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Efecto de las gotas citoplásmicas sobre la capacidad fecundante del espermatozoide en el cerdo Tesis Doctoral Germán Gómez Londoño Director: Francisco Javier Henao Uribe, PhD Asesores evaluadores: Consuelo Vélez Álvarez, PhD Alejandro Ceballos Márquez, PhD Jonatan Rubén Sánchez-Osorio Moreno, PhD Doctorado en Ciencias Agrarias Facultad de Ciencias Agropecuarias Universidad de Caldas Julio 11 de 2014
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Efecto de las gotas citoplásmicas sobre la capacidad fecundante del espermatozoide en el cerdo
Tesis Doctoral
Germán Gómez Londoño
Director:
Francisco Javier Henao Uribe, PhD
Asesores evaluadores:
Consuelo Vélez Álvarez, PhD
Alejandro Ceballos Márquez, PhD
Jonatan Rubén Sánchez-Osorio Moreno, PhD
Doctorado en Ciencias Agrar ias Facultad de Ciencias Agropecuarias
Universidad de Caldas
Ju l io 11 de 2014
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Tabla de contenido
INTRODUCCIÓN 5
CAP ÍTULO I 9
REV IS IÓN DE L ITERATURA 9 TABLA 1. FACTORES ASOCIADOS A LA PRESENTACIÓN DE ALTERACIONES SEMINALES REPORTADOS EN LA LITERATURA 11 1 . EVALUAC IÓN DE LA CAL IDAD SEMINAL 16 1.1 CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA 18 TABLA 2. FACTORES QUE ALTERAN LA CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA. 19 1.2 MOVILIDAD 23 !.# MORFOLOGÍA ESPERMÁTICA 26 1.4 ANORMALIDADES ESPERMÁTICAS 31 1.5 FRAGMENTACIÓN DE ADN 34 1.6 INTEGRIDAD ACROSÓMICA 39 1.7 INTEGRIDAD FUNCIONAL DE LA MENBRANA 43 1.8 INTEGRIDAD ESTRUCTURAL DE LA MENBRANA 47 1.9 PENETRACIÓN IN VITRO 49 1.10 EVALUACIÓN POLIVALENTE 52 1.11 TEMPERATURA 53 1.12 PH 54 TABLA2. VALORES DE REFERENCIA PARA VARIABLES SEMINALES. 58 2 . GOTAS C ITOPLÁSMICAS 59 2.1 FORMACIÓN Y ESTRUCTURA DE LAS GOTAS CITOPLÁMICAS 61 2.2 COMPOSICIÓN DE LAS GOTAS CITOPLÁSMICAS 64 2.3 CLASIFICACIÓN DE LAS GOTAS CITOPLÁSMICAS 66 2.4 FACTORES ASOCIADOS A LA PRESENTACIÓN DE GOTAS 68 TABLA 3 FACTORES ASOCIADOS A LA PRESENTACIÓN DE GOTAS CITOPLASMÁTICAS EN MACHOS PORCINOS ACTIVOS REPRODUCTIVAMENTE. 71 B IBL IOGRAF ÍA 73
CAPITULO II 86
REVISIÓN SISTEMÁTICA DE LOS FACTORES ASOCIADOS A LA PRESENTACIÓN DE GOTAS CITOPLÁSMICAS EN PORCINOS. 86 1. INTRODUCCIÓN 88 2. MATERIALES Y MÉTODOS 90 3. RESULTADOS 94 4. DISCUSIÓN 99 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 101
CAPITULO III 106
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DYNAMICS OF PORCINE SEMEN QUALITY IN THE WESTERN-‐CENTRAL REGION OF COLOMBIA 106 ABSTRACT 106 1. INTRODUCTION 107 2. MATERIALS AND METHODS 109 2.1 SEMINAL EVALUATION TECHNIQUES 109 2.2 STATISTICAL ANALYSIS 110 3. RESULTS 110 4. DISCUSSION 118 5. CONCLUSIONS 121 BIBLIOGRAPHY 123
CAPITULO IV 125
LAS GOTAS CITOPLÁSMICAS Y SU RELACIÓN CON LA CAPACIDAD FECUNDANTE EN VERRACOS DEL CENTRO OCCIDENTE DE COLOMBIA 125 1. INTRODUCCIÓN 125 2. MATERIALES Y MÉTODOS 127 2.1 TÉCNICAS DE EVALUACIÓN SEMINAL 128 2.2 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 130 3. RESULTADOS 131 DISCUSIÓN 143 CONCLUSIONES 146 BIBLIOGRAFÍA 147
CAPITULO V 151
DISCUSIÓN GENERAL 151 BIBLIOGRAFIA 161
CONCLUSIONES GENERALES 165
ANEXOS 169
NORMAS TÉCNICAS 169
CALIDAD SEMINAL 169
DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA 169
DETERMINACIÓN DE LA FRAGMENTACION DEL ADN 177
DETERMINACIÓN DE INTEGRIDAD ACROSÓMICA 185
DETERMINACIÓN DE MORFOLOGÍA ESPERMÁTICA 190
DETERMINACIÓN DE INTEGRIDAD ACROSÓMICA 196
DETERMINACIÓN DE SUPERVIVENCIA ESPERMÁTICA 201
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FORMULARIO PARA LA EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LAS BÚSQUEDAS 209
INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE INFORMACIÓN EN GRANJA. 212
INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE INFORMACIÓN PARA NOVEDADES DE MACHO 220
INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE INFORMACIÓN INDIVIDUAL PARA CAMBIO DE DIETA EN LOS MACHOS EN GRANJA 225
INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE INFORMACIÓN INDIVIDUAL PARA ENFERMEDAD Y TRATAMIENTO DE MACHOS 226
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INTRODUCCIÓN
Las actuales condiciones de producción pecuaria, caracerizadas por un modelo
productivo globalizado, demandan de los empresarios dedicados a la producción
de carne porcina esquemas de asociatividad, economías de escala y la
certificación de procesos como herramientas de desarrollo primordiales que les
aseguren una adecuada rentabilidad a sus empresas. La Asociación Colombiana
de Porcicultores, reporta un inventario para el año 2013 de 8070 reproductores y
146.000 hembras adultas y 26.344 cerdas de reemplazo, (una proporción de 18
cerdas/macho), situación que evidencia la subutilización de los verracos en los
planes de reproducción en el país. Esta situación, unida al desconocimiento de los
umbrales de clasificación de la calidad seminal de verracos en las condiciones de
explotación colombianas, limita el desempeño indicadores reproductivos y
productivos de las granjas porque predispone a los porcicultores a utilizar material
seminal de calidad desconocida y puede comprometer la productividad y la
competitividad de la empresa.
La utilización de semen con baja capacidad fecundante en programas de
inseminación artificial, donde se llegan a obtener entre 1500 y 2000 dosis por
macho en un año (Rutten et al., 2000), puede generar una disminución de la
efectividad en los servicios, lo cual trae como consecuencias un incremento de
retorno al celo, el desecho de cerdas de reemplazo a temprana edad y en general
la disminución de la eficiencia productiva reproductiva de la granja (Koketsu and
Sasaki, 2008; Safranski, 2008).
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La valoración de la calidad seminal mediante técnicas in vitro, en muestras
procedentes de semen refrigerado o congelado, debe incluir el análisis de tantas
varibles como sea económicamente posible para que permitan recabar
información rápida y confiable sobre la capacidad fecundante del macho (Turba et
al., 2007). La evaluación convencional aporta información del estado del
eyaculado en un momento dado (Gadella et al., 2008; Ruiz-Sanchez et al., 2006) y
la incorporación de técnicas que evalúan la integridad del DNA, la membrana del
espermatozoide y la valoración objetiva de la cinética espermática, ayudan a
detectar verracos problema y por tanto a mejorar la fertilidad en campo (Perez-
Llano et al., 2009).
En Colombia, el esquema de control de calidad seminal en los centros de
inseminación artificial no está definido y presenta importantes falencias, al
respecto el Instituto Colombiano Agropecuario ha hecho esfuerzos por ajustar la
comercialización del material seminal, pero en muchos casos, la medida no ha
sido tomada por los porcicultores como mecanismo mejorador de los procesos
productivos de sus explotaciones y por tanto de los indicadores nacionales de
producción porcina.
La certificación de procesos, entre otros aspectos, apunta a mejorar los
indicadores en los centros de inseminación artificial para enfrentar dos graves
limitantes: el desconocimiento del comportamiento reproductivo de los verracos y
la baja calidad seminal del semen, este último, afectado, por la presencia de
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remanentes citoplásmicos denominados gotas citoplásmicas (GCs), las cuales se
consideran como la alteración morfológica más frecuente en machos porcinos
destinados a procesos de reproducción controlada (Fischer et al., 2005; Gómez,
2010); la presentación de un elevado porcentaje de estas en el eyaculado, limitan
parcial o definitivamente la utilización del macho afectado, con la particularidad de
que las GCs aparecen y desaparecen espontáneamente, o permanecen
constantemente altas en algunos reproductores (Althouse, 1998; Fischer et al.,
2005). La presentación de GCs se ha asociado a factores ambientales como la
estación del año, las elevadas temperatura ambiental y humedad relativa así como
el fotoperiodo (Andersson et al., 1998; de Serrano et al., 1989; Echeverria-Alonzo
et al., 2009; Suriyasomboon et al., 2005); la edad de los reproductores (Díaz et al.,
2009); otras anormalidades espermáticas como cola corta, cola enrollada y reflejo
distal (Holt, 1982; Lovercamp et al., 2007; Sukura et al., 2002); la elevada
temperatura escrotal (Malmgren, 1989); la fragmentación de ADN (López-
Fernández et al., 2008) y la cromatina inestable (Ardón et al., 2008).
Determinar el efecto de las gotas citoplasmicas distales y proximales sobre la
capacidad fecundante del espermatozoide en el cerdo, identificar los factores
asociados a la variabilidad en la frecuencia de presentación de éstas en verracos
activos reproductivamente, valorar su relación con la integridad del ADN y de la
membrana del espermatozoide, con la cinética espermática medida mediante un
sistema asistido con computador y realizar un metaanálisis de los factores
asociados reportados en la literatura, son aportes encaminados a prevenir y
controlar de la presentación de la esta alteración en los centros de inseminación
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artificial en Colombia. Con esta propuesta se espera generar un sistema integral
de estimación de la fertilidad del verraco, e identificar las causas y los efectos de
la dinámica de presentación de las GCs en el porcino.
El desarrollo y la adopción de técnicas de evaluación seminal, replicables,
confiables, económicamente viables y objetivas es fundamental para la
porcicultura colombiana, estas deben aportar criterios que ayuden a consolidar un
adecuado y racional desarrollo de los centros de inseminación, además de ofrecer
sustento científico a la generación, adopción y ejecución de medidas de control
sobre la calidad seminal que logren estimular el interés del gremio porcicultor por
contar con registros completos de los resultados reproductivos de sus
reproductores.
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CAPÍTULO I
REVISIÓN DE L ITERATURA
En reproducc ión porc ina , una hembra apor ta un poco más de dos
camadas a l año , en tan to que un macho supera con c reces es ta
c i f ra s i se cons idera la inseminac ión a r t i f i c ia l como her ramien ta
de c ruzamien to (Ru t ten e t a l . , 2000) . Los ind icadores
reproduc t i vos resu l tan tes de la ap l i cac ión de la inseminac ión
a r t i f i c ia l dependen de mú l t ip les fac to res como: la nu t r i c ión
(Wi l son e t a l . , 2004a) ; l a san idad de la g ran ja (Madsen , 2005) ;
e l momento de la inseminac ión (Knox and Rodr iguez . , 2001) , a
ca l idad de l semen (F lowers , 2002a ; Lovercamp e t a l . , 2007a ;
Wabersk i e t a l . , 1994) y fac to res re lac ionados con var iab les
c l imá t i cas (Sur i yasomboon A e t a l . , 2005) .
La fe r t i l i dad de un macho depende bás icamente de la p roducc ión
de gametos v iab les duran te la espermatogénes is , es te p roceso
se e fec túa en t res e tapas : p ro l i fe ra t i va o m i tó t i ca
(espermatoc i togénes is ) , me ió t i ca ( reducc ión c romosómica) y de
d i fe renc iac ión (espermiogénes is ) (F ranca e t a l . , 2005) . La
espermatogénes is es regu lada por la in te racc ión de l e l e je
h ipo tá lamo-p i tu i ta r ia - tes t í cu los , l as cé lu las tes t i cu la res (de
10
Leyd ig , de Ser to l i y ge rmina les ) , l os conduc tos de fe ren tes , e l
ep id íd imo (O 'Donne l e t a l . , 2001) y la expres ión de
aprox imadamente 100 genes que juegan un ro l impor tan te en la
func ión tes t i cu la r (Sch lech t e t a l . , 2004) .
En e l ve r raco se cons ideran norma les los eyacu lados a par t i r de
los se is meses de edad (F lowers , 2004b) , con la edad avanzada
d isminuye la concen t rac ión y la v iab i l i dad espermát i ca y se
inc rementa e l po rcen ta je de anorma l idades mor fo lóg icas
(Rozeboom e t a l . , 2000b) ; ad ic iona lmente , l a ca l idad
espermát i ca depende de la e f i c ienc ia espermatogén ica , de l
d iámet ro y la long i tud de los tubos semin í fe ros y de l tamaño
tes t i cu la r (Fuen tes e t a l . , 1989) .
Las a l te rac iones en la mor fo log ía espermát i ca es tán
s ign i f i ca t i vamente re lac ionadas con e l reduc ido tamaño de
camada y con ba jas tasas de no re to rno (Su tkev ič i enė and
Ž i l i nskas , 2004) , cua lqu ie r a l te rac ión func iona l o es t ruc tu ra l de l
espermatozo ide a fec ta la mov i l i dad espermát i ca y a l te ra la
fe r t i l i dad (F lowers , 2004a) .
En la l i t e ra tu ra se repor tan una ser ie de fac to res asoc iados a la
p resen tac ión de a l te rac iones semina les c las i f i cados como
gené t i cos , amb ien ta les , san i ta r ios , f recuenc ias de eyacu lac ión ,
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técn icas de conservac ión , y tóx icos , los cua les se p resen tan en
la Tab la 1 , donde se descr ibe e l fac to r , e l t i po de a l te rac ión
ana l i zada la desc r ipc ión de l fac to r y la re fe renc ia b ib l iog rá f i ca .
Tab la 1 . Fac to res a soc iados a l a p resentac ión de a l te rac iones semina le s repor tados en l a l i t e ra tu ra
Factor Alteración Descripción Referencia
Genéticos
Poliploidía familiar como generadora de falla en la espermatogénesis. Traslocación autosómica en aves, efecto sobre la fertilidad y características del semen. Esterilidad hereditaria por cola corta en espermatozoides en cerdos York. Cambios en la motilidad y en la morfología generados por la edad en atas Noruegas Pardas.
Asociación entre alteraciones cromosómicas y malformaciones en semen en humanos. Se examinaron 10 características seminales diferentes en gallos que presentaron traslocaciones cromosómicas, estas no afectaron los procesos de espermatogénesis. Se reporta un nuevo síndrome de infertilidad en verracos Yorkshire que genera malformaciones en la cola y alteraciones en la motilidad espermática. Se evaluó el efecto de la edad sobre cambios patológicos en testículos, epidídimo y próstata, la edad posee efectos deletéreos en la calidad seminal y espermatogénesis,
(Benzacken et al., 2001) (Blazak W F and S, 1979) (Skura A et al., 2002) (Syntin P and B, 2001)
Efecto del fotoperiodo sobre la calidad seminal en verracos destinados
La luz natural o artificial no ejerce ningún efecto significativo sobre las anomalías morfológicas del semen, el sistema
(Rivera del Álamo 2003)
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Ambientales
a la inseminación artificial. Morfología espermática durante las estaciones en caballos pura sangre en Japón. Efecto de la temperatura y humedad sobre la morfología espermática en cerdos Duroc bajo diferentes condiciones de alojamiento en Tailandia. Variación anual de la calidad de semen porcino y su relación con parámetros reproductivos. Cambios reproductivos en toros antes y durante la exposición a temperaturas ambientales elevadas.
endocrino del verraco se adapta a los cambios de luz y la luz no ejerce ningún efecto sobre la capacidad de conservación del semen. En 299 eyaculados se reportan las gotas citoplásmicas como la alteración de mayor presentación. La morfología espermática es afectada moderadamente por el tipo de alojamiento, las altas temperaturas y la humedad. Se encontró una asociación negativa entre la calidad seminal y la estacionalidad, las variables climatológicas afectan la calidad espermática y los parámetros de producción de lechones. En toros expuestos a alta temperatura ambiental se afecta la calidad seminal, se reduce la producción espermática y se incrementa el porcentaje de espermatozoides alterados.
(Koyago et al., 2008) (Suriyasomboon A et al., 2005) (Hernandez, 1998) (Meyerhoeffer et al., 1985)
Sanitarias
El efecto de Pseudorabia sobre la fertilidad en cerdos adultos.
Inoculación experimental del virus generó alteraciones en la espermatogénesis e
(Hall L B et al., 1984)
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La inoculación del virus de la enfermedad del ojo azul en verracos de la raza pelón Mexicano. Virus de transmisión sexual: relación semen y virus.
infertilidad y presencia de GCs. El virus de la enfermedad del ojo azul en verracos produjo la presencia de nódulos granulomatosos en la cabeza del epidídimo. Se describen los mecanismos de infección de algunos virus a las fracciones seminales con el fin de entender como los virus de transmisión sexual afectan al semen.
(Ramirez et al., 1999) (Zea-Mazo et al., 2010)
Frecuencia de eyaculación
Estudio del eyaculado de un verraco estresado por la frecuencia de recogidas en inseminación artificial. Efecto de colecciones repetidas sobre las características del semen de alpacas.
Asociación negativa entre la elevada frecuencia de recogida y la calidad del semen en verracos, aumento del 60% en las formas inmaduras, en especial GCs La elevada frecuencia de eyaculación afecta la negativamente la calidad seminal, en especial la concentración, el % de anormalidades de cabeza y cola y la concentración del semen.
(Bonet, 1987) (Bravo P W et al., 1997)
Técnicas de conservación
Caracterización cuali-cuantitativa de patologías espermáticas: estudio comparativo de la incidencia de anormalidades espermáticas en semen porcino fresco y refrigerado.
Se reporta una mayor incidencia de patologías seminales en semen refrigerado que en semen fresco, en especial alteraciones de la cabeza.
(Torretta M E et al.)
Tóxicos:
La Turnera diffusa en el desarrollo testicular de cerdos prepúberes.
Plantas como la Turnera diffusa suministrada a cerdos prepúberes
(Mendez et al., 2005)
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Efecto de los insecticidas y dos herbicidas sobre los patrones de movilidad espermática, analizada por computador. Efecto de la polución ambiental sobre la calidad espermática. Debilitamiento de la calidad seminal asociada con exposición ambiental de DDT en hombres jóvenes que viven en área de malaria en la provincia de Limpopo, Sur África Retención de gotas citoplásmicas en cabeza de epidídimo en ratas después del tratamiento con agentes citotóxicos y xenobióticos. Alteraciones espermáticas, gotas
estimula el desarrollo testicular y el epidídimo en peso, volumen longitud y perímetro. Utilizando un sistema asistido por computador se determinó como se afecta la movilidad espermática por efecto de agentes tóxicos. La contaminación ambiental afecta la calidad seminal en humanos. Asociación negativa entre la exposición de hombres al DDT y la calidad del eyaculado. Exposición de ratas a insecticidas organofosforados y matathion generó aumento en retención de gotas entre un 65% y 95% e inhibición del movimiento. La exposición de ratas a organofosforados afecta la
(Resendiz, 2003) (Hansen C et al., 2010) (Aneck-Hahn et al., 2007) (Akbarsha M.A et al., 2000)
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citoplasmáticas y baja motilidad como principales indicadores de la baja calidad espermática debida a pesticidas organofosforados en ratas.
calidad seminal, en especial se incrementa la presencia de gotas citoplásmicas y la motilidad.
(Okamura A et al., 2009)
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1 . EVALUACIÓN DE LA CAL IDAD SEMINAL
E l aná l i s i s semina l i n v i t ro (espermiograma) , comp lementa r io de l
examen c l ín i co , es de a l to va lo r d iagnós t i co para eva luar en
fo rma ind i rec ta la func ión tes t i cu la r , ep id id imar ia y de l t rac to
gen i ta l de l ve r raco , es te aná l i s i s permi te de tec ta r casos de
in fe r t i l i dad de sub- fe r t i l i dad as í como e l g rado de norma l idad de l
semen an tes de ser p rocesado para su uso en inseminac ión
a r t i f i c ia l ( IA ) . La eva luac ión semina l i nc luye de manera ru t ina r ia ,
l a de te rminac ión inmed ia ta de l vo lumen, aspec to (co lo r , o lo r ,
pH, tempera tu ra ) , l a concen t rac ión , e l g rado de mov i l i dad de los
espermatozo ides , l a mor fo log ía espermát i ca y la p resenc ia de
cé lu las ex t rañas as í como de con taminan tes bac te r ianos y
v i ra les (Rodr íguez-Mar t ínez e t a l . , 2005) .
La p rec is ión de la eva luac ión de la ca l idad semina l puede es ta r
in f luenc iada por la va r iac ión b io lóg ica , po r e l e r ro r humano
imp l i cado en la rea l i zac ión de l aná l i s i s y por e l t i po de equ ipo
u t i l i zado , por tan to , pa ra que las p ruebas sean cons ideradas
ú t i l es en la p red icc ión de la fe r t i l i dad , ha de tenerse p rudenc ia
en la se lecc ión de las va r iab les a cons idera r y es tas deben
ana l i za rse con a l ta p rec is ión , han de ser independ ien tes en t re
s í , pe ro co r re lac ionados con la fe r t i l i dad (Amann, 1989) . Para la
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va lo rac ión de la ca l idad semina l med ian te técn icas i n v i t ro , de
mues t ras p roceden tes de semen re f r ige rado o conge lado , se
deben inc lu i r e l aná l i s i s de tan tas ca rac te r ís t i cas como sea
económicamente pos ib le , con e l f i n de recabar in fo rmac ión
ráp ida y con f iab le sobre la capac idad fecundan te de l macho
(Turba e t a l . , 2007) .
La fe r t i l i dad po tenc ia l de una mues t ra de semen dependende de l
con ten ido su f i c ien te de espermatozo ides v iab les ,
mor fo lóg icamente norma les y func iona lmente competen tes , l os
cua les es tén en capac idad de l l egar a l ov iduc to , capac i ta rse ,
l og ra r la fecundac ión de l ooc i to y consecuen temente in i c ia r e l
desar ro l lo embr ionar io , l o cua l es fundamenta l pa ra e l éx i to de
los p rogramas de inseminac ión a r t i f i c ia l (B roekhu i j se , 2012)
En la ac tua l idad se d iscu te la re lac ión ex is ten te en t re la
eva luac ión convenc iona l de la ca l idad semina l y la re lac ión con
los resu l tados de fe r t i l i dad en campo, pero se acep ta que la
p r imera apor ta in fo rmac ión impor tan te sobre e l es tado de l
eyacu lado en un momento dado (Gade l la e t a l . , 2008 ; Ru iz -
Sanchez e t a l . , 2006) . La incorporac ión de Técn icas modernas
que eva lúan , la in tegr idad de l DNA y de la membrana de l
espermatozo ide , y la va lo rac ión ob je t i va de la c iné t i ca
18
espermát i ca pueden tener mayor re lac ión con la fe r t i l i dad en
g ran ja (Perez -L lano e t a l . , 2009a) .
1 .1 CONCENTRAC IÓN ESPERMÁTICA
La concen t rac ión espermát i ca y e l vo lumen de semen de l
eyacu lado re f le jan las cond ic iones de p roducc ión espermát i ca y
de sa lud de l macho (Foxcro f t e t a l . , 2008 ; Gadea, 2005) , s i se
comp lementan con o t ros ind icadores de ca l idad semina l como la
mor fo log ía , l a superv ivenc ia y la mot i l i dad , se puede l l egar a
cuan t i f i ca r un adecuado número de dos is p roduc idas por
eyacu lado (Foxcro f t e t a l . , 2008) , me jo rando por tan to la
ren tab i l i dad de los cen t ros de inseminac ión a r t i f i c ia l (Camus e t
a l . , 2011) ; s in embargo , e l uso de la concen t rac ión espermát i ca
por s í so la , no p red ice camb ios de la fe r t i l i dad de un eyacu lado
(Gadea, 1997a ; Gadea e t a l . , 2004 ; Xu e t a l . , 1998a) .
En la ac tua l idad , se cons idera que la u t i l i zac ión de semen
d i lu ido en IA se debe con ta r con una concen t rac ión ≥3x10 9
espermatozo ides por dos is de 80 a 100 ml (Popwe l l and F lowers ,
2004) ; ten iendo en cuen ta que , pese a u t i l i za r es ta
concen t rac ión , s i se comb ina e l semen de va r ios machos se
enmascara la fe r t i l i dad rea l de los ve r racos (Foxcro f t e t a l . ,
2008 ; Johnson e t a l . , 2000b ; Tard i f e t a l . , 1999) . Por o t ro lado ,
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concen t rac iones in fe r io res a 3x10 9 espermatozo ides generan
reducc ión de la tasa de no re to rno , de l tamaño de la camada, y
de la tasa de par tos (A lm e t a l . , 2006) , m ien t ras que (Xu e t a l . ,
1998a) repor ta ron que es tas concen t rac iones a fec tan e l tamaño
de la camada pero no la tasa de par to .
Los p r inc ipa les fac to res que a fec tan la concen t rac ión
espermát i ca se descr iben en la Tab la 2 .
TABLA 2 . FACTORES QUE ALTERAN LA CONCENTRAC IÓN ESPERMÁTICA . Factor E lemento Autor Cl imát i cos E levada
tempera tu ra amb ien ta l y humedad re la t i va . Fo toper iodo Época de l año U t i l i zac ión de luz a r t i f i c ia l Es tac iones de l año
(Kunavongkr i t e t a l . , 2005 ; Sur i yasomboon e t a l . , 2004a) (Sancho e t a l . , 2004a) (de Ser rano e t a l . , 1989) (Sancho e t a l . , 2004b ; Sancho e t a l . , 2006) (Harayama e t a l . , 1992 ; Knech t e t a l . , 2014 ; Rocha e t a l . , 2005)
Even tos pa to lóg icas p rocesos in f lamato r ios de l ep id id imo y de l tes t í cu lo , l a va r i coce le y la f i b ros is tes t i cu la r
(Úbeda e t a l . , 2010) .
A l te rac iones nu t r i c iona les
De f i c ienc ia en e l apor te de p ro te ínas Sumin is t ro de
(Lou is e t a l . , 1994) (Mar in -Guzman e t
20
se len io y v i tamina E a l . , 2000) Genét i cos Raza
Tamaño tes t i cu la r
(Smi ta l , 2009b ; Swie rs t ra , 1973a ; Swie rs t ra , 1973b) (C la rk e t a l . , 2003 ; Foo te , 1978 ; Huang and Johnson , 1996) .
Fac to res admin is t ra t i vos
F recuenc ia de eyacu lac ión . Cond ic iones de monta , e l con tac to soc ia l y espac ios f i s i cos ma l d iseñados . Sumin is t ro de tes tos te rona exógena .
(P runeda e t a l . , 2005 ; Rocha e t a l . , 2005 ; Swie rs t ra , 1973a ; Xu e t a l . , 1998a) (Kunavongkr i t e t a l . , 2005) (Sur i yasomboon e t a l . , 2004b)
Edad Edad de l macho , en espec ia l an ima les adu l tos
(Rocha e t a l . , 2005 ;
Smi ta l , 2009a ; )
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1.1.1. CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA
La l i t e ra tu ra repor ta den t ro de las técn icas más f recuen tes las
s igu ien tes :
• E l recuen to en cámaras hemoc i tomét r i cas .
• La u t i l i zac ión de espec t ro fo tómet ros .
• Los métodos f luo romét r i cos .
• Los s i s temas de aná l i s i s de semen as is t idos por
computador (CASA, Compute r Ass is ted Semen Ana lyzer ) .
1.1.1.1. CÁMARAS HEMOCITOMÉTRICAS Estas se cons idera como e l s i s tema es tándar para ca l ib ra r o t ros
equ ipos como los fo tómet ros , l os con tadores Cou l te r , l a
c i tomet r ía de f lu jo y e l CASA (Kus te r , 2005) . Den t ro de las
cámaras hemoc i tomét r i cas o de recuen to ce lu la r , se encuen t ran
las cámaras de Neubauer , de Thoma, de F luchs-Rosen ta l y de
Bürker . Med ian te su uso se rea l i za un con teo de
espermatozo ides en un vo lumen f i j o y conoc ido (Maes e t a l . ,
2011) . En la l i t e ra tu ra se repor tan o t ros métodos como e l de
Kar ras (Ho lý , 1986) y técn icas que u t i l i zan cámaras cap i la res
le ja como e l aná l i s i s Hami l ton Torne , que no p resen ta
d i fe renc ias con la cámara de Bürker y e l método fo tomét r i co
(Maes e t a l . , 2010) . La de te rminac ión de la concen t rac ión más
22
recomendada por la l i t e ra tu ra se rea l i za med ian te e l uso de la
cámara de Bürker y un m ic roscop io de campo c la ro a
magn i f i cac ión 400X, con 5 µ l de una d i luc ión 1 :200 de semen y
so luc ión sa l ina fo rmo lada (2 ,25 g de NaCl . + 249 ,25 m l de agua
es té r i l , des t i l ada y des ion izada + 0 ,75 ml fo rmo l ) . (Perez -L lano
e t a l . , 2001) .
1.1.1.2. ESPECTROFOTOMETRIA Este método func iona med ian te de te rminac ión de la dens idad
óp t i ca (Maes e t a l . , 2011) , se cons idera como ráp ido , de fác i l
uso , su med idas son a l tamente repe t ib les y p rec isas (Camus e t
a l . , 2011) , s in embargo , es necesar io rea l i za r la ca l ib rac ión para
cada macho (Gadea, 1997a) .
1.1.1.3.MÉTODOS FLUOROMÉTRICOS La c i tomet r ía de f l u jo se cons idera como como un método muy
p rec iso y que tamb ién ana l i za o t ras va r iab les de func iona l idad
espermát i ca , pe ro se cons idera de a l to cos to (Maes e t a l . ,
2011) , po r lo cua l no es de fac i l acceso a labora to r ios
convenc iona les .
1.1.1.4 EL SISTEMA CASA® Este método permi te eva luar tan to mot i l i dad y concen t rac ión , s in
embargo , es tas dos u l t imas técn icas requ ie ren invers iones muy
a l tas para se r u t i l i zadas exc lus ivamente para es te f i n , po r lo
23
cua l s iempres se acompaña de o t ros t i pos de eva luac ión (Maes
e t a l . , 2011) .
1 .2 MOVIL IDAD
El ob je to de su es t imac ión es de te rminar la p roporc ión de
espermatozo ides móv i les y la p roporc ión de aqué l los que
p resen tan mov im ien to p rogres ivo (Ma lmgren , 1997) . Es ta
va r iab le se cons idera como un fac to r c r í t i co en e l p roceso de
in te racc ión de los gametos ; una d isminuc ión en la ve loc idad y en
la p roporc ión de cé lu las móv i les p rogres ivas re f le ja les iones
ce lu la res que pueden reduc i r l as pos ib i l i dades de fecundac ión
(K jaes tad e t a l . , 1993) . Se cons idera que la mov i l i dad y la
ve loc idad espermát i ca mues t ran dos aspec tos d is t in tos de la
ac t i v idad f lage la r , pe ro ambos dependen de la func ión de l
axonema, por tan to , se espera una cor re lac ión en t re es tos
parámet ros (K jaes tad e t a l . , 1993) ; de igua l manera , e l
adecuado func ionamien to de la membrana espermát i ca es ta
co r re lac ionado pos i t i vamente con la mov i l i dad g rac ias a l
con ten ido de ác idos g rasos sa tu rados y po l i i nsa tu rados ; es
impor tan te tener en cuen ta que la in tegr idad de la membrana se
a fec ta duran te e l a lmacenamien to por la reducc ión de l ác ido
docosahexaeno ico , e l cua l ha mos t rado tamb ién una asoc iac ión
pos i t i va con la mov i l i dad (Am- in e t a l . , 2011) .
24
1 .2 .1 VALORAC IÓN DE LA MOVIL IDAD ESPERMÁTICA
1.2.1.1 VALORACIÓN VISUAL Este se cons idera como un método s imp le , ráp ido y económico ,
pe ro es a l tamente sub je t i vo deb ido a que los resu l tados
dependen de la per i c ia de l eva luador y de l t i po de concen t rac ión
de la mues t ra , se cons idera que no es un método que de fo rma
f iab le permi ta p redec i r l a capac idad fecundan te de l
espermatozo ide por tan to , con la ex is tenc ia de métodos
ob je t i vos de eva luac ión , es indeseab le rea l i za r lo
sub je t i vamente , en espec ia l po r la ex igenc ia en cond ic iones de
normoc ines is y de cons tan te con t ro l de la tempera tu ra de la
mues t ra y de l med io amb ien te (Mu iño e t a l . , 2005) . Es te
p roced im ien to para la eva luac ión de una mues t ra no es pos ib le
rea l i za r la basándose en un examen v isua l , deb ido a la
sub je t i v idad de l eva luador , a la reduc ida can t idad de la mues t ra
y a las va r iac iones de tempera tu ra de las laminas por ta ob je to ,
po r tan to , eva luar una mues t ra con base en es te parámet ro
resu l ta en una ba ja co r re lac ión con la fe r t i l i dad i n v i vo .
1.2.1.2 DETERMINACIÓN OBJETIVA DE LA MOVILIDAD Desde los años ochen ta , se in t rodu je ron los s i s temas de aná l i s i s
de imagen compute r i zados CASA (Compute r Ass is ted Sperm
25
Ana lys is ) , que fueron in i c ia lmente desar ro l lados para su uso en
e l aná l i s i s de la mov i l i dad de l semen humano; en la ac tua l idad
es tos s i s temas pos ib i l i t an un aná l i s i s de la mov i l i dad de fo rma
au tomat i zada , ráp ida y ob je t i va basadas en la eva luac ión de los
espermatozo ides ind iv idua lmente , p roporc ionando un cá lcu lo
p rec iso de los d is t in tos parámet ros semina les , (B roekhu i j sea e t
a l . , 2011 ; G i l e t a l . , 2009 ; Ma lmgren , 1997) .
E l concep to genera l subyacen te a los s i s temas de aná l i s i s de la
mov i l i dad espermát i ca res ide en la u t i l i zac ión de un mic roscop io
de con t ras te de fases nega t i vo , a par t i r de una cámara de v ideo ,
(F igura 1 ) de la cua l se ob t iene la imagen de la mues t ra , l a cua l
se d ig i ta l i za y se le ap l i can var ios a lgor i tmos para ana l i za r la
mov i l i dad espermát i ca en d iez va r iab les . Bás icamente ex is ten 2
t i pos p r inc ipa les de s is temas CASA, uno que cap tu ra una
secuenc ia de 20 imágenes en aprox imadamente 0 ,8 segundos de
los mov im ien tos de l espermatozo ide re t rospec t i vamente y o t ro
que opera en t iempo rea l po r per iodos de t iempo p ro longados
(Amann, 1989) .
En la ac tua l idad , los equ ipos más avanzados para la va lo rac ión
de la mov i l i dad son de l t i po Sperm C lass Ana lyzer® (SCA®) , que
eva lúan la ca l idad de acuerdo con las s igu ien tes pau tas :
ve loc idad curv i l ínea (µm/s) , ve loc idad p romed io de la t rayec to r ia
(µm/s) , amp l i tud de l desp lazamien to la te ra l de la cabeza (µm/s) ,
26
l i nea l idad de la t rayec to r ia p romed io , l i nea l idad de la t rayec to r ia
cu rv i l ínea , osc i lac ión y f recuenc ia de ba t ida (Qu in te ro -Moreno ,
2003) . Para asegura r e l resu l tado óp t imo en los p rocesos de
reproducc ión con t ro lada , se recomienda que la mov i l i dad to ta l
debe es ta r en n ive les super io res a l 80% (Broekhu i j sea e t a l . ,
2012 ; H i ra i e t a l . , 2001) .
F i gu ra 1 . E q u i p o c ompu t a r i z a d o p a r a e v a l u a c i ó n s em i n a l C A S A ( L a b o r a t o r i o B i o l o g i a d e l a R e p r o d u c c i ó n )
! .# MORFOLOGÍA ESPERMÁTICA
E l espermatozo ide es tá compues to por dos es t ruc tu ras : l a
cabeza y la co la ; l a cabeza de los espermatozo ides de los
mamí fe ros p resen ta fo rma y tamaño muy var iados , l a de ce rdo
t iene fo rma ovo ide y posee una long i tud en t re 8 ,4 y 9 ,4 µ , y un
ancho en t re 4 ,2 y 5 ,5 µ ; l a cua l con t iene e l núc leo y e l
27
acrosóma. La c romat ina en e l núc leo , se ca rac te r i za por es ta r
a l tamente condensada , es to p ro tege a l mate r ia l gené t i co de
daños duran te e l a lmacenamien to en e l t rac to reproduc to r
mascu l ino o en e l t rans i to por e l apara to reproduc to r de la
hembra (K ing and Macpherson , 1966b) . Los p rocesos de
condensac ión y descondesac ión de la c romat ina espermát i ca son
uno de los even tos de mayor impor tanc ia de la f i s io log ía
reproduc t i va , e r ro res en es te p roceso , genera les iones en e l
Ác ido Desox i r r ibonuc le ico (ADN ) , l o cua l re t rasa la fo rmac ión
de l p ronúc leo mascu l ino después de la pene t rac ión en e l
ovoc i to , p roduc iendo muer te embr ionar ia temprana ; la
eva luac ión de la in tegr idad de la c romat ina espermát i ca ha
cobrado en los ú l t imos años g ran impor tanc ia y ha s ido
es tud iada en an ima les de impor tanc ia zoo técn ica y en e l hombre
como ind icador de ca l idad de los eyacu lados (López-Fernández
e t a l . , 2008) .
1.3.1 ACROSÓMA El ac rosóma, como se observa en la f i gu ra 2 , es una ves ícu la
in t race lu la r , membranosa y ap lanada que cubre la par te an te r io r
de la cabeza de l espermatozo ide , la cua l se fo rma duran te la
espermatogénes is a par t i r de l comp le jo de Go lg i de las
espermát idas ; es tá compues to por dos membranas , la ac rosomal
in te rna y la ac rosomal ex te rna , las cua les duran te la reacc ión
28
acrosómica se fus ionan l i be rando a l ex te r io r su con ten ido
enz imát i co , e l cua l es ta cons t i tu ido mayor i ta r iamente por
enz imas h id ro l í t i cas , como la h ia lu ron idasa y la ac ros ina (Ax e t
a l . , 2002) .
F igura 2 C a b e z a d e e s p e rma t o z o i d e c o n e l a c r o s óma i n t a c t o A P = a c r o s óma . B r i t z ( 1 9 8 5 )
1.3.2 COLA La co la de l espermatozo ide es ta d iv id ida en cua t ro reg iones : e l
cue l lo , l a p ieza in te rmed ia y los segmentos p r inc ipa l y te rm ina l .
E l cue l lo o p ieza conec t i va , en laza la cabeza con la co la de l
espermatozo ide y s i r ve como cen t ro o rgan iza t i vo en la fo rmac ión
de l axonema y las co lumnas es t r iadas . La p ieza in te rmed ia se
s i túa a con t inuac ión de l cue l lo , con t iene den t ro la membrana
p lasmát i ca m i tocondr ias d ispues tas he l i co ida lmente que
recubren e l axonema. Es ta es t ruc tu ra m i tocondr ia l , es tá
adher ida a los re t í cu los submi tocondr ia les , que se conec tan
en t re s i l a te ra lmente y se fus ionan con e l annu lus , (pun to de
29
un ión en t re la p ieza in te rmed ia y la p ieza p r inc ipa l ) . Den t ro de
la p ieza in te rmed ia y ex tend iéndose has ta e l segmento p r inc ipa l
de la co la se encuen t ran las f i b ras densas ex te rnas , las cua les
rodean e l comp le jo de l axonema, las cua les se componen de
p ro te ínas r i cas en c is te ína . La p ieza te rm ina l es la porc ión f i na l
de la co la (Basso ls e t a l . , 2005) .
E l c i toesque le to de los espermatozo ides es ta cons t i tu ido por un
c i l i nd ro hueco , con fo rmado por dos co lumnas long i tud ina les
un idas por an i l l os c i r cu la res compues tos por f i l amentos que se
o r ien tan c i r cu la rmente en un fue r te empaquetamien to ; es ta
es t ruc tu ra recor re toda la p ieza in te rmed ia , y va d isminuyendo e l
g rosor de los an i l l os según se aprox iman a l ex t remo de la co la y
te rm ina abrup tamente en la par te f i na l .
La p resenc ia de e lementos semi r r íg idos en la p ieza in te rmed ia y
e l segmento p r inc ipa l ( va ina f i b rosa y f i b ras densas) o to rgan
d i recc iona l idad y f l ex ib i l i dad a l mov im ien to f l age la r , l o cua l hace
que la co la p resen te un mov im ien to ro tac iona l y e l íp t i co , l a cua l
se t ransmi te a la cabeza de l espermatozo ide a t ravés de l cue l lo
generando e l mov im ien to p rogres ivo a l espermatozo ide (Bone t e t
a l . , 1992) .
30
1.3.3 MEMBRANA ESPERMÁTICA La membrana p lasmát i ca (MP ) de l espermatozo ide p resen ta una
mayor p roporc ión de p ro te ínas (has ta e l 50% de su compos ic ión)
que las membranas de las cé lu las somát i cas ; se encarga de
regu la r e l de paso enz imas , recep to res y p ro te ínas
t ranspor tadoras ; su capa más ex te rna es un g l i cocá l i x fo rmado
por o l igosacár idos que se unen a las p ro te ínas y l íp idos de
membrana , una de sus func iones es p ro teger a l espermatozo ide
de agen tes f í s i cos o qu ímicos lo cua l pe rmi te la in te racc ión de l
espermatozo ide con o t ras cé lu las (C legg e t a l . , 1975) .
La MP es ta cons t i tu ida por t res capas d is t in tas : una b icapa de
l íp idos , una in te r fase de fos fo l íp idos y agua y un g l i coca l i x ; l os
p r inc ipa les l íp idos en la membrana son los fos fo l íp idos ( la
fos fa t id i l co l ina , la fos fa t id i l e tano lamina , la es f ingomie l ina , la
ca rd io l ip ina y pequeñas can t idades de fos fa t id i l se r ina y
fos fa t id i l i nos i to l ) y e l co les te ro l . La fos fa t id i l se r ina y la
fos fa t id i l e tano lamina se encuen t ran en la capa in te rna de la
membrana , m ien t ras que la fos fa t id i l co l ina y la es f ingomie l ina se
encuen t ran en la capa ex te rna de la membrana espermát i ca . La
p roporc ión fos fo l íp idos /co les te ro l es un ind icador de la f l u idez
de la membrana espermát i ca , su re lac ión mo la r no es cons tan te
31
en t re espec ies ; e l co les te ro l , j un to con las p ro te ínas ac túa como
es tab i l i zador de la membrana . La concen t rac ión de co les te ro l
va r ía en las d i fe ren tes reg iones de la membrana p lasmát i ca ,
s iendo e l ac rosoma donde se p resen ta en mayor p roporc ión
(Hur tgen e t a l . , 1980 ; Johnson e t a l . , 2000a)
1 .4 ANORMAL IDADES ESPERMÁTICAS
1.4.1. ANORMALIDADES PRIMARIAS Estas anorma l idades se generan en e l tes t í cu lo duran te la
espermatogénes is ; se subd iv iden en anorma l idades de cabeza
(p i r i fo rme, m ic ro cabeza , macro cabeza , redondeada, de fo rmada,
es t recha , pun t iaguda y con inserc ión es t recha) ; t rac to
in te rmed io (dob le , en ro l lado) y co la dob le y enro l lada
(F reshman, 2002 ; Juhaz e t a l . , 2000) .
1.4.2 ANORMALIDADES SECUNDARIAS Las anorma l idades secundar ias se fo rman duran te e l paso de las
cé lu las espermát i cas a t ravés de l ep id íd imo, o duran te la
p reparac ión de las dos is en e l l abora to r io o en la g ran ja . Las
a l te rac iones secundar ias se subd iv iden en anorma l idades de
cabeza (sue l tas ) ; t rac to in te rmed io (go ta c i top lásmica d is ta l ) y
co la (dob lada , inver t ida y segmento d is ta l en ro l lado) (F reshman,
2002 ; Juhaz e t a l . , 2000 ; Oet t le and So ley , 1988) .
32
Algunas de las anorma l idades espermát i cas mas comúnmente
d iagnos t i cadas se mues t ran en la f i gu ra 3 , donde se pueden
observar a l te rac iones de cabeza , p ieza in te rmed ia y co la .
F igura 3 . A n o rma l i d a d e s e s p e rmá t i c a s d e c a b e z a , p i e z a i n t e rm ed i a y c o l a . ( L a b o r a t o r i o B i o l o g í a d e l a R e p r o d u c c i ó n )
En porc inos se acep tan un mín imo de 70% de espermatozo ides
norma les (Gadea, 1997b ; Rozeboom e t a l . , 1998) ; a l respec to ,
se deben encon t ra r menos de l 10% de anorma l idades de cabeza ,
menos de 20% de co la , menos de 20% de go tas c i top lásmicas y
menos de l 30% to ta l de espermatozo ides anorma les (Darw in ,
33
2004 ; F lowers , 2002b ; Wi l son e t a l . , 2004b) .
Se cons idera que a lgunas anorma l idades espermát i cas son de
o r igen desconoc ido , o t ras son deb idas a fac to res gené t i cos
(Bacce t t i e t a l . , 2001 ; Chenoweth , 2005 ; Co l lode l and More t t i ,
2006) , nu t r i c iona les (Mar in -Guzman e t a l . , 2000 ; Wi l son e t a l . ,
2004b) , med ioambien ta les (Sur i yasomboon e t a l . , 2004b) , po r
e r ro res en la p reparac ión de las dos is en la g ran ja (Br i z e t a l . ,
1995 ; Pruneda e t a l . , 2005) o por edad avanzada de los ve r racos
(D iaz e t a l . , 2009 ; Gómez, 2010) .
La mor fo log ía de l espermatozo ide guarda re lac ión d i rec ta con la
mayor ía de los fac to res re lac ionados con la p roducc ión semina l
como la gené t i ca , l a edad y e l es tado de sa lud de l macho , e l
adecuado ba lance nu t r i c iona l y e l p rocesamien to de l semen (De
Vr ies and Co lenbrander , 1990) . La impor tanc ia de con ta r con un
buen eyacu lado es ta asoc iado con descar te de dos is semina les
y de machos , lo cua l a fec ta e l rend im ien to económico de los
cen t ros de p roducc ión de semen y consecuen temente e l p roceso
de p roducc ión de carne porc ina . Se cons idera que eyacu lados
porc inos con menos de 70% de espermatozo ides con mor fo log ía
norma l no son recomendab les para la inseminac ión a r t i f i c ia l .
(Gadea e t a l . , 2004 ; Perez -L lano e t a l . , 2009a) .
34
El aná l i s i s de la mor fo log ía de las cé lu las espermát i cas se
recomienda rea l i za r lo en un m ic roscop io de con t ras te de fases ,
en una mues t ra de semen f i j ada so luc ión a l 2% de
g lu ta ra ldeh ído en PBS, (Gadea, 1997b) para de te rminar e l
po rcen ta je de de fec tos de cabeza (sue l ta , macro , m ic ro ,
p i r i f o rme) , t rac to in te rmed io (dob le , l azo , engrosado) , co la
( la t igo , l azo , esca le ra ) y go ta c i top lasmicas (GCs) (d is ta l ,
p rox ima l ) (Faze l i e t a l . , 1997 ; Hancock , 1952 ; Nagy e t a l . , 2003 ;
Purse l and Johnson , 1974 ; Purse l e t a l . , 1972 ; Rozeboom e t a l . ,
2000b ; Vazquez e t a l . , 1992) .
1 .5 FRAGMENTAC IÓN DE ADN
El d iagnós t i co de l po tenc ia l fecundan te de una mues t ra de
semen porc ino es esenc ia l pa ra ob tener una a l ta y cons tan te
e f i c ienc ia reproduc t i va , po r tan to , es c ruc ia l e l uso de técn icas
que eva lúen la capac idad fecundan te y que tengan va lo r
p red ic t i vo de la fe r t i l i dad de l eyacu lado (Braundmeie r and Mi l l e r ,
2001a) . La f ragmentac ión de l ADN espermát i co es tá re lac ionada
con d isminuc ión de l tamaño de la camada (Boe-Hansen , 2005) ,
con anorma l idades en e l desar ro l lo de l embr ión (Perez -L lano e t
a l . , 2006) y con reduc ida capac idad de un ión de l espermatozo ide
a l ep i te l i o de l ov iduc to (Ardón e t a l . , 2008) .
35
1.5.1 FACTORES CAUSALES DE LA FRAGMENTACIÓN DEL ADN
Las d i fe renc ias en la suscep t ib i l i dad a l daño de l ADN
espermát i co en t re eyacu lados es resu l tado de fac to res
ex t r ínsecos como la reco lecc ión de la mues t ra de semen, la
man ipu lac ión duran te e l p rocesamien to de l eyacu lado , la
d i luc ión de la mues t ra (Wabersk i e t a l . , 2011) y e l
a lmacenamien to de l semen (Boe-Hansen , 2005) ; ad ic iona lmente
tamb ién se repor tan fac to res in t r ínsecos en t re los cua les se
encuen t ran : la remode lac ión de la c romat ina , e l es t rés ox ida t i vo
y la apop tos is (A i t ken and DeIu l i i s , 2009 ; F raser e t a l . , 2011) ;
o t ras causas de f ragmentac ión de ADN es tán re lac ionadas con
cond ic iones pa to lóg icas de l an ima l como la c r ip to rqu id ia , e l
cáncer , l a p resenc ia de f ieb re , de in fecc iones y de
leucoc i tospermia ; fac to res med io amb ien ta les como la rad iac ión ,
l os med icamentos , l a con taminac ión de l a i re , l os p lagu ic idas , los
p roduc tos qu ímicos (Evenson and Wixon , 2006) , l a tempera tu ra
(Pérez -L lano e t a l . , 2010) y edad de l macho . S in embargo , la
mayor ía de es tas causas pueden no se r vá l idas para
pob lac iones de ver racos a lo jados ba jo cond ic iones c l imát i cas
con t ro ladas (Wabersk i e t a l . , 2011) .
36
1 .5 .2 EVALUAC IÓN DE LA FRAGMENTAC IÓN DEL ADN ESPERMÁTICO
Las p ruebas es tándar para eva luac ión de semen como: la
mov i l i dad , la mor fo log ía , e l es tado de l ac rosoma, la in tegr idad y
func iona l idad de la membrana ( IFM ) , as í como d ive rsas p ruebas
de v i ta l i dad (Perez -L lano e t a l . , 2006) que de te rminan la
es t ruc tu ra de la membrana ( IEM ) , cada una de las p ruebas por
separado son l im i tadas en su capac idad para iden t i f i ca r ve r racos
sub fé r t i l es no pueden p redec i r l a fe r t i l i dad , por e l lo es tas deben
in tegra rse (Pe t runk ina e t a l . , 2007) , y se deben sumar o t ras
p ruebas como las de eva luac ión de la in tegr idad de l ADN
espermát i co , que nos p roporc iona in fo rmac ión ú t i l pa ra e l
d iagnós t i co de la fe r t i l i dad (Pe t runk ina e t a l . , 2007 ; Wabersk i e t
a l . , 2011) . A l respec to , l a eva luac ión de la f r agmentac ión de l
ADN posee par t i cu la r i n t rés , deb ido a que es ta mo lécu la es
de te rminan te para e l buen desar ro l lo de l embr ión , y por tan to
para lo log ra r una buena p ro l i f i c idad . Es in te resen te tener
p resen te que un espermatozo ide con mot i l i dad norma l , ac rosoma
in tac to y membranas normles , puede p resen ta r e l DNA
f ragmentado y como consecuenc ia , p resen ta r p rob lemas en la
fe r t i l i zac ión (Perez -L lano e t a l . , 2006) .
Las técn icas u t i l i zadas para eva luar la f ragmentac ión de l ADN
en espermatozo ides son :
• La p rueba cometa (Hughes e t a l . , 1996) .
37
• La p rueba TUNEL (Termina l T rans fe rase-med ia ted DNA End
Labe l l i ng ) (Sun e t a l , 1997) .
• La p rueba ISNT ( In S i tu N ick T rans la t ion ) (Gorczyca e t a l . ,
1993) .
• E l ensayo de la es t ruc tu ra de la c romat ina espermát i ca
(SCSA, Sperm Chromat in S t ruc tu re Assay) (Evenson and
Wixon , 2006 ; Fernández e t a l . , 2003) .
Es tas técn icas requ ie ren ins t rumentos cos tosos , son d i f í c i l es de
imp lementa r , y neces i tan e l uso de enz imas cuya ac t i v idad y
acces ib i l i dad a las ro tu ras en e l ADN puede ser i r regu la r (De
Ambrog i e t a l . , 2006) .
En la ac tua l idad , ex is te un k i t pa ra e l aná l i s i s de la
f ragmentac ión de l ADN en e l semen de cerdo adap tado por
Enc iso e t a l . (2006) a par t i r de la p rueba de d ispers ión de la
c romat ina (SCD ) , denominado Ha lo tech ® (Enc iso e t a l . , 2006) .
Los resu l tados de es ta p rueba es tán a l tamente co r re lac ionados
con los ob ten idos con o t ras técn icas , como SCSA (Fernández e t
a l . , 2005 . ) , además, es bas tan te ráp ido , fác i l de usar y permi te
una med ida f iab le de la cond ic ión de l ADN de los
espermatozo ides . E l func ionamien to de la p rueba es tá basado
en la respues ta d i fe renc ia l de l núc leo de los espermatozo ides
f ragmentados y no f ragmentados a un t ra tamien to de
38
despro te in izac ión con una so luc ión desna tu ra l i zan te ác ida ; es ta
respues ta se puede ev idenc ia r en e l m ic roscop io , g rac ias a que
los espermatozo ides con ADN f ragmentado p resen tan un ha lo
a l rededor de l núc leo de un co lo r más tenue que es te , deb ido a la
desna tu ra l i zac ión de l ADN; aque l los con ADN no f ragmentado
aparecen como una es t ruc tu ra de fo rma ova lada , de co lo r oscuro
só l ido , s in ese ha lo o con una corona muy tenue y de lgada a su
a l rededor , deb ido a que son res is ten tes a la desna tu ra l i zac ión ,
l o cua l se ev idenc ia en la f i gu ra 4 (Fernández e t a l . , 2003 ; We l l s
and Awa, 1970) .
F i gu ra 4 . F r a gmen t a c i ó n d e DNA c o n k i t H a l o t e c® . Es p e r m a t o z o i d e s c o n e l A D N f r a g m e n t a d o c o n h a l o a l r e d e d o r d e l a c a b e z a d e l o s m i s m o s . ( L a b o r a t o r i o B i o l o g í a d e l a R e p r o d u c c i ó n )
Se recomienda que p rueba de f ragmentac ión de l ADN se rea l i ce
s imu l taneamente con e l res to de var iab les eva luadas en las
p ruebas convenc iona les , es to con e l f i n tomar una dec is ión mas
cer te ra sobre la u t i l i dad de l eyacu lado . Se cons idera que
39
encon t ra r e l DFI con va lo res ≥15% desca l i f i ca la mues t ra para la
se u t i l i zada en inseminac ión a r t i f i c ia l (López-Fernández e t a l . ,
2008) .
1 .6 INTEGR IDAD ACROSÓMICA
El ac rosoma es una ves ícu la sec re to ra der i vada de l apara to de
Go lg i , l oca l i zada en la cabeza de l espermatozo ide como un
capuchón , ocupando las dos te rce ras par tes de l núc leo , como se
puede observar en la f i gu ra 5 . Es ta es t ruc tu ra con t iene enz imas
p ro teo l í t i cas como la ac ros ina y la h ia lu ron idasa , que es tán
p ro teg idas por la membrana ac rosomal , l as cua les son
responsab les de la d iges t ión de l cumu lus oophorus y zona
pe lúc ida de l ovoc i to ; es tas enz imas son l i be radas duran te e l
p roceso de reacc ión ac rosómica , una fo rma mod i f i cada de
exoc i tos is , que induce p ro fundos camb ios func iona les y
es t ruc tu ra les en e l espermatozo ide , donde se p resen tan
mú l t ip les fus iones en t re la membrana p lasmát i ca de la reg ión
an te r io r de la cabeza y membrana ac rosomal ex te rna , quedando
la membrana ac rosomal in te rna como nueva membrana de
super f i c ie (Purse l e t a l . , 1972) .
40
F i gu ra 5 . E s p e rm a t o z o i d e c o n e l a c r o s oma i n t a c t o ( N A R ) ( L a b o r a t o r i o B i l o g í a d e l a R e p r o d u c c i ó n ) .
1.6.1 ALTERACIONES EN LA MORFOLOGÍA DEL ACROSOMA La p resenc ia de anorma l idades mor fo lóg icas de l ac rosoma es tá
asoc iada a reducc ión de la fe r t i l i dad , po r tan to , l a eva luac ión de
de su in tegr idad es de par t i cu la r i n te rés , deb ido a su
par t i c ipac ión de te rminan te en los p rocesos de capac i tac ión ,
reacc ión de l ac rosoma y un ión con e l ovoc i to (Gadea, 1997b) .
Los daños en e l ac rosoma es tan asoc iados a p rocesos
f i s io lóg icos re lac ionados con e l enve jec im ien to de la cé lu la
espermát i ca y con e l p roceso de fecundac ión (Yamaguch i e t a l . ,
2009) (Yanag imach i , 1994) ; no obs tan te tamb ién se p roducen
cambios en e l ac rosoma como consecuenc ia de shock por f r ío ,
(en los p rocesos de conge lac ión -desconge lac ión) , en los
camb ios de p res ión osmót i ca generados por d i luc iones o lavados
41
y por la rea l i zac ión de cen t r i fugac iones repe t idas (Faze l i e t a l . ,
1997) . Los eyacu lados porc inos con más de l 20% de
anorma l idades ac rosómicas no son recomendab les para
inseminac ión a r t i f i c ia l (F lowers , 2002a ; Rozeboom e t a l . ,
2000a) .
1.6.2. EVALUACIÓN DEL ACROSOMA
La mor fo log ía de l ac rosoma en porc inos , como se mues t ra en la
f i gu ra 6 , se c las i f i ca en c inco t ipos : bo rde ap ica l no rma l (NAR ,
Norma l Ap ica l R idge) , en los cua les e l capuchón es tá
suavemente adher ido a l núc leo y poseen un borde ap ica l que
fo rma una c res ta suave ; borde ap ica l dañado (DAR , Damaged
Ap ica l R idge) , aque l los espermatozo ides en los que se observa
un desprend im ien to en la par te pos te r io r de l bo rde ap ica l ,
hac iéndo lo i r regu la r ; bo rde ap ica l fa l tan te (MAR , M iss ing Ap ica l
R idge) , donde los espermatozo ides ca recen de l bo rde ap ica l ,
pe ro e l capuchón ac rosomal es ta fue r temente adher ido a la
cabeza de l espermatozo ide ; capuchón ac rosomal desprend ido
(LAC , Loose Ap ica l Cap) , son aque l los espermatozo ides que
t i ene una ves icu lac ión de l capuchón ac rosomal an te r io r ; y borde
ap ica l no rma l (NAR , Norma l Ap ica l R idge w i th pa r t i c les ) , donde
se observa un ac romosa in tegro . (Purse l e t a l . , 1972) .
42
El método para de te rminar la in tegr idad de l ac rosoma debe ser
exac to , f i ab le , ráp ido y ap l i cab le a un pequeño número de
cé lu las , y capaz de p roporc ionar la d i fe renc iac ión en t re
reacc iones ac rosómicas fa lsas , que es tán asoc iadas a la muer te
de la cé lu la , y las ve rdaderas , que es tán asoc iadas a la
fecundac ión para que e l espermatozo ide pene t re la zona
pe lúc ida de l ovoc i to es necesar io que ocur ra la l i be rac ión de las
enz imas h id ro l í t i cas con ten idas en e l ac rosoma (Perez -L lano e t
a l . , 2009a)
Para rea l i za r su va lo rac ión se u t i l i za un m ic roscop io de
con t ras te de fase a 100X, f i j ando la mues t ra con g lu ta ra ldeh ido
a l 2% (Turba e t a l . , 2007) .
La eva luac ión de la in tegr idad ac rosómica de l semen de ver raco
es una p rueba espec ia l i zada de con t ro l de ca l idad semina l y
comp lementa de manera sus tanc ia l l as p ruebas de eva luac ión
semina l ex is ten tes ; s in embargo , la es t imac ión rea l de l
compor tamien to de un macho se ob t iene ob tener so lo med ian te
la comparac ión de los resu l tados de la eva luac ión semina l y los
resu l tados de fe r t i l i dad y p ro l i f i c idad ob ten idos en campo
(Osor io -Serna e t a l . , 2007) .
43
F igura 6 . E v a l u c i ó n d e l e s t a d o d e l a c r o s óma . Espermatozoides con acrosóma normal NAR (1), acrosóma dañado DAR (3); acrosóma perdido MAR (4); desprendido LAC (5); acrosóma normal NAR (2). ( P u r s e l a n d J h o n s o n 1 9 7 2 )
1 .7 INTEGRIDAD FUNCIONAL DE LA MENBRANA
La func ión p r inc ipa l de l espermatozo ide es la fecundac ión , pa ra
l l evar a cabo es te p roceso su membrana debe es ta r ín tegra y
func iona lmente ac t i va (Perez -L lano e t a l . , 2009b) , deb ido a que
es ta par t i c ipa no so lo en e l metabo l i smo ce lu la r , s ino , en los
p rocesos de capac i tac ión , reacc ión ac rosómica y un ión en t re
44
gametos ; po r tan to la func iona l idad de la membrana es un
ind icador de la capac idad fecundan te de l espermatozo ide
(Jeyendran e t a l . , 1984) . La membrana p lasmát i ca p ro tege e l
ac rosoma, a l con ten ido de ADN, la p ieza in te rmed ia , y a l f l age lo
de l espermatozo ide (Perez -L lano e t a l . , 2009b) , fo rmando
domin ios según la es t ruc tu ra que recubra (Gade l la e t a l . , 2008) .
La eva luac ión de la In tegr idad Func iona l de la Membrana ( IFM )
p roporc iona una va l iosa in fo rmac ión sobre los métodos de
p rocesamien to de l semen y la iden t i f i cac ión de los pun tos de l
p roceso que más con t r ibuyen a las a l te rac iones en la membrana
de l espermatozo ide (Johnson e t a l . , 2000a) . E l g rado de les ión
de las membranas p lasmát i ca y de l ac rosoma es tá re lac ionado
con la fe r t i l i dad de la mues t ra p rocesada , pero so lamente en los
casos en que e l daño sea ex tenso (Rodr íguez-Mar t ínez e t a l . ,
2005) .
1.7.1 TEST DE HINCHAZON HIPOOSMÓTICA (HOST)
Es ta es una p rueba que de te rmina la IFM med ian te expos ic ión
de los espermatozo ides a un med io h ipoosmót i co (Perez -L lano e t
a l . , 2001 ; Vazquez e t a l . , 1997) , como se ev idenc ia en la f i gu ra
7 , l a expos ic ión de es tos a cond ic iones h ipoosmót i cas p roduce
45
un aumento de la en t rada de agua en un in ten to de la cé lu la ,
con e l f i n de a lcanzar e l equ i l i b r io osmót i co , l o cua l aumenta por
tan to e l vo lumen de agua en la cé lu la , p roduc iendo su
h inchamien to y consecuen te a la rgamien to de la co la , po r e l
con t ra r io cuando la membrana se encuen t ra norma l , se p roduce
un enro l lamien to de la co la , como un mecan ismo de
compensac ión de l equ i l i b r io osmót i co (Jeyendran e t a l . , 1984) .
F i gu ra 7 . T e s t d e h i n c h a z ó n h i p o o smó t i c a . Se aprecia espermatozoide HOST positivo (Izquierda) y HOST negativo (Derecha). (Biología de la Reproducción)
Las p r inc ipa les causas de perd ida de func iona l idad de la
membrana es tán asoc iadas con t iempos de conservac ión muy
la rgos (Perez -L lano e t a l . , 2003) , i nadecuadas tempera tu ras de
conservac ión (Henao e t a l . , 2010 ; Sa la Echave e t a l . , 2008) y
shock té rm ico por inadecuado en f r iamien to de l semen desde
20°C a 15°C (Perez -L lano e t a l . , 2001) o por la conge lac ión
(Meyers , 2005) . Es de g ran impor tanc ia tener en cuen ta que
g ran par te de las p ruebas ca l idad semina l convenc iona les no
t ienen va lo r p red ic t i vo de la fe r t i l i dad in v i vo de un eyacu lado
46
(Gadea e t a l . , 1998) , a l respec to , e l HOST a p resen tado
cor re lac iones s ign i f i ca t i vas con la tasa de par to (Perez -L lano e t
a l . , 2001) ; s in embargo , en los es tud ios rea l i zados por (Gadea
and Matas , 2000) , es te no p resen to co r re lac ión con la tasa de
pene t rac ión de ovoc i tos .
Ac tua lmente se han rea l i zado p ruebas que combinan e l HOST
con la in tegr idad ac rosómica y con la superv ivenc ia espermát i ca
(Perez -L lano e t a l . , 2009b ; Perez-L lano e t a l . , 2003) , además
med ian te es tas comb inac iones se puede de te rminar la p resenc ia
de reacc ión ac rosómica verdadera , l a cua l se da después de l
p roceso de capac i tac ión (Perez -L lano e t a l . , 2009b) , l a
pob lac ión de espermatozo ides iden t i f i cados con es tas
ca rac te r ís t i cas equ iva le a la encon t rada med ian te la p rueba de
Annex ina-V , que iden t i f i ca los p r imeros cambios de la
capac i tac ión (Peña e t a l . , 2003) . E l va lo r mín imo acep tado para
func iona l idad de la membrana p lasmát i ca es de 60%. (Perez -
L lano e t a l . , 2001) . La de te rmianc ión de la IFM se re l i za con la
p rueba de endosmos is (HOST o Hypoosmot ic Swe l l i ng Tes t ) : po r
incubac ión en una so luc ión de 100 mOsm/L . (Qu in te ro -Moreno ,
2003) .
47
1 .8 INTEGR IDAD ESTRUCTURAL DE LA MENBRANA
La de te rminac ión de la superv ivenc ia espermát i ca permi te
es tab lecer la in tegr idad es t ruc tu ra l de la membrana p lasmát i ca
( IEM ) y pe rmi te d isc r im inar en t re espermatozo ides v i vos y
muer tos ; l a IEM asegura e l metabo l i smo ce lu la r , l os camb ios en
sus p rop iedades son dec is i vos en e l p roceso de capac i tac ión y
fecundac ión ; as i m ismo la IEM es fundamenta l pa ra asegura r la
un ión a la zona pe lúc ida , l a pene t rac ión y la fus ión con e l
oo lemma duran te la fecundac ión (Rodr íguez-Mar t ínez e t a l . ,
2005) . La impor tanc ia de l manten im ien to de es ta ca rac te r ís t i ca
de l espermatozo ide se jus t i f i ca por la incapac idad de la cé lu la
espermát i ca para se l la r o res taura r la in tegr idad de la membrana
cuando su f re daños , su in tegr idad es e l requer im ien to mín imo
para que e l espermatozo ide sea móv i l , cuando la membrana
p lasmát i ca se les iona , no puede mantener las concen t rac iones
c i top lasmát i cas de iones y de co - fac to res esenc ia les para e l
mov im ien to f l age la r (Par r i l l a e t a l . , 2009) .
La IEM proporc iona in fo rmac ión sobre los métodos de
p rocesamien to de l semen y la iden t i f i cac ión de los pun tos de l
p roceso que más con t r ibuyen a las a l te rac iones en la membrana
de l espermatozo ide (Johnson e t a l . , 2000a) .
48
1 .8 .1 . EVALUAC IÓN DE LA INTEGR IDAD ESTRUCTURAL DE LA
MEMBRANA:
1.8.1.1. COLORACIÓN CON EOSINA-‐NIGROSINA:
El fundamento de la p rueba , se basa en que la membrana in tac ta
de una cé lu la v i va imp ide e l paso de la Eos ina a l i n te r io r de la
m isma, m ien t ras que cé lu las con la membrana es t ruc tu ra lmente
dañadas permi ten e l paso de l co lo ran te y la t i nc ión de la cé lu la ,
po r tan to las cé lu las muer tas se to rnan co lo r rosadas y las v i vas
no toman la co lo rac ión (Perez -L lano e t a l . , 2009a) .
1.8.1.2 COLORACIÓN CON FLUOROCROMOS
Median te la co lo rac ión con yoduro de p rop id io (P I ) y SYBR-14 se
pueden d is t ingu i r y cuan t i f i ca r fác i lmente las cé lu las v i vas y
muer tas lo cua l se aprec ia en la f i gu ra 8 ; l os dos co lo ran tes
reacc ionan con e l DNA y se ex i tan con la m isma long i tud de
onda . E l P I es un co lo ran te que t iene la p rop iedad de a t ravesar
la membrana p lasmát i ca permeab le (dañada) o en p roceso de
degenerac ión , pa ra un i rse y teñ i r e l ADN ce lu la r s i r v iendo de
ind icador de l daño de la membrana . Cuando e l P I pene t ra la
cé lu la , emi te una f luo rescenc ia ro ja en la cabeza de l
espermatozo ide . E l SYBR-14 es capaz de a t ravesar membranas
ce lu la res in tac tas y por tan to permi te iden t i f i ca r la pob lac ión de
espermatozo ides v iab les , l os cua les emi ten f l uo rescenc ia ve rde
49
en su cabeza . Ambas co lo rac iones se de tec tan med ian te
m ic roscop ía de f l uo rescenc ia con un f i l t ro de 488nm (Qu in te ro -
Moreno , 2003) .
F i gu ra 8 . C o l o r a c i ó n c o n f l u o r o c r omo s . Se aprecian espermatozoides vivos (verdes) y espermatozoides muertos (rojos). (Biología de la Reproducción)
1 .9 PENETRAC IÓN IN V ITRO
El d iagnós t i co de l po tenc ia l fecundan te de una mues t ra de
semen porc ino es esenc ia l pa ra ob tener una a l ta y cons tan te
e f i c ienc ia reproduc t i va (Braundmeie r and Mi l l e r , 2001a) . Las
eva luac iones semina les convenc iona les , o f recen in fo rmac ión de
la ca l idad de l semen la cua l es fundamenta l pa ra es tud ia r la
f i s io log ía y la conservac ión espermát i ca (Gadea, 1997b) , pe ro
no eva lúan las ca rac te r ís t i cas re lac ionadas con e l p roceso de
fecundac ión (Gadea and Matas , 2000 ; Ru iz -Sanchez e t a l . , 2006)
como la capac i tac ión , la reacc ión ac rosómica , la un ión a la zona
pe lúc ida y la pene t rac ión (Ru iz -Sanchez e t a l . , 2006) ; po r ta les
50
mot ivos , es c ruc ia l e l uso de técn icas que eva lúen la capac idad
fecundan te y que tengan va lo r p red ic t i vo de la fe r t i l i dad de l
eyacu lado .
Las técn icas u t i l i zadas en la ac tua l idad son :
• Pene t rac ión i n v i t ro con ovoc i tos de hámste r l i b res de zona
pe lúc ida , med ian te e l cua l se puede d isc r im inar en t re
machos fé r t i l es e in fé r t i l es (Berger and Hor ton , 1988) .
• E l tes t de un ión a la zona pe lúc ida , med ian te e l cua l se
puede iden t i f i ca r machos que p roducen camadas pequeñas
deb ido a su co r re lac ión con e l tamaño de la camada,
aunque no p resen ta co r re lac ión de es te tes t con la tasa de
par to (Braundmeie r e t a l . , 2004) . Cuando se rea l i za
inseminac ión a r t i f i c ia l he te rospérmica , la comb inac ión de l
tes t con la mov i l i dad , la mor fo log ía norma l , l a p resenc ia de
go tas d is ta les y la in tegr idad ac rosómica t iene cor re lac ión
con e l tamaño de la camada, s in embargo , e l tes t per se no
p resen ta es ta co r re lac ión (Co l l i ns e t a l . , 2008) .
• Pene t rac ión i n v i t ro homó loga con ovoc i tos madurados i n
v i t ro , en e l cua l , e l número de espermatozo ides por ovoc i to
ob ten ido es e l fac to r p r inc ipa l de va r iac ión de l tamaño de
la camada, (Xu e t a l . , 1998b) . La tasa de fo rmac ión de
p ronúc leos mascu l inos ob ten ida , rep resen ta de l 12 a l 17%
de la va r iac ión de la tasa de par to (Ru iz -Sanchez e t a l . ,
51
2006) ; s in embargo , para va lo ra r es tos parámet ros se
neces i tan métodos i n v i t ro más comp le jos , y e l va lo r
p red ic t i vo de la p rueba t iene que ser muy a l to para
jus t i f i ca r és te t i po de tecno log ía en una s i tuac ión p rác t i ca
(Xu e t a l . , 1998b) .
• E l tes t de pene t rac ión i n v i t ro homó loga (hIVP , Homologous
i n v i t ro pene t ra t ion tes t ) con ovoc i tos inmaduros ; donde las
tasas de pene t rac ión y e l número de espermatozo ides por
ovoc i to permi te d isc r im inar eyacu lados que p roducen tasas
de par to ba jas , med ias y a l tas ; y en t re eyacu lados que
p roducen tamaños de camada med ios y ba jos (Gadea,
1997b ; Gadea e t a l . , 1998) . En la f i gu ra 9 se puede
observar un ovoc i to pene t rado y como se despende la co la
de la cabeza de l espermatozo ide .
La tasa de pene t rac ión espermát i ca ob ten ida en s is temas i n
v i t ro , no es equ iva len te a l p roceso i n v i vo , pe ro p roporc iona una
es t imac ión ú t i l de los espermatozo ides con a l ta capac idad de
fecundac ión (Gadea and Matas , 2000) ; además, a l u t i l i za r
ovoc i tos inmaduros con la zona pe lúc ida in tac ta como en e l caso
de l h IVP, se cuen ta con un induc to r f i s io lóg ico de la reacc ión
ac rosómica (Braundmeie r and Mi l l e r , 2001b) , se ha l lan igua les
tasas de pene t rac ión que e l uso de ovoc i tos rec ién ovu lados , y
se puede ob tener in fo rmac ión de la capac idad fecundan te de l
52
espermatozo ide , sumado a es to , l a incubac ión d i rec ta de l semen
con los ovoc i tos , p rop ic ia e l p roceso de capac i tac ión y reacc ión
ac rosómica verdadera , s in rea l i za r p rocesos de lavado y
capac i tac ión p rev ios (Mar t inez , 1996) .
La re lac ión en t re las va r iab les comúnmente eva luadas en e l
aná l i s i s semina l y la capac idad fecundan te i n v i t ro de l
espermatozo ide son : la func iona l idad b ioqu ímica de la
membrana , la mov i l i dad , e l es tado de l ac rosoma, e l tes t de
res is tenc ia osmót ica y la mor fo log ía ; l as va r iab les que no
p resen tan és ta re lac ión son la superv ivenc ia y la concen t rac ión
(Gadea and Matas , 2000 ; Lovercamp e t a l . , 2007b) .
1 .10 EVALUAC IÓN POL IVALENTE
Ex is ten ac tua lmente p ruebas de labora to r io que eva lúan los
domin ios de la membrana de fo rma independ ien te : l a p rueba de
in tegr idad ac rosómica desar ro l lada por Purse l y Johnson (1974) ,
e l tes t co r to de res is tenc ia osmót i ca (sORT, ) que eva lúa la
res is tenc ia de la membrana ac rosómica a es te s t ress (Pérez–
L lano , 1999) , l a p rueba de superv ivenc ia o in tegr idad es t ruc tu ra l
de la membrana p lasmát i ca con SYBR-14 y yoduro de p rop id io ,
(Garner and Johnson , 1995) y e l tes t co r to de h inchazón
h ipoosmót i ca (sHOST) que eva lúa la in tegr idad func iona l de la
53
membrana de l f l age lo luego de expos ic ión en una so luc ión
h ipoosmót i ca (Perez -L lano e t a l . , 2001) . Se ha encon t rado la
ex is tenc ia de cor re lac iones en t re e l sHOST con la fecundac ión
(Jeyendran e t a l . , 1984) y de l sHOST (Perez -L lano e t a l . , 2001)
y e l sORT (Pérez–L lano , 1999) con la fe r t i l i dad en cerdos . As í
m ismo, se han repor tado cor re lac iones en t re e l sORT y e l
sHOST (Pérez -L lano e t a l . , 1998) , l o cua l a dado p ie a la
rea l i zac ión de p ruebas combinadas en donde se eva lúan
con jun tamente va r ios domin ios de la membrana , como en la
p rueba desar ro l lada por Pérez-L lano e t a l . (2003) , que ev idenc ia
una pob lac ión de espermatozo ides con la membrana ac rosómica
res is ten te a l s t ress osmót i co y con func iona l idad de la
membrana de l f l age lo : En la p rueba sHOST combinada con
superv ivenc ia y res is tenc ia ac rosómica sHOST p lus v iab i l i t y tes t
(sHV ) , l a cua l ev idenc ia una pob lac ión con la membrana
ac rosómica res is ten te a l s t ress osmót i co , con func iona l idad de
la membrana de l f l age lo y con superv ivenc ia (Perez -L lano e t a l . ,
2009a) .
1 .11 TEMPERATURA
La eva luac ión de la tempera tu ra de mues t ras de semen d i lu ido ,
t i ene una par t i cu la r impor tanc ia deb ido a las imp l i cac iones que
es ta posee sobre la ca l idad semina l ( Johnson e t a l . , 2000a) . Las
54
var iac iones de tempera tu ra super io res a los 17 ,7 °C causan :
inc remento de la perox idac ión l i p íd ica , apop tos is ce lu la r ,
a l te rac iones i r revers ib les sobre la v iab i l i dad , la in tegr idad
func iona l de la membrana espermát i ca , l a in tegr idad ac rosómica
y e l po tenc ia l de la membrana mi tocondr ia l (Kumaresan e t a l . ,
2009 ; Zou and Yang , 2000a) . As í m ismo, cuando e l semen se
somete a tempera tu ras in fe r io res a 15°C, se generan les iones
sobre la membrana espermát i ca deb ido a la ba ja res is tenc ia de
es ta a l f r i o (Johnson e t a l . , 2000a ; Pau lenz e t a l . , 2000) , s iendo
más g rave e l daño cuando la tempera tu ra se acerca a los 5°C
(Maxwe l l e t a l . , 1996) . La conservac ión de semen en t re los 8°C
y los 10°C causa reducc ión de la mot i l i dad a n ive les no
acep tab les para la inseminac ión a r t i f i c ia l , menor res is tenc ia de
la membrana a la en t rada de l ca lc io y aumento de
espermatozo ides con reacc ión ac rosómica ; además de a fec ta r la
fe r t i l i dad pos t - i nseminac ión (A l thouse e t a l . , 1998) .
1 .12 pH
La de te rminac ión de l pH en mues t ras de semen genera
in fo rmac ión va l iosa sobre las cond ic iones de conservac ión de
los espermatozo ides . E l pH de la f racc ión r i ca f l uc túa en t re 7 ,36
y 8 ,02 y luego de la d i l uc ión es te d isminuye g radua lmente has ta
55
ub ica rse en t re 6 ,8 y 7 ,2 (Gadea, 2003) ; en es te rango , e l pH
in t race lu la r , l a mot i l i dad y e l metabo l i smo se reducen
s ign i f i ca t i vamente , s i tuac ión fundamenta l pa ra e l adecuado
p roceso de conservac ión (Johnson e t a l . , 2000a) . Se cons idera
que n ive les super io res a 7 ,14 generan e l desencadenamien to de
la reacc ión ac rosómica e h iperac t i vac ión de la mot i l i dad de
fo rma p rematu ra pues inc rementan e l pH in t race lu la r en e l
espermatozo ide (Purdy e t a l . , 2010) . De igua l manera , n ive les
de pH por deba jo de 6 ,4 , es tán re lac ionados con per iodos de
conservac ión muy la rgos deb ido a l aumento de l ác ido lác t i co
(Fo ley e t a l . , 1967) , po r con taminac ión bac te r iana de l semen y
por fa l l as duran te la co lecc ión (A l thouse e t a l . , 2000 ; A l thouse
and Lu , 2005) . Se cons idera que una vez p reparado e l d i l uyen te ,
su t i empo de es tab i l i zac ión es tá comprend ido en t re los 60 y 90
m inu tos (Newth and Lev is , 1999 ; O l i va T re jo J , 2004) .
E l t i empo de a lmacenamien to de l semen, e je rce una in f luenc ia
s ign i f i ca t i va sobre su ca l idad ; se ha demost rado que la
conservac ión de semen en d i luyen tes de la rga durac ión por más
de 5 d ías a 16°C, aumenta e l número de espermatozo ides con
capac i tac ión y reacc ión ac rosómica p rematu ras ; además,
d isminuye la capac idad de fecundac ión de l semen, las tasas de
par to y e l tamaño de la camada, aun con tando con a l tos
porcen ta jes de mov i l i dad p rogres iva (Cone jo -Nava e t a l . , 2003 ;
Es t ienne e t a l . , 2007) ; as í m ismo, e l a lmacenamien to en t re 16°C
56
y 18°C por per iodos comprend idos en t re 2 y 5 d ías , reduce
s ign i f i ca t i vamente la mov i l i dad espermát i ca , l a in tegr idad de l
ac rosoma, la in tegr idad de l ADN, as í como la tasa de par to
(Boe-Hansen , 2005 ; Johnson e t a l . , 1982) .
En la ac tua l idad ex is ten d isc repanc ias en cuan to a la asoc iac ión
de las p ruebas de l aná l i s i s semina l convenc iona l , y la fe r t i l i dad
de l eyacu lado . E l espermatozo ide para l l evar a cabo su func ión
en e l p roceso de fecundac ión , debe tener las membranas
p lasmát i ca y ac rosómica in tac tas y func iona lmente ac t i vas , con
e l f i n de que és tas pueden rea l i za r a p len i tud su func ión
p ro tec to ra y de in te racc ión con los componentes ce lu la res
in te rnos , la cabeza , e l t rac to in te rmed io , e l f l age lo , e l con ten ido
de ADN y e l con ten ido de enz imas ac rosómicas (Perez -L lano e t
a l . , 2009a) . Ex is te una es t recha re lac ión en t re e l tes t de
endósmos is que eva lúa la func iona l idad b ioqu ímica de la
membrana p lasmát i ca , y la fe r t i l i dad (Pérez–L lano , 1999) ; en e l
caso de la superv ivenc ia espermát i ca Gadea (1997) encon t ró
que és ta re lac ión es escasa , deb ido a que una membrana
dañada es t ruc tu ra lmente , p ie rde su func iona l idad. Se ha
demost rado que tan to e l tes t de endósmos is y la eva luac ión de
in tegr idad ac rosómica , pueden ser u t i l i zados para d isc r im inar
eyacu lados de escasa fe r t i l i dad , pe ro no d i fe renc ian en t re
eyacu lados con fe r t i l i dad med ia y a l ta (Gadea, 1997b ; Gadea e t
57
a l . , 1998) . Es te m ismo resu l tado fue ha l lado para mov i l i dad ,
concen t rac ión y mor fo log ía norma l (Ru iz -Sanchez e t a l . , 2006) .
No obs tan te , e l po rcen ta je de espermatozo ides
mor fo lóg icamente norma les se re lac iona con e l tamaño de la
camada; la reducc ión de la concen t rac ión de 30x10 6
espermatozo ides /mL a 20x10 6 espermatozo ides /mL, no a fec ta la
tasa de par to , pe ro s i a fec ta e l tamaño de la camada (Xu e t a l . ,
1998b) . Ad ic iona lmente la a l ta p roporc ión de GCs y de co las en
lá t igo se re lac iona con ba ja fe r t i l i dad (Gadea and Matas , 2000 ;
Lovercamp e t a l . , 2007b) .
En la tab la 2 se p resen tan los va lo res de re fe renc ia u t i l i zados
para la ca l i f i cac ión de mues t ras ana l i zadas en labora to r io .
58
TABLA2 . VALORES DE REFERENC IA PARA VAR IABLES SEMINALES .
V a r i a b l e V a l o r a c e p t a b l e R e f e r e n c i a
T e m p e r a t u r a 1 5 º C 1 5 a 2 0 º C 1 6 ° C
( G a d e a , 2 0 0 3 ; J o h n s o n e t a l . , 2 0 0 0 a ; Z o u a n d Y a n g , 2 0 0 0 b )
p H ( r e c i é n e y a c u l a d o ) p H ( d i l u y e n t e ) p H F r a c c i ó n r i c a
7 , 4 ± 0 , 2 6 , 8 a 7 , 2 7 , 6 9 ± 0 , 3 3
( A l t h o u s e a n d L u , 2 0 0 5 ; G a d e a , 2 0 0 3 ; K i n g a n d M a c p h e r s o n , 1 9 6 6 a )
C o n c e n t r a c i ó n 3 x 1 0 9 2 x 1 0 9
2 , 5 a 4 x 1 0 9
( G a d e a , 2 0 0 3 ; J o h n s o n e t a l . , 2 0 0 0 a ; L e v i s e t a l . , 2 0 0 2 ; P e r e z - L l a n o e t a l . , 2 0 0 1 )
s H O S T > 6 0 %
( G a d e a , 2 0 0 3 ; J o h n s o n e t a l . , 2 0 0 0 a ; L e v i s e t a l . , 2 0 0 2 ; P e r e z - L l a n o e t a l . , 2 0 0 1 )
A n o r m a l i d a d e s c o n G o t a s < 2 0 % ( d e S e r r a n o e t a l . , 1 9 8 9 ;
F l o w e r s , 2 0 0 4 a )
A n o r m a l i d a d e s < 3 0 % ( D a r w i n , 2 0 0 4 ; R o z e b o o m e t a l . , 2 0 0 0 a )
G C < 1 5 % ( R o z e b o o m e t a l . , 2 0 0 0 a ; S m i t a l , 2 0 0 9 a ; S m i t a l a n d F i e d l e r , 2 0 0 8 )
< 2 0 ( F l o w e r s , 2 0 0 4 a ) C o l a s d o b l a d a s < 1 0 % ( R o z e b o o m e t a l . , 2 0 0 0 a )
A g l u t i n a c i ó n < 2 5 % < 4 0 %
( F l o w e r s , 2 0 0 2 a ; R o z e b o o m e t a l . , 2 0 0 0 a )
A n o r m a l i d a d e s a c r o s ó m i c a s
< 6 0 % < 4 9 %
( F l o w e r s , 2 0 0 2 a ; R o z e b o o m e t a l . , 2 0 0 0 a )
M o v i l i d a d T o t a l 8 0 % ( G a d e a e t a l . , 2 0 0 4 ) M o v i l i d a d p r o g r e s i v a 6 6 % ( G a d e a e t a l . , 2 0 0 4 )
59
2 . GOTAS C ITOPLÁSMICAS
Las Gotas C i top lásmicas (GCs ) son pequeños remanentes de l
c i top lasma o r ig ina l de l espermatozo ide , que le quedan adher idos
después de la espermatogénes is (F ischer e t a l . , 2003 ; Kap lan e t
a l . , 1984c) ; es tas es t ruc tu ras m ig ran desde la porc ión p rox ima l
de l t rac to in te rmed io de l espermatozo ide a la porc ión d is ta l ,
du ran te e l paso por e l ep id íd imo en e l p roceso de madurac ión ,
como se puede observar en la f i gu ra 9 (Br i z e t a l . , 1995 ; F ischer
e t a l . , 2005a ; Kus te r e t a l . , 2004b) , pa ra luego e l im inarse
(Kap lan e t a l . , 1984a ; Ka to e t a l . , 1996) . Su e l im inac ión ocur re
uno a dos m inu tos después de la eyacu lac ión , cuando los
espermatozo ides se mezc lan con componentes de l p lasma
semina l (PS) como la f ruc tosa y e l adenos ín monofos fa to c íc l i co
(AMPc) , se cons idera que un macho t iene pers is tenc ia de GCs
cuando permanentemente p resen ta un porcen ta je ≥15% después
de l p roceso na tu ra l de e l im inac ión (Harayama e t a l . , 1996) .
60
F igura 9 . D e s p r e n d im i e n t o l a t e r a l d e l a g o t a c i t o p l a sm i c a d i s t a l . ( B r i z e t a l . , 1 9 9 5 )
El ep id íd imo como órgano fundamenta l en e l p roceso
espermiogén ico , i n te rv iene en la madurac ión func iona l de los
espermatozo ides , en la remoc ión de espermatozo ides
de fec tuosos y en la e l im inac ión de las GCs; ad ic iona lmente ,
p roporc iona tempera tu ra , tens ión de ox ígeno , pH y energ ía
(Marengo , 2008) . E l ep i te l i o de l ep id íd imo es ta compues to de
cé lu las p r inc ipa les y basa les , en é l se c rea un amb ien te
comp le jo a l rededor de l espermatozo ide (Dacheux e t a l . , 2005) ;
en cond ic iones norma les , en la cabeza de l ep id íd imo se
reabsorben has ta e l 90% de los f l u idos p roven ien tes de los
conduc tos an te r io res a es te (O 'Donne l e t a l . , 2001) . Cuando se
a l te ra la expos ic ión , l a durac ión y e l t rans i to de l espermatozo ide
por e l ep id id imo, se hacen man i f ies tas las GCs, las cua les son
61
cons ideradas como un s igno de inmadurez espermát i ca (Br i z ,
1996) .
En e l ep id íd imo de l ve r raco las GCs se desp lazan desde una
pos ic ión p rox ima l en e l cue l lo de l espermatozo ide has ta una
pos ic ión d is ta l en la p ieza in te rmed ia ; l a p resenc ia de cé lu las
espermát i cas con GCs en la cabeza de l ep id íd imo es de un 90%
para i r d i sminuyendo a lo la rgo de l t ráns i to ep id id imar io (70% en
la co la de l ep id íd imo) y tener unos ba jos n ive les en e l eyacu lado
in fe r io res a l 15% (Kap lan y co ls . , 1984) .
La a l ta f recuenc ia de eyacu lac iones en los ve r racos camb ia e l
m ic ro amb ien te de l ep id íd imo a l a l te ra r la ve loc idad de paso de
los espermatozo ides , e l pa t rón de absorc ión y la sec rec ión de
los f l u idos ep id id imar ios , l o cua l p rop ic ia la p resen tac ión de
GCs, lo cua l demues t ra la impor tanc ia de la par t i c ipac ión de l
ep id íd imo sobre en la ca l idad semina l (P runeda e t a l . , 2005) .
2 .1 FORMACIÓN Y ESTRUCTURA DE LAS GOTAS C ITOPLÁMICAS
Las GCs se fo rman cuando los espermatozo ides es tan
comple tamente d i fe renc iados de las cé lu las de Ser to l i de l
ep i te l i o de los túbu los semin í fe ros de los tes t í cu los , en es te
momento , l a mayor ía de las GCs son reabsorb idas y fagoc i tadas
62
por las cé lu las de Ser to l i . Duran te es te p roceso una pequeña
masa de res tos de c i top lasma, pueden permanecer conec tados a
la par te pos te r io r de la cabeza de l espermatozo ide o a la par te
an te r io r de la p ieza in te rmed ia ; po r tan to la fo rmac ión de las
GCs ocur re en e l momento m ismo en que los gametos en
desar ro l lo se d i r igen a la luz de l ep i te l i o semin í fe ro ; en es te
p roceso se reduce e l c i top lasma de 500 a 10 µm, e l núc leo toma
su fo rma y aparece la co la (Cooper e t a l . , 2004 ; Pruneda e t a l . ,
2005) .
La compos ic ión y d is t r ibuc ión de l con ten ido de las GCs, se
mod i f i ca duran te su m ig rac ión de la pos ic ión p rox ima l a la
pos ic ión d is ta l , que norma lmente co inc ide con e l t ráns i to de los
espermatozo ides desde la cabeza a la co la de l ep id id imo (Br i z ,
1996)
Con e l uso de mic roscop ia e lec t rón ica , como se observa en las
f i gu ras 10 y 11 , la es t ruc tu ra de las GCs se aprec ia como una
membrana de p lasma de f in ido la cu l con t iene pequeñas
ves ícu las , e lementos sacu la res , cu rvas con fo rma de her radura
o c i r cu la r y túbu los de super f i c ie l i sa , i den t i f i cados como
lamin i l l as , de muy ba ja dens idad y ca ren te de r ibosomas,
g lucógeno , y de inc lus iones de l íp idos ; l as lamin i l l as y o t ras
es t ruc tu ras de la membrana de las GCs se c ree que son
e lementos res idua les de des in tegrac ión de res tos de ves ícu las
de re t í cu lo endop lasmát i co . (Kap lan e t a l . , 1984a) .
63
F igura 10 . E s t r u c t u r a d e l a g o t a c i t o p l a sm i c a p r o x im a l p o r m i c r o s c o p i a e l e c t r ó n i c a . C D = g o t a c i t o p l á s m i c a , M = m i t o c o n d r i a s . ( B r i z e t a l . , 1 9 9 5 )
F igura 11 . A l t e r a c i ó n g e n e r a d a p o r l a d e s p o l a r i z a c i ó n d e e l emen t o s d e l a m emb r a n a e s p e rm á t i c a g e n e r a d a p o r g o t a c i t o p l á sm i c a . ( A k b a r s h a e t a l . , 2 0 0 0 )
64
En la f i gu ra 12 se puede aprec ia r como la p resenc ia de go ta
c i top lámica p rox ima l a l te ra la norma l con fo rmac ión de las
m i tocondras en e l espermatozo ide .
F igura 12 . D e s a r r e g l o m i t o c o n d r i a l o c a s i o n a d o p o r l a p r e s e n c i a d e g o t a c i t o p l á sm i c a p r o x im a l . M P = m i t o c o n d r i a s , C P = G o t a p r o x i m a l , C D = g o t a c i t o p l á m i c a . ( B r i z e t a l . , 1 9 8 5 )
2 .2 COMPOS IC IÓN DE LAS GOTAS C ITOPLÁSMICAS
Las enz imas se han encon t rado como e le lemtos cons t i tu t i vos de
las GCs, s iendo repor tadas la desh id rogenasa de ác ido lác t i co ,
l a c rea t ina fos fo qu inasa , la superóx ido d ismutasa y la g lucosa-
6 - fos fa to desh id rogenasa , la hexoqu inasa , la g lucosa fos fa to
65
i somerasa , y lac ta to desh id rogenasa , as í como la g l i ce ra ldeh ído
3 - fos fa to desh id rogenas ; es tas puede ser responsab les de la
s ín te is de espec ies reac t i vas de ox igeno (ROS) en e l eyacu lado
(A i t ken and DeIu l i i s , 2009 ; Akbarsha e t a l . , 2000) .
Todas las enz imas , recep to res y mo lécu las necesar ios para la
homeos tas is ce lu la r , an tes de la madurac ión de los
espermatozo ides , se encuen t ran p resen tes en las GCs y
con t iene por tan to las enz imas necesar ias para la madurac ión
de l espermatozo ide ; no se conoce con exac t i tud s i es to es un
mecan ismo u t i l i zado por e l espermatozo ide para re tener
de te rminadas mo lécu las re lac ionadas con la madurac ión o s i
es tas son s imp lemente un subproduc to de la espermatogénes is ;
l a mayor ía de inves t igadores es tán de acuerdo que las enz imas
asoc iadas con las GCs no p roporc ionan n ingún bene f i c io a los
espermatozo ides o a su med io c i r cundan te (Lovercamp e t a l . ,
2007a) .
Ad ic iona lmente , las GCs es tán compues tas de c i toso l , e lementos
ves icu la res in te rnos der i vados de la membrana como
remanentes de Go lg i y o t ros o rgane los de la espermát ide
degradados en e l es tado f ina l espermiogén ico (F ischer e t a l . ,
2005b ; Kap lan e t a l . , 1984b ; Oko e t a l . , 1993) ; y poseen
ac t i v idad enz imát i ca h id ro l í t i ca (Br i z , 1996 ; Kus te r and A l thouse ,
2003) . En un p roceso de gametogénes is norma l , l as GCs son
66
absorb idas en g ran p roporc ión por e l ep id íd imo, pueden ser
l i be radas an tes , du ran te , i nmed ia tamente después de l eyacu lado
o p resen ta rse de fo rma l i b re en e l eyacu lado . (Br i z , 1996 ;
F ischer e t a l . , 2005b ; Pruneda e t a l . , 2005) , l as GCs que se
encuen t ran un idas a los espermatozo ides eyacu lados se
cons ideran pa to lóg icas (Kap lan e t a l . , 1984b) .
Las GCs se pueden romper den t ro de l ep id íd imo o en la
eyacu lac ión , aunque no se conocen las causas de la rup tu ra se
ha encon t rado que es tas se des in tegren en pequeñas ves ícu las
que podr ían con tener enz imas como la h id ro lasa y d i fund i rse en
los f l u idos de l t rac to reproduc t i vo , por lo cua l su rup tu ra puede
ser una amenaza para la fe r t i l i dad (Do t t and D ing le , 1968) ; l as
cé lu las ep i te l i a les de l ep id íd imo pueden fagoc i ta r l os res tos de
las GCs, lo cua l sug ie re que e l ep id idmo ac tua como un s is tema
de con t ro l de las go tas (Su tkev ič i enė and Ž i l i nskas , 2004) .
2 .3 CLAS IF ICAC IÓN DE LAS GOTAS C ITOPLÁSMICAS
Las GCs son fác i lmente v i s ib les con un mic roscop io de luz
convenc iona l a 400X de magn i f i cac ión ; con m ic roscop ía
e lec t rón ica se han de te rminado la fo rma y e l tamaño med ia de
las GCs de los mami fe ros , las cua les son t íp i camente c i rcu la res
67
y con un tamaño p romed io de 2 a 3µm de d iámet ro (Kap lan e t
a l . , 1984b ; Oko e t a l . , 1993) .
Según su pos ic ión en e l espermatozo ide , las GCs se c las i f i can
como go tas c i top lásmicas p rox ima les (GCP ) cuando se
encuen t ra jus to pos te r io r a la cabeza de l espermatozo ide como
se ev idenc ia en la f i gu ra 13 , y como go tas c i top lámicas d is ta les
cuando (GCD ) cuando se encuen t ran ub icadas en la porc ión f i na l
de la p ieza in te rmed ia , como se puede observar en la f i gu ra 14 ;
du ran te e l t ráns i to por e l ep id id imo la GCD norma lmente se
des l i za a la pos ic ión d is ta l (DCD) (Bone t e t a l . , 1993) .
F i gu ra 13 . Espermatozo ide no rma l ( Super io r ) y e spe rmatozo ide con go ta c i top l á sm ica p rox ima l ( I n fe r i o r ) . (Biología de la Reproducción)
68
F i gu ra 14 . E spe rmatozo ides con p resenc i a de go ta c i top l á smica d i s t a l . (Biología de la Reproducción).
En la zona donde se encuen t ra la go ta c i top lásmica se genera
un deb i l i t amien to es t ruc tu ra l po r acc ión enz imát i ca y
desorgan izac ión de los componentes es t ruc tu ra les de la co la ,
p rop ic iando e l en ro l lamien to o p legamien to de la co la sobre la
GC (Br i z , 1996) .
2 .4 FACTORES ASOC IADOS A LA PRESENTAC IÓN DE GOTAS
En la l i t e ra tu ra las GCs se cons ideran como la ma l fo rmac ión
espermát i ca más f recuen temente asoc iada con eyacu lados de
ba ja ca l idad y genera ba jos n ive les de fe r t i l i dad en los machos
a fec tados , as í m ismo se repor ta como la anorma l idad más
f recuen te en semen de machos porc inos des t inados a
69
i nseminac ión a r t i f i c ia l (A l thouse , 1998 ; Ares tova and A lekseev ,
2013 ; Gómez, 2010 ; Ka to e t a l . , 1996) ; ad ic iona lmente , se ha
encon t rado una a l ta va r iac ión en la f recuenc ia de p resen tac ión
de GCs en t re machos , a lo la rgo de su la v ida ú t i l y en la
pers is tenc ia en d i fe ren tes momentos (D iaz e t a l . , 2009 ; Gómez,
2010) .
Los fac to res más f recuen temente asoc iados con la p resen tac ión
de GCs en porc inos , son los c l imá t i cos (es tac iona l idad ,
tempera tu ra amb ien ta l y fo toper iodo) y la f recuenc ia de
eyacu lac ión de los ve r racos . Con respec to a los repor tes sobre
asoc iac iones en t re la p resen tac ión de GCs y va r iab les c l imá t i cas
se repor ta e l i nc remento de las GCs en e l ve rano , en pa íses con
es tac iones , como Japón (de Ser rano e t a l . , 1989 ; Nakayama e t
a l . , 1991 ; Sur i yasomboon e t a l . , 2005) ; se repor ta asoc iac ión
pos i t i va en t re p reva lenc ia de GCs y tempera tu ra amb ien ta l y
humedad re la t i va (Echever r ia -A lonzo e t a l . , 2009 ; Kus te r e t a l . ,
2004a ; Larsson and E inarsson , 1984) ; en par t i cu la r Larson y
E inarsson (1984) encon t ra ron e levac iones man i f ies tas en e l
po rcen ta je de GCs por enc ima de 31 .6 0 C de tempera tu ra
amb ien ta l y de 78% de humedad re la t i va ; y se ha asoc iado
aumento de las GCs a la d isminuc ión de las horas luz en e l
o toño (Andersson e t a l . , 1998 ; Sancho e t a l . , 2004b) .
Con re lac ión a la f recuenc ia de eyacu lac ión , ex is ten repor tes
donde ver racos eyacu lados con una f recuenc ia mayor a dos
70
co lec tas por semana, p resen ta ron una mayor p roporc ión de GCs,
las cua les se cons ideran como s igno de inmadurez espermát i ca
(Bone t , 1987 ; F rangez e t a l . , 2005 ; Pruneda e t a l . , 2005) .
En la tab la 3 se descr iben los fac to res asoc iados a la
p resen tac ión de GCs encon t rados en la l i t e ra tu ra con sus
respec t i vos n ive les c r í t i cos asoc iados . Como se puede observar ,
e l c l ima es tá re lac ionado de manera f recuen te con la
p resen tac ión de GCs, en espec ia l cuando se someten los
an ima les a tempera tu ra amb ien ta l mayores de 31 .6 ° C , humedad
re la t i va mayor a 78%; e l segundo fac to r cons iderado como mas
inc iden te es la f recuenc ia de eyacu lac ión , en espec ia l cuando
los ve r racos se someten a reco lecc iones super io res a 2
eyacu lados por semana; ad ic iona lmente se repor ta la
d isminuc ión de GCs por e l sumin is t ro de se len io en la d ie ta y la
in fecc ión exper imenta l con Pseudo rab ia .
71
TABLA 3 FACTORES ASOC IADOS A LA PRESENTAC IÓN DE GOTAS C ITOPLASMÁTICAS EN MACHOS PORC INOS ACT IVOS REPRODUCT IVAMENTE .
Factor Asociado Efecto generado Relación de la asociación
Referencia
Temperatura y humedad ambiental. Clima (estación, primavera, verano)
31,6 - 40,0°C 78% - 96% humedad relativa. Incremento de GCs por alta temperatura ambiental y humedad relativa, Verano.
Incremento de GCs
(Andersson et al., 1998; de Serrano et al., 1989; Echeverria-Alonzo et al., 2009; Nakayama et al., 1991; Suriyasomboon et al., 2005)
Fotoperíodo Baja luminosidad en otoño. Incremento en la presentación
GCs
(Sancho et al., 2004b)
Edad Tendencia a mayor presentación de GCs en verracos adultos
Incremento en la presencia de
GCs con la edad.
(Díaz et al., 2009)
Frecuencia eyaculación Mas de 2 eyaculaciones por semanas.
Incremento en la presentación
GC
(Pruneda et al., 2005; Suriyasomboon et al., 2005; Suriyasomboon et al., 2004b)
Tiempo de almacenamiento y temperatura del semen
Disminución de gotas a 15°C y 48 horas.
Disminución de GCs en semen
procesado
(Zou and Yang, 2000b)
Suminstro deTestosterona.
Inyección de 250 - 500 mg. Disminución en la incidencia de
las GCs
(Nakayama et al., 1991)
Temperatura escrotal alta Temperatura escrotal superior a los 39°C
Incremento de GCs en
eyaculado
(Malmgren, 1989)
Suministro de Selenio en dieta
0.5 ppm en alimento. Disminución de las GCs
(Echeverria-Alonzo et al., 2009; Marin-Guzman et al., 1997)
Fragmentación de DNA Espermatozoides con índice >15%.
Asociado a GCs
proximales.
(López-Fernández et al., 2008)
Cromatina inestable Espermatozoides con cromatina instrable > 5%.
Asociada a GCs
(Ardón et al., 2008)
Cola corta Defecto genético en semen Presencia de GCs
(Skura et al., 2002)
Cola enrollada Asociada a gota Asociada a gota
(Holt, 1982)
Pseudorabia Infección experimental. Incremento en la presentación
de GCs
(Larsen, 1980)
72
En e l con t ro l de la ca l idad semina l de porc inos aún se
desconoce la d inámica de las a l te rac iones espermát i cas ,
p r inc ipa lmente la de las go tas c i top lásmicas . Has ta ahora so lo
se han rea l i zado aprox imac iones a l d iagnós t i co ob je t i vo de las
GC y su re lac ión con la fe r t i l i dad (F ischer e t a l . , 2005b ;
Lovercamp e t a l . , 2007b) pero con técn icas cos tosas y de d i f í c i l
imp lementac ión .
73
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86
CAPITULO II
REVISIÓN SISTEMÁTICA DE LOS FACTORES ASOCIADOS A LA PRESENTACIÓN DE GOTAS CITOPLÁSMICAS EN PORCINOS.
Germán Gómez1, Consuelo Velez2, Alejandro Ceballos3, Francisco Javier Henao4
Recibida en arbitraje en la Revista de Salud Publica, Universidad Nacional de Colombia. Junio 25 de 2014
RESUMEN Objetivo: Determinar los factores asociados con la presentación de gotas
citoplasmáticas en porcino.
Métodos: Se realizó una revisión sistemática donde se encontraron 133 artículos,
se eliminaron 70 por duplicados y 65 se seleccionaron finalmente: 57 en Cab
Abstract, 39 en Pub Med, 20 en Agrícola y 17 en Science Direct. Se recuperaron
47 artículos en texto completo. Los datos se tabularon en EpiData Entry, se
transfirieron al programa Stata versión 12.0.
Resultados: Los factores más frecuentemente asociados con la presentación de
GCs en porcinos, son los climáticos (estacionalidad, temperatura ambiental y
fotoperiodo) y la frecuencia de eyaculación de los verracos. La información a pesar
de ser heterogénea y diversa, no menciona estudios realizados bajo condiciones
intertropicales, ni bajo condiciones comerciales, ni involucra animales dedicados a
la producción intensiva de semen para reproducción controlada. 1 Estudiante de Doctorado, Doctorado Ciencias Agrarias, Universidad de Caldas 2 Departamento de Salud Pública. Facultas de Ciencias para la Salud. Universidad de Caldas 3 Grupo de investigación Biología de la Producción Pecuaria, Universidad de Caldas 4 Grupo de investigación Biología de la Producción Pecuaria, Universidad de Caldas. Correspondencia: [email protected], Calle 65 Nº 26-10, Manizales, Colombia
87
Conclusiones: La información se caracteriza por su amplia heterogeneidad y
diversidad de estudios. No fue posible la determinación de la relación temporal
entre la causa y el efecto de las GCs.
PALABRAS CLAVE: Gotas citoplásmicas, espermatozoides, factores epidemiológicos,
inseminación artificial, revisión sistemática (Fuente: DeCS BIREME).
SYSTEMATIC REVIEW OF FACTORS ASSOCIATED WITH THE PRESENCE OF CYTOPLASMIC DROPLETS IN BOARS
ABSTRACT Objective: To determine the factors associated with the presence of cytoplasmic
droplets in boars.
METHODS: A systematic review was carried out in which 133 articles were found,
70 were eliminated for being duplicated, and 65 were finally selected: 57 in Cab
Abstract, 39 in Pub Med, 20 in Agricola, and 17 in Science Direct. Forty-seven
articles were recuperated in full text. Data was tabulated in EpiData Entry and
transferred to the Stata version 12.0 program.
Results: Factors Associated with CGs are: Climatic and environmental variables;
ejaculation frequency with intervals lesser than three weeks; spermatic
morphologic alterations in tail (coiled and distal reflex); DNA fragmentation; and
enzymatic factors related to seminal biochemistry. Work carried out in equatorial
climate regions or focused in the analysis of implications of CGs in artificial
insemination centers was not found.
88
Conclusions: The information is characterized for its wide heterogeneity and
diversity in studies, none of them carried out under commercial production or for
genetic improvement semen. Climate is a factor that is mostly frequent in the
presence of cytoplasmic droplets.
KEY WORDS: Cytoplasmic droplets, sperm, epidemiologic factors, artificial
insemination, systematic review (Source: MeSH):
1. INTRODUCCIÓN
Las gotas citoplásmicas (GCs) son la alteración espermática más frecuente
encontrada en semen de machos porcinos destinados a procesos de reproducción
controlada (1, 2). El hallazgo de una elevada proporción de estas en los
eyaculados está claramente correlacionada con bajos niveles de fertilidad de los
reproductores; así mismo, se ha identificado variabilidad en la frecuencia de
presentación de GCs entre machos a lo largo de su la vida (2, 3). Las GCs son
vesículas residuales del citoplasma, de 2 µm de diámetro (4), proximales o
distales, según su ubicación en la pieza intermedia (5-7), que en condiciones
normales son eliminadas, en alta proporción, en el epidídimo, antes, (8) durante
(9) o inmediatamente después de la eyaculación (10); las GCs también pueden
encontrarse libres en el eyaculado después del proceso natural de eliminación (4).
Se consideran una alteración morfológica cuando se encuentran unidas a la pieza
intermedia de los espermatozoides eyaculados, en una proporción superior al 15%
(2, 8). Se considera que un macho tiene persistencia de GCs cuando presenta un
porcentaje ≥ al 20% (11, 12).
89
La persistencia de las GCs en el eyaculado, está asociada con factores, como
presencia de 15-lipoxigenasa en el semen (9), la presencia de espermatozoides
con el DNA fragmentado (13), la edad de los reproductores (2, 14), la frecuencia
elevada de eyaculación (15), la dieta limitada en antioxidantes (16), la alteración
en el patrón de absorción y secreción de los fluidos epididimarios que regulan la
osmolaridad (10, 17), factores climáticos como la alta temperatura y humedad
relativa (18), y factores genéticos (19).
En el control de la calidad seminal de porcinos, hasta ahora solo se han realizado
aproximaciones al diagnóstico objetivo de las GCs y su relación con la fertilidad (9,
20, 21), lo cual hace necesario el contar con información que permita identificar en
la literatura, los factores asociados a la presentación de GCs. Ante la gran
cantidad de información científica disponible sobre un tema particular, es
necesario contar con herramientas que permitan analizar la información y resumir
la evidencia adecuadamente, ya que muchas veces es difícil acceder y revisar con
profundidad lo publicado, analizar críticamente la evidencia científica existente y
comprender la utilidad de lo nuevo (22). A pesar de la facilidad de ingreso que
proporcionan las bases de datos y las revistas científicas en red, el abordaje,
ordenado, sistemático y sin sesgos de la información de trabajos científicos es
difícil, por lo cual es necesario disponer de herramientas que permitan acceder a
la información adecuada en términos de pertinencia, número, calidad y vigencia
(23).
La revisión sistemática (RS) ofrece, mediante el uso de métodos explícitos y
sistemáticos que limitan el error y reducen los sesgos introducidos por los
revisores, la posibilidad de resumir la evidencia sobre una intervención particular
90
pudiendo obtener conclusiones y tomar decisiones. En tal sentido, la RS se
caracteriza por su rigurosidad (criterios claros de inclusión y calidad), efectividad
(dirigida a problemas reales que responden preguntas claramente delimitadas),
exhaustividad (información pertinente, sin sesgos en la selección de la información
y las publicaciones), y sistematización al ser suficientemente clara en los métodos
utilizados para llevar a cabo la revisión (22, 24).
El objetivo del presente trabajo fue aportar antecedentes, mediante la realización
de una revisión sistemática, acerca de la evidencia que hay publicada con
respecto a la presencia de las gotas citoplasmáticas y su eventual asociación con
los factores de riesgo, orientada con especificidad a clima (estacionalidad,
temperatura, humedad relativa y fotoperiodo), edad del verraco, morfología
espermática, sanidad del verraco, alimentación del verraco, y frecuencia de
eyaculación.
2. MATERIALES Y MÉTODOS Búsqueda de l i t e ra tu ra . Se realizó una búsqueda de literatura en bases de
datos electrónicas para identificar estudios primarios realizados entre 1975 y 2012.
Para la búsqueda de la información electrónica se consultaron las siguientes
bases de datos, disponibles en la biblioteca de la Universidad de Caldas: CAB
ABSTRACTS (vía internet ), PUB MED (vía internet), AGRICOLA (vía internet), y
SCIENCE DIRECT (vía internet). Los términos utilizados inicialmente para las
búsquedas fueron: (boar OR cerdo) AND (espermatozoides OR spermatozoa OR
semen OR gota citoplasmática OR cytoplasmic droplet) AND (fecundación OR
91
fertilization) AND (factores de riesgo OR risk factor). Se restringieron las revistas y
las publicaciones elegibles a aquéllas publicadas en bases de datos, no se
incluyeron resúmenes o actas de congresos, capítulos de libros y tesis de grado.
Para incluir el artículo en la revisión, se tuvo en cuenta que fuera fruto de
investigación primaria, que fuera publicada en revista indexada y que en el título o
en el resumen se incluyera alguna de las palabras usadas en la búsqueda.
Resu l tado de in te rés y ex t racc ión de l a i n fo rmac ión . El evento de
interés para la realización de la revisión sistemática fue el reporte de la presencia
de GCs en machos porcinos reproductivamente activos y la indicación de su
eventual asociación con algunos factores de riesgo.
Se realizó la selección de los artículos de acuerdo con los criterios de selección
establecidos, con el fin de contar con la información pertinente sobre GCs bien se
en el título o en el resumen. Posteriormente, se hizo la extracción de la
información relacionada con la calidad del estudio y la presencia de GCs, como se
evidencia en la tabla1.
Tabla 1. Formulario empleado para la evaluación de la calidad de los artículos obtenidos en las búsquedas.
Elemento Descripción Autor Los autores se encuentran
92
debidamente identificados.
Año de Publicación Se encuentra estipulado el año de publicación del trabajo
Tipo de Publicación La publicación se encuentra debidamente clasificada
Idioma Idioma de publicación
País donde se realizó el estudio Identificación del país donde se realizó el trabajo.
Año del estudio Se encuentra el año(s) de elaboración del trabajo.
Se presentan los criterios usados para la determinación de tamaño de la muestra
El tamaño de muestra esta debidamente explicitado.
Valoración Se encuentran los criterios de inclusión y exclusión de los animales en el estudio
Elementos para determinar los animales involucrados en el trabajo experimental
Se describen o presentan los factores asociados a la presentación de las gotas citoplásmicas.
Inclusión en el trabajo de los factores asociados a la presentación de GCs
Se encuentran las características de los animales estudiados.(Alojamiento, alimentación, entre otros)
Descripción de la forma de tenencia de los animales involucrados en el trabajo.
Se incluyen detalles sobre la prevalencia de presentación de las gotas antes de iniciar el estudio
Cuantificación de valores de GCs
Se realiza una descripción de los protocolos de diagnóstico utilizados en el trabajo
Elementos que permitan identificar las GCs
Tratamientos realizados en los animales.
Se describen las intervenciones experimentales en los animales.
Descripción de la selección de los grupos de estudio en el experimento
Se indica la forma de selección de los grupos experimentales.
En la estructura jerárquica usada para el análisis se realizan evaluaciones repetidas en un mismo macho.
Se describen los intervalos y número de evaluaciones realizadas a los verracos durante el trabajo.
La estadística usada en el análisis es apropiada
Descripción del análisis estadístico utilizado.
Se describe el tipo de diseño experimental del estudio
Se presenta la metodología usada en el diseño experimental.
Se define tipo de población estudiada Se describen las características de los animales utilizados.
Se indica el número de muestras de semen evaluadas.
Las muestras de material seminal evaluado están claramente secuenciadas en el tiempo.
Se presenta la edad de los verracos La clasificación atarea de los machos esta claramente descrita.
Se encuentra la descripción del genotipo de los verracos
El tipo racial de los machos se puede identificar claramente
Se tiene clara la unidad o nivel de análisis
El nivel de análisis utilizado en el trabajo esta definido.
Se indica el numero de tratamientos en los grupos
Los tratamientos experimentales están definidos.
93
Se especifica la duración del estudio (en meses)
Se identifica la duración en tiempo del trabajo.
Se tuvieron en cuenta las unidades experimentales perdidas en el estudio para la diferencia.
En caso de perder unidades experimentales, estas son tenidas en cuenta para el análisis final.
Se especifica la frecuencia de realización de las evaluaciones seminales
Se indica la frecuencia de eyaculación de los verracos.
Se describen o indican el o los método (s) usado(s) en la determinación de las gotas citoplásmicas.
Las técnicas de evaluación seminal destinadas al diagnóstico de las GCs están adecuadamente descritas.
Una vez se confirmó la inclusión del artículo en la revisión por el cumplimiento de
los criterios par incluirlos, se procedió con la consecución del manuscrito completo
para hacer la extracción de la información relacionada con la calidad de estudio. A
continuación se realizó la impresión del artículo completo para proceder a obtener
la información necesaria, la cual se extrajo separadamente por dos personas, uno
de los autores y otra persona ajena a los mismos, posteriormente se compararon
ambas bases de datos con el objeto de validar la extracción inicial de la
información y las inconsistencias fueron resueltas por el autor senior de la revisión.
Una vez obtenida la lista de referencias de cada base de datos, ésta fue exportada
al programa EndNote versión X7 (Thomson Reuters, New York, NY, USA) para la
eliminación de los duplicados y la revisión y el procesamiento de las citas
bibliográficas. Posteriormente, los datos correspondientes a la evaluación de la
calidad del estudio se tabularon usando el programa EpiData versión 3.1 (EpiData
Assoc., Odense, Denmark) y fueron transferidos a una tabla en el programa Excel
(Microsoft Corp., Redmond, WA, USA) para el análisis y tabulación de la
información.
94
3. RESULTADOS
Búsqueda de literatura. Al realizar la búsqueda con los términos mencionados, no
se encontraron resultados o referencias asociadas con los mismos, lo que indicó
una alta restricción con la combinación de términos utilizada. Por lo tanto con el fin
de lograr una menor restricción en la búsqueda y una mayor obtención de
estudios, se rediseñó la estrategia final de búsqueda mediante la utilización de las
siguientes palabras clave y conectores booleanos: (cytoplasmic droplet) AND
(boar), limitando la búsqueda a artículos de texto completo que contuviera las
palabras clave, bien fuera en el título o en el resumen, y sin restringir la fecha de
publicación.
Con las modificaciones introducidas en la combinación de términos para la
búsqueda, se encontraron 133 referencias, de las cuales se obtuvieron 57
referencias en el CAB ABSTRACTS, 39 en PUB MED, 20 en AGRICOLA y 17 en
SCIENCE DIRECT. Una vez revisadas, se eliminaron 70 referencias que estaban
citadas en dos o más bases de datos, quedando finalmente 65 estudios originales.
Posterior al análisis de la publicación, se procedió a realizar la revisión general del
resumen, con el fin de confirmar la pertinencia del estudio y la viabilidad de ser
incluido en la revisión; a continuación se seleccionaron y recuperaron en texto
completo 47 publicaciones, los cuales se imprimieron en su totalidad para
proceder a realizar la extracción de datos y su posterior análisis.
En la tabla 2, se muestran los 17 artículos que no pudieron obtenerse en texto
completo, y que fueron analizados el estudio por el contenido de su resumen.
95
Tabla 2. Artículos no recuperados en texto completo para la revisión sistemática
Autor (es) Año Factor identificado Motivo de no consecución (25) 2003 La Criptorquidia como generadora de
anormalidades espermáticas. Se reporta la presencia de GCs
No disponible a través de la biblioteca nuestra universidad
(6) 1992. El desarrollo de anormalidades morfologicas en cola. Se reporta presencia de CGs
No disponible a través de la biblioteca nuestra universidad
(26) 1975 Los cambios en membranas espermáticas. No se reporta presencia de GCs
No disponible a través de la biblioteca nuestra universidad
(27) 1975. El efecto de suministro de alpha-chlorohydrin sobre la fertilidad en semen: No se reoprta presentación de GCs
No disponible a través de la biblioteca nuestra universidad
(28) 1990 Caracterización de las GCs. No disponible a través de la biblioteca nuestra universidad
(29) 1996. La Fructuosa asociada a eliminación de GCs en epidídimo.
No disponible a través de la biblioteca nuestra universidad
(30) 1992. Los cambios en mofología espermática durante el paso por el epidídimo. Se reportan GCs.
No disponible a través de la biblioteca nuestra universidad
(31) 1980. Elementos que alteran la calidad seminal. No se reportan GCs
No disponible a través de la biblioteca nuestra universidad
(32) 1984. El paso por el epididimo como elemento asociado a cambios en estructura y eliminación de las GCc
No disponible a través de la biblioteca nuestra universidad
(33) 1988 Las anormalidades espermáticas en cola y su posible efecto genetico. Se reporta presencia de GCs
Idioma Japonés
(34) 1977. Las caracteristicas físicas de la preservación de semen. No se reoprta presencia de GCs
Tésis no disponible en la bases consultadas de nuestra universidad
(35) 1993. La suplementación con carotenos y su efecto sobre el semen. No hay reporte de GCs
Aleman
(36) 1985. Las alteraciones en la pieza intermedia de los espermatozoides. Se reporta presenncia de GCs
No disponible a través de la biblioteca nuestra universidad
(37) 1993 Los efectos de la suplementación con β-carotenos sobre la sangre y el semen. No se reportan GCs
Idioma Aleman
(38) 1990. Caracterización de espermatozoides con GCs.
No disponible a través de la biblioteca nuestra universidad
(39) 1997. El efecto de las estaciones climáticas sobre la generación de anormalidades en semen. Se reporta presentación de Gcs
No disponible en bases consultadas
(7) 1984 El estres calorico como generador de cambios en calidad seminal. No se reporta presentación de GCs
No disponible a través de la biblioteca nuestra universidad
96
Figura 1. Flujograma de las 133 citaciones encontradas originalmente en la búsqueda, exclusión de 70 referencias citadas en dos o más bases de datos, exclusión de las publicaciones no recuperadas e inclusión de 47 estudios a través del proceso de revisión sistemática.
La revisión sistemática mostró que los mayor parte de los artículos se publican en
idioma inglés, en los países de Estados Unidos, España, Japón, Inglaterra y
Alemania. En cuanto al año de realización del estudio, de los 47 trabajos
realizados, siete se publicaron en la década de los 70, diez en los 80, tres en los
Artículos obtenidos en la primera búsqueda: 133
Artículos duplicados: 70
Artículos seleccionados para revisar resumen: 63
Artículos obtenidos por búsqueda manual: 1
Artículos no recuperados: 17
Artículos analizados y recuperados en texto completo: 47
97
90 y entre el 2000-2010 se publicaron 14 estudios relacionados con el resultado
de interés.
Tabla 3. Factores asociados a la presentación de gotas citoplásmicas en porcinos, identificados en la literatura.
Factores Referencia Asociados con clima Clima (estación, primavera, verano), fotoperiodo (18, 40-42) Temperatura ambiental alta (7, 41, 43) Asociados con el macho Edad del verraco (14) Frecuencia eyaculación (10); (18) Alta Temperatura escrotal (44) Asociados con manipulación del semen Tiempo de almacenamiento del semen (45) Temperatura del semen (45) Asociados con calidad seminal Fragmentación de DNA y cromatina inestable. (13, 46) Cola corta (47) Cola enrollada (48) Reflejo distal (21) Plasma seminal (30, 49, 50) pH (50) Bioquímicos Capacidad de adhesión en epididimo (51, 52) Heprin binding (53) 15 Lipooxigenasa (9, 20, 54) Pseudorabia (55)
En la Tabla 3 se presentan los factores asociados con la ocurrencia de GCs en
machos porcinos activos reproductivamente. Los factores más reportados sobre la
ocurrencia de las GCs están relacionados con el clima, la elevada temperatura
ambiental, la presencia de lipooxigenasa, la frecuencia de eyaculación, la
capacidad de adhesión en epidídimo, la fragmentación de ADN. Adicional a estos,
se han estudiado otros factores como la morfología del espermatozoide,
temperatura escrotal, edad de los verracos, y temperatura del semen entre otras.
Tabla 4. Factores asociados y niveles críticos de afectación sobre la presentación de gotas citoplasmáticas en machos porcinos activos reproductivamente.
98
Factor Nivel de la afectación Relación de la
asociación Autor
Temperatura y humedad ambiental. Clima (estación, primavera, verano)
31,6 - 40,0°C 78% - 96% humedad relativa. Incremento de GCs por alta temperatura ambiental y humedad relativa, Verano.
Incremento de GCs
(18, 40-42, 56)
Fotoperíodo Baja luminosidad en otoño. Incremento en la presentación
GCs (57)
Edad Tendencia a mayor presentación de GCs en verracos adultos
Incremento en la presencia de
GCs con la edad.
(14)
Frecuencia eyaculación Mas de 2 eyaculaciones por semanas.
Incremento en la presentación
GC (10, 18, 58)
Tiempo de almacenamiento y temperatura del semen
Disminución de gotas a 15°C y 48 horas.
Disminución de GCs en semen
procesado (45)
Suminstro deTestosterona. Inyección de 250 - 500 mg.
Disminución en la incidencia de
las GCs (42)
Temperatura escrotal alta Temperatura escrotal superior a los 39°C
Incremento de GCs en
eyaculado (44)
Suministro de Selenio en dieta 0.5 ppm en alimento. Disminución de
las GCs (41, 59)
Fragmentación de DNA Espermatozoides con índice >15%.
Asociado a GCs
proximales. (13)
Cromatina inestable Espermatozoides con cromatina instrable > 5%.
Asociada a GCs (46)
Cola corta Defecto genético en semen Presencia de GCs (60)
Cola enrollada Asociada a gota Asociada a gota (48)
Pseudorabia Infección experimental. Incremento en la presentación
de GCs (55)
En la Tabla 4 se describen los factores asociados a la presentación de GCs con
sus respectivos niveles críticos asociados al efecto. El clima está relacionado de
manera frecuente con la presentación de GCs, a niveles de temperatura ambiental
mayores de 31.6°C, a humedad relativa mayor a 78%; seguido por la frecuencia de
99
eyaculación (recolecciones superiores a 2 eyaculados por semana) y la
disminución de GCs por el suministro de selenio en la dieta
4. DISCUSIÓN En el presente estudio se desarrolló un protocolo comprensible, sistemático y
aplicable a otras preguntas de interés para resolver por parte de diversos
investigadores. La estrategia de búsqueda incluyó bases de datos y resúmenes de
congresos, lo que no elimina la posibilidad que se hayan dejado por fuera algunos
estudios no publicados y otros que no fue posible recuperar completos, al
respecto, no es claro cómo su no inclusión haya podido afectar los resultados
obtenidos hasta el momento. Esta limitación es inherente al proceso de revisiones
sistemáticas y ha sido reportado que puede ocurrir (61).
Se considera a las GCs como la malformación seminal más frecuentemente
asociada con eyaculados de baja calidad y con bajos niveles de fertilidad en los
machos afectados, así mismo se reporta como la anormalidad más frecuente en
semen de machos porcinos destinados a inseminación artificial (1, 2, 50, 62) y.
Adicionalmente, se ha encontrado una alta variación en la frecuencia de
presentación de GCs entre machos, a lo largo de su la vida útil, así como y su
persistencia en otros (2, 3).
De acuerdo con esta revisión, los factores más frecuentemente asociados con la
presentación de GCs en porcinos, son los climáticos (estacionalidad, temperatura
ambiental y fotoperiodo) y la frecuencia de eyaculación de los verracos.
100
Respecto a los factores climáticos, en ocho de los estudios incluidos en la revisión
se encontraron reportes sobre asociaciones entre la prevalencia de GCs y
variables climáticas, de los cuales tres tocan directamente con el incremento de
las GCs en el verano, en países con estaciones, como Japón (18, 42, 56); otros
tres hacen referencia a una asociación positiva entre prevalencia de GCs y
temperatura ambiental y humedad relativa (7, 41, 43), en particular Larson y
Einarsson (1984) encontraron elevaciones manifiestas en el porcentaje de GCs
arriba de 31.60C y de 78% de humedad relativa; y los otros dos autores reportan
aumento de las GCs asociado a la disminución de las horas luz en el otoño (40,
57).
Con relación a la frecuencia de eyaculación, se encontraron reportes donde
verracos eyaculados con una frecuencia mayor a dos colectas por semana,
presentaron una mayor proporción de GCs, las cuales se consideran como signo
de inmadurez espermática (10, 63, 64).
Con respecto a los estudios analizados, la mayoría son descriptivos, se
caracterizan por representar un bajo nivel dentro de la escala de la evidencia
científica, pueden estar sujetos a sesgos de selección, no siguen un proceso
sistemático y aleatorio para la selección de las muestras, por lo cual no es posible
la determinación de la relación temporal entre la causa y el efecto debido al
proceso de selección de los casos de machos positivos a GCs. Un ejemplo de
esta causación reversa es la asociación entre la presencia de GCs y la actividad
enzimática (20, 65).
101
La información analizada se caracteriza por su amplia heterogeneidad y diversidad
de estudios, ninguno de los cuales se desarrolló bajo condiciones de explotación
comercial o involucrando animales dedicados a la producción intensiva de semen.
Se destaca la falta de estudios relacionados con las implicaciones económicas,
productivas y reproductivas de las GC en explotaciones comerciales o en centros
de producción comercial de semen.
Las gotas citoplásmicas (GCs) son la alteración espermática más frecuente
encontrada en semen de machos porcinos destinados a procesos de reproducción
controlada.
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106
CAPITULO III
Dynamics of porcine semen quality in the Western-Central region of Colombia
Germán Gómez-Londoño5, Henry Mesa6, Jonatan Sánches-Osorio-Moreno7, Francisco Javier Henao-Uribe8
Enviado para publicación a Theriogenology el 14 de mayo de 2014
ABSTRACT To characterize the dynamics of porcine semen quality in the Western-Central
region of Colombia, information of 1,017 assessments from 177 males from 12
swine farms located between 700 and 2,600 meters above sea level in different
inter-tropical systems was collected in the Laboratory of Reproductive Biology at
Universidad de Caldas, Colombia during seven years. The database included the
seminal variables: concentration, morphology (head, midpiece and tail), membrane
structural integrity (MSI), acrosome integrity (ACRI), and membrane functional
integrity (MFI). Additionally, the racial group of the male (grac): maternal cross
(cm), paternal cross (cp), paternal pure (pp), maternal pure (pm) and age group
(agegr): young (up to 18 months), mature (19 to 36 months) and old (over 37
months) were registered.
Data was explored by estimating descriptive statistics; it was analyzed using a log-
linear model consisting of a Poisson regression with a log link function: g(υ)=In(υ)
(using the PROC GENMOD of SAS (SAS Inst. Cary, NC). The effect of age group
and racial group on semen quality variables using a mixed model for repeated 5 Doctoral Degree Candidate, Doctorado en Ciencias Agrarias, Universidad de Caldas 6 Departamento Producción Agropecuaria, Universidad de Caldas 7 Departamento de Medicina y Cirugía Animal, Universidad de Murcia, Murcia, España. 8 Grupo Biología de la Producción Animal, Universidad de Caldas. Mail to: [email protected], Calle 65 Nº 26-10, Manizales, Colombia
107
measurements in the same boar over time were evaluated. The Spearman
correlation coefficients between variables were calculated. The variables: macro,
micro and pyriform head; double, eccentric, and thickened midpiece; tail whip;
ladder bow; ball and distal reflection showed less than 1% prevalence. The highest
values of MFI were found in cm and pp. Males cp, cm and pm do not differ from
each other in MFI, but all had higher values than pp. The ACRI in cm was higher
than cp, and these higher than pm. Presentation of TCD increased with age, with a
higher percentage of PCD in older animals than in younger animals; mature
animals showed intermediate values between them. The TCD exceeded 15% of
presentation, being always higher for PCD than for GCP. The TCD is negatively
correlated with MSI and ARCI, but positively correlated with MFI. The same trend
is observed in the correlations with distal cytoplasmic droplets. However, the
correlation of proximal droplets with the structural integrity loses significance,
though they are negatively correlated with acrosome integrity. Values for MSI, MFI
and ACRI, do not limit the quality of the samples in this population.
Key words: Boar sperm, semen analysis, semen quality, sperm.
1. INTRODUCTION
Colombia has an environmental diversity that puts most swine farms through
108
important differences related to altitude above sea level, temperature and humidity,
which added to a diversity of factors related to age and racial group of the male,
inherent characteristics of the administrative processes of each farm, and most
important, lack of knowledge of the dynamics of semen quality under these
conditions, hinder the development of programs for the control of fertility and
prolificity The pig industry in Colombia has not made intensive use of the available
technological possibilities to improve reproductive efficiency in boars.
The evaluation of semen quality is the tool that allows making an approximation to
the fertilizing potential of an ejaculate in a given time and allows discarding those
with low fertility [1, 2]. In artificial insemination programs it has been shown that the
measurement of a single variable is not a reliable indicator of semen quality, being
necessary an analysis of as many variables as possible [3]. Although some of
these variables are used to detect reproductive disorders that generate low fertility,
they are not useful to predict healthy boars’ fertility in which a proportion of
abnormal sperm in the ejaculate is accepted [4, 5]. The use of sperm with low
fertilizing capacity in artificial insemination programs, in which between 1,500 and
2,000 doses per male are used in a year [6], causes a decrease in the efficiency of
services, an increased return to estrus, the early disposal of replacement sows,
and, in general, a decreased reproductive efficiency in the farm [7, 8]. Therefore,
accounting on tools that allow a more accurate evaluation of semen quality in
addition to information of the reproductive behavior of males, allows making a
rational and appropriate use of breeding males. The aim of this study was to
characterize the dynamics of porcine semen quality in the Western-Central region
of Colombia.
109
2. MATERIALS AND METHODS At the Universidad de Caldas Reproductive Biology Laboratory, information of
1,017 evaluations obtained from 177 males from 12 swine farms located in the
Western-Central region of Colombia (Antioquia, Valle del Cauca, Risaralda, and
Caldas) which are located between 700 and 2,600 meters above sea level in
different inter-tropical ecosystems was collected for seven years (27 quarters, from
July 2005 to March 2012). The database included the seminal variables:
concentration, morphology (head, midpiece and tail), membrane structural integrity
(MSI), acrosome integrity (ACRI), and membrane functional integrity (MFI).
Additionally, males were classified into four racial groups (grac) depending on the
information supplied by commercial breeders: maternal cross (cm), paternal cross
(cp), paternal pure (pp), maternal pure (pm) and into three age groups (agegr):
young (up to 18 months), mature (19 to 36 months) and old (over 37 months).
2 .1 Semina l eva lua t ion techn iques
Sperm morphology was assessed in sperm fixed with formaldehyde saline solution
(NaCl + 2.25 g 249.25 mL of sterile distilled, deionized water + 0.75 mL
formaldehyde), using a X400 magnification phase contrast microscope.
Abnormalities present in 300 sperm head (loose, macro, micro, pyriform), midpiece
(double, bent), tail (short, bent, coiled, loose, looped, and doubled), and
cytoplasmic droplets (CD): proximal or distal, were counted [11]. The MSI was
110
assessed by staining with eosin nigrosin (E/N), for which 100 spermatozoa were
counted in a 400X magnification bright field microscope [12]. The MFI was
assessed using a short hypo-osmotic swelling test with subsequent fixation in
formaldehyde saline solution; positive spermatozoa were identified using a 400X
magnification phase contrast microscope after performing 2 counts of 100 sperm
each [9, 10]. The ACRI was assessed by fixation with 2% glutaraldehyde in BTS,
the number of sperm with normal apical ridge was recorded after counting 200
spermatozoa in a 400X magnification phase contrast microscope [11].
Concentration was measured using Bürker’s chamber, temperature was measured
with digital thermometer, and pH was measured using a glass electrode meter [12,
13]. All counts carried out were expressed as proportions for the final analysis.
2 .2 S ta t i s t i ca l ana ly s i s
Due to the non-normal distribution of the variables, they were analyzed using a log-
linear model: g(µ) = In(µ) consisting of a Poisson regression with a logarithmic link
function using PROC GENMOD of SAS (SAS Inst. Cary, NC). The effect of age
group and racial group on semen quality were assessed using a mixed model for
repeated measurements on the same boar. Results were reported as least square
means ± standard error. Due to the non-normal distribution of the variables, the
Spearman correlation coefficients were calculated among the seminal variables.
3. RESULTS
111
All data was initially screened by estimating descriptive statistics summarized in
Table 1. The variables: sperm head (loose, macro, micro, pyriform), midpiece
(double, bent), and tail (short, bent, coiled, loose, looped, doubled), had prevalence
lower than 1% (results not presented).
Table 1. Descriptive statistics of the seminal variables analyzed for 27 quarters
Mean Median Standard Deviation
Maximum Minimum
PCD, % 5.6 2.7 8.4 90.2 0 DCD, % 9.1 5.9 9.3 51.5 0 TCD, % 14.7 10.0 14.1 90.2 0 Normal, % 77.8 85.0 20.2 99.3 0 MSI, % 89.6 91.0 7.8 100 0 MFI, % 56.0 57.5 16.1 98.0 0 ACRI, % 86.8 89.5 14 100 0 Concentration, million ⋅ml-1
40.4 35.0 31.0 380.0 0
Distal Reflex 4.9 1.6 8.9 81.1 0 PCD = proximal cytoplasmic droplets, DCD = distal cytoplasmic droplets, TCD = Total cytoplasmic droplets, Normal = normal cell morphology, MSI = membrane structural integrity, MFI = membrane functional integrity, ACRI= acrosome integrity.
As showed in Table 1, half of the samples of diluted semen showed concentrations
greater than 35 million cells ⋅ml-1 (3.5 × 109 cells per dose of 100 ml), with values
exceeding 40 million ⋅ml-1 cells in the trimester comprising September, October and
November 2010 Figure 1).
112
Figure 1. Concentration of diluted semen samples received during 27 quarter. The line indicates the 30 million cells ⋅ml-1 target value.
As evidenced in Figure 2, the highest MSI values were found in pp and cm males,
with MSI values always above 80% during the evaluation period (Figure 3).
Figure 2. Percentage of sperm with membrane structural integrity (MSI) for different racial groups: cm = cross maternal, cp = cross paternal pm = pure maternal, pp = pure paternal. Different letters identify different means (P<0.05).
113
Figure 3. Percentage of sperm with structural integrity of the membrane (MSI) for 27 quarters. The line indicates the 80% threshold considered acceptable.
The percentage of MFI is shown in Figure 4; this variable remained higher than
50% most of the time during the 27 quarters analyzed.
Figure 4. Percentage of sperm with functional membrane integrity (MFI) during 27 quarters. The line indicates the 50% threshold considered acceptable.
114
Figure 5 depicts the behavior of MFI and its relationship with racial group. It is
evidenced that cp, cm, and pm males do not differ among themselves, but cp and
pm values were significantly higher than those of pp.
Figure 5. Percentage of sperm with functional membrane integrity (MFI) for different racial groups. cm = cross maternal cp = cross paternal pm = pure maternal, pp = pure paternal. Different letters identify different means (P <0.05)
The values of normal morphology sperm is shown in Figure 6; pp animals had a
higher percentage of normal cells than other racial groups analyzed, which did not
show differences from each other.
Figure 6. Percentage of morphologically normal sperm for different racial groups. cm = cross maternal, cp = cross paternal pm = pure maternal, pp = pure paternal. Different letters identify different means (P<0.05).
115
The ACRI percentage during the time of the study was above 80%, as evidenced
in Figure 7. The cm males showed the highest values for ACRI, while pp males
showed intermediate values between cp and pm (Figure 8).
Figure 7. Percentage of sperm with acrosomal integrity (ACRI) during 27 quarters. The line indicates the 80% threshold considered acceptable.
Figure 8. Percentage of sperm with acrosomal integrity (ACRI) for different racial groups. cm = cross maternal, cp = cross paternal pm = pure maternal, pp = pure paternal. Different letters identify different means (P<0.05). The percentage of TCD and its relationship with age is presented in Figure 9; we
did not detect significant differences among age groups for this variable.
116
Figure 9. Percentage of sperm with total cytoplasmic droplets (TCD) presence for different age groups. The presentation of PCD and its relationship with age is presented in Figure 10,
which shows a higher PCD percentage in older than younger animals, while
mature animals showed intermediate values among them.
Figure 10. Percentage of sperm with proximal cytoplasmic droplets (PCD) for different age groups. Different letters identify different means (P<0.05).
In Figure 11, the percentage of samples that would be rejected by excess of TCD
with different recommended thresholds in the literature can be observed. Even with
the most lenient (25%) threshold, almost 20% of the samples had TCD excess.
117
Figure 11. Percentage of samples for the presence of potentially rejected total cytoplasmic droplets (TCD), according to different reference thresholds.
Figure 12 shows DCD, PCD and TCD distribution percentage during the 27
quarters of the analysis. It can be seen how TCD frequently exceeded 15%, a
value considered limiting of reproductive performance. Likewise, DCD presentation
was always higher than PCD.
Figure 12. Percentage of spermatozoa with distal, proximal and total cytoplasmic droplets during 27 quarters.
118
Table 3 presents TDC, DCD and PCD coefficients correlation with normal and with
ACRI MSI, MFI. It is noteworthy that TCD is negatively correlated with the
membrane structural integrity and acrosome integrity, but positively correlated with
the membrane functional integrity. The same trend is observed in the distal
cytoplasmic droplets correlations. However, the correlation of proximal droplets
functional integrity loses strength and loses significance with functional integrity,
even though they are negatively correlated with the acrosome integrity. As
expected, the correlations of the number of normal cells with GCT, GCP and GCD
are high and negative.
MSI MFI NORMAL ACRI
TCD -0.11
(<0.01)
0.09
(<0.01)
-0.88
(<0.01)
-0.15
(<0.01)
DCD -0.09
(<0.01)
0.12
(<0.01)
-0.76
(<0.01)
-0.16
(<0.01)
PCD
-0.07
(0.04)
0.04
(0.29)
-0.65
(<0.01)
-0.10
(<0.01)
Table 3. Spearman correlation coefficients between the variables analyzed (significance in parentheses). TCD = total cytoplasmic droplets, DCD = distal cytoplasmic droplets, PCD = proximal cytoplasmic droplets, MSI = membrane structural integrity, MFI = membrane functional integrity, ACRI = acrosome integrity.
4. DISCUSSION
The incorporation of artificial insemination in the swine industry makes it necessary
to have reliable processes to obtain high quality semen to ensure optimal
reproductive performance, as well as information of the limiting variables when
using refrigerated semen [3].
119
The prevalence under 1% for macro, micro and pyriform head; midpiece (double,
bent), tail (short, bent, coiled, loose, looped, doubled) makes them irrelevant as
determinant quality factors of ejaculates in our study, and are consistent with
values reported in a previous work [14]. Likewise, the values found for MSI, MFI
and ACRI agree with previous reviews [15, 16] and are considered not limiting for
the quality of the samples in our study.
Half of the diluted semen samples that arrived in the laboratory were found to have
concentration higher than 35 million cells ⋅ml-1, which exceeds the recommended
3 × 109 cells per dose value [17, 18]. This shows poor quality control in the
preparation of doses for artificial insemination, compromising the samples’ lifetime
because of a diminished capacity of the extender to regulate pH and osmotic
pressure and to maintain cellular metabolism and microbial growth inhibition [4,
19].
In this study, a relationship of racial group with MSI was found (the highest values
were found in cm and pp males); however, other studies [20] did not find
differences when comparing Large White pigs with Kolbroek pigs. Boars cp and pm
showed higher MFI than pp males, while other studies found increased hypotonic
resistance of sperm in Pietrain than in Large White pigs [16].
120
Similar to our results, an evaluation of three racial groups in the Czech Republic
identified increased ACRI in breeding males from paternal origin [21]. Additionally,
ACRI values in cm presented a higher percentage than in cp, and those were
greater than pm, similar to other reports in which the normal acrosomes
percentage was higher in maternal line than in paternal lines [22, 23]. Similarly to
our results, a positive heterosis has been reported in Hampshire crossbred pigs
[24]. Semen quality genetic variability (motility, morphology, duration and ability to
fertilize) is questioned because many environmental factors make it difficult to
determine its genetic basis. However, semen quality is commercially important and
must be the subject of intense research to determine its heritability and its inclusion
in selection schemes [25].
It has been demonstrated that age affects the quality of the ejaculate [26], which is
consistent with our finding of a GCP higher percentage in older than younger
animals. In our analysis, TCD prevalence was close to 15%, a value considered
limiting for reproductive performance [27, 28]. Likewise, DCD presentation was
always higher than that of PCD, which is consistent with previous reports [15, 29].
It is pertinent to note that the presentation of PCD in sperm is associated with
mitochondria structural disorders, which can lead to mobility alterations [30]. The
negative and highly significant correlations of cytoplasmic droplets with MSI can be
attributed to the hydrolytic enzyme activity that immature sperm possess [31]. Non-
significant correlations of CD presentations with ACRI, and TCD and PCD with
MSI, could be attributed to the regional independence of the plasmatic membrane
and the sperm head [9]. In addition, the correlation between the DCD and MFI,
121
although low, was positive and significant, which may represent enzymatic
processes associated with the factors that affect sperm maturation during passage
through the epididymis, which alter the osmolarity pattern [31].
5. Conclusions
The values of morphologically normal spermatozoa with membrane structural
integrity, functional membrane integrity, and acrosome integrity were always higher
than the threshold considered acceptable; likewise, the variables: sperm head
(loose, macro, micro, pyriform), midpiece (double, bent), tail (short, bent, coiled,
loose, looped, doubled) had very low prevalence, making them of little importance
in semen quality control in the Western-Central region of Colombia. Half of the
diluted semen samples that arrived in the laboratory were found to exceed the
desirable concentration, which shows poor quality control in the preparation of
doses for artificial insemination.
The cytoplasmic droplets are the most frequent morphological alteration in semen
samples from farms in the Western-Central region of Colombia. A higher
presentation of cytoplasmic droplets was found as age increased; furthermore, the
distal cytoplasmic droplets presentation was always higher than proximal
cytoplasmic droplets. In this study, cytoplasmic droplets and structural integrity of
the membrane and the acrosome are negatively correlated. On the other hand, a
positive correlation between cytoplasmic droplets and the functional integrity of the
membrane was detected. These associations suggest that it is possible to make
122
different combinations of variables in a semen quality control process to determine
the number of functionally competent sperm in an attempt to obtain quick and
efficient reliable predictors of the fertilizing capacity of an ejaculate. This opens the
possibility to perform the quality control before the material is used in a large
number of females, with the easily foreseen economic benefits in such scheme.
So far, the causes and effects of GCs on the fertilizing capacity of sperm in
Colombia are not clearly understood. The need for a more detailed follow-up of
semen quality and associated factors will pinpoint the associations between in vitro
results and the reproductive and productive performance of swine farms.
Acknowledgements
Project founded by Vicerectoría de Investigaciones y Posgrados of Universidad de
Caldas, Colombia
123
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125
CAPITULO IV
Las gotas citoplásmicas y su relación con la capacidad fecundante en verracos del centro occidente de Colombia
Germán Gómez Londoño9, Henry Mesa10, Jonatan Sánches-Osorio Moreno11,
Francisco Javier Henao Uribe12
1. INTRODUCCIÓN
El desconocimiento de la dinámica de la calidad seminal en programas de
inseminación artificial, asociado a la gran heterogeneidad en infraestructura,
bioseguridad, planes sanitarios, alimentación, administración, genética,
alimentación y ubicación geográfica (altitud sobre el nivel del mar, temperatura
ambiental y humedad relativa), son factores que someten a las granjas porcinas a
diferencias sustanciales que afectan de manera significativa la calidad seminal y
dificultan el desarrollo de programas eficientes de control de la fertilidad y
prolificidad (Ardón et al., 2005; Gadea et al., 2004).
De acuerdo con trabajos realizados por Amann (1989) y Ax et al. (1989), las
evaluaciones convencionales de calidad seminal in vitro son herramientas que
permiten hacer una aproximación al potencial fertilizante de un eyaculado en un
momento dado; Turba et al. (2007) proponen que una mejor aproximación a este
se logra mediante un análisis integral de diferentes variables, tantas como sea
9 Estudiante de Doctorado, Doctorado Ciencias Agrarias, Universidad de Caldas 10 Departamento de Producción Agropecuaria, Universidad de Caldas 11 Departamento de Medicina y Cirugía Animal, Universidad de Murcia, Murcia, España. 12 Grupo de investigación Biología de la Producción Pecuaria, Universidad de Caldas. Correspondencia: [email protected], Calle 65 Nº 26-10, Manizales, Colombia
126
económicamente posible. Diversos autores han abordado la relación entra la
calidad seminal y la capacidad fecundante de los espermatozoides,
particularmente en variables como la integridad del acrosoma (Flowers, 2002;
Rozeboom et al., 2000), la movilidad espermática (Broekhuijse et al., 2012; Holt et
al., 1997) y la tasa de fragmentación del ADN (López-Fernández et al., 2008;
Perez-Llano et al., 2006). Del mismo modo, en otros frentes, se ha logrado
establecer algún nivel de asociación con indicadores de fertilidad como tamaño de
camada y tasa de retorno (Sutkevičienė and Žilinskas, 2004).
Las GCs son la alteración morfológica más frecuente en machos porcinos
destinados a procesos de reproducción controlada (Fischer et al., 2005; Gómez,
2010), una alta presencia de estas se encuentra asociada a bajo desempeño
reproductivo de los machos afectados (Althouse, 1998; Fischer et al., 2005).
Kaplan et al. (1984) describen las GCs como vesículas residuales del citoplasma,
de 2 µm de diámetro, que según su ubicación en la pieza intermedia se clasifican
como proximales o distales, (Bonet et al., 1993; Bonet et al., 1992; Larsson and
Einarsson, 1984). En condiciones normales las GCs son eliminadas, en alta
proporción en el epidídimo, antes, (Briz, 1996) durante (Fischer et al., 2005) o
inmediatamente después de la eyaculación (Pruneda et al., 2005); también
pueden encontrarse libres en el eyaculado (Kaplan et al., 1984). De acuerdo con
reportes realizados Briz (1996) se considera que un eyaculado es inviable cuando
las GCs se encuentran en una proporción superior al 15%.
La presentación de GCs ha sido asociada por diversos autores a variables
climáticas, en especial se incrementan en el verano en países con estaciones (de
Serrano et al., 1989; Nakayama et al., 1991; Suriyasomboon et al., 2005);
127
temperatura ambiental y humedad relativa, donde por encima de 31,60C y de 78%
de humedad, se aumenta la presentación de GCs, (Echeverria-Alonzo et al., 2009;
Kuster et al., 2004; Larsson and Einarsson, 1984); la disminución de horas luz en
otoño, las cuales elevan su presentación. Además también se reportan
asociaciones a variables como la edad de los reproductores (Kondracki et al.,
2005), donde se evidencia incremento de GCs a mayor edad de los verracos;
frecuencia de eyaculación en especial cuando se realizan mas de dos colectas de
semen por semana, (Bonet, 1987; Frangez et al., 2005; Pruneda et al., 2005); y la
fragmentación de ADN, reportada por López-Fernández et al.(2008) en España,
quien se encontró una asociación positiva entre los valores de fragmentación del
ADN y las Gotas citoplásmicas proximales (GCP).
El objetivo del presente trabajo es la descripción de la calidad seminal y de los
factores asociados a ella, con énfasis en las GCs, en centros de inseminación
artificial del centro occidente colombiano.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
Por un periodo de 9 meses, con intervalos de 45 días, se recopiló información
procedente de 6 granjas porcinas en el centro-occidente de Colombia, a una
altitud comprendida entre los 920 y los 2600 metros. Durante dicho periodo, la
calidad seminal de 72 verracos ubicados en dichas granjas fue evaluada en el
laboratorio de Biología de la Reproducción de la Universidad de Caldas. Las
muestras de semen se colectaron y diluyeron en cada granja entre las 5 a.m. y las
128
9 a.m., se transportaron el mismo día al laboratorio a una temperatura constante
170C, para proceder a su análisis inmediatamente arribaron al laboratorio.
Con el fin de identificar los factores asociados a la presentación de las GCs se
utilizó una ficha de seguimiento de los machos en cada granja, la cual contempló:
granja (ubicación, altura sobre el nivel del mar), edad del macho, grupo racial del
macho, operario, hora de toma de la muestra, frecuencia de eyaculación, eventos
sanitarios (vacunaciones, vermifugaciones, medicamentos, suplementos) y
eventos relacionados con alimentación. Se realizaron mediciones diarias de la
temperatura ambiental y la humedad relativa de cada granja, a las 07:00, 13:00 y
19:00 horas. En la Tabla 1 se indica el número de granjas, su ubicación y el
numero de machos involucrados en el estudio granjas el número de machos
involucrados es el estudio.
Tabla 1. Número de machos muestreados en cada granja.
Granja Macho Ubicación 1 22/20 Cartago 2 16/17 La unión 3 13/34 Marsella 4 6/5 Marsella 5 8/7 Risaralda 6 7/5 Villa María
2 .1 TÉCNICAS DE EVALUAC IÓN SEMINAL
La morfología espermática fue evaluada en semen fijado con solución salina
formolada (2,25 g NaCl + 249,25 ml de agua estéril, destilada y desionizada + 0,75
ml formol), mediante microscopio de contraste de fases con magnificación de
400X. Se contaron las anomalías presentes en 100 espermatozoides incluyendo
129
alteraciones en la cabeza (suelta, macro, micro, piriforme), tracto intermedio
(doble, lazo, engrosado), cola (látigo, lazo, ovillo, escalera y cola suelta) y gota
citoplásmica (distal, proximal) (Freshman, 2002). La Integridad Estructural de la
Membrana (IEM) se evaluó mediante fluorescencia con Yoduro de Propidio y
SYBR-14, en microscopio Nikon eclipse 80i equipado con epifluorescencia a
1000X de magnificación (Garner and Johnson, 1995). Para la valoración de la
movilidad (MOV) y la concentración (CON) se utilizó un equipo Sperm Class
Analyzer® (SCA®) de la casa comercial Microptic, se evaluó movilidad progresiva
(MOVPROG) y movilidad total (MOVTOTAL) (Quintero-Moreno, 2003); la
concentración espermática se determinó además con cámara de Bürker. La
fragmentación se evaluó usando el kit Halotech® con un microscopio de campo
claro a 400X. La Integridad Funcional de Membrana (IFM) se evaluó mediante una
prueba corta de hinchazón hipo osmótica y posterior fijación en solución salina
formolada; se identificaron los espermatozoides positivos utilizando un
microscopio de contraste de fases con magnificación 400X luego de realizar un
conteo de 100 espermatozoides cada uno (Perez-Llano et al., 2001). La Integridad
Acrosómica (IAC) fue evaluada mediante fijación con glutaraldehído al 2% en
BTS, se registró el número de espermatozoides con cresta apical normal después
de contar 100 espermatozoides en microscopio de contraste de fases con
magnificación 400X (Pursel et al., 1972); la temperatura de llegada de las
muestras al laboratorio se determinó con termómetro digital y el pH mediante un
medidor con electrodo de vidrio (Henao et al., 2010; Johnson et al., 2000). Los
130
resultados de los conteos espermáticos realizados se expresaron en proporciones
para el análisis final.
2 .2 ANÁL IS I S ESTADÍST ICO
Debido a la distribución no normal de los datos y a que las mediciones de las
variables analizadas consistieron en conteos de casos (alteraciones en cabeza,
tracto intermedio, cola y membranas) en una población de células espermáticas,
se utilizó un modelo log-lineal consistente en una regresión Poisson con una
función de enlace logarítmica de la forma g(µ) = In(µ) usando el PROC GENMOD
de SAS (SAS Inst. Cary, NC). Se evaluó el efecto de granja (bloque), grupo etáreo
y grupo racial, y la interacción lineal de grupo etáreo por grupo racial, sobre las
variables de calidad seminal, incluyendo el efecto aleatorio de individuo para
mediciones repetidas en el mismo verraco. Adicionalmente, y nuevamente debido
a la distribución no normal de los datos obtenidos, se estimaron los coeficientes de
correlación de Spearman entre las variables seminales. Con los registros de
temperatura ambiental y de humedad relativa se calcularon promedios semanales,
los que mediante análisis de correlación de Spearman se evaluaron con las
variables seminales medidas dos semanas después del registro climático.
Se evaluaron los factores asociados a la presentación de GCs, para identificar las
variables que en cada granja fueron determinantes de las diferencias en calidad
seminal, se utilizó el programa estadístico STATA verión 13.1 (StataCorp. College
Station, TX) mediante análisis de correlación y de regresión, se evaluó el efecto de
131
grupo racial del macho, edad y frecuencia de eyaculación, operario del proceso,
día y hora de eyaculación, eventos sanitarios (vacunaciones, vermifugaciones,
medicamentos, suplementos) y eventos relacionados con alimentación del macho,
sobre GCP, GCD y GCT.
En cada granja se identificaron los machos denominados persistentes, definidos
como aquellos que presentaron durante tres muestreos consecutivos una
frecuencia de GCs ≥ 15%.
3. RESULTADOS Las estimaciones de la estadística descriptiva de los datos analizados estadísticos
se muestran en la Tabla 2, donde se destaca que la presentación de GCT es
levemente superior al 15% y que hubo individuos con valores de GCT hasta de del
85% .Adicionalmente, se encontró que el 50% de las muestras de semen diluido
analizadas presentaron concentraciones superiores a 30x109 células por dosis.
Tabla 2. Estadísticos descriptivos de las variables seminales analizadas durante 9 meses en seis granjas del centro occidente de Colombia
Variables Promedio Mediana Desviación estándar
Error estándar Máximo Mínimo
GCP, % 7,1 3,0 9,7 0,6 52,0 0 GCD, % 8,3 4,0 10,5 0,6 63,0 0 GCT, % 15,4 9,0 15,4 0,9 85,0 0 NORMALES, % 72,3 76,0 15,8 1,0 97,0 8,0 IEM, % 85,7 88,0 9,1 0,6 99,0 40,0 IFM,% 62,5 65,0 14,3 0,9 94,0 11,0 IAC, % 88,9 90,0 6,5 0,4 98,0 49,0 Concentración, millones por ml 33,4 30,0 15,3 0,94 115,5 0,0
DFI, % 0,18 0,02 0,26 0,02 0,8 0,0 Movilidad progresiva 65,7 67,6 14,3 0,8 92,9 11,0
Movilidad total 80,3 82,7 11,6 0,71 99,3 34,2 GCP= gotas citoplásmicas proximales, GCD= gotas citoplásmicas distales, GCT= total de gotas citoplásmicas, Normales= células de morfología normal, IEM=integridad estructural de la membrana, IFM= integridad funcional de la membrana, IAC= integridad acrosómica, DFI= índice de fragmentación.
132
En la misma tabla se evidencia como las variables morfológicas: cabeza macro,
micro y piriforme; tracto intermedio doble, excéntrico y engrosado; cola en látigo,
lazo, escalera ovillo y reflejo distal, presentaron valores inferiores al 1%.
En la Figura 1 se presenta el comportamiento de seis variables analizadas durante
los seis muestreos realizados. Se puede observar las GCs inician con un
porcentaje de incidencia del 20%, y van descendiendo a partir del segundo y
tercer muestreo para estabilizarse alrededor del 18% en el tercer muestreo. Los
valores restantes como IFM, IAC, GCT, e IEM, se encuentran por encima del 60%;
los valores de DFI se encuentran en valores por debajo del 5%.
Figura 1. Comportamiento de las variables analizadas durante los seis muestreos. IFM= Integrida funcional de membrana; IAC= Integridad Acrosómica; GCT= Gotas citoplásmica tota; IEM= Integridad estructural de membrana; Movilidad total; DFI= Fragmentación ADN.
133
En la Tabla 3 se presentan los coeficientes de correlación de Spearman de
GCs. de GCD, GCP, y GCT, con IDF, IEM, NORM, IFM, IAC, MOVPROG y
MOVTOTAL en las seis granjas analizadas durante los nueve meses. En el
presente trabajo se encontró que las GCP y las GCT presentaron una correlación
negativa, aunque baja, con IAC de (-0,13 y 0-016) respectivamente; se encontró
ausencia de significancia (P>0,05) entre la presencia de gotas y las variables IDF,
IEM, IFM, MOVPROG y MOVTOTAL. Como es de esperarse, la correlación de
GCD, GCP y GCT con espermatozoides normales fue alta y negativa.
Tabla 3. Coe f i c ien tes de cor re lac ión de Spearman de GCs y las va r iab les de ca l idad semina l ana l i zadas (s ign i f i canc ia en t re parén tes is ) .
Gotas IDF IEM NORM IFM IAC MOVPROG MOVTOTAL
GCD 0,14
(P>0,05) -0,04
(P>0,05) -0,57
(<0,01) -0,09
(P>0,05) -0,09
(P>0,05) 0,00
(P>0,05) 0,06
(P>0,05)
GCP 0,01
(P>0,05) 0,04
(P>0,05) -0,52
(<0,01) 0,03
(P>0,05) -0,13 (0,02)
-0,05 (P>0,05)
-0,01 (P>0,05)
GCT 0,09
(P>0,05) -0,01
(P>0,05) -0,69
(<0,01) -0,04
(P>0,05) -0,16
(<0,01) -0,03
(P>0,05) 0,05
(P>0,05)
GCT= total de gotas citoplásmicas, GCD= gotas citoplásmicas distales, GCP= gotas citoplásmicas proximales, IDF=índice de fragmentación, NORM=normales IEM=integridad estructural de la membrana, IFM=integridad funcional de la membrana, IAC=integridad acrosómica, MOVPROG=movilidad progresiva, MOVTOTAL= movilidad total; ns= no significativo (P>0,05)
El comportamiento de GCs durante los nueves meses en las seis granjas
evaluadas, se presenta en la Tabla 4. Se puede apreciar como en las granjas uno,
dos y cinco, se encuentra una alta presentación de GCs; particularmente la granja
dos mostro en dos muestreos consecutivos porcentajes de presentación de GCs
superiores al 40%, y en los tres restantes se encontró por encima del 25%. Por el
contrario la granja tres, se caracterizó por presentar en los seis muestreos una
134
incidencia inferior al 7,9%. En la granja cuatro, solamente en el primer muestreo
se encontró una presentación de GCs del 16,75%.
Tabla 4 Presentación de GCs durante los seis muestreos en las granjas analizadas durante nueve meses. Muestreo Granja 1 Granja 2 Granja 3 Granja 4 Granja 5 Granja 6
Media Error estándar
Media Error estándar
Media Error estándar
Media Error estándar
Media Error estándar
Media Error estándar
1 17,50 0,064 41,00 0,059 7,90 0,11 16,75 0,12 24,50 0,10 22,75 0,11
2 20,00 0,062 40,00 0,053 5,60 0,13 8.00 0,18 22,50 0,11 3,33 0,32
3 15,90 0,067 25,50 0,06 5,70 0,14 9.33 0,19 18,25 0,12 4,50 0,24
4 12,90 0,077 27,60 0,06 7,33 0,12 6,33 0,23 23,00 0,12 3,75 0,26
5 12,40 0,078 22,50 0,07 4,75 0,12 9,00 0,17 18,00 0,120 12,25 0,14
6 12,00 0,072 28,90 0,07 7,75 0,13 6,50 0,20 12,50 0,120 4,75 0,23
En la Figura 2, se muestra el comportamiento de las GCT en las seis granjas
evaluadas durante los seis muestreos. Se evidencia como las granjas uno y dos,
siempre presentaron porcentajes de GCs superiores al 15% durante todos los
muestreos; la granja cinco, durante los tres primeros muestreos presento
constantemente valores superiores al 15%, pero a partir del tercer muestreo la
presentación de GCs disminuyó por debajo de la cifra anterior; las granjas cuatro y
seis, iniciaron el primer muestreo con valores cercanos al 20% y para el segundo
muestreo se estabilizaron con valores siempre por debajo del 15%.
135
Figura 2. Comportamiento de las GCT durante los seis muestreos en las granjas evaluadas
En la Figura 3 se indican los valores promedio de GCP, GCD y GCT en las seis
granjas, durante los seis muestreos realizados. Se puede observar como el
porcentaje de CGT al iniciar los muestreos se encuentra alrededor del 17 %, pero
a partir del segundo muestreo este baja a niveles del 14% para estabilizarse
alrededor del 12%. Con respecto a la GCD y GCT, se observa como el porcentaje
de GCD inicia en el 10% y desciende hasta el muestreo tres y cuatro, para
incrementarse en el quinto y sexto y terminar alrededor del 7%. Las GCP por el
contrario, se incrementan ligeramente entre el primero y segundo, descienden
simultáneamente con las GCD hasta el cuarto muestreo, y continúan
descendiendo para estabilizarse en el quinto y sexto en valores cercanos al 4%.
136
Figura 3. Comportamiento de las gotas citoplásmicas durante nueve meses, en los seis muestreos realizados.
En la Tabla 5, se presenta el porcentaje de muestras que potencialmente podrían
ser rechazadas por gotas GCT en diferentes porcentajes de presentación, en las
seis granjas porcinas involucradas en el trabajo. Se evidencia como las granjas
uno, cinco y dos presentan, respectivamente los niveles mas altos de rechazo, y
las granjas tres, seis y cuatro, presentan los niveles mas bajos de rechazo por
gotas totales.
Tabla 5 Porcentaje de muestras potencialmente rechazables con presencia de GCT en seis planteles porcinos, ubicados en el centro occidente de Colombia.
En el presente trabajo se encontró que de los 72 machos evaluados durante los
nueves meses en las seis granjas, 14 verracos ubicados en tres granjas
presentaron persistencia de GCs; los criterios de selección para los verracos con
Granja Machos Número
de Muestras evaluadas
Porcentaje de muestras Rechazables
al 15%
Porcentaje de muestras Rechazables
al 20%
Porcentaje de muestras Rechazables
al 25 % 1 22 83 77,4 64,2 56,6 2 16 53 38,6 26,6 16,9 3 13 63 6,4 1,6 1,6 4 6 22 18,2 9,1 4,6 5 8 25 52,0 32,0 28,0 6 7 24 16,7 8,3 4,2
Total 72 270 36,3 25,6 20,0
137
persistencia de GCs fueron el de contar con mínimo tres muestreos y presentar
niveles de GCs superiores al 15% en tres muestreos consecutivos.
La Figura 4 muestra la persistencia de GCs en machos de las tres granjas con
mayor presentación de GCT, durante los seis muestreos realizados. En la granja
uno, se evaluaron 15 machos con mas de tres muestreos, de los cuales, cuatro
presentaron persistencia de GCs; en la granja dos 11 machos estuvieron
presentes en la totalidad de las evaluaciones y siete fueron persistentes y
finalmente en la granja cinco, ocho verracos tuvieron mas de tres muestreos, de
los cuales tres fueron persistentes.
Al analizar el comportamiento de los verracos, se encontró como en la granja uno
los machos F1028 y F1423, mostraron un comportamiento similar, con valores
siempre superiores al 15% en los seis muestreos; el macho X1422, en tres
muestreos, presentó valores mayores al 54%; el macho F2156, redujo
constantemente la presentación de GCs durante los muestreos, pero terminó con
30% de GCs; en la granja dos, se aprecia que seis machos presentan un
comportamiento irregular en la presentación de GCs, con valores entre 17% y
56%; el macho F2187, presentó siempre valores por encima del 31%; en la granja
cinco, dos machos presentaron valores entre 8% y 30%, y en un macho se registró
en tres muestreos valores superiores al 40%.
138
Figura 4. Machos con persistencia de GCs en las seis granjas analizadas, durante los seis muestreos. En la Figura 5 se presenta el comportamiento de GCs y las variaciones de
temperatura ambiental y humedad relativa, durante las seis evaluaciones
realizadas. Se observa un descenso en la presentación de GCs en todas las
139
granjas a partir de la segunda evaluación. El comportamiento de la temperatura
ambiental en todas las granjas es relativamente estable, por el contrario el de la
humedad relativa presenta fluctuaciones permanentes. La granja dos presentó los
valores de temperatura más altos, en comparación con las demás. No se aprecia
una asociación entre los fluctuaciones de temperatura ambiental, humedad relativa
y GCs.
140
Figura 5. Comportamiento de la presentación de GCs, Temperatura y humedad relativa en las seis granjas evaluadas. En la Tabla 6 se presenta los coeficientes de correlación de Spearman entre el
promedio de temperatura ambiental y humedad relativa y de los valores mínimos y
máximos para las dos semanas previas a la eyaculación con los indicadores de
141
calidad seminal. Se puede apreciar que cuando la temperatura ambiental
promedio aumenta, se incrementa el porcentaje de GCD, GCP y GCT. Se observa
una correlación negativa entre la presencia de gotas, y la humedad máxima. La
humedad promedio no presento efecto significativo sobre la presentación de las
gotas, y la presencia de GCD no mostró significancia con la humedad mínima.
Adicionalmente, se presentó correlación negativa entre la presencia de GCD, GCP
y GCT y la humedad máxima. También se aprecia una correlación negativa entre
la temperatura ambiental promedio con IAC, IEM y espermatozoides normales. La
MOVPRO, MOVTOTAL e IFM no son afectadas por la temperatura promedio.
También se evidencia que al aumentar la humedad relativa promedio, la IEM
disminuye y la movilidad espermática e IFM aumentan. La temperatura ambiental
y la humedad relativas máxima disminuyen la MOVTOTAL, aunque
aparentemente cuando las temperaturas y humedades mínimas suben se
favorecen los valores de MOVTOTAL y MOVPROG
142
Tabla 6 Coef i c ien tes de cor re lac ión de Spearman (va lo r de P) en t re va r iab les c l imá t i cas y semina les .
IEM GCD GCP GCT Normales IFM IAC MOVPROG MOVTOTAL
Temperatura Promedio
-0.19 (<0.01)
0.37 (<0.01)
0.29 (<0.01)
0.41 (<0.01)
-0.34 (<0.01)
0,04 0,05
-0.24 (<0.01)
0,02 0,05
0,12 0,05
Humedad Promedio
-0.12 (>0,05)
-0,06
(>0,05)
0,02
(>0,05)
0,01
(>0,05)
0,09
(>0,05) 0.24
(<0.01) 0,01
(>0,05) 0.19
(<0.01) 0.16
(0.02)
Temperatura Máxima
-0.22 (<0.01)
0.24 (<0.01)
0.21 (<0.01)
0.26 (<0.01)
-0.18 (<0.01)
0,01
(>0,05) -0.20
(<0.01) -0.12
(>0,05) -0,04
(>0,05)
Humedad Máxima
0,2
(>0,05) -0.18
(<0.01) -0.21
(<0.01) -0.27
(<0.01) 0.22
(<0.01) 0,03
(>0,05) 0.24
(<0.01) 0,02
(>0,05)
-0,05
(>0,05)
Temperatura Mínima
-0.12 (>0,05)
0.34 (<0.01)
0.28 (<0.01)
0.41 (<0.01)
-0.37 (<0.01)
0,07
(>0,05) -0.21
(<0.01) 0.16
(0.02) 0.23
(<0.01)
Humedad Mínima
-0.14 (0.04)
-0,08
(>0,05) 0.14
(0.03) 0.18
(<0.01) -0,07
(>0,05) 0.29
(<0.01) -0.21
(<0.01) 0.15
(0.03) 0.15
(0.03)
IEM=integridad estructural de la membrana GCD= gotas citoplásmicas distales, GCP= gotas citoplásmicas proximales, GCT= total de gotas citoplásmicas, Normales= células de morfología normal, IFM= integridad funcional de la membrana, IAC= integridad acrosómica, MOVPROG=movilidad progresiva, MOVTOTAL=Movilidad total; ns= no significativo (P>0,05).
En el estudio observacional realizado en las seis granjas con el fin de identificar
los factores asociados a la presentación de GCs, al estratificar el análisis por
granja se encontró que ninguna de las variables analizadas en la granja
(ubicación, temperatura ambiental, humedad relativa, altura sobre el nivel del mar),
los machos (edad y genotipo), el operario, las hora de recolección de la muestra
(a.m., p.m.), la frecuencia de eyaculación, los eventos sanitarios (vacunaciones,
vermifugaciones, medicamentos, suplementaciones vitamínicas o minerales) y el
tipo de alimentación, explicaron las diferencias en la presentación de las GCs.
143
DISCUSIÓN
En el presente trabajo, se encontró que la presentación de GCT fue del 15,4%,
valor calificado como limitante del desempeño reproductivo de los machos
(Althouse et al., 1998; Lovercamp et al., 2007) y que concuerda con reportes
realizados anteriormente por Bonet et al. (1992) y Gómez (2010) (Bonet et al.,
1992; Gómez, 2010) quienes encontraron valores similares; así mismo la
presentación de las GCD siempre fue mayor que las de las GCP, hallazgo que
reportado en trabajos previos (Fischer et al., 2005; Gómez et al., 2014). La
correlación negativa (-0.13 y -0.16 respectivamente) encontrada entre GCP y GCT
con Integridad del acrosoma, concuerda con resultados reportados previamente
(Fischer et al., 2005; Gómez, 2010; Perez-Llano et al., 2009), y puede ser atribuida
a la independencia funcional entre los diferentes dominios de la membrana
espermática (Perez-Llano et al., 2001). La ausencia de correlación encontrada el
presente estudio entre GCP, GCD y GCT con el IDF, difiere con reportes previos
realizados en España, donde se encontró una asociación positiva entre los valores
de fragmentación del ADN y las GCP (López-Fernández et al., 2008).
En el actual estudio, no se encontró correlación significativa entre presencia de
gotas (GCD, GCP y GCT) e IEM, contrario a reportes realizados previamente
(Gómez et al., 2014; Kuster et al., 2004); con la IFM, en la que se ha reportado
asociación negativa con las GCD (Gómez et al., 2014; Kuster et al., 2004); y con la
MOVPROG y la MOVTOTAL, donde se ha evidenciado que el desarreglo de las
estructuras mitocondriales generado por las GCP afectan la movilidad (Briz et al.,
1995; Briz, 1996).
144
En el presente estudio se evidenció la presencia de GCs en niveles superiores al
15% en el 67% de las granjas evaluadas, en las cuales se alcanzaría un nivel de
descarte del 36% de las muestras analizadas por presencia de GCs; el resultado
anterior concuerda con reportes previos de Waberski et al. (1994), y Althouse,
(1998) quienes recomiendan que el máximo de CGs no debe sobrepasar el 15%
para semen diluido refrigerado, ya que se encuentra una correlación negativa con
la taza de preñez y la el tamaño de camada.
Se encontró en el actual trabajo el 20% de machos con persistencia de GCs, estos
verracos están presentes en 50% de las granjas; adicionalmente también se pudo
evidenciar una gran variabilidad en el porcentaje de GCs a través de las diferentes
evaluaciones, tanto entre granjas como entre y dentro de verracos; los hallazgos
concuerda con lo reportado previamente por Lovercamp et al.(2007), quienes
encontraron diferencias en la presentación de GCs en verracos en distintas
épocas del año; y con trabajos de Althouse (1998) y Diaz et al. (2009), en donde la
persistencia de GCs esta asociada con la avanzada edad de los machos y con
exposición a altas temperaturas ambientales por periodos superiores a cuatro
semanas (Cameron and Blackshaw, 1980) y con una frecuencia de eyaculación
superior a dos colectas por semana (Bonet, 1987; Frangez et al., 2005; Pruneda et
al., 2005).
En este trabajo se evidenció una correlación positiva de temperatura ambiental y
correlación negativa de humedad máxima relativa con GCD, GCP y GCT, lo
anterior no coincide con lo reportado en reportes realizados en verracos de
Tailandia, donde se determinó el efecto negativo de alta temperatura ambiental y
alta humedad relativa sobre la calidad seminal al generar incrementos en la
145
presentación de GCs, (Suriyasomboon et al., 2004); en en cerdos Yorkshire en
india en diferentes estaciones (Pandey, 1997) y en Japón durante el verano
(Nakayama et al., 1991). En el presente estudio se encontró que la temperatura
ambiental afectó negativamente la IAC y la IEM, situación reportada en estudios
previos realizados por Knecht el al. (2014) y por Wettemann et al. (1976). Con
relación a la movilidad espermática, en el presente trabajo se encontró que esta
no se ve afectada por la temperatura ambiental promedio, lo anterior discrepa con
reportes previos donde temperaturas ambientales superiores a 33.40C reducen la
movilidad espermática (Cameron and Blackshaw, 1980), y con trabajos donde
extremos de temperatura y humedad disminuyen la movilidad espermática
(Tretipskul et al., 2012); pero discrepa con los resultado expuestos por Henao et
al. (2004) quienes no encontraron efecto de la temperatura ambiental elevada
sobre esta variable.
En el estudio observacional, ninguno de los factores analizados como: grupo racial
del macho, edad y frecuencia de eyaculación, operario, día y hora de eyaculación,
eventos sanitarios (vacunaciones, vermifugaciones, medicamentos, suplementos)
y tipo de alimentación, logró explicar las diferencias en la presentación de GCP,
GCD y GCT entre las granjas estudiadas. Este hallazgo es contrario a reportes
previos en los que la edad (Díaz et al., 2009), y el genotipo del macho (Gómez,
2010) y la frecuencia de eyaculación (Pruneda et al., 2005; Suriyasomboon et al.,
2005; Suriyasomboon et al., 2004), la temperatura ambiental y humedad relativa,
superiores a 31,60C y a 78% de humedad, aumentan la presentación de GCs,
(Echeverria-Alonzo et al., 2009; Kuster et al., 2004; Larsson and Einarsson, 1984).
146
CONCLUSIONES Las gotas citoplasmáticas son la alteración morfológica más frecuente en
muestras de semen procedentes de granjas en el centro-occidente colombiano. Se
evidenció correlación positiva de temperatura ambiental y correlación negativa de
humedad relativa máxima con la presentación de las GCs.
Hay diferencias en la presentación de GCs entre granjas, las cuales no fueron
explicadas por efectos nutricionales, sanitarios, raciales, etáreos, o de frecuencia,
hora de eyaculación u operario que realizó el proceso.
La baja frecuencia de las anormalidades de cabeza, tracto intermedio y cola, así
como los valores aceptables de espermatozoides morfológicamente normales, con
integridad estructural de membrana, integridad funcional de membrana, y con
integridad acrosómica, hace esta variables no limitantes de la calidad seminal en
los centros de inseminación del centro-occidente colombiano.
Los centros de inseminación tienen que realizar esfuerzos encaminados a mejorar
el control de calidad, la cualificación de sus técnicos y operarios y el registro de
información confiable, que permita cuantificar y prevenir los efectos de las GCs
sobre la eficiencia reproductiva, productiva y económica en la porcicultura
colombiana.
147
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151
CAPITULO V
DISCUSIÓN GENERAL En el cerdo la evaluación convencional “ in vitro” de la calidad seminal
t iene baja relación con los resultados de ferti l idad en campo, su valor
esta determinado fundamentalmente por la información que aporta
sobre el estado de un eyaculado en un momento dado (Gadella et al.,
2008; Ruiz-Sanchez et al., 2006), al evaluar tantas variables como
sea económicamente posible (Turba et al., 2007). La información
obtenida, por tanto, permite solamente hacer una aproximación al
potencial fecundante del eyaculado (Amann, 1989; Ax et al., 2002).
En diversas investigaciones sobre este tema, se han allegado
evidencias sobre la relación entre la calidad seminal y la capacidad
fecundante de los espermatozoides, particularmente en variables
como la integridad del acrosoma (Flowers, 2002; Rozeboom et al.,
2000), la movil idad espermática (Broekhuijse et al., 2012; Holt et al.,
1997) y la tasa de fragmentación del ADN (López-Fernández et al.,
2008; Perez-Llano et al., 2006). Del mismo modo, en otros frentes, se
ha logrado establecer algún nivel de asociación con indicadores de
ferti l idad como tamaño de camada y tasa de retorno (Sutkevič ienė
and Ž i l inskas, 2004).
En las evaluaciones convencionales de calidad seminal t iene gran
peso la morfología de las diferentes estructuras del espermatozoide
152
(cabeza, pieza intermedia y cola); las malformaciones más
frecuentemente encontradas en verracos destinados a la
reproducción controlada, son las gotas citoplasmáticas (GCs),
vesículas residuales del citoplasma, de 2 µm de diámetro (Kaplan et
al., 1984), proximales o distales, según su ubicación en la pieza
intermedia (Bonet et al., 1993; Bonet et al., 1992; Larsson and
Einarsson, 1984), que en condiciones normales son eliminadas, en
alta proporción, en el epidídimo, antes, (Briz, 1996) durante (Fischer
et al., 2005) o inmediatamente después de la eyaculación (Pruneda et
al., 2005); las GCs también pueden encontrarse l ibres en el
eyaculado (Kaplan et al., 1984). Se consideran una alteración
morfológica cuando se encuentran unidas a la pieza intermedia de los
espermatozoides, en una proporción superior al 15% (Briz, 1996;
Gómez, 2010). Hay evidencia de la asociación entre alta proporción
de GCs y la integridad funcional y estructural de las membranas
espermáticas (IEM, IAC, e IFM), lo cual soporta la consideración
previa de varios autores sobre la relación entre una alta prevalencia
de esta malformación y un bajo desempeño reproductivo en los
machos afectados (Althouse, 1998; Arestova and Alekseev, 2013;
Gómez, 2010; Kato et al., 1996; Lovercamp et al., 2007a).
Un estudio retrospectivo de la calidad en muestras de semen diluido
refrigerado, destinado a inseminación artif icial, procedentes de 177
machos de 12 granjas porcinas del centro occidente de Colombia, en
153
un periodo de siete años, permitió corroborar que las GCs fueron la
alteración morfológica mas frecuentemente asociada con eyaculados
de mala calidad. La presentación de GCT fue cercana al 15%, las
GCD fueron mas frecuentes que las de las GCP, lo cual concuerda
con reportes anteriores (Díaz et al., 2009; Fischer et al., 2005). De
otro lado, se detectó nuevamente la asociación entre la presencia de
GCs y la integridad funcional y estructural de las membranas
espermáticas (IEM, IAC, e IFM). La correlación negativa y altamente
signif icativa encontrada entre GCs e IEM puede atribuirse a la
actividad enzimática hidrolít ica que poseen los espermatozoides
inmaduros (Kuster et al., 2004); mientras que la correlación negativa
no signif icativa evidenciada con IAC, sumada a la anterior, podría ser
atribuida a la independencia funcional entre los diferentes dominios
de membrana espermática (Perez-Llano et al., 2001); adicionalmente,
la correlación entre las GCD y la IFM, aunque baja, fue posit iva y
signif icativa, esto puede representar procesos enzimáticos asociados
a los factores que afectan la maduración espermática durante su
paso por el epidídimo, que alteran el patrón de osmolaridad (Kuster
et al., 2004). Estas asociaciones sugieren, además, la posibil idad de
combinar los valores de morfología espermática con los de integridad
funcional y estructural de las membranas con el propósito de hacer
una predicción mas certera de la fert i l idad del macho evaluado, con
base en lo que podría denominarse la población de espermatozoides
funcionalmente competentes (Perez-Llano et al., 2009).
154
En concordancia con estudios previos, en este trabajo se logró
evidenciar que el porcentaje de GCs aumenta con la edad de los
reproductores (Kondracki et al., 2005), y que hay una gran
variabil idad en la frecuencia de presentación de GCs entre machos, a
lo largo de su la vida úti l , asi como en su persistencia (Diaz et al.,
2009; Gómez, 2010).
Con respecto a las demás variables morfológicas se encontraron
presentaciones inferiores al 1% de cabeza macro, micro y piriforme,
tracto intermedio doble, excéntrico y engrosado, cola en látigo, lazo,
escalera, ovil lo y reflejo distal, lo cual evidencia el bajo grado de
alteración de estas estructuras, en concordancia con lo encontrado
por Gadea et al. (2004). Así mismo, ocurrió con los valores
encontrados para IEM (89.6%), IFM (56%) y IAS (86.8%) que
concuerda con los reportes previos de Díaz et al. (2009) y Druart el
al. (2009).
La mitad de las muestras de semen diluido evaluadas en este trabajo
presentaron concentración superior a 35x106 células por ml, lo cual
excede el valor recomendado de 3×109 células por dosis (López-
Rodríguez, 2012; Popwell and Flowers, 2004), mostrando desajustes
en la dosif icación del semen que comprometen la vida úti l de las
muestras por agotamiento de la capacidad del di luyente para regular
pH y presión osmótica y para mantener metabolismo celular e inhibir
desarrollo microbiano (Althouse and Lu, 2005; Flowers, 2002).
155
Como resultado de una revisión sistemática sobre factores asociados
a la presentación de GCs en semen porcino, orientada con
especif icidad a cl ima (estacionalidad, temperatura, humedad relativa
y fotoperiodo), edad del verraco, morfología espermática, sanidad del
verraco, al imentación del verraco, y frecuencia de eyaculación, se
encontró información que a pesar de ser heterogénea y diversa, no
menciona estudios realizados bajo condiciones intertropicales, ni bajo
condiciones comerciales, ni involucra animales dedicados a la
producción intensiva de semen para reproducción controlada. La
mayoría de las fuentes analizadas son de tipo descriptivo,
caracterizadas por representar un bajo nivel dentro de la escala de la
evidencia científ ica, con posibles sesgos de selección, y carentes de
un proceso sistemático y aleatorio para la selección de las muestras,
por lo cual no fue posible la determinación de la relación temporal
entre la causa y el efecto.
De acuerdo con esta revisión, los factores más frecuentemente
asociados con la presentación de GCs en porcinos, son los cl imáticos
(estacionalidad, temperatura ambiental y fotoperiodo) y la frecuencia
de eyaculación de los verracos.
Respecto a los factores cl imáticos, en ocho de los estudios incluidos
en la revisión se encontraron reportes sobre asociaciones entre la
prevalencia de GCs y variables cl imáticas, de los cuales tres tocan
directamente con el incremento de las GCs en el verano, en países
con estaciones, como Japón (de Serrano et al., 1989; Nakayama et
156
al., 1991; Suriyasomboon et al., 2005); otros tres hacen referencia a
una asociación posit iva entre prevalencia de GCs y temperatura
ambiental y humedad relativa (Echeverria-Alonzo et al., 2009; Kuster
et al., 2004; Larsson and Einarsson, 1984), en particular Larson y
Einarsson (1984) encontraron elevaciones manifiestas en el
porcentaje de GCs arriba de 31.60C y de 78% de humedad; y los
otros dos autores reportan aumento de las GCs asociado a la
disminución de las horas luz en el otoño (Andersson et al., 1998;
Sancho et al., 2004).
Con relación a la frecuencia de eyaculación, se encontraron reportes
donde verracos eyaculados con una frecuencia mayor a dos colectas
por semana, presentaron una mayor proporción de GCs, las cuales se
consideran como signo de inmadurez espermática (Bonet, 1987;
Frangez et al., 2005; Pruneda et al., 2005).
Con el propósito de confrontar el panorama descrito anteriormente,
se realizó un estudio prospectivo sobre la calidad seminal y sobre los
factores ambientales asociados con la misma, en seis granjas
comerciales del centro occidente de Colombia, empleando 72
verracos, durante nueve meses consecutivos. Las variables
seminales y la mayoría de los factores ambientales fueron registradas
seis veces cada 45 días, la temperatura ambiental y la humedad
relativa se registraron diariamente.
157
En este trabajo se encontró que la presentación de GCT fue del
15,4%, valor calif icado como l imitante del desempeño reproductivo de
los machos (Althouse et al., 1998; Lovercamp et al., 2007b) y que
concuerda con reportes realizados anteriormente por Bonet et al.
(1992) y Gómez (2010) quienes encontraron valores similares; así
mismo la presentación de las GCD siempre fue mayor que las de las
GCP, hallazgo que reportado en trabajos previos (Fischer et al.,
2005; Gómez et al., 2014). La correlación negativa (-0.13 y -0.16
respectivamente) encontrada entre GCP y GCT con Integridad del
acrosoma, concuerda con resultados reportados previamente (Fischer
et al., 2005; Gómez, 2010; Perez-Llano et al., 2009), y puede ser
atribuida a la independencia funcional entre los diferentes dominios
de la membrana espermática (Perez-Llano et al., 2001). La ausencia
de correlación encontrada el presente estudio entre GCP, GCD y GCT
con el IDF, dif iere con reportes previos realizados en España, donde
se encontró una asociación posit iva entre los valores de
fragmentación del ADN y las GCP (López-Fernández et al., 2008).
En este trabajo no se encontró correlación signif icativa entre
presencia de gotas (GCD, GCP y GCT) e IEM, contrario a reportes
realizados previamente (Gómez et al., 2014; Kuster et al., 2004); con
la IFM, en la que se ha reportado asociación negativa con las GCD
(Gómez et al., 2014; Kuster et al., 2004); y con la Movil idad
progresiva y la movil idad total, donde se ha evidenciado que el
desarreglo de las estructuras mitocondriales generado por las GCP
158
afectan la movil idad (Briz et al., 1995; Briz, 1996). De otro lado, se
evidenció la presencia de GCs en niveles superiores al 15% en el
67% de las granjas evaluadas, en las cuales se alcanzaría un nivel
de descarte del 36% de las muestras analizadas por presencia de
GCs; el resultado anterior concuerda con reportes previos de
Waberski et al. (1994), y Althouse, (1998) quienes recomiendan que
el máximo de CGs no debe sobrepasar el 15% para semen diluido
refrigerado, ya que se encuentra una correlación negativa con la taza
de preñez y la el tamaño de camada.
Se encontró, además, el 21% de machos con persistencia de GCs, los
cuales están presentes en 50% de las granjas; adicionalmente
también se pudo evidenciar una gran variabil idad en el porcentaje de
GCs a través de las diferentes evaluaciones, tanto entre granjas
como entre y dentro de verracos; los hallazgos concuerda con lo
reportado previamente por Lovercamp et al.(2007), quienes
encontraron diferencias en la presentación de GCs en verracos en
distintas épocas del año; y con trabajos de Althouse (1998) y Diaz et
al. (2009) en donde la persistencia de GCs esta asociada con la
avanzada edad de los machos y con exposición a altas temperaturas
ambientales por periodos superiores a cuatro semanas (Cameron and
Blackshaw, 1980) y con una frecuencia de eyaculación superior a dos
colectas por semana (Bonet, 1987; Frangez et al., 2005; Pruneda et
al., 2005).
159
Se evidenció una correlación posit iva de temperatura ambiental y
correlación negativa de humedad máxima relativa con GCD, GCP y
GCT, lo anterior no coincide con lo reportado en trabajos realizados
en verracos de Tailandia, donde se determinó el efecto negativo de
alta temperatura ambiental y alta humedad relativa sobre la calidad
seminal al generar incrementos en la presentación de GCs,
(Suriyasomboon et al., 2004); en reportes previos en cerdos
Yorkshire en india en diferentes estaciones (Pandey, 1997); en Japón
durante el verano (Nakayama et al., 1991). En el presente estudio se
encontró que la temperatura ambiental afectó negativamente la IAC y
la IEM, situación reportada en estudios previos realizados por Knecht
el al. (2014) y por Wettemann et al. (1976). Con relación a la
movil idad espermática, en el presente trabajo se encontró que esta
no se ve afectada por la temperatura ambiental promedio, lo anterior
discrepa con reportes previos donde temperaturas ambientales
superiores a 33.40C reducen la movil idad espermática (Cameron and
Blackshaw, 1980), y con trabajos donde extremos de temperatura y
humedad disminuyen la movil idad espermática (Tretipskul et al.,
2012); pero discrepa con los resultado expuestos por Henao et al.
(2004) quienes no encontraron efecto de la temperatura ambiental
elevada sobre esta variable.
Ninguno de los factores analizados como: grupo racial del macho,
edad y frecuencia de eyaculación, operario, día y hora de
160
eyaculación, eventos sanitarios (vacunaciones, vermifugaciones,
medicamentos, suplementos) y t ipo de alimentación, logró explicar las
diferencias en la presentación de GCP, GCD y GCT entre las granjas
estudiadas. Este hallazgo es contrario a reportes previos en los que
la edad (Díaz et al., 2009), y el genotipo del macho (Gómez, 2010) y
la frecuencia de eyaculación (Pruneda et al., 2005; Suriyasomboon et
al., 2005; Suriyasomboon et al., 2004), la temperatura ambiental y
humedad relativa, superiores a 310C, y a 78% de humedad, aumentan
la presentación de GCs, (Echeverria-Alonzo et al., 2009; Kuster et al.,
2004; Larsson and Einarsson, 1984).
161
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165
CONCLUSIONES GENERALES
• Los valores de espermatozoides morfológicamente normales,
con integridad estructural de membrana, integridad funcional de
membrana, y con integridad acrosómica, fueron siempre
superiores a los umbrales considerados aceptables; así mismo,
las variables: cabeza macro, micro y piriforme; tracto intermedio
doble, excéntrico y engrosado; cola en látigo, lazo, escalera,
ovil lo y reflejo distal, presentaron prevalencias muy bajas, lo
cual las hace poco relevantes en el control de la calidad
seminal en el centro-occidente colombiano.
• La mitad de las muestras de semen diluido que l legaron al
laboratorio se encontraron con concentración superior a la
deseable, lo cual evidencia deficiente control de calidad en la
preparación de las dosis destinadas para la inseminación
artif icial.
• Las gotas citoplasmáticas son la alteración morfológica mas
frecuente en muestras de semen procedentes de granjas en el
centro-occidente colombiano. Se encontró una mayor
presentación de gotas citoplasmáticas a medida que avanza la
edad.
• Las gotas citoplasmáticas y la integridad estructural de la
membrana y del acrosoma están correlacionadas
negativamente. De otro lado, se detectó una correlación
posit iva entre las gotas citoplasmáticas y la integridad funcional
de la membrana.
166
• De acuerdo con la revisión sistemática, se considera a las GCs
como la malformación seminal más frecuentemente asociada
con eyaculados de baja calidad y con bajos niveles de ferti l idad
en los machos afectados, así mismo se reporta como la
anormalidad más frecuente en semen de machos porcinos
destinados a inseminación artif icial y adicionalmente, se ha
encontrado una alta variación en la frecuencia de presentación
de GCs entre machos, a lo largo de su la vida úti l , así como y
su persistencia en otros.
• Los factores más frecuentemente asociados con la presentación
de GCs en porcinos, son los cl imáticos (estacionalidad,
temperatura ambiental y fotoperiodo) y la frecuencia de
eyaculación de los verracos.
• Con respecto a los estudios analizados, la mayoría son
descriptivos, se caracterizan por representar un bajo nivel
dentro de la escala de la evidencia científ ica, pueden estar
sujetos a sesgos de selección, no siguen un proceso
sistemático y aleatorio para la selección de las muestras, por lo
cual no es posible la determinación de la relación temporal
entre la causa y el efecto debido al proceso de selección de los
casos de machos posit ivos a GCs. Un ejemplo de esta
167
causación reversa es la asociación entre la presencia de GCs y
la actividad enzimática.
• La información analizada se caracteriza por su amplia
heterogeneidad y diversidad de estudios, ninguno de los cuales
se desarrolló bajo condiciones de explotación comercial o
involucrando animales dedicados a la producción intensiva de
semen.
• Se destaca la falta de estudios relacionados con las
implicaciones económicas, productivas y reproductivas de las
GC en explotaciones comerciales o en centros de producción
comercial de semen.
• Se evidenció correlación posit iva de temperatura ambiental y
correlación negativa de humedad relativa máxima con la
presentación de las GCs.
• Hay diferencias en la presentación de GCs entre granjas, las
cuales no fueron explicadas por efectos nutricionales,
sanitarios, raciales, etáreos, o de frecuencia, hora de
eyaculación u operario que realizó el proceso.
• La baja frecuencia de las anormalidades de cabeza, tracto
intermedio y cola, así como los valores aceptables de
espermatozoides morfológicamente normales, con integridad
estructural de membrana, integridad funcional de membrana, y
con integridad acrosómica, hace esta variables no l imitantes de
168
la calidad seminal en los centros de inseminación del centro-
occidente colombiano.
169
ANEXOS
NORMAS TÉCNICAS
CALIDAD SEMINAL
DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA DESCRIPTORES: Semen porcino; calidad seminal;
concentración espermática
1. OBJETO Esta Norma describe la determinación de la concentración espermática en
semen porcino, mediante dos de los métodos más utilizados
internacionalmente: recuento celular en cámara de Bürker y microscopio de
campo claro y estimación por fotometría. Los resultados relacionados con
ella pueden ser empleados en diversas disciplinas y actividades
relacionadas con la producción porcina.
2. TÉRMINOS Y DEFINICIONES
- Concentración espermática: Es el número de espermatozoides por mL
en una muestra seminal.
170
- Directiva IVD 98/79 CE: Productos sanitarios para diagnostico in vitro,
publicado el 7 de diciembre de 1998 en el boletín oficial de la Unión
Europea. Con el símbolo CE sobre un producto, el fabricante certifica
que este, cumple con las exigencias fijadas en las directivas de la Unión
Europea. - ACS: Grado Reactivo Analítico. Son aquellos productos que cumplen
con las normas de la ACS (American Chemical Society) son los más
frecuentemente utilizados; cuando una empresa confiable hace
referencia a ellos, es garantía de su funcionalidad en el laboratorio. - c.s.p.: Cantidad suficiente para.
3. MÉTODO 1: RECUENTO CELULAR CON CÁMARA DE BüRKER Y MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO
3.1. PRINCIPIO Y DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
La cámara de Bürker es una lámina de vidrio acondicionada especialmente
para recuento celular (Marcada según la directiva IVD 98/79 CE). Su
funcionamiento está basado en dos cuadrículas de recuento, ubicadas a
lado y lado de una depresión central lineal. Cada cuadrícula de recuento
está dividida por líneas triples (trazadas a una distancia de 0,01667mm), en
9 cuadros grandes, cada uno de 1 mm de lado y 1 mm2 de área. Cada
cuadro grande está dividido por líneas dobles (trazadas a una distancia de
0,05 mm), en 16 cuadros medianos, cada uno de 0,2 mm de lado y 0,4 mm2
de área. Las líneas dobles forman 25 cuadrados pequeños (cada cuadro
grande estaría dividido en 400 cuadros pequeños), cada uno de 0,05 mm
de lado y 0,0025 mm2 de área (Ver Figura 1). El recuento celular se realiza
en un microscopio convencional de campo claro con un objetivo de 40x.
171
Figura 1. Representación esquemática de la cuadrícula de recuento de una
cámara de Bürker.
172
3.2. REACTIVOS (Pureza, concentración y preparación) 3.2.1. Agua desmineralizada Tipo II
3.2.2. Cloruro de sodio (NaCl) BAKER ANALYZED ACS.
3.2.3. Formaldehido, solución al 37% (HCHO) BAKER ANALYZED ACS.
3.2.4. Solución de Cloruro de sodio (NaCl) al 0,9% en agua desmineralizada Tipo
II (w/v): 900 mg de Cloruro de sodio (NaCl) y agua desmineralizada Tipo II
c.s.p. 100 mL. Utilizar inmediatamente después de la preparación.
3.2.5. Solución salina formolada al 0,3% (v/v): 0,3 mL de formaldehido, solución al
37% (HCHO) y 99,7 mL de solución de Cloruro de sodio (NaCl) al 0,9%.
Almacenar en recipiente de vidrio bien cerrado, a 4°C por un periodo no
mayor a un mes para prevenir contaminación.
3.3. EQUIPOS Y MATERIALES
3.3.1. Balanza semianalítica
3.3.2. Micropipeta de 1-10 µL (puntas desechables)
3.3.3. Micropipeta de 100-1000 µL (puntas desechables)
3.3.4. Microscopio de campo claro con objetivo de 40 x
3.3.5. Cámara de Bürker con pinzas y lámina de cuarzo cubre objetos
3.3.6. Agitador magnético para tubos de ensayo
3.3.7. Viales desechables de 1,5 mL, de plástico, con tapa.
3.3.8. Frasco de tapa rosca estéril
3.3.9. Guantes de nitrilo
3.4. PREPARACIÓN Y PRESERVACIÓN DE MUESTRAS
El material a analizar es una contramuestra de semen diluido refrigerado,
preparada en cada granja y transportada al laboratorio de acuerdo con sus propios
173
protocolos. Los criterios básicos aplicados son: dosis seminales de 80 a 100 mL
con 2,5-3 x109 células, empacadas en recipientes plásticos estériles bien cerrados
y completamente identificados, refrigeradas a 15-17,7°C, y enviadas al laboratorio
inmediatamente después de procesadas.
3.5. PROCEDIMIENTO 3.5.1. preparación de la cámara de Bürker para recuento En un vial plástico de 1,5 mL se depositan 5 µL de semen de la contramuestra y
995 µL de solución salina formolada (1:199 v/v), para preparar una dilución
compuesta por una parte de semen en 200 ml de solución. La preparación se agita
en agitador magnético por 10-20 s, y se transfieren 5 µL a cada cuadricula de
recuento de la Cámara de Bürker, y se deja en reposo por lo menos 5 min.
3.5.2. Recuento celular En microscopio de campo claro con objetivo de 40 x se cuentan los
espermatozoides contenidos en 40 cuadros pequeños, elegidos al azar. En cada
cuadro pequeño se cuenta teniendo en cuenta solo los espermatozoides cuyas
cabezas están ubicadas totalmente dentro del cuadro o en contacto con las líneas
izquierda e inferior de este. Ver figura 2.
Figura 2
174
Figura 2. Recuento celular
3.6. PRESENTACIÓN DE LOS RESULTADOS La preparación de la cámara se hace dos veces consecutivas y el recuento celular
se realiza cuatro veces. La concentración espermática final se expresa en millones
de espermatozoides por mL de contramuestra (nx106), y se cuantifica
multiplicando el promedio de los cuatro recuentos por la constante 2x107.
4. METODO 2: ESTIMACIÓN POR FOTOMETRÍA 4.1. PRINCIPIO Y DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO El Fotómetro Spermacue desarrollado especialmente para la determinación de la
densidad espermática de animales, mide la turbidez del semen con la ayuda de un
filtro de 570 nm. Cada fotómetro esta calibrado para una especie, con
determinaciones comparativas de densidad en la cámara de contaje de Bürker. La
muestra de medición es normalmente semen no diluido; el microprocesor del
fotómetro lleva a cabo la medición y muestra entonces el resultado directamente
en 106 o 109 espermios por mililitro.
4.2. EQUIPOS Y MATERIALES 4.2.1. Fotómetro SpermaCue
4.2.2. Microcubetas del spermaCue
4.2.3. Micropipeta de 10-100 µL (puntas desechables)
4.3. PREPARACIÓN Y PRESERVACIÓN DE MUESTRAS
Emplear muestras de 2 mL de semen puro almacenadas en jeringa desechable de
10 mL; las muestras se deben conservar refrigeradas a una temperatura de 16°C
±1°C.
175
4.4. PROCEDIMIENTO 4.4.1. Preparación de la muestra
Homogenizar la muestra de semen porcino manualmente y tomar una porción que
cubra la apertura circular de la microcubeta lo cual puede realizarse por
capilaridad sumergiendo la punta en la muestra o con la ayuda de una micropipeta
tomando un volumen de 25 µL.
4.4.2. Calibración del fotómetro SpermaCue
Se recalibra el fotómetro SpermaCue de acuerdo a lo especificado en el manual
del equipo según los datos obtenidos en la verificación de la cubeta de control o
cuando el equipo se utilice para la medición de concentración de semen de otra
especie.
4.4.3. Medición de la concentración
Se mide la concentración del semen porcino en la microcubeta y se registra el
dato arrojado por el equipo en x 106/mL.
4.5. EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
El resultado registrado por el fotómetro SpermaCue es reportado como número de
espermatozoides x 106/mL. 4.6. INFORME DE LOS ENSAYOS El informe de ensayo debe incluir como mínimo la siguiente información:
- Método empleado (es decir A o B)
176
- Identificación y características particulares de la muestra
- Semen porcino utilizado(diluido o puro)
- Cualquier desviación de los métodos de ensayo incluidos en esta norma
ANEXO A: BIBLIOGRAFIA
1. FLOWERS, W.L. Increasing fertilization rate of boars: influence of number and quality of spermatozoa inseminated. J. Anim. Sci. 80 (E. Suppl. 1): E47-E53. 2002.
2. QUINTERO, A. Estudio sobre la dinámica de poblaciones espermáticas en semen de caballo, cerdo y conejo. 2003.
3. ROZEBOOM, K.J. Evaluating of boar semen quality. Animal Science Facts. Publication number ANS 00-812S. Extension Swine Husbandry. College of Agriculture & Life Sciences. North Carolina State University. pp. 1-8. 2000.
177
DETERMINACIÓN DE LA FRAGMENTACION DEL ADN DESCRIPTORES: Semen porcino; calidad seminal;
Fragmentación de ADN OBJETO
Esta Norma describe la determinación de la fragmentación del ADN en
semen porcino, evaluada mediante un kit comercial utilizado
internacionalmente, llamado Halotech® (ChromaCell SL, Madrid, España)
que nos permite la evaluación celular en microscopio de campo claro, para
determinar el índice de fragmentación del ADN (DFI, del inglés DNA
fragmentation index) que es el porcentaje de la fragmentación del ADN de
células anormales en comparación con las células normales. Los resultados
obtenidos pueden ser empleados en diversas disciplinas y actividades
relacionadas con la producción porcina.
TERMