Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016)

4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación

Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016

Memorias

Inducción de embriogénesis somática directa en la variedad morada de caña

(Saccharum officinarum)

Xochitl Ortiz Carbajal (Becaria)

Unidad Académica de Ciencias Ambientales de la UAGro

Academia Mexicana de Ciencias

Xoc.darlingelf@gmail.com

Área VI: Biotecnología y Ciencias Agropecuarias

Carolina Abigail Sulu Uc (Colaborador)

Instituto Tecnológico de Mérida

CaritoSulu@Gmail.com

Dr. Luis Carlos Rodríguez Zapata (Asesor)

Profesor-investigador del Centro de investigaciones científicas de Yucatán, A.C.

M.C. Miguel Ángel Keb Llanes (Co-asesor)

Técnico de laboratorio del centro de investigaciones científicas de Yucatán, A.C.

Resumen

Debido a la importancia de la caña de azúcar en la actualidad, se ha buscado un método de

producción masiva donde obtengamos plantas vigorosas y sobre todo libres de patógenos, (Muños,

2004). La embriogénesis somática es un proceso en el cual las células meristemáticas se desarrollan

en embriones somáticos a través de diferentes estados morfológicos similares a la embriogénesis

cigótica, pero sin la fusión de gametos (Williams y Maheswaran, 1986). El objetivo de este trabajo

es el desarrollo de un método eficiente para la rápida propagación de caña de la línea morada por

medio de la embriogénesis somática directa en medio líquido. Se utilizó 0.5 g del meristemo apical

de tallos de caña para la inducción de pro-embriones en medio Murashige y Skoog (MS) y

diferentes concentraciones de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Para la maduración de pro-

embriones se utilizó benzil-aminopurina (BAP), Kinetina (KIN) y diferentes concentraciones y

combinaciones de ácido giberélico (GA3) con Gelrite. Los resultados de la observación en el

microscopio indican que la concentración de 1.25 mg/l de 2,4-D con carbón activado induce a la

formación de pro-embriones. En la maduración se observó que los reguladores de crecimiento

como el BAP y KIN en combinación con altas concentraciones de Gelrite tienen un mejor

crecimiento de embriones a la fase torpedo.

Palabras Clave: Caña, embriogénesis, embriones.

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Introducción

En 1902, el botánico austriaco Gottlieb Haberlandt propuso la teoría de la totipotencialidad

vegetal, es decir, que se puede formar plantas completas a partir de células vegetales, esta teoría

fue afirmada en 1958 por Reinert y Steward, al descubrir la inducción de embriones somáticos a

partir de callos derivados del ápice radical de la Zanahoria (Daucus carota).

La embriogénesis somática (ES) también llamada embriogénesis asexual es un proceso

mediante el cual las células somáticas haploides o diploides se desarrollan en embriones somáticos

a través de diferentes estados morfológicos similares a la embriogénesis cigótica, pero sin la fusión

de gametos (Williams y Maheswaran, 1986). Existen dos tipos de embriogénesis somática: la

directa, que es cuando el embrión se origina directamente de una célula (meristemática) o tejido y

la indirecta, donde primero se forma un callo embriogénico a partir del cual se forman los

embriones. Las células meristemáticas son las responsables del crecimiento vegetal, cuyas

características son: células no diferenciadas, pequeñas, el citoplasma ocupa la mayor parte de

volumen celular, ya que las vacuolas son muy pequeñas, tienen forma poliédrica, paredes finas y

no posee cloroplastos ni ningún otro plástido diferenciado.

Una de las características sobresalientes de los embriones somáticos es que presentan la

potencialidad de producir duplicados de un genotipo específico. Las principales aplicaciones de la

técnica de cultivo de células, tejido y órganos vegetales son en el campo de la micropopagación,

obteniendo plantas libres de patógenos, preservación de germoplasma, mejoramiento genético,

biosíntesis de metabolitos e investigación básica en áreas de genética, fisiología y bioquímica

(Fowler, 1987; Carpita y McCann, 2000).

La propagación de plantas por este técnica representa el método más eficiente de

multiplicación clonal que se ha desarrollado hasta la fecha (Freire, 2003).

Debido a la importancia de la caña de azúcar en la actualidad, se ha buscado un método de

producción masiva donde obtengamos plantas vigorosas y sobre todo libres de patógenos, (Muños

Rojas 2004). El cultivo de S. officinarum en México es de suma importancia para la economía del

país, su importancia radica en ser la materia prima de una de las agroindustrias de mayor relevancia,

al producir más de 60 millones de toneladas de caña y casi 7 millones de toneladas de azúcar en el

año 2012-13.

El cultivo in vitro de caña de azúcar ha sido establecido en muchas variedades comerciales

con el propósito de producir material libre de enfermedades microbianas, conservar germoplasma,

detectar resistencia a enfermedades y plagas, etc. En este sentido, el objetivo de este trabajo es el

desarrollo de un método eficiente para la rápida propagación de caña de la línea morada por medio

de la embriogénesis somática directa en medio líquido.

Materiales y Métodos

El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de fisiología vegetal y transformación

genética del departamento de Biotecnología perteneciente al Centro de investigaciones Científicas

de Yucatán, A.C.

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Material Vegetal

De la colección de caña del CICY se colectaron los meristemos apicales de plantas jóvenes

de aproximadamente 4 a 6 meses de edad, de un tamaño de 1.70 a 2 metro de altura y un diámetro

de 4 a 7 cm, los meristemos apicales fueron seccionados de 15 a 25 cm de largo.

Desinfestación del material vegetal

El meristemo apical de tallos, se desinfesto con agua destilada y jabón comercial, se retiró

la primera lamina, después se colocó en alcohol al 70% se agito durante 10 minutos, se eliminó el

alcohol y se vertió cloro al 10% (cloralex con 5.6 de ingrediente activo) y tween 80 (Sigma) y se

agito durante 10 min, enseguida se enjuagaron los explante en agua destilada estéril, para luego

extraer el meristemo para su siembra.

Extracción de la zona meristemática

Los explantes estériles se eliminaron las primeras capas hasta llegar a las zonas altamente

meristemáticas de color amarillo claro, luego se fragmentaron en presencia de un buffer

antioxidante (carbón activado, ácido ascórbico, PVP), (Fig.1).

Figura 1. Proceso extracción de la zona meristemática: A) explante esteril en agua destilada esteril,

B) Extracion de laminas sobre una sanita esteril, C) Zona altamente meristemática en medio

anteoxidante , D) Fragmentación del tejido meristematico.

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Efecto del 2,4-D en la inducción de pro-embriones en tejido meristemático en medio líquido

Del Tejido meristemático fragmentado se pesó 0.5g y se colocó en matraces con 50 ml de

medio MS con diferentes concentraciones de 2,4-D a 1.25 mg/, 2.5 mg/l y 5 mg/l con carbón

activado, se incubo a 100 rpm en oscuridad a 25°C

Conteo de células y pro-embriones en la cámara contador de colonias

Se contó en la cámara Gridded Sedgewick Rafter 1 mm2 de la marca WSG, 1 ml de células

de la muestra con la concentración de 1.25 mg/l de 2,4-D, ya que la muestra con 5 mg/l presentó

un alto grado de contaminación.

Luego de 3 días de cultivo de los meristemos en el medio liquido con diferentes

concentraciones de 2,4-D, se extrajo 1 ml de muestra a cada tratamiento, se centrifugó a 13,000

rpm por 5 minutos en una microcentrífuga D-37520 Osterode, se eliminó el sobrenadante y se le

agrego 50 µl de solución salina y 10 µl de hematoxilina, de esto, se puso 20 µl en la cámara y se

observó en un microscopio Axio scope.A1.

Resiembras para el desarrollo embriones somáticos de caña

Para el desarrollo de los pro-embriones, se filtró el medio MS que contenía los pro-

embriones con un colador marca ekco, y se vertió en un tubo falcón estéril, posteriormente se

centrifugó y se retiró el sobrenadante dejando 5 ml de volumen, este se sustrajo para verterlo en el

nuevo medio MS liquido con 1.25 mg/l de 2,4-D, se incubo a 25° en oscuridad y a 100 rpm.

Maduración de embriones globulares

Para plaquear los pro-embriones en el medio de maduración sólido, se transfirió 10 ml del

MS de crecimiento con pro-embriones a un tubo falcón, posteriormente se centrifugo y se decantó,

enseguida se vertió 5 ml de medio y se plaqueó 800 µl por tratamiento.

Los medios de maduración contenían BAP, KIN y diferentes concentraciones y

combinaciones de GA3 con Gelrite (Véase tabla 1).

Tabla 1. Denominación de los medios según su contenido.

Concentración

de Gelrite Con GA3 Sin GA3

Bajo M1 M4

Medio M2 M5

Alto M3 M6

Resultados

Efecto del 2,4-D en la inducción de pro-embriones en tejido meristemático

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Los resultados de la observación en el microscopio de los tratamientos de inducción

indicaron que la mejor concentración es 1.25 mg/l de 2,4-D donde se observa una gran cantidad de

células meristemáticas y pro-embrionarias, por el contrario, altas concentraciones de 2,4-D (5 mg/l)

se observó pocas células meristemáticas, en la fig. 2-A con 1.25 mg/l de 2,4-D se observa las

células meristemáticas con las características descritas por Doerner (2000) una célula pequeña,

isodiamétrica y un núcleo altamente denso y teñido de color azul por el colorante hematoxisilina

el cual es específico para ácidos nucleicos, además se puede observar pro-embriones de 0.1 a 0.5

µm. Por el contrario en la figura 2-B se observan pocas células meristemáticas células diferenciadas

y contaminación endógena.

Fig. 2. Células meristemáticas y pro-embrionarias de caña (línea morada) en medio MS y diferentes

concentraciones de 2,4-D: A) Tratamiento con 1.25 mg/l de 2,4-D, 100x, B) Tratamiento con 5

mg/l de 2,4-D 100x.

Conteo de células y pro-embriones en la cámara Contador de colonias

La formación de embriones globulares fue mayor a comparación de embriones escutelar y

torpedo; la fase globular representa el 81.3%, mientras que los de la fase escutelar solo el 18.7%

de embriones contabilizados, hasta este paso de la inducción, antes de la resiembra de pro-

embriones, no se encontraron embriones en fase torpedo.

Tabla 2. Tabla de número de células meristemáticas y porcentajes de las diferentes fases de la

embriogénesis somática en la variedad morada de caña de azúcar.

2,4-D mg/l gMF por

matraz

No. Células

meristemáticas

/ml

No. Embriones

globulares (%)

No. Embriones

escutelares (%)

No.

Embriones

torpedo (%)

1.25 0.5 g 43900 81.3 18.7 0

Resiembras para el desarrollo embriones somáticos de caña

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Los resultados de la segunda resiembra, fueron los siguientes: un notable aumento de

tamaño de los pro-embriones (5 a 20 µm), en la Figura 3, se observa una reducción del número

de células meristemáticas, por lo tanto un incremento del número de pro-embriones y algunos en

fase escutelar y escasos en la fase torpedo.

Fig. 3. Pro-embriones observados en un microscopio, de un tamaño de 5 a 20 µm. A) Enfoque a

100x, B) Enfoque a 40x, solo se logra apreciar embriones de 10 a 20 µm.

Maduración de embriones globulares

La maduración es la fase en donde los embriones globulares pasa al estadio escutelar y

luego al torpedo. En los resultados obtenidos con el ensayo de diferentes medios para la

maduración, se observó en la figura 5 un mejor crecimiento de los pro-embriones a la fase escutelar

y a torpedo con el medio M4, por el contrario, en medio M6 los pro-embriones se visualizan de

menor crecimiento, los tratamientos M1 y M2 presentan un lento desarrollo a comparación con

M3.

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Fig. 4. Embriones globulares, primer día en el medio de maduración, cuyo tamaño oscila entre 5 a

20 µm. Visualización en estereoscopio marca Labomed, Mod. Luxeo 4D, 2.5x - 3.5x.

Fig. 5. Embriones en fase escutelar y torpedo, después de una semana de su siembra en medio de

maduración, se visualizan embriones de mayor tamaño. Visualización en estereoscopio marca

Labomed, Mod. Luxeo 4D, 3.5x.

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Discusión y conclusiones

Hasta la fecha hay pocos artículos publicados acerca de la inducción de embriogénesis

somática de caña en medio líquido, investigadores de Cuba desarrollaron una metodología para la

formación de callo por medio de la embriogénesis somática en medio líquido a partir de hojas caña,

obtuvieron células meristemáticas y agregados pro-embriogénicos, sin embargo no continuaron

con la maduración, ni formación de plantas.

En comparación con el trabajo realizado por Fraire-Seijo y colaboradores (2006) donde

obtuvieron de estructuras embriogénicas en medio MS líquido, nuestro trabajo obtuvo 87 veces

más de pro-embriones que los obtenidos en el trabajo antes mencionado, además continúan

madurando a embriones escutelar y torpedo.

Como conclusión final, para la inducción de formación de embriones la mejor

concentración es 1.25 de 2,4-D y además para su maduración se requiere altas concentraciones de

Gelrite, debido a que causa estrés abiótico a los embriones para su maduración.

Agradecimientos

Agradezco a la Academia Mexicana de Ciencias por el apoyo brindado, a la Universidad Autónoma

de Guerrero por la difusión y apoyo a jóvenes investigadores, al Dr. Luis Carlos Rodriguez y al

M.C. Miguel Keb Llanes por recibirme en su laboratorio, apoyarme, orientare y darme la

oportunidad de aprender cosas nuevas. Doy gracias a Carolina Sulu Uc y Antonio Reyes quienes

colaboraron en este proyecto.

Referencias

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Biochemistry and Molecular Biology of Plants. USA: American society of plant

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Freire-Seijo, M., Kosky, R.G., Herrera Ofarril, I., Reyes M. (2006). Formación de callos y

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