas conjugadas mejor conocidas son las
asociadas a péptidos o a moléculas de bajo peso molecular como ácidos fenólicos,
amidas de ácidos hidroxicinámicos, las cuales son solubles en el citoplasma
(Galston y Kaur-Sawhney, 1990).
En función de su solubilidad se distinguen dos tipos principales de conjugados:
1. Solubles en agua con al menos un grupo amino libre. Se incluyen las PAs alifáticas
(Put, Spd y Spm), las cuales forman complejos con compuestos de bajo peso
molecular y son solubles en el citoplasma de la célula y se encuentran protegidas
contra la degradación durante su transporte a través de la planta.
2. Insolubles en agua en las cuales todos los grupos amino primarios o secundarios han
sido combinados. Se incluyen aminas alifáticas, aromáticas (tiramina, dopamina ,
serotonina, octopamina, triptamina, etc.), y macromoléculas como la celulosa de la
pared celular y sitios aniónicos de las membranas. Debido al alto peso molecular de
este complejo, las PAsen este estado no se presentan en el citoplasma celular.
13
CAPÍTULO 1
La PAs conjugadas se forman por una unión amida, utilizando ésteres de CoA que provee
los grupos carboxilos activados requeridos. Las reacciones de conjugación podrían
regular las funciones de las PAs; por ejemplo, pueden afectar su unión e interacción con
los ácidos nucleicos (De la Peña, 2003) .
1.4.3 Poliaminas inusuales o poco comunes
En este tipo de poliaminas se encuentran aquellas cuya distribución en la naturaleza está
más limitada que las poliaminas típicas (Put, Spd y Spm). Estas son: 1 ,3-diaminopropano,
cadaverina (Cad), nor-espermidina (o termina), homo-espermidina, termoespermina, nor
espermina (o caldina), homo-espermina, canavalmina, caldopentamina y caldohexamina
(Carmona, 1997). La función de estos compuestos es muy poco conocida, si bien, se les
han atribuido papeles de protección específicos, tanto en bacterias como en las plantas
adaptadas a ambientes extremos. Las largas cadenas de PAs poco comunes, como la
termoespermina, son esenciales en bacterias termófilas para proteger a las enzimas de la
desnaturalización por calor (Galston y Kaur-Sawhney, 1990).
1.4.4 Funciones de las poliaminas
Los niveles de PAs son muy sensibles a condiciones externas tales como la luz, la
temperatura y varios extremos biológicos, químicos y físicos; pero, por otro lado, la
aplicación exógena de PAs a las plantas o algunas partes de ellas pueden producir
efectos tales como la prevención de la senescencia y la formación de embriones (Galston
y Kaur-Sawhney, 1990). En las diversas respuestas fisiológicas que inducen, se incluyen
la estimulación de la división celular, la formación de túbulos, la iniciación de la raíz, la ES,
el desarrollo de flores y la maduración de frutos. Las PAs son mucho más abundantes en
las plantas que los fitorreguladores como giberelinas y citocininas, y se requieren
cantidades del orden milimolar para que se induzca una respuesta biológica (De la Peña,
2003).
Las PAs aumentan la estabilidad del complejo de los nucleosomas y participan en la
condensación y remodelación de la estructura de la cromatina y, por lo tanto, en la
transcripción y replicación del ADN. Se sabe que procesos de acetilación que modifican a
las histonas pueden acetilar también a las PAs. Las PAs protegen al ADN de la
14
•
CAPÍTULO 1
degradación enzimática, degradación por rayos X y gamma (y), de las especies reactivas • del oxígeno, por radicales libres y por calor. En este caso, la capacidad de compactación
del ADN y la capacidad de secuestrar radicales libres, son los atributos principales de la
PAs que brindan estabilidad y protección del ADN. Además, debido a su carácter de ácido
débil, podría amortiguar el citoplasma en condiciones de estrés ácido (Rodríguez y
Domínguez, 2007) .
Investigaciones realizadas in vitro e in vivo con Helianthus tuberosus L. han demostrado
que el máximo nivel de síntesis de PAs se encuentra justo antes de la replicación del ADN
y la división celular, por tal motivo, se propone que existe una alta correlación entre los
niveles de poliaminas y ciertos eventos del ciclo celular en plantas (Serafini et al., 1989).
Cuando se presentan bajas tasas de síntesis de estas moléculas y de división celular, el
contenido endógeno de PAs disminuye (Egea y Mizrahi, 1991). En consecuencia, el
proceso de crecimiento está afectado positivamente por la presencia y actividad de las
PAs (Faust y Wang, 1992).
Las PAs, además de ser esenciales para el crecimiento, bajo condiciones apropiadas,
pueden ejercer funciones específicas de control de la morfogénesis. Tabor y Tabor (1984)
demostraron que en mutantes de la levadura de Saccharomyces cereviseae incapaces de
sintetizar niveles suficientes de PAs, se presentan problemas en el crecimiento. Por
ejemplo, aquellos mutantes que no pueden sintetizar suficiente Spd crecen, pero son
incapaces de esporular. Este hecho demuestra que la Put puede sostener el crecimiento y
que las otras PAs son necesarias para llevar a cabo la diferenciación celular.
Las PAs promueven el crecimiento de algunos tejidos. En un gran número de plantas se
ha relacionado la presencia de PAs con órganos y tejidos en crecimiento activo y con
diferentes procesos de diferenciación y morfogénesis. Por ejemplo, la formación de
nódulos y raíces en Phaseolus aureus Roxb, la determinación en el meristemo del tallo
del desarrollo vegetativo o reproductivo en Sinapsis alba L. (Havelange et al., 1996), la
iniciación y el desarrollo floral, la formación del polen, el desarrollo del fruto en el chícharo
(Pisum sativum L.) (Evans y Malmberg, 1989; Marquínez et al., 2001;), la formación del
embrión en zanahoria (0. carota) (Bastola y Minocha, 1995) y la germinación de semillas
15
•
CAPÍTULO 1
(Galston y Flores, 1991; Bais y Ravishankar, 2002). La aplicación exógena de PAs retarda
la destrucción de clorofilas e induce la síntesis de 'ADN y la división celular (Siocum et al.,
1984).
1.4.5 Biosíntesis y metabolismo
La vía de biosíntesis de las poliaminas ha sido establecida en muchos organismos
(Kusano, et al., 2007) y se puede dividir en dos pasos principales:
1.- Síntesis de la diamina Put a partir de los aminoácidos básicos L-ornitina (Orn) y L
arginina (Arg),
2.- Síntesis de las poliaminas Spd y Spm a partir de Put y del aminoácido L-metionina
(Met) (Figura 1.4).
1.4.5.1 Biosíntesis de la putrescina
Las plantas superiores comparten con las bacterias la existencia de dos vías alternativas
para la síntesis de la Put y las restantes poliaminas. La diamina Put se origina a partir de
los aminoácidos básicos, arginina y ornitina, mediante procesos de descarboxilación
catalizados por dos enzimas claves en la regulación de su biosíntesis como son la
arginina descarboxilasa (ADC, EC 4.1.1.19) y la ornitina descarboxilasa (ODC, EC
4.1.1.17). En definitiva, se consideran dos posibles rutas para la síntesis de la Put: una
directa (vía de la ODC) y otra indirecta (vía de la ADC) (Carmona, 1997; Mendoza y
Rocha, 2002) (Figura 1.4).
En la vía directa la Put se origina a partir de la Orn mediante una única reacción de
descarboxilación catalizada por la ODC. La vía de la ADC resulta más compleja y requiere
la formación de varios compuestos intermediarios previamente a la Put. El primer
intermediario es la agmatina, producida por la descarboxilación de la Arg mediante la
acción de la enzima ADC. En el siguiente paso la agmatina es hidrolizada para formar N
carbamoilputrescina con liberación de amoniaco, estando mediada dicha reacción por la
agmatina iminohidrolasa (AIH, EC 3.5.3.12). En última instancia, la N-carbamoilputrescina
da lugar a la Put por la acción de la enzima N-carbamoilputrescina amidohidrolasa
16
•
CAPÍTULO 1
(NCPAH, EC 3.5.1.53) . Se ha de tener en cuenta que existen vías de interconversión
entre los aminoácidos, Arg y Orn . La transformación de la Arg en Orn es una vía directa,
muy activa en plantas y está mediada por la arginasa (EC 3.5.3.1) y en ella se libera urea.
La transformación en sentido contrario; sin embargo, es más compleja , menos activa e
implica la realización de una serie de reacciones que en su conjunto se define como el
ciclo de la ornitina (Bagni y Tassoni, 2001 ).
1.4.5.2 Biosíntesis de la espermidina y espermina
La biosíntesis de la Spd y la Spm, es llevada a cabo mediante la adición sucesiva de
grupos propilamino a los extremos de la molécula de Put en reacciones que están
catalizadas por las aminopropiltransferasas. El donador de los grupos propilamino es el S
adenosilmetionina descarboxilada (SAMd), el cual se deriva de la S-adenosilmetionina
(SAM) por acción de la enzima S-adenosilmetionina descarboxilasa (SAMDC, EC
4.1.1.50). No se conoce otra reacción fisiológica en la que el SAM descarboxilada pueda
participar, hallándose a muy baja concentración y constituyendo, por tanto, el factor
limitante en la síntesis de la Spd y Spm (Bagni y Tassoni, 2001; Kusano et al., 2007) .
La biosíntesis de la Spd se realiza por la acción del enzima espermidina sintasa (SPDS,
EC 2.5.1.16) y en ella se lleva a cabo la transferencia del grupo propilamino terminal de la
molécula del SAMd a la molécula de Put.
La biosíntesis de Spm ocurre de una manera análoga a la anterior con la intervención de
una segunda aminopropiltransferasa, la espermina sintasa (SPMS, EC 2.5.1.22), la cual
transfiere el grupo propilamino del SAMd a la Spd (Bagni y Tasson i, 2001 ; Kusano et al. ,
2007).
A partir del precursor SAMd se puede sintetizar la fitohormona etileno cuyas funciones
son antagónicas con las PAs (Mendoza y Rocha, 2002). Habitualmente, cuando los
inhibidores de la biosíntesis de PAs se aplican a tejidos de plantas, se observa un fuerte
incremento en la producción de etileno (Roberts et al., 1984).
17
•
CAPÍTULO 1
Cadaverina )
SAMDC
.. ......... .. ; SAMd ; ..... ····'
SPOS
SPMS
Figura 1.4 Biosíntesis de las PAs. ADC=arginina descarboxilasa, AIH= arginina iminohidrolasa,
CPA= N-carbamoil putrescina aminohidrolasa, ODC= ornitina descarboxilasa, SAM= S-adenosil
metionina, SAMDC= S-adenosil metionina descarboxilasa, SAMd= S-adenosil metionina
descarboxilada, SPDS= espermidina sintasa, SPMS= espermina sintasa, ACC= ácido 1-amino
ciclopropano-1-carboxilo . ACCS= ACC sintasa, ACCO= ACC oxidasa, LDC= lisina descarboxilasa
(Kusano et al. , 2007).
1.4.5.3 Catabolismo
Las poliaminas Put, Spd y Spm son catabolizadas principalmente por diamino oxidasas
(DAO, EC1.4.3.6) y poliaminas oxidasas (PAO, EC1 .5.3.11 ) (Bagni y Tassoni , 2001;
Cohen , 1998; Smith, 1985) y por la putrescina aminopropiltransferasa (PAPT), las cuales
están involucradas en la producción de PAs poco comunes, como norespermidina,
norespermina, caldopentamina y otras (Figura 1.5). Estas PAs poco comunes se
presentan en ciertos microorganismos como Physarum polycephalum, en organismos que
habitan en condiciones extremas como bacterias termófilas tipo Caldariella acidophila
(Mendoza y Rocha, 2002) .
18
•
CAPÍTULO 1
Arginina Agmatina
CicloTCA
l! t •
N-c<~rbamoil Succinato putrescina
• (JI)(' • POli (; .
Omltlna • Putrescina • 1- Plrrollna • c.An • Glutamato
• " ·. ,ux· / '! _
\1 • d.:\ \1 Esperm1dma 1' o
' ' • 1, "' 1. l Diaminoprop:mo " p-AI;mina
n 1·lJ·3Minopropil)-pirrolln3 .1.5·diazabiciclononano
Figura 1.5 Vía de biosíntesis y catabolismo de PAs en plantas (Bhatnagar et al. , 2002).
1.4.6 lnhibidores de la biosíntesis de poliaminas
Una herramienta muy poderosa para las investigaciones sobre la bioquímica y fisiología
en el cam po de las poliaminas, lo constituye el grupo de inhibidores más o menos
específicos para casi todas las enzimas que intervienen en las rutas de biosíntesis y
degradación (Pegg, 1987; Slocum y Galston, 1987). Una forma de reducir el contenido de
poliaminas celulares y estudiar sus funciones sobre el desarrollo, se deriva del uso de
compuestos que puedan bloquear su síntesis.
En un principio, se usaron los análogos estructurales de la Arg y Orn (L-canavalina y L
canalina) o sus inhibidores competitivos reversibles (D-arginina, DL-a-metilarginina y DL
a-metilornitina). Sin embargo, la mayoría de estos compuestos son inespecíficos o
pueden interferir con otros procesos (Aitman et al., 1983). El uso de inhibidores
específicos de estas enzimas no fue posible hasta que se sintetizaron los denominados
inhibidores irreversibles, tipo "suicida": DL-a-difluorometilornitina (Metcalf et al., 1978) y
DL-a- difluorometilarginina (Kalio et al., 1981).
19
•
CAPÍTULO 1
1. a-Difluorometilarginina (DFMA) es el inhibidor de la ADC y presenta las siguientes
características:
../ Altísima especificidad sobre la ADC .
../ Unión irreversible por la formación de un enlace covalente con la enzima .
../ Baja toxicidad relativa.
2. a-Difluorometilornitina (DFMO), es el inhibidor de la ODC y presenta las mismas
características que el anterior.
3. Metilglioxal-bis-guanilhidrazona (MGBG), es un inhibidor de la SAMDC. Sus
características son las siguientes:
../ No es específico para la SAMDC, ya que también inhibe una enzima de la ruta de
degradación de las poliaminas: la DAO .
../ La unión a la enzima es reversible .
../ Presenta una alta toxicidad .
../ La SAMDC es inhibida fuertemente por la SAMd.
4. Ciclohexilamina (CHA), es un potente inhibidor de la SPDS. Presenta las siguientes
características:
../ Es un inhibidor específico para la SPDS .
../ El tipo de inhibición es competitiva, compite con el sustrato Put y su unión con la
enzima parece ser reversible (Shirahata y Samajima, 1990).
2 Aminoguanidina, es un inhibidor de la conversión de Put en Ll1- pi rrolina y ácido
gama aminobutírico (GABA).
Muchos de los estudios bioquímicos y fisiológicos sobre las PAs en plantas se han
basado en el uso de estos inhibidores. DFMA y DFMO no están disponibles
comercialmente y su uso está condicionado a la donación de los laboratorios Merrei-Dow
(Cincinnati , USA). Si bien es cierto que estos inhibidores tienen un valor inestimable para
20
•
CAPÍTULO 1
muchas investigaciones, es necesaria una interpretación correcta de los datos obtenidos . mediante su uso. No todos los estudios han demostrado que un efecto biológico particular
promovido por el inhibidor sea revertido por la adición junto al inhibidor de la poliamina
apropiada.
1.4.7 Antecedentes de pol iaminas en la embriogénesis somática
Los eventos celulares y morfogenéticos durante la ES están controlados por una serie de
condiciones de cultivo y efectos genéticos. Bagni (1989) demostró que la adición de Put,
Spd y Spm al medio de cultivo resultó en la producción de callos en explantes de
tubérculos de alcachofa (Jerusalem artichoke). Montague et al. (1978, 1979) reportaron un
doble incremento en los contenidos de Put en cultivos embriogénicos de zanahoria sobre
los cultivos no embriógenicos. Fienberg et al. (1984) observaron un incremento en la
producción de Spd y Spm junto con una alta actividad de la SAMDC en cultivos
embriogénicos, en comparación con las células no diferenciadas (Kakkar et al., 2000).
Minocha et al. (1999) realizaron un estudio sobre los niveles de PAs durante el desarrollo
de embriones somáticos y cigóticos en Pinus radiata, en donde altas proporciones de Spd
y Spm fueron observados en embriones capaces de germinar y formar plántulas (Steiner
et al., 2007).
La aplicación de PAs exógenas a plantas enteras o alguna de sus partes puede producir
efectos visibles sobre el crecimiento y desarrollo, tales como la prevención de la
senescencia en hojas cortadas, la formación de embriones en ciertos cultivos de tejidos
vegetativos, la maduración del fruto, el aumento de longevidad de los óvulos y del polen,
respuestas de tipo defensivo, iniciación floral, etc. (Carmona, 1997).
Calheiros et al. (1994), demostraron que la aplicación de PAs exógenas (Put, Spd y Spm)
disminuyeron el número de embriones producidos en café. Altos contenidos de PAs en un
medio suplementado con 2,4-D y BAP ha sido demostrado ser necesario para superar la
naturaleza recalcitrante de Hevea brasiliensis con respecto a la embriogénesis somática
(EI-Hadrami y D'Auzac, 1992). Estos mismos autores, realizaron la aplicación exógena de
PAs, en donde se pudo observar que hubo una mejora en la producción de callo
embriogénico y un incremento en el número de embriones producidos por callo (Kakkar et
al., 2000).
21
•
CAPÍTULO 1
En estudios recientes, Steiner et al., (2007), evaluaron el efecto de las PAs en el ¡
crecimiento, así como los niveles endógenos en cultivo embriogénico de Araucaria
angustifolia, en donde se pudo observar que la adición de PAs al medio de cultivo
mejoraron el crecimiento del cultivo embriogénico, y de igual forma hubo un incremento en
los niveles endógenos de otras hormonas vegetales. Paul et al., (2009) concluyeron que
la aplicación de las PAs al medio embriogénico redujeron los contenidos endógenos de
las mismas, pero también tuvieron un efecto en el crecimiento de callo embriogenico, en
términos de peso fresco y número de embriones somáticos por callo, durante estadios
tempranos de la ES en Momordica charantia. Un estudio reciente realizado por Mauri y
Manzanera (2011 ) mostró el contenido endógeno de poliaminas en los embriones
somático de encino (Quercus i/ex L.), observándose que en callo embriogénico,
embriones somáticos y cigóticos inmaduros fué más abundante el contenido de
poliaminas, disminuyendo en la fase de maduración y germinación.
En resumen , las PAs participan en el proceso embriógenico de muchas especies
vegetales, ya que se ha visto que las estructuras embriogénicas contienen mayor cantidad
de estos compuestos en comparación con las no embriogénicas. Por otro lado, la
importancia de las PAs exógenas radica en el hecho de que mejoran los procesos in vitro,
tales como la ES la cual puede ser regulada mediante la manipulación de los niveles y el
metabolismo de las PAs. No obstante, también se sabe que no todas las especies
vegetales responden de igual forma a la ES, así como al tratamiento in vitro con PAs.
1.4.8 Análisis del contenido endógeno de poliaminas
El contenido de PAs puede reflejar aspectos claves de la fisiología de la planta,
relacionados con cada uno de los estados de desarrollo y como respuesta a diferentes
condiciones ambientales. De igual manera, este contenido varía en los diferentes tejidos y
órganos de la planta (Mendoza y Rocha, 2002).
La determinación de PAs se lleva a cabo utilizando diferentes métodos cromatográficos,
tales como la cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía de gases (CG) y
cromatografía liquida de alta resolución (HPLC). Esta última técnica es la más utilizada
actualmente en el análisis de las PAs.
22
•
CAPÍTULO 1
Es frecuente el análisis de derivados de aminas por medio de agentes derivatizantes . como el cloruro de dansilo (Dns-CI), llamando a este tipo de método dansilacion de las
PAs.
El cloruro de dansilo (cloruro de 5-N,N-dimetilano-naftalen-1-sulfonilo) es un reactivo de
derivatización fluorogénico utilizado para la determinación de aminas primarias y
secundarias (Linares, 1998).
La determinación de las PAs por dansilación consiste en la incorporación a éstas de uno o
más grupos dansilos que cede el Dns-CI que se unen al grupo amino o imino. Este grupo
dansilo es el que hace posible la cuantificación de las PAs ya que es fluorescente (Feixa,
2001) (Figura 1. 6).
- HCI
Figura 1.6 Reacción de cloruro de dansilo con aminas
La HPLC es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes
de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil.
El compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase estacionaria
mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. La
muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan
diferencialmente, dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase
estacionaria a medida que adelantan por la columna.
23
•
CAPÍTULO 1
El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del
compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que
tarda un compuesto en ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención (Rt) . La
utilización de presión en este tipo de cromatografías incrementa la velocidad lineal de los
compuestos dentro la columna y reduce así su difusión dentro de la columna mejorando la
resolución de la cromatografía. Los disolventes más utilizados son el agua, el metano! y el
acetonitrilo.
24
CAPÍTULO 1
HIPÓTESIS
Si las poliaminas en las plantas están re lacionadas con el crecimiento y el desarrollo
celular, entonces, la adición de Put, Spd y Spm deberán influir en el comportamiento de
los embriones somáticos de chile habanero (C. chinense).
OBJETIVO GENERAL Estudiar el efecto de diferentes PAs (Put, Spd y Spm) sobre el desarrollo de los
embriones somáticos en chile habanero.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Evaluar el efecto de las concentraciones de PAs (0.01 , 0.1, 1 mM) de manera
independiente, sobre la formación de embriones somáticos.
2. Determ inar el contenido de Put, Spd y Spm por medio de cromatografía líquida de
alta resolución (HPLC) en los embriones somáticos provenientes de los diferentes
tratamientos.
3. Evaluar el efecto de inhibidores de la biosíntesis de poliaminas: CHA y AG sobre el
proceso de embriogénesis somática de chile habanero.
4. Evaluar la respuesta a la germinación de embriones somáticos después de ser
tratados con las PAs.
25
•
CAPÍTULO 1
JUSTIFICACIÓN
Puesto que el cultivo del chile habanero es muy importante como fuente de ingresos,
especialmente para los productores de la Península de Yucatán, así como materia prima
para muchas industrias, se emplean las técnicas biotecnólogicas, la embriogénesis
somática, una vía con un mayor potencial multiplicativo, para optimizar la producción de
este cultivo. Sin embargo, años de investigación han confirmado que el género Capsicum
enfrenta un problema en el cultivo in vitro: la recalcitrancia ; por lo que se están' realizando
diversos estudios sobre la causa de este fenómeno.
Es por esta razón que este trabajo se enfoca en estudiar al estudio del efecto de las PAs
exógenas en la ES de chile habanero, ya que se ha visto en diversos estudios que estos
compuestos han mejorado las respuestas morfogéneticas en diferentes especies
vegetales.
26
•
CAPÍTULO 1
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
Variedad Mayan Ba'alche Germinación de semillas en medio MS + 1.156 ~M GA3
{Santana et al., 2005)
+ Inducción de ES en medio semisólido
MS+ 9.05 ~M 2,4-D (Avi lés-Viñas, 2007)
,¡,
Obtención de embriones somáticos en medio líquido MS + 4.5 ~M 2, 4-0 (Avilés-Viñas, 2007)
Adición de PAs e inhibidores: Put, Spd y Spm (0.01, 0.1 y 1.0 mM) CHA y AG (0.1 y 1.0 mM)
(Kevers et al., 2000)
+ 1 Colecta de ESs 1
Extracción y Evaluación
Cuantificación de PAs por HPLC de la
(Tiburcio et al., 1986) respuesta de la ES a la germinación
1 Análisis de datos
1
1 1
Diagrama de flujo de la estrategia experimental general.
27
•
CAPÍTULO 1
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Santana-Buzzy (2007). Somatic embryogenesis in habanero pepper (C. chinense
Jacq.) from cell suspensions. HortScience, 42, 329-333.
35
•
CAPÍTULO 1
•
36
•
CAPÍTULO 11
CAPÍTULO 11
EFECTO DE LA APLICACIÓN EXÓGENA DE POLIAMINAS SOBRE LA
EFICIENCIA DE LA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DE CHILE HABANERO
2.1 INTRODUCCIÓN
Las PAs son compuestos orgánicos nitrogenados que son ubicuos en las células
vegetales. Estas son muy importantes, ya que participan en ~uchos procesos fisiológ icos
y de desarrollo en la planta. Las PAs que se encuentran más frecuentemente en las
plantas son la Put, la Spd y la Spm. Otras PAs solo se encuentran en una o dos famil ias
de plantas, como el diaminopropano (DAP) en la famil ia Poaceae, Cad en las
Leguminoseae y caldopentamina en el género de Gossypium (algodonero).
Se han realizado estudios sobre el papel de las PAs en la ES de varias especies
vegetales. Por ejemplo, Steiner et al., (2007) evaluaron el efecto de las PAs en el
crecimiento, así como los niveles endógenos de estos compuestos en cultivo
embriogénico de Araucaria angustifolia. Paul et al. , (2009), concluyeron que la aplicación
de PA 's al medio embriogénico redujeron los contenidos endógenos de las mismas, pero
también tuvieron un efecto en el crecimiento de callo embriógenico, en términos de peso
fresco y número de embriones somáticos por callo, durante estadios tempranos de la ES
en Momordica charantia. Kevers et al., (2000) observaron que adicionando PAs al medio
de cultivo de Panax ginseng pudieron incrementar el número de embriones somáticos
producidos hasta cuatro veces.
En el género Capsicum se han realizado estudios sobre la caracterización de poliaminas
en la ES (Regla-Márquez, 2011) , así como el efecto de la adición de las mismas y de
inhibidores de las enzimas de la biosíntesis en el desarrollo de brotes de C. frutescens M.
(Kumar et.al., 2007). Sin embargo, en C. chinense no se tienen reportes de los efectos de
estas aminas, así como de sus inhibidores en la ES. Por ello, en este capítu lo se detalla el
establecimiento del cultivo embriógenico para la obtención de material vegetal , y los
experimentos realizados en embriones somáticos de chile habanero tratados con PAs
exógenas e inhibidores y su efecto en la eficiencia de la ES.
37
•
2.2. MATERIALES Y MÉTODOS.
2.2.1 Lugar Experimental
CAPÍTULO 11
Este trabajo de investigación se realizó en el Laboratorio 09 de la Unidad de Bioquímica y
Biología Molecular, del Centro de Investigación Científica de Yucatán (CICY), Mérida,
México.
2.2.2 Fuente de explantes
Para este estudio se utilizó la variedad Mayan Ba'alché de Capsicum chinense Jacq.,
proveniente del banco de germoplasma de la Unidad de Bioquímica y Biología Molecular
de Plantas del Centro de Investigación Científica de Yucatán.
Los explantes fueron tomados de plantas de 25 a 30 días de edad , las cuales fueron
obtenidas a partir de semillas germinadas in vitro.
2.2.3 Desinfección de las semillas
La desinfección se realizó siguiendo el protocolo reportado por Santana-Buzzy et al. ,
(2005). El procedimiento se describe a continuación:
1. En una solución de etanol al 70%, se sumergen las semillas de chile habanero
durante cinco minutos y se enjuagan con agua destilada estéril tres veces.
2. Nuevamente se sumergen en una solución de cloro comercial (Cioralex 6% activo)
diluida al 30%, durante 15 minutos y se enjuagan las semillas 3-4 veces con agua
destilada estéril.
Todo el proceso se realiza en agitación . Para su germinación, las semillas fueron
cultivadas en un medio MS, adicionando 1.156 IJM de ácido giberélico (AG3), 3% de
sacarosa y 0.2% de gelrite; el pH se ajustó a 5.8.
38
•
CAPÍTULO 11
2.2.4 Inducción de la embriogénesis somática ¡
Para la inducción de la embriogénesis se utilizó el protocolo de Avilés-Viñas (2007). Se
tomaron hipocotilos de plántulas de 30 días en condiciones asépticas. Los hipocotilos
fueron colocados en un medio MS(Murashige y Skoog, 1962) suplementado con 9.05 IJM
de ácido 2, 4-diclorofenoxiácetico (2,4-D), 3% de sacarosa y 0.2% de gelrite. Se colocaron
1 O explantes por frasco y tres frascos de cultivo por tratamiento, y se mantuvieron a 25 ±
2°C, bajo fotoperíodo (16/8 horas luz/oscuridad) a una intensidad lumínica de 40-50 IJmol
m-2, s-1 .
Para el tratamiento control, al cabo de 30 días en el medio de inducción, los hipocotilos se
transfirieron a un medio MS adicionando solo la mitad de la concentración de 2, 4-D
utilizados en la inducción y sacarosa (30 g.L-1) . Se incubaron en el cuarto de fotoperiodo
de 24 h a una temperatura de 25 ± 2oc a una intensidad lumínica de 40-50 1Jmol-m-2 ·s-1
en agitación de 100 rpm . con cambio de medio cada 14 días por 42 días (Avilés-Viñas,
2007) .
2.2.5 Adición de poliaminas e inhibidores de poliaminas al medio de cultivo
A los 30 días en el medio de inducción, los hipocotilos se cambiaron a un medio MS
adicionando con 4.5 11M de 2,4-D, sacarosa (30 g.L-1) y las PAs Put, Spd y Spm (0.01, 0.1
y 1.0 mM de cada PA) fueron añadidas individualmente al medio MS, esterilizadas
previamente por filtración.
Para evaluar el papel de las PAs en la ES de C. chinense, se incorporaron inhibidores de
PA's: ciclohexilamina (CHA) y aminoguanidina (AG) a una concentración de 0.1 y 1.0 mM
(c/u) en el medio MS líquido antes mencionado de manera independiente de las PAs. Los
inhibidores fueron esterilizados por filtración y preparados en una solución acuosa. Los
tratamientos se llevaron a cabo en matraces de 250 mi con 50 mi de medio MS más el
tratamiento evaluado, utilizando tres matraces por tratamiento.
39
•
CAPÍTULO 11
2.2.6 Efecto de poliaminas exógenas sobre la eficiencia de la embriogénesis
somática de chile habanero
Para evaluar la eficiencia embriogénica de los ESs de chile habanero se tomaron tres
muestras de 1 O mi por cada matraz contenidendo 50 mi de medio embriogénico, siendo
tres matraces de 50 mi los utilizados por tratamiento. Los embriones de cada muestra
fueron contabilizados bajo el estereoscopio Nikon SMZ800 con un lente C-W1 OXA/22 ,. Nikon Japan.
Los resultados fueron analizados usando un análisis de varianza y las medias fueron
comparadas usando la prueba de Tukey (p< 0.05). Cada tratamiento fue repetido dos
veces con tres réplicas cada una. El programa SPSS 16.0 fue utilizado para los análisis
estadísticos.
40
•
CAPÍTULO 11
2.3 RESULTADOS
2.3.1 Inducción de la embriogénesis somática
Como resultado del proceso de inducción de la ES, utilizando hipocotilos de chile
habanero, se observó una alta frecuencia de formación y proliferación de embriones
somáticos, como lo reporta Avilés-Viñas (2007). La frecuencia de formación de los
embriones se pudo apreciar altamente eficiente, observándose aproximadamente 100
ESs por explante a los 42 días de inducido el proceso (tratamiento control), pudiendo
distinguirse los diferentes estadías de desarrollo de los emoriones (globular, acorazonado,
torpedo y cotiledonar) (Figura 2.1 ).
Figura 2.1 Embriones somáticos de chile habanero en diferentes estadíos. a) Estadío globular; b)
Estadío corazón; e) Estadío torpedo; d) Cotiledonar; y e) Hipocotilo de C. chinense con embriones
somáticos.
41
•
CAPÍTULO 11
2.3.2 Efecto de poliaminas exógenas sobre la eficiencia de la embriogénesis
somática de chile habanero
En la Figura 2.2 se muestra el número de ESs que se obtuvieron por litro de medio de
cultivo, de los tratamientos con Put exógena. Se pudo observar un ligero incremento en el
número de ESs en los tratamientos a diferentes concentraciones sin embargo, estos
incrementos fueron no significativos en comparación con el control.
25000
o 20000 o w ~ 15000 w o o a::
10000 .... ::; ........ "' V) w 5000
o o 0.01 0.1 1
TRATAM IENTOS (mM)
Figura 2.2 Efecto de la Put exógena sobre la eficiencia de la ES de C. chinense por litro de medio
de cultivo. Cada valor es el promedio de seis réplicas independientes con el error estándar.
42
CAPÍTULO 11
En la Figura 2.3 se observa cómo los ESs se formaron en el medio de cultivo en los ¡
tratamientos con Put y en el cual no se observaron diferencias marcadas sobre la
eficiencia y desarrollo de los mismos.
Figura 2.3 ESs de los tratamientos con Put. a) control; y b) tratamiento con Put 0.01 mM.
43
CAPÍTULO 11
En la Figura 2.4 se muestra la eficiencia embriogénica en los tratamientos con Spd
exógena. Una disminución en el número de ESs de chile habanero de estos tratamientos
fueron constatados, principalmente con el tratamiento de 1.0 mM de Spd, que difirió
significativamente del control.
22000
21500 a T
o 21000 o
20500 w ~ w 20000 o o 19500 «
1 al> T ab
1 T 1 b
~ T :::i 19000 .........
.l.
... V)
18500 ll.l
18000
17500
o 0.01 0.1 1
TRATAMIENTOS (mM)
Figura 2.4 Efecto de la Spd exógena sobre la eficiencia de la ES de C. chinense por litro de medio
de cultivo. Cada valor es el promedio de seis réplicas independientes con el error estándar. Medias
seguidas por letras diferentes indican diferencias significativas (p>0.05) (Tukey) .
44
CAPÍTULO 11
En la Figura 2. 5 se muestran los ESs de chile habanero con Spd exógena . Como se pudo ' apreciar en la gráfica de la Fig 2.4, la tendencia a disminuir el número de ESs, de igual
forma pudo observarse visiblemente en los cultivos.
Figura 2.5. ESs de los tratamientos con Spd. a) control; y b) tratamiento con Spd 1.0 mM.
45
•
CAPÍTULO 11
En los tratamientos con Spm exógena se observó una tendencia a mantenerse la
eficiencia de los ESs producidos en los diferentes tratamientos cuando se compararon
con el control. Sin embargo, todas las diferencias observadas fueron no significativas
(Figura 2.6) .
25000
o 20000 o w ~ 15000 w o o 0::
10000 1-:::; .._ "' 1/) w 5000
o o 0.01 0.1 1
TRATAMIENTOS (mM)
Figura 2.6 Efecto de la Spm exógena sobre la eficiencia de la ES de C. chinense por litro de medio
de cultivo Cada valor es el promedio de seis réplicas independientes con el error estándar.
46
•
CAPÍTULO 11
A diferencia de lo observado con los tratamientos con Put y Spd , los ESs de los
tratamientos con Spm mostraron un mejor desarrollo (Figura 2.7) cuando se compararon
con el tratamiento control.
Figura 2.7 Desarrollo de los ESs con Spm exógena. a) Control; b) tratamiento con 0.01 mM; e)
tratamiento con 0.1 mM; y d) tratamiento con 1.0 mM.
47
•
CAPÍTULO 11
2.3.3 Efecto de los inhibidores de la biosíntesis de poliaminas sobre la ' eficiencia de la embriogénesis somática de chile habanero
El efecto de los inhibidores de la biosíntesis de PAs, ciclohexilamina (CHA) y
aminoguanidina (AG), fueron evidentes en la eficiencia de la ES. Como se muestra en la
Figura 2.8, se redujo drásticamente la formación de ESs de chile habanero con las
concentraciones evaluadas (0.1 y 1.0 mM) cuando se compararon con el control, -principalmente con AG a 1.0 mM. Los resultados obtenidos sobre la eficiencia
embriogénica con CHA 1.0 mM no se presentan en la gráfica ya que se observó que
durante el cultivo en medio líquido con este inhibidor se fenolizó el tejido , así como
también se observó posteriormente necrosis, posiblemente debido a que los ESs no
soportaron esa concentración del inhibidor. Se observó una tendencia a disminuir el
número de ESs de chile habanero conforme aumentó la concentración de AG.
25000 ,
20000 J o > ¡:: ...J :::¡ u w
15000 1 o o o w :lE w o o 10000 1 0:: 1-::::; -., (/) w
5000 ..;
o o
CONTROL
0.1
AG 1
AG TRATAMIENTOS (mM)
0.1 CHA
1
CHA
Figura 2.8 Efecto de inhibidores de la biosíntesis de PAs sobre la eficiencia de la ES de C.
chinense en un litro de medio de cultivo. Cada valor es el promedio de seis réplicas independientes
con el error estándar.
48
•
CAPÍTULO 11
2.4 DISCUSIÓN • Al cuantificar el número de ESs entre los diferentes tratamientos con PAs, solamente se
encontraron diferencias significativas entre el tratamiento control y el tratamiento con Spd
1.0 mM, el cuál ocasionó una disminución en el número de ESs, no pudiéndose observar
la misma respuesta en los demás tratamientos. En reportes sobre el efecto de PAs
exógenas en diferentes especies vegetales, se ha observado que estos compuestos
favorecen las respuestas embriogénicas (Yadav y Rajam, 1998; Kevers et al., 2000;
Steiner et al., 2007; Paul et al., 2009). EI-Hadrami et al. (1989a, 1989b) observaron que
en Hevea brasiliensis, las PAs añadidas al medio de cultivo mejoraron la producción de
callo embriogénico e incrementaron el número de embriones producidos por gramo de
callo embriogénico.
Sin embargo, los resultados de nuestro estudio coinciden con algunos reportes en los
cuales, las PAs, reducen las respuestas en los cultivos embriogénicos. Silveira et al. ,
(2006) observaron una reducción en el crecimiento de los cultivos en suspensión en
medio líquido de Araucaria angustifolia cuando las PAs Spd y Spm (1 .0 mM) fueron
añadidas al medio de cultivo. Calheiros et al. , (1994), realizaron un estudio adicionando
PAsen el medio de cultivo para la ES directa en Coffea canephora y arabica, en donde se
observaron que no todos los genotipos respondieron de la misma forma, ya tratamientos
con Spd (50 y 100 ¡..¡.M) redujeron el número de ESs en dos genotipos de Coffea
canephora (N90-6 y N84-3); sin embargo, no se obtuvo el mismo efecto en otro genotipo
(N123) . Cuando la Spd y la Spm (20 ¡..¡.M) fueron aplicadas en combinación , el efecto
negativo de la Spd fue significativo, incluso en concentraciones mínimas (20 ¡..¡.M) en C.
canephora y C. arabica. Esto confirmó los resultados de los experimentos previos. Spm
inhibió el proceso de embriogénesis en C. canephora, así como también en C. arabica,
pero con diferencias estadísticas no significativas.
Respuesta similares fueron encontradas en nuestro estudio, ya que la Spd exógena
mostró una tendencia a disminuir el número de ESs de chile habanero más que las otras
PAs (Put y Spm), especialmente entre el control y el de Spd 1.0 mM. Los efectos
inhibitorios de las PAs sobre la ES en café no no son casos aislados. Patil et al., (1998)
observaron una reducción en la inducción de ESs por Put (0.1, 0.2, 0.5 mM), Spd (0.1 y
0.2 mM), inhibidores de etileno e inhibidores de la biosíntesis de PAs en garbanzo.
49
CAPÍTULO 11
Si lveira et al., (2004) y Rastogi y Davies (2000) reportaron que en cultivos en suspensión
de Pinus taeda y callos de Nicotiana tabacum, altos niveles de Put estaban asociados con
la reducción del crecimiento celular. Contrario a lo antes mencionado, Kevers et al.,
(2000) obtuvieron un incremento en el número estructuras embriogénicas en cultivos en
suspensión de Panax ginseng con la adición de PAs (0.01, 0.1 y 1.0 mM). De igual forma,
Paul et al. , (2009) cuando adicionaron PAs (Put 0.1 , 0.5 y 1.0 mM; Spd y Spm 0.1, 0.5 y
1.0 11M) al medio embriogénico, incrementaron el número de embriones somáticos en
Momordica charantia.
En nuestro trabajo, todos los inhibidores de la biosíntesis de PAs evaluados redujeron el
número de ESs producidos cuando se compararon con el control. Efectos de inhibidores
de PAs han sido reportados que afectan procesos embriogénicos, como lo observado en
los trabajos de EI-Hadrami y D'Auzac (1992) en Hevea brasiliensis, y Fobert y Webb
(1988) en Solanum melongena.
En híbridos de Cichorium se observó que la ES (número de ESs por mm-2) se inhibió
cuando el DFMA (0.1 a 1 O mM), un inhibidor irreversible de la ADC, fue añadido al medio
de cultivo embriogénico (Helleboid et al. , 1995). Kumar et al. , (2008), observaron una
reducción de la respuesta embriogénica utilizando los inhibidores DFMA y DFMO (1 .0
mM) en Coffea canephora. En cultivo de células de zanahoria , DFMA inhibió la ES,
mientras DFMO promovió la biosíntesis y la formación de embriones somáticos (Rabie y
Minocha, 1989; Nissen y Minocha, 1993), en donde la promoción de la ES por DFMO fue
posiblemente debido a la inhibición de la producción de etileno. Khan et al. (1991)
reportaron que la CHA (0.5 mM) solo retardó la ES cuando se añadió al medio de cultivo
pero no la inhibió.
En Panax ginsen, Kevers et al., (2000), incorporaron inhibidores de biosíntesis de PAs:
DFMA, DFMO, CHA y AG para corroborar el efecto de poliaminas exógenas en la ES.
Ellos observaron que todas las concentraciones evaluadas (0.01 , 0.1 y 1.0 mM) de los
diferentes inhibidores redujeron el número de ESs producidos. CHA o AG a concentración
de 1.0 mM completamente bloquearon la ES cuando fueron añadidas al medio de
inducción. En este trabajo no se inhibió completamente la ES; sin embargo, como se
observó en P. ginseng, sí se redujera el número de ES obtenidos, comparados con el
50
•
CAPÍTULO 11
control; la inhibición de la ES por CHA a altas concentraciones (1 .0 mM) pudo ser debida
a reducción del radio Put/Spd. Los efectos inhibitorios de la AG se han interpretado como
una posible participación de la vía catabólica de la Put para formar la 1:::.1 pirrolina.
Los resultados hasta el momento muestran que las PAs exógenas no tienen efectos
significativos en la eficiencia de la ES, es decir, no inh iben ni mejoran el proceso. Sin
embargo, sí se pudo observar una disminución en el número de ESs producidos con los
inhibidores CHA y AG (1 .0 mM) cuando se compararon con el tratamiento control. Se ha
observado que las PAs responden específicamente entre especies e incluso entre
variedades como fue observado por Calheiros et al. , (1994) entre variedades de Coffea
canephora y Coffea arabica.
51
•
CAPÍTULO 11
2.5 BIBLIOGRAFÍA
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CAPÍTULO 11
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CAPÍTULO 11
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54
CAPÍTULO 111
CAPÍTULO 111
COMPORTAMIENTO DE LAS POLIAMINAS ENDÓGENAS EN EMBRIONES
SOMÁTICOS DE CHILE HABANERO TRATADOS CON POLIAMINAS
EXÓGENAS
3.1 INTRODUCCIÓN
El efecto de las PAs en la eficiencia de la ES se vió afectada solamente de manera
significativa con Spd a 1.0 mM disminuyendo, el número de ESs con respecto al control.
De manera general, las PAs inhibieron el crecimiento y desarrollo de los embriones
somáticos de chile habanero.
Las PAs han sido estudiadas en relación a la ES en diversos sistemas vegetales.
Tratamientos que modifican los niveles de PAs, como la aplicación de PAs exógenas, se
ha visto que son importantes vías para mejorar los procesos morfogenéticos. Es conocido
que las PAs exógenas pueden inducir la división celular e incrementar la regeneración en
el cultivo de células vegetales (Kakkar et al., 2000). En varios estudios se ha demostrado
la importancia de las PAs exógenas para mejorar procesos in vitro, como la
embriogénesis somática (Kevers et al., 2000; Takeda et al., 2002; Silveira et al., 2006;
Steiner et al. , 2007). Se evaluó el efecto de PAs exógenas sobre su contenido endógeno.
Solamente se detectaron Put y Cad en los tratamientos, sin embargo, estos contenidos
fueron menores con respecto al tratamiento control. También se observó que las PAs se
encontraron mayormente en su forma unida estando ausentes en su forma libre.
El objetivo de este capítulo fue analizar el comportamiento de las PAs endógenas por el
efecto de poliaminas exógenas en la ES de chile habanero.
55
CAPÍTULO 111
3.2 MATERIALES Y MÉTODOS
3.2.1 Condiciones generales
Los medios de cultivo y los materiales requeridos durante la manipulación de los
explantes en condiciones asépticas, fueron previamente esterilizados en autoclave a 121
oc y 1.2 kg·cm-2 de presión durante 15 min. Para los medios de cultivo en estado
semisólido se colocaron 25 mL en frascos de vidrio con capacidad de 100 mL, mientras
que para el medio semisólido se colocaron 50 mL en matraces de 250 ml. El pH de los
medios se ajustó antes de la esterilización a 5.8 con NaOH 1 N y HCI 1 N. Las siembras se
realizaron en campana de flujo laminar horizontal.
3.2.2 Obtención de material vegetal
Se utilizaron semillas de la variedad Mayan' Balché, proveniente del banco de
germoplasma de C. chinense conservado en el Centro de Investigación Científica de
Yucatán. El establecimiento y germinación in vitro se realizó según el protocolo de
Santana et al. , (2005) , como se describió en el Capítulo 11.
3.2.3 Inducción de embriogénesis somática
Se realizó la inducción de la embriogénesis somática según el protocolo descrito por
Avi les-Viñas (2007).
3.2.4 Análisis de estándares de poliaminas
Para la determinación de los tiempos de retención de las PAs, se inyectaron los
dansilados de Put, Cad, Spd y Spm (50 mM) (Regla-Marquez, 2011). El tiempo total del
análisis fue de 30 min en el cual bajo estas condiciones se logró una buena separación de
las PAs, obteniendo picos bien definidos. Para la detección de los estándares de PAs se
utilizó la longitud de emisión y de excitación de 340 y 51 O nm respectivamente, reportado
por Minocha et al., (1990).
Una vez establecidas las condiciones cromatográficas se procedió a realizar la curva de
calibración , para lo cual se inyectaron seis concentraciones de la mezcla de PAs (0.05,
0.075, 0.1, .5, 1.0 y 2.0 mM) , cada una por triplicado. La cuantificación de estándares se
llevó a cabo por HPLC en un equipo Agilent Technologies 1200 series.
56
•
CAPÍTULO 111
3.2.5 Adición de poliaminas al medio de cultivo •
Después de treinta días en el medio de inducción, los hipocotilos se transfirieron a un
medio MS adicionando solo con 4.5 1-1M de 2,4-D, del que se usó en la inducción ,
sacarosa (30 g.L-1) y PAs (Put, Spd o Spm: 0.01, 0.1 y 1 mM de cada una), añadidas por
filtración en la campana de flujo laminar. El cultivo pro-embriogénico permaneció en los
tratamientos con PAs 14 días. Posteriormente, se cambiaron a un medio sin PAs durante
28 días con subcultivos cada 14 días.
Al fin de corroborar la presencia de las PAs así como el papel de éstas en la ES de C.
chinense, fueron evaluados los inhibidores de PAs: ciclohexilamina (CHA) y
aminoguanidina (AG) a concentraciónes de 0.1 y 1.0 mM cada una, en el medio de cultivo
esterilizadas por filtración, en la etapa de histodiferenciación
Los explantes se incubaron en condiciones de luz continua a una temperatura de 25 ±
2°C, a una intensidad lumínica de 40-50 1JM ·m-2 ·s-\ en agitación de 100 rpm . Al término
del tiempo de cultivo se separaron los ESs y se llevó a cabo la cuantificación de PAs
endógenas de cada tratamiento.
Todas las mediciones fueron realizadas por duplicado. Los resultados son dados en
medias con los errores estándar calculados a partir de tres réplicas .
3.2.6 Germinación de embriones somáticos
Embriones somáticos fueron transferidos a un medio líquido MS (Murashige y Skoog,
1962) suplementado con ácido abscísico para . la maduración. Posteriormente se
transfirieron a un medio MS líquido adicionado con 1.153 1-1M de ácido giberélico (AG 3) y
3% de sacarosa, y permanecieron en medio semisólido hasta su germinación.
Posteriormente se traspasaron a un medio MS semisólido con AG 3 para seguir la
evaluación de la germinación. Las condiciones de cultivo fueron las mismas mencionadas
anteriormente.
Para llevar a cabo la prueba de germinación de ESs de chile habanero tratados con PAs
exógenas, se colocaron cinco ESs por matraz con cuatro réplicas cada uno, dando un
57
•
CAPÍTULO 111
total de 20 ESs en estadio cotiledonar por tratamiento. Los medios de cu ltivo y los
materiales que se utilizaron , se esterilizaron en autoclave a 121 oc y 1.2 Kg . cm· 2 de
presión . El pH de los medios se ajustaron antes de la esterilización a 5.8 con Na OH 1 N y
HCI 1 N. Las siembras se realizaron en campana de flujo laminar horizontal.
3.2.7 Efecto de las poliaminas exógenas en la embriogénesis somática
Se adicionaron las poliaminas (Put, Spd o Spm) e inhibidores de poliaminas (C A y AG),
esterilizadas por fil tración , al medio de cultivo de manera independiente (no se hicieron
combinaciones) . Los embriones fueron sometidos a los diferentes tratamientos descritos
en el Cuadro 3.1, desde el inicio de la histodiferenciación [al momento de la transferencia
de los explantes del medio de inducción (sólido) al medio líquido].
Cuadro 3.1. Tratamientos y concentraciones de PAs e inhibidores de PAs a evaluar.
PAs E INHIBIDORES DE POLIAMINAS (mM)
TRATAMIENTOS
PUT SPD SPM CHA AG
o ----- ----- ----- ----- -----
1 0.01 ----- -----
2 0.1 ----- ----- ----- -----
3 1.0 ----- ----- ----- -----
4 ........... 0.01 ----- ----- -----
5 ----- 0.1 ----- ----- -----
6 ----- 1.0 ----- ----- -----
7 ----- ----- 0.01 ----- -----
8 ----- ----- 0.1 ----- -----
58
•
CAPÍTULO 111
9 1.0
10 0.1 0.1
11 1.0 1.0
El protocolo utilizado en los tratamientos fue el de Avilés-Viñas (2007) . PUT=putrescina, SPD=espermidinina, SPM=espermina, CHA= ciclohexilamina, AG= aminoguanidina.
3.2.8 Cuantificación de poliaminas endógenas en los embriones somáticos
Se cuantificaron los contenidos de PAs en los ESs de los diferentes tratamientos con PAs
exógenas conforme a lo establecido por Tiburcio et al., (1986) con pequeñas
modificaciones realizadas por Regla-Márquez (2011) en la Unidad de Bioquímica y
Biología Molecular de Plantas del Centro de Investigación Científica de Yucatán , como se
explicará de manera general en los siguientes apartados.
Para iniciar la cuantificación se tomaron 0.2 g de ES de 42 días en medio líquido y se
cuantificó el contenido de PAs por medio de Cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC). Cada tratamiento fue repetido dos veces con tres réplicas cada una.
3.2.9 Protocolo de extracción y cuantificación de poliaminas
El protocolo de extracción utilizado fue el de Tiburcio et al., (1986) con pequeñas
modificaciones de Regla-Márquez (2011 ).
Extracción
El proceso de extracción se llevó a cabo pulverizando 0.2 g de tejido de peso fresco en un
mortero colocando nitrógeno liquido (aprox. 100 mi). La mezcla se transfirió a un tubo
eppendorf de 2 mi y se añadió 1 mi de ácido perclórico al 5% (p/v) (PCA), posteriormente
se colocó 1 h a 4°C en total oscuridad, luego se centrifugó a 14,000 x g durante 30 mina
4°C. Se tomó el sobrenadante el cual contiene las PAs libres y conjugadas y se depositó
en un tubo eppendorf que se emplearon para tomar alícuotas de PAs conjugadas y libres.
Para la obtención de las PAs conjugadas se tomaron 250 IJL del sobrenadante que las
contiene y se hidroliza como se detalla más adelante. La pastilla se resuspendió en 1 mi
59
•
CAPÍTULO 111
con NaOH 1 N, se agitó en el vortex por 30 s hasta homogeneizar, se centrifuga a 14,000
x g durante 30 min a 4°C y se tomó el sobrenadante el cual contiene las PAs unidas. De
este extracto se tomaron 250 IJL y se hidrolizaron.
Hidrólisis
Para la hidólisis se tomaron 250 IJL de las muestras nombradas anteriormente para
extraer las PAs unidas y conjugadas. Se mezclaron con 250 IJL de HCI 12N, se colocaron
en ampolletas de vidrio y se sellaron, la hidrólisis se realiza a 11 ooc por 18 h en el
calentador en seco marca Benchmarck Research Product o en la mufla. Posteriormente
se filtraron con filtros de jeringa Millipore Millex hidrofílicos de 0.45 1-1m y se colocaron en
tubos eppendorf. Para evaporar el extracto, nuevamente se colocaron en el calentador en
seco a 11 ooc de 5 a 6 h. Posteriormente se resuspendieron en 200 IJL de PCA al 5%.
Dansilación
Se tomaron alícuotas de 200 IJL de cada extracto de PAs (libres, unidas y conjugadas) y
se les agregó 100 IJL de Na2C03 saturado, 100 IJL de cloruro de dansilo (1 O mg mi -1
acetona) , se agitaron en el vortex por 1 min y se incubaron a 60°C por 1 h en oscuridad a
baño maría . Se añadieron 50 IJL de L-prolina (1 00 mg mr1 H20) para remover el exceso
del dansilo y se incubaron a 60°C por 30 min en condiciones de oscuridad a baño maría.
Las muestras se secaron dejandolas destapadas por 45 min para remover la acetona a
temperatura ambiente en un sitio con poca luz. Las dansilpoliaminas se extrajeron con
400 IJL de benceno, y se centrifugaron a 14,000 x g 1 min para separar las fases. Se
recuperó la fase orgánica (400 IJL aproximadamente) que contenía las PAs disueltas en
benceno; y se evaporó el extracto dejando abiertos los tubos eppendorf por 8 h.
Finalmente se resuspendió el residuo en 500 IJL de metanol grado HPLC.
Preferentemente el día que se fue a inyectar la muestra, ésta se filtró con filtros de jeringa,
Millipore 0.45 IJm, no siendo necesario filtrar las muestras hidrolizadas ya que ya fueron
filtradas previamente en el proceso de hidrólisis (Minocha et al., 1990 y 1994).
60
•
CAPÍTULO 111
Cuantificación por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)
Se utilizó un cromatógrafo de líquidos Agilent Technologies 1200 series, con una columna
C-18 de 250 mm x 4.6 mm 5 u, flujo 2 ml/min (acetonitrilo: H20 72/28 v/v) por 30 min y un
post-tiempo de 1 min , la temperatura de la columna fué de 50°C, con un detector de UV
Visible a una longitud de onda de 220 y 337 nm y un detector de fluorescencia con una
fase de excitación de 340 nm y una fase de emisión de 510 nm, inyectando 80 iJL de •
muestra.
Se corrieron tres repeticiones de estándares de PAs (putrescina: Put; cadaverina: Cad;
espermidina: Spd; espermina: Spm) a diferentes molaridades (0.05, 0.075, 0.1 , 0.5, 1 .0,
2.0 mM) para identificar su tiempo de retención y realizar una curva de calibración (Walter
y Geuns, 1986).
61
CAPÍTULO 111
3.3 RESULTADOS
3.3.1 Análisis de estándares de poliaminas
Se realizaron los análisis previos para establecer los tiempos de retención de las PAs
(Put, Cad, Spd y Spm) y se realizaron las corridas de los estándares. El tiempo total del
análisis fue de 30 min en el cual bajo estas condiciones se logró una buena separación de
las mezclas de PAs obteniendo picos bien definidos como se observa en la Figura 3.1 . •
Se pudo determinar, por medio de los cromatogramas, los tiempos de retención de los de
los estándares de PAs a diferentes concentraciones, para posteriormente identificarlas en
las muestras tratadas con las mismas. Los tiempos de retención fueron : Put, 3.9 min Cad
4.4 min Spd, 9.8 y Spm, 26. 5 min. Asimismo se realizaron las curvas de calibración de la
mezcla de PAs a las concentraciones mencionadas anteriormente en donde se pudo
observar que tuvieron un coeficiente de correlación adecuado y por consiguiente una
buena confiabilidad entre las variables empleadas para realizar la curva de calibración .
CJ FLD1 A. E><-3<10. Em~10 (C•\CHEioi32\III>ATAINS9 POUAWIIIASII>EF _LC 2010.11·20 08-31·32"001.0101 .1>)
LU ~ .. o.
C> ~ 25 .. ., ..
O! ~ u o "
20
"&. t/1
~ ·~ .. ..
o ~ .. a
10 t/1
... :;¡ ~
~ ~ "'
~~ j_ o
o 6 10 15 20 25 mi
Tiempo (minutos)
Figura 3.1 Perfi l de elución de la mezcla de estándares de PAs. Estándares a 0.05 mM.
Fluorescencia Ex=340 nm, Em=510 nm.
62
•
CAPÍTULO 111
En la Figura 3.2 se observa el coeficiente de correlación de las curvas de calibración de la 4
mezcla de poliaminas a diferentes concentraciones (0.05, 0.075, 0.1, .5.0, 1.0 y 2.0 mM).
PUT yo S180.6x • 789 91 CAD y • 6989.3x • 568.84 R' = 0.9578
R' • 0.9785 16000 16000 14000 HOOO
llOOO 11000
3 10000 10000 8000 3 8000 . . .¡ 6000 .
6000 -4. ~000 4000 1000 1000
o.s J .S lS O. S l . S l . S
Conctntr~ctón mM Conco~ttodón mM
SPD yo l789lx • 979.S1 SPM v= HlS.Sx·UOOS R' • 0.8989 R1 =0.8S78
JlOOO 11000
10000 10000
8000 8000 3 6000 3 6000 . . ..i .
~000 -4. ~000
1000 1000
o O. S 1 S lS O. S l .S H
Concentradón mM Conc•ntradón mM
Figura 3.2 Curva de calibración de cada PA a diferentes concentraciones.
63
•
CAPÍTULO 111
3.3.2 Efecto de Put en el contenido de PAs totales en ESs de chile habanero
Como resultado del efecto de Put en los niveles de PAs endógenas totales de los ESs de
chile habanero, se pudo observar solamente la presencia de Put y Cad en los
tratamientos; sin embargo, fueron contenidos significativamente menores comparados con
los del control. Se detectó la presencia de una PA no común en plantas: la Cad , como lo
reportó Regla-Márquez (2011) en embriones cigóticos y somáticos de chile habanero.
Como se muestra en la Figura 3.3, la PA más abundante fue Put, siendo Cad la segunda
PA más abundante, no pudiéndose encontrar Spd y Spm, al menos a niveles
cuantificables. Sin embargo, ningún tratamiento superó al control.
1600
1400
::: 1200
-3 1000 .. ";;;- 800
..a 600 E E 400
200
1600
1400 "
... 1200 ! .. .:; 1000 ~ .. ";;;- 800
1 600 1 E 400
200 j
Contenidos endógenos totales de Put
o 0.01 0.1
Tratamientos (mM)
Contenidos endógenos totales de Spd
o ~~--~--------------~----~ o 0.01 0.1
Tratamlontos(mMI
1600
1400
Contenidos endógenos totales de Cad
~:!~~ n ";;;- 800
~ 600 E E 400
200
0 1 -¡- ~ -r- ~
1600
1400
~ 1100
.:; 1000 .. "';;- 800 .!! e 6oo E 400
200
o
0.01 0.1
Tratamientos {mM}
Contenidos endógenos totales de Spm
0.01 0.1
Tratamlontos(mMI
Figura 3.3 • Contenidos totales de putrescina (Put), cadaverina (Cad), espermidina (Spd) y
espermina (Spm) en embriones somáticos (ESs) de chile habanero tratados con Put exógena a
distintas concentraciones (0.0 (control), 0.01, 0.1 y 1.0 mM].
64
CAPÍTULO 111
Al analizar el contenido de PAs (Put, Cad , Spd, Spm) en sus formas unidas, conjugadas y 4
libres (Figura 3.4) se pudo observar que sólo Put y Cad en su forma unida y Put en su
forma conjugada, se pudieron detectar, encontrándose a muy bajas concentraciones en
estos tratamientos, comparadas con el tratamiento control , principalmente Put en su forma
conjugada.
CONTROL (SIN PAs) PUT 0.01 mM • PUT
1200 1200 OCAD
1000 -1000
•SPD ... ... ... 800 .... OSPM . .. .... ....
~ ~ 600 600 • ..! o o
400 e 400 e e e lOO
lOO 111 o ~- ~ ~ o UNIDAS CONJUGADAS UBRES
UfliDAS CONJUGAOM UBRES
Tipo de PAs TipodePAs
PUT 0.1 mM PUT 1.0 mM 1200 1100
1000 ~ 1000 ... ... .... 800
.... 800 -; . .. .... ....
~ 600 " ~ 600 i . . o o e 400 e 400 e e
lOO " 100 1
O+*= o 1 -1 UNIDAS CONJUGADAS UBRES UtliDAS CO!UUGAOAS UBRES
Tipo da PAs TopodaPAs
Figura 3.4 Contenido de PAs unidas, conjugadas y libres en los ESs tratados con Put a diferentes
concentraciones [0.0 (control), 0.01, 0.1 y 1.0 mM] .
65
CAPÍTULO 111
3.3.3 Efecto de Spd en el contenido de PAs totales en ESs de chile habanero
Como resultado de la cuantificación de PAs totales de los tratamientos con Spd exógena
en los ESs de chile habanero, se pudo observar que solamente Put y Cad fueron
detectadas; sin embargo, fueron contenidos mucho menores comparados con el control ,
especialmente los contenidos de Cad. Los contenidos de Put fueron disminuyendo
conforme aumentaron los niveles de Spd, abatiéndose estos contenidos conforme
aumentaron los contenidos exógenos (a concentraciones de 1.0 mM de Spd). Los
contenidos de Cad fueron muy bajos en los tratamientos con Spd 0.1 y 1.0 mM ; sin
embargo, con Spd 0.01 mM se abatieron completamente (Figura 3.5).
Contenidos endógenos totales de Put Contenidos endógenos totales de Cad
1600 1600
1400 1400
... 1200 ... 1200 ~
n ... ... .: 1000 .: 1000 ~ .. .. ~ 800 "';;- 800
~ . 600 -¡; 600
E E E 400 E 400
200 200 •
o - o T --o 0.01 0.1 o 0.01 0.1
Trotamiont os (mM) Trato m lentos (mM)
Contenidos endógenos totales de Spd Conten idos endógenos totales de Spm
1600 1600
1400 1400 -
... 1200 ... 1200 ... ...
.: 1000 .: 1000 .. .. ";;;- 800 : 800 .!! o 600 1 -¡; 600 -E E
. E 400 i E 400 -
200 - 200
o o T
o 0.01 0.1 o .0.01 0.1
Trotomiontos (mM) Trotomiontos(mM)
. Figura 3.5 Contenidos totales de putrescina (Put) , cadaverina (Cad), espermidina (Spd) y
espermina (Spm) en embriones somáticos (ESs) de chile habanero tratados con Spd exógena a
distintas concentraciones [0.0 (control) , 0.01, 0.1 y 1.0 mM].
66
•
CAPÍTULO 111
Al analizar el contenido de PAs (Put, Cad , Spd , Spm) en sus formas unidas, conjugadas y •
libres (Figura 3.6) , se pudo observar que solamente se detectaron Put y Cad, pero a
diferencia de los tratamientos con Put, se detectaron solo en su forma conjugada,
encontrándose a concentraciones muy por debajo de los encontrados en el tratamiento
control.
CONTROL (SIN PAs) • PUT SPD 0.01 mM
1200 DCAO 1200
1000 • •SPO 1000 ... ... 0..
0.. 800 D SPM . 800 . ., ., ..
~ 600 ; ~ 600 . o .. E 400 , o 400 E E E
lOO ' lOO
o ' o • UNIDAS CONJUGADAS LIBRES UNIDAS CONJUGADAS UBRES
Tipod• PAs Tipod• PAs
SPDO.l Mm SPDl.OmM
1200 1200 1
1000 1000 LL LL 0.. 0..
" 800 . 800 " , , o
600 "' 600 1 -¡¡; ... .. • o 400 -o 400 E E
E E 200 200
o -- - o UNI DAS CONJUGADAS LIBRES UNIDAS CONJUGADAS UBRES
Tipo de PAs Tipo de PAs
Figura 3.6 Contenido de PAs unidas, conjugadas y libres en los ESs tratados con Spd a diferentes
concentraciones [0.0 (control) , 0.01 , O. 1 y 1 .O mM] .
67
CAPÍTULO 111
3.3.4 Efecto de Spm en el contenido de PAs totales en ESs de chile habanero
Como resultado del efecto de Spm en los niveles de PAs endógenas totales de los ESs de
chi le habanero, se pudo observar solamente la presencia de Put en los tratamientos, los
cuales aumentaron los niveles conforme aumentaron la concentraciones de Spm
evaluadas; sin embargo, de la misma manera que con los tratamientos con Put y Spd,
fueron contenidos muy bajos comparados con el control (Figura 3.7).
1600
1400
~ l200 J
! 1000 1 "';;- 800 .!! ~ 600
E 400 j 200
o
1600 ,
1400 i ~ 1200 i
! 1000 ~ ';;- 800 . ~ 600
E 400 4
200 j o
Contenidos endógenos totales de Put
o 0.01 0.1
Tratamientos (mM)
Contenidos endógenos tot ales de Spd
o 0.01 0.1
Tratamientos (mM)
1600
HOO
~ l200 < ... ~ 1000 .. ";;- 800 ~ . ~ 600
E 400
200 -
o
1600 ,
1400 ~
::: 1200 1 ~ 1000 .. = 800 ... ~ 600
E 400 <
200
o _n
Contenidos endógenos totales de Cad
0.01 0.1
Tratamientos (mM)
Contenidos endógenos totales de Spm
r 0.01 0.1
Tratamie ntos (mM)
Figura 3.7 Contenidos totales de putrescina (Put) , cadaverina (Cad), espermid ina (Spd) y
espermina (Spm) en embriones somáticos (ESs) de chile habanero tratados con Spm exógena a
distintas concen!raciones [(0.0 (control) , 0.01 , 0.1 y 1.0 mM].
68
•
CAPÍTULO 111
En la Figura 3.8 se muestran los contenidos d~ PAs (Put, Cad, Spd y Spm) en sus formas
unidas, conjugadas y libres en donde se pudo observar que solamente se logró detectar,
en los tratamientos evaluados, Put en su forma unida, que al igual que los otros
tratamientos (con Put y Spd exógena) sus concentraciones estuvieron por debajo de las
encontradas en el control. Los contenidos de Put fueron aumentando conforme a los
contenidos exógenos.
1200 CONTROL (SIN PAs)
1000 • ~ ...
800 . ., .. ";;;- 600 . o E 400 E
o UNIDAS CONJUGADAS LIBRES
Tipo de PAs
SpmO.lmM llOO
1000 ~ ...
800 . ., ~ 600 -< . o E 400 • E
lOO "
1 o UNIDAS CONJUGADAS LIBRES
Tipo de PAs
• PUT
OCAD
•SPD
OSPM
llOO 1
1000 ~ ...
800 J . ., ~
600 ~ • o E 400 E
lOO '
o ..--JiL UNIDAS
1000 ~
llOO j ~ 800 1
~ 600 • o E E 400 l
lO: - ~~ UNIDAS
SpmO.OlmM
CONJUGADAS UBRES
Tipo de PAs
Spml.OmM
--,------1
CONJUGADAS UBRES
TipodePAs
Figura 3.8 Contenido de PAs unidas, conjugadas y libres en los ESs tratados con Spm a diferentes
concentraciones [0.0 (control), 0.01, 0.1 y 1.0 mM].
69
CAPÍTULO 111
3.3.5 Efecto de PAs exógenas en la germinación de los embriones somáticos
Durante la germinación de los ESs de chile habanero, se observó que en los tratamientos
con Spm fueron en los que mejores resultados se obtuvieron (Figura 3.9a). Los ESs
germinados tuvieron un desarrollo armonioso en la parte apical y caulinar, así como
también se observó la emisión de hojas cotiledonares y un cambio de coloración de
blanco cremoso a verde (Figura 3.9b).
A pesar de la mejoría en la morfología de los ESs observada, aún se presentan
anormalidades en los ESs germinados; sin embargo, la frecuencia de los tipos de
anormalidades han disminuido notablemente (Figura 3.9c).
-Spm
+Spm
Figura 3.9 Germinación de los ESs de chile habanero . a) ESs de los tratamientos con Spm: -Spm
tratamiento control, +Spm-tratamiento con Spm exógena; b) Tratamientos con Spm 0.1 mM; y e)
deformaciones más comunes en los ESs.
70
•
CAPÍTULO 111
3.3.6 Efecto de los inhibidores de la biosíntesis de PAs en el contenido ¡
endógeno de PAsen ESs de chile habanero
Los contenidos totales de PAsen los tratamientos con inhibidores de la biosíntes is (Figura
3.1 O) mostraron que con AG, los contenidos endógenos de PAs disminuyeron
notablemente conforme aumentó la concentración del inhibidor evaluado. Cuando se
compararon con el control se observó que el contenido endógeno difirió significativamente
pudiéndose observar también que solamente se detectó Put, estando abatidos la Cad,
Spd y Spm.
Con CHA se observó que al igual que con el inhibidor antes mencionado, solamente se
detectó la diamino Put en cantidades menores a las del control. Con CHA a niveles de 1.0
mM no se presentaron resultados, ya que desde los cultivos se observó que este
tratamiento causó necrosamiento y posterior muerte a los ESs.
• PUT CHAO.lmM CO NTROL
OCAO 60 ~ 1600 1
1400 ' • sPO so :t 1.200 ...
u~ O SPM Í " j ~ 1000 ..
; ~o : 800
1 o 600 " l"i E E 400 '
lOO 10
o j- - ~ o PUT CAO SPO SPM PUT CAD SPO SPM
PAs PAs
60 AG 0.1mM
60 1 AG l .OmM
so so ~ 40
~
., r ol .. : ~o : 30
~ lO o E ~ 20 '
10 10
o PUT CAO SPO WM PUT SPO SPM
PAs PAs
Figura 3.1 O Contenidos totales putrescina (Put} , cadaverina (Cad), espermidina (Spd) y espermina
(Spm) en embriones somáticos (ESs) de chile habanero tratados con inhibidores de la biosíntesis
de PAs.
71
CAPÍTULO 111
En la Figura 3.11 se muestran los contenidos de PAs unidas, conjugadas y libres de los
tratamientos con los inhibidores de la biosíntesis. Se pudo observar que se detectaron
solamente la diamino Put en su forma conjugada en los tratamientos con AG y CHA. Se
encontró esta misma PA en su forma unida solamente en el tratamiento con AG a
concentraciones de 0.1 mM, a diferencia del control en el se pudo notar la presencia de
PAs comunes y la diamino Cad en sus tres formas.
1200
l OOO ... ~ 800 .... .. "";;¡- &00 . o E 400 E
200
o
:t 30
~ 25
~ 20 • o 15 E E 10
5
o
UNIDAS
UNIDAS
CONTROL
-CONJUGADAS
TipodePA>
AGO. l mM
CO NJ UGADAS
Tipo de PA>
UBRES
UBRES
40
35
LL 30 Q.
~ 25
~ 20 ~ 15 l E E 10 t
5
o
40 " 35
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5 ~
o
UNIDAS
UNIDAS
CHAO.l m M
CONJUGADAS
Tipo de PA>
AGl.O mM
CO NJUGADAS
Tipo de PA>
•
LIBRES
LIBRES
Figura 3.11 Contenidos de PAs unidas, conugadas y libres en los ESs tratados con inhibidores de
la biosíntesis de PAs (AG 0.1, 1.0 mM y CHA 1.0 mM).
72
CAPÍTULO 111
3.4 DISCUSIÓN
Al medir el contenido de PAs endógenas de los ESs de chile habanero tratados con PAs
exógenas, fueron encontradas aquellas PAs que son comunes en plantas y la presencia
de una PA no común, la Cad, como lo reportó Regla-Márquez (2011) al caracterizar los
contenidos endógenos de PAsen embriones somáticos y cigóticos de C. chinense.La Cad
ha sido principalmente encontrada en la familia de las fabaceaes (Gamarnik y Frydman,
1991), y también se tienen reportes de la presencia de esta PA en varias especies de la
familia Solanácea en el que se relaciona con la producción de alcaloides (Kuznetsov et
al. , 2006). Sziderics et al. (201 O) cuantificaron los niveles de PAs en plantas de Capsicum
annuum en condiciones naturales con deficiencia de agua; al extraer las PAs libres de
hoja y raíz detectaron las PAs comunes y la Cad en mayor cantidad en las hojas,
únicamente los niveles de Put y Cad fueron significativamente diferentes al control. En los
ESs de chile habanero tratados con PAs exógenas, Put y Cad fueron las PAs que se
encontraron en mayor cantidad; sin embargo, ninguno de los tratamientos evaluados
superaron al control.
El papel de la Put en el crecimiento celular no está totalmente elucidado. Sin embargo, se
ha reportado que en cultivos embriogénicos de Pinus oocarpa y Pinus patula, Put estimuló
la división celular (Feirer, 1995), mientras que en suspensiones celulares de Pinus taeda y
de callo de Nicotiana tabacum el alto contenido de Put endógena fue asociado con la
reducción del crecimiento celular (Rastogi y Davies, 2000; Silveira et al., 2004).
Trabajando con protoplastos de avena se observó que la aplicación de Put exógena
estimuló la división celular, aunque no se encontró una relación directa entre la
concentración de esta PA y la respuesta del cultivo (Wu y Kuniyuki , 1997). Este mismo
patrón fue observado en cultivos embriogénicos de Araucaria angustifolia suplementados
con PAs (Steiner et al., 2007) .
Spd y Spm no se detectaron en ninguno de los casos. Esto puede deberse a una rápida
retroconversión de Spm a Spd y de ésta a Put (Yadav y Rajam , 1998). Shevyakova et al
(2004) trabajando con Mesembyanthemum crystallinum L. detectaron una interacción
entre el etileno y la Cad. Estos autores observaron que al someter hojas de esta especie
en un ambiente con etileno, se incrementaban los contenidos de Cad, y simultáneamente
disminuyeron los contenidos endógenos de Spd. Este resultado fue debido probablemente
73
CAPÍTULO 111
a la competencia que existe entre el etileno y las PAs (Spd y Spm) por el mismo
precursor: SAM (Moshkov et al., 2008). También se observó que el etileno estimula a la
LDC aumentando el contenido de Cad.
Al evaluar el efecto de Put sobre el contenido de PAs unidas, conjugadas y libres
solamente se detectaron la Put y Cad en su forma unida, y Put conjugada a muy baja
concentración; esta forma de PAs están involucradas en la respuesta de la§ plantas a
estrés ambiental y a deficiencias nutricionales, dando estabilidad a proteínas y ácidos
nucleicos. En lo reportado por Regla-Márquez. (2011), se observó que los ESs de chile
habanero, probablemente el estrés al que están sometidos, ocasione que las PAs libres
se unan a los ácidos nucleicos y a las proteínas para protegerlos, así como a la respuesta
al estrés de etileno dentro del recipiente de cultivo, lo que estimula la actividad de la LDC,
aumentando la síntesis de Cad y la disminución de Spd y Spm al competir por SAM.
En los ESs de chile habanero tratados con Spd exógena se detectó solamente Put en su
forma conjugada. Martin-Tanguy (2001) reportó que durante la germinación del arroz, las
PAs conjugadas actúan como formas de almacenamiento de las propias PAs, las cuales
después de una hidrólisis, pueden suplir a la célula con PAs adicionales que podrán
participar durante la división y expansión celular. También se han correlacionado sus
niveles con la viabilidad de las semillas. La disminución de la eficiencia de la ES con Spd
ya ha sido reportada. Bajaj y Rajam (1995) reportaron que la Spd exógena (5.0 mM)
ejerció un efecto inhibitorio en la regeneración de plantas de arroz a partir de callo fresco
embriogénico (3 semanas). En cultivos en suspensión de tabaco, se llevó a cabo un
estudio sobre PAs e inhibidores de las mismas y se vió que la adición de Spd sola (0.5
mM) o combinada con inhibidores de la biosíntesis (MGBG 0.5mM) redujeron las
actividades enzimáticas principalmente de SAMDC y ADC (Hiatt et al., 1986). En nuestro
estudio, Spd y Spm no se detectaron en ninguno de los tratamientos evaluados
posiblemente debido a la reducción de la actividad de la enzima encargada de catalizar la
síntesis de SAM descarboxilada de donde toman los grupos aminopropilo la SPDS y
SPMS para fa formación de Spd y Spm, respectivamente.
En este trabajo se observó que las PAs libres no se detectaron en ninguno de los
tratamientos con PAs exógenas. En diversos trabajos se ha visto que la utilización de PAs
74
CAPÍTULO 111
exógenas disminuyen los niveles de PAs libres (Steiner et al., 2007; Paul et al. , 2009) . Las •
PAs son aminas alifáticas que están implicadas en una gran diversidad de procesos
biológicos, por lo que sus concentraciones dentro de las células son estrictamente
reguladas (Alcazar et al., 201 O) . De esta manera, además del ritmo de su biosíntesis, la
concentración intracelular de estos compuestos (PAs) libres, es regulada mediante su
conjugación con moléculas pequeñas, especialmente ácidos hidroxicinámicos (PAs • conjugadas solubles) (Stetsenko et al., 2009) o con sustancias de alto peso molecular,
como hemicelulosa, lignina y en menor medida proteínas ·(PAs conjugadas insolubles).
Además de la conjugación, los niveles de PAs libres pueden ser disminuidos por
desaminación oxidativa.
Los niveles citoplasmáticos de las PAs también pueden ser regulados por
compartamentalización subcelular en vacuolas, mitocondrias y cloroplastos, así como por
extrusión (Moschou et al., 2008). La proporción relativa de PAs libres y conjugadas varía
entre las diferentes especies de plantas; por ejemplo, en el tabaco arriba del 90% de las
PAs se encuentran de forma conjugada (Bagni y Tassoni , 2001 ). Las características más
importantes de las PAs conjugadas con ácidos fenólicos (solubles en ácido perclórico)
durante la adaptación al estrés es su actividad antioxidante (Alcázar et al. , 201 0).
Bors et al., (1989) fueron los primeros en describir la actividad antioxidante de las PAs
libres y conjugadas solubles en acido perclórico, mostrando que las PAs libres tienen
menor constante de unión con todos los tipos de ROS (comparado con sus conjugados
con ácido caféico, cumárico y ferúlico). Conjugados de PAs en plantas bajo condiciones
de estrés pueden neutralizar los efectos dañinos. Sin embargo, la formación de PAs
conjugadas con compuestos fenólicos bajo condiciones de estrés puede depender de
gran manera en la especie de la planta así Gamo el contenido de PAs y sustancias
fenólicas en la planta (Stetsenko et al. , 2009).
Un número de potentes inhibidores de la SPDS han sido reportado (Pegg , 1986; Coward y
Pegg , 1987); la ciclohexilamina es la mejor conocida y la más comúnmente utilizada como
inhibidor de esta enzima. Este compuesto es rápidamente tomado por las células y causa
una rápida disminución en los niveles de Spd en los tejidos. Khan et al., (1991) reportaron
el efecto de la CHA en la ES de zanahoria. Observaron cambios en los contenidos
75
•
CAPITULO 111
celulares de poliaminas en cultivos de zanahoria en respuesta a dos concentraciones de
CHA. Concentraciones de 0.1 y 0.5 mM promovieron la acumulación de Put (durante un
período de cultivo de 6 d) cuando se comparó con el control mientras, mientras que los
niveles celulares de Spd fueron sustancialmente reducidos. Los niveles de Spm celulares
fueron los menos afectados durante las primeras 24 h, pero un incremento significativo
fue observado a mayor tiempo. En este estudio, la CHA (0.1 mM) causó una disminución
significativa en el contenido de PAs endógenas comparada con el· control,
específicamente hablando de Put, ya que fue la única PA que se detectó , notándose que
las otras PAs no se detectaron en ningún tratamiento .
A diferencia de lo obtenido en este trabajo , Mackintosh y Walters (1997) , observaron
incrementos en los niveles celulares de Put en el hongo Pyrenophora avenae con el
tratamiento con CHA (0.05, 0.1 y 0.5 mM), los niveles de Spd permanecieron inalterados,
así como sus actividades enzimáticas.
Cambios inducidos por CHA en los niveles de PAs han sido observados en extractos de
Helianthus tuberosus (Torrigiani et al., 1987), en cotiledones de pino (Biondi et al., 1986) y
en cultivo de células de animales (Mitchell et al. , 1985). En los tratamientos con AG se
observó una disminución en los contenidos endógenos de Put, diamina que únicamente
fue encontrada en los ESs de chile habanero, cuando se compararon con el tratamiento
control. La explicación para la disminución de Put observada requiere futuros trabajos.
En los ESs germinados se observó un cambio de coloración de blanco cremoso a verde
que probablemente esté relacionado con actividades fotosintéticas. Las PAs han sido
localizadas en vacuolas, mitocondrias y cloroplastos (Siocüm, 1991 ). Recientemente
estos compuestos han sido detectados en la membrana tilacoides de espinacas,
asociadas con complejos captadores de luz y fotosistema 11 (Borre!! et al., 1995). Este
mismo autor concluyó que el papel de las PAs puede ser para mantener la actividad
fotosintética, previniendo la senescencia inducida por estrés osmótico.
76
CAPÍTULO 111
3.5 BIBLIOGRAFÍA
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81
CAPÍTULO 111
•
82
•
CAPÍTULO IV
CAPÍTULO IV
4.1 DISCUSIÓN GENERAL
En el presente trabajo se observó que la eficiencia embriogénica no fue significativa
comparada con el control, pero sí hubo una notable mejora en el desarrollo de los ESs,
principalmente con los tratamientos con Spm (0.01, 0.1 y 1.0 mM). Sin embargo, los
resultados de este estudio coinciden con algunos reportes en los cuales las PAs, reducen
las respuestas (número de embriones somáticos, reducciór;t en el crecimiento de los
cultivos) en los cultivos embriogénicos (Calheiros et al., 1994; Silveira et al., 2006) .
Respuestas similares fueron encontradas en este estudio, ya que la Spd exógena mostró
una tendencia a disminuir el número de embriones somáticos de chile habanero más que
las otras PAs (Put y Spm).
Efectos inhibitorios de las PAs sobre la embriogénesis somática en café no es un caso
aislado. Patil et al., (1998) observaron una reducción en la inducción de ESs por Put, Spd,
etileno y sus inhibidores de la biosíntesis en garbanzo. Contrario a lo antes mencionado,
Kevers et al., (2000) obtuvieron un incremento en el número estructuras embriogénicas en
cultivos en suspensión de Panax ginseng con la adición de PAs (Put, Spd y Spm 10, 100
y 1000 J..LM de cada una). De igual forma, Paul et a. , (2009) cuando adicionaron PAs (Put,
0.1, 0.5 y 1.0 mM; Spd y spm, 0.1, 0.5 y 1.0 J..LM) al medio embriogénicos, incrementaron
el número de embriones somáticos en Momordica charantia, así como los inhibidores de
biosíntesis de PAs evaluados redujeron la eficiencia embriogénica en este como en el
presente trabajo.
Efectos de inhibidores de PAs han sido reportados afecta·r procesos embriogénicos, como
lo observado en los trabajos de EI-Hadrami y D'Auzac (1992) en Hevea brasiliensis, y
Fobert y Webb (1988) en Solanum melongena. En híbridos de Cichorium se observó que
la ES (número de ESs por mm-2) se inhibió cuando el DFMA (0.1 a 1 O mM), un inhibidor
irreversible de la ADC, fue añadida al medio de cultivo embriogénico (Helleboid et al. ,
1995). Kumar et al., (2008), observaron una reducción de la respuesta embriogénica
utilizando los inh ibidores DFMA y DFMO (1.0 mM) en Coffea canephora. Khan et al.
(1991) reportaron que la CHA (0.5 mM) solo retardó la ES cuando se añadió al medio de
cultivo pero no la inhibió.
83
CAPÍTULO IV
En Panax ginsen, Kevers et al., (2000), incorporaron inhibidores de la biosíntesis de PAs:
DFMA, DFMO, CHA y AG , observando que todas las concentraciones evaluadas (10, 100
y 1000 J..tM de cada una) de estos inhibidores redujeron el número de ESs producidos.
CHA o AG a concentración de 1.0 mM completamente bloquearon la ES cuando fueron
añadidas al medio de inducción. En este trabajo no se inhibió completamente la ES; sin
embargo, como se observó en P. ginseng, sí se redujo el número de ES obtenidos
comparados con el control. La inhibición de la ES por CHA a altas concentraciones (1.0
mM) pudo ser debida a reducción del radio Put/Spd. Los efectos inhibitorios de la AG son
interpretados como una posible participación de la vía catabólica de la Put para formar !:::. 1
pirrolina .
Al cuantificar el contenido endógeno de PAs en ESs de chile habanero se observaron
aquellas PAs comunes en plantas y la presencia de una PA no común: la Cad. La
presencia de esta diamino en C. chinense pudiera estar asociada con la producción de
alcaloides que se le atribuye a algunas especies de la familia de las solanáceas. De igual
forma que este trabajo, Regla-Márquez (2011) caracterizó los contenidos endógenos de
PAsen embriones somáticos y cigóticos en C. chinense y pudieron observar la presencia
de Cad, lo que podría estar confirmando lo anteriormente mencionado.
En los ESs de ch ile habanero tratados con PAs exógenas, Put y Cad fueron las PAs más
abundantes; sin embargo, ninguno de los tratamientos evaluados superaron al control. El
papel de la Put en el crecimiento celular no está totalmente dilucidado. Sin embargo, se
ha reportado que en cultivos embriogénicos de Pinus oocarpa y Pinus patula, Put estimuló
la división celular (Feirer, 1995), mientras que en suspensiones celulares de Pinus taeda y
de callo de Nicotiana tabacum el alto contenido de Put endógena fue asociado con la
reducción del crecimiento celular (Silveira et al., 2004; Rastogi y Davies, 2000).
Trabajando con protoplastos de avena se observó que la aplicación de Put (0.5 mM)
exógena estimuló la división celular, aunque no se encontró una relación directa entre la
concentración de esta PA y la respuesta del cultivo 0fVu y Kuniyuki , 1997). Este mismo
patrón fue observado en cultivos embriogénicos de Araucaria angustifolia suplementados
con PAs (Steiner et al., 2007) .
84
•
CAPÍTULO IV
La Spd y Spm no se detectaron en ninguno de los casos. Esto puede deberse a una
rápida retroconversión de Spm a Spd y de ésta a Put (Yadav y Rajam, 1998; Matto et al.,
201 0) . Shevyakova et al., (2004) trabajando con Mesembyanthemum crystallinum L.
detectaron una interacción entre el etileno y la Cad. Estos autores observaron que al
someter hojas de esta especie a un ambiente con etileno, se incrementaban los • conten idos de Cad, y simultáneamente disminuyeron los contenidos endógenos de Spd.
Este resultado puede ser debido probablemente a la competencia que existe entre el
etileno y las PAs (Spd y Spm) por el mismo precursor: SAM (Moshkov et al., 2008) .
Al evaluar el efecto de Put sobre el contenido de PAs unidas, conjugadas y libres
solamente, se detectaron la Put y Cad en su forma unida, y Put conjugada a muy bajas
concentraciónes; estas formas de PAs están involucradas en la respuesta de las plantas
al estrés ambiental y a deficiencias nutricionales, dando estabilidad a proteínas y ácidos
nucleicos. En lo reportado por Regla-Márquez (2011), se observó que ESs de chile
habanero probablemente por el estrés al que están sometidos in vitro, ocasione que las
PAs libres se unan a los ácidos nucleicos y a las proteínas para protegerlos, así como a la
respuesta al estrés de etileno dentro del recipiente de cultivo, lo que estimula la actividad
de la LDC, aumentando la síntesis de Cad y la disminución de Spd y Spm al competir por
SAM.
En los ESs de chile habanero tratados con Spd exógena (0.01, 0.1 y 1.0 mM) se detectó
solamente Put en su forma conjugada. Martin-Tanguy (2001) reportó que durante la
germinación del arroz, las PAs conjugadas actúan como formas de almacenamiento de
las propias PAs las cuales, después de una hidrólisis, pueden suplir a la célula con PAs
adicionales que podrán participar durante la división y" expansión celular. Bajaj y Rajam
(1995) reportaron que la Spd (5.0 mM) exógena ejerció un efecto inhibitorio en la
regeneración de plantas de arroz a partir de callo embriogénico fresco . En cultivos en
suspensión de tabaco, se llevó a cabo un estudio sobre PAse inhibidores de las mismas y
se vió que la adición de Spd sola o combinada con inhibidores de la biosíntesis (MGBG)
redujeron las actividades enzimáticas principalmente de SAMDC y ADC (Hiatt et al.,
1986).
85
•
CAPITULO IV
En este estudio, Las PAs Spd y Spm no se detectaron en ninguno de los tratamientos
evaluados posiblemente debido a la reducción de la actividad de la enzima encargada de
catalizar la síntesis de SAM descarboxilada de donde la SPDS y SPMS obtienen los
grupos propilamino para la formación de Spd y Spm, respectivamente.
Las PAs libres no se detectaron en ninguno de los tratamientos con PAs exogenas. En
diversos trabajos se ha visto que la utilización de PAs exógenas disminuyen les niveles de
PAs libres (Steiner et al. , 2007; Paul et al., 2009). La concentración de PAs dentro de las
células son estrictamente reguladas (Alcazar et al., 201 O). Factores como el ritmo de
biosíntesis, y la concentración intracelular de estos compuestos (PAs) libres son
regulados mediante su conjugación con moléculas pequeñas, especialmente ácidos
hidroxicinámicos (Stetsenko et al., 2009) (PAs conjugadas solubles) o con sustancias de
alto peso molecular, como hemicelulosa, lignina y en menor medida proteínas (PAs
conjugadas insolubles) . Además de la conjugación, los niveles de PAs libres pueden ser
disminuidos por desaminación oxidativa. Los niveles citoplasmáticos de las PAs también
pueden ser regulados por compartamentalización subcelular de vacuolas, mitocondrias y
cloroplastos, así como por extrusión (Moschou et al., 2008). La proporción relativa de PAs
libres y conjugadas varía entre las diferentes especies de plantas; por ejemplo, en el
tabaco arriba del 90% de los recursos de PAs se encuentran de forma conjugada (Bagni y
Tassoni , 2001 ).
Al evaluar el efecto de las PAs en la germinación de los ESs pudo observarse una
adecuada armonía entre la parte apical y radical del embrión desarrollado, así como un
cambio de coloración tornándose verde, siendo más intenso hacia la parte apical. Este
comportamiento probablemente esté relacionado con lal presencia de la Spm en el medio
de cultivo. Numerosas investigaciones en los últimos años han puesto especial atención al
efecto de la aplicación de poliaminas exógenas sobre la fotosíntesis (Shu et al., 201 0). He
et al., (2002) demostraron qu pueden entrar rápidamente al cloroplasto intacto, lo que
permite inferir que pudieran estar involucradas en alguna actividad protectora en el
aparato fotosintético. Hay pruebas sustanciales concernientes al papel de las PAs en los
cloroplastos. Dornemann et al. , (1996) han demostrado que las PAs son reguladas
durante la biogénesis del aparato fotosintético . La biosíntesis de estas aminas es
controlada por la luz (Kramer et al., 2002) y durante la foto adaptación , el radio Put/Spd
86
•
CAPÍTULO IV
está correlacionado con la estructura y función del aparato fotosintético . •
La CHA es un inhibidor de la enzima SPDS, este compuesto es rápidamente tomado por
las células y causa una rápida disminución en los niveles de Spd en los tejidos. Khan et
al. (1991 ) reportaron el efecto de la CHA en la ES de zanahoria. Observara¡ cambios en
los contenidos celulares de PAs en cultivos de zanahoria en respuesta a dos
concentraciones de CHA. Concentraciones 0.1 y 0.5 mM promovieron la acumulación de
Put (durante un período de cultivo de 6 d) cuando se compararon al control mientras los
niveles celulares de Spd fueron sustancialmente reducidas. Los niveles de Spm celulares
fueron las menos afectadas durante las primeras 24 h, pero un incremento significativo
fue observado a mayor tiempo. En este estudio, la CHA (0.1 mM) causó una disminución
significativa en el contenido de PAs endógenas comparadas con el control,
específicamente hablando de Put, ya que fue la única PA que se detectó, notándose que
la Cad, Spd y Spm, no se detectaron en ningúno de los tratamientos. A diferencia de lo
obtenido en este trabajo, Mackintosh y Walters (1997) , observaron incrementos (1.7 veces
más) en los niveles de Put en el hongo Pyrenophora avenae, y los niveles de Spd
permanecieron inalterados. Cambios inducidos por CHA en los niveles de PAs han sido
observados en extractos de Helianthus tuberosus (Torrigiani et al., 1987), en cotiledones
de pino (Biondi et al., 1986) y en cultivo de células de animales (Mitchell et al., 1985).
4.2 CONCLUSIONES • Estos resultados permiten concluir, que la cadaverina (Cad) es una poliamina común
para la especie Capsicum chinense.
• Se constató que las PAs afectan el crecimiento y desarrollo de los embriones
somáticos de chile habanero. La Spd inhibe el crecimiento mientras que la Put y la
Spm afectaron favorablemente ambos procesos.
• La adición de Spm al medio cultivo ejerce un efecto similar a los RCV durante el
desarrollo y la germinación de los ESs de chile habanero.
87
CAPÍTULO IV
• Los ESs sometidos al efecto de las PAs se tornaron verdes durante la germinación
por lo que probablemente estos compuestos estén involucrados en la actividad
fotosintética durante el proceso.
• La adición de Spm al medio de cultivo fue determinante en el desarrollo armónico de
hojas cotiledonares y radícula de los ESs durante la germinación. •
• Las poliaminas favorecieron la respuesta de los embriones somáticos de C. chinense,
especie recalcitrante a la regeneración in vitro.
4.3 PERSPECTIVAS.
Los avances alcanzados sobre el estudio de las poliaminas en C. chinense, especie
recalcitrante a la regeneración in vitro, permiten corroborar la importancia que pueden
tener estos compuestos en procesos tan complejos como el crecimiento y el desarrollo.
Sin embargo, se requieren otros estudios que permitan conocer cómo, cuándo y dónde
actúan , durante estos procesos. Estos resultados abren nuevas alternativas y
posibilidades para esta especie, aunque aún no contamos con toda la información
requerida para asegurar cuál es el nivel de beneficio que la adición de estos compuestos
pueda aportar a la germinación y conversión en plantas. Estos resultados pueden ser de
mucha utilidad para otras especies con problemas similares durante el cultivo in vitro .
88
•
CAPÍTULO IV
4.4 BIBLIOGRAFÍA
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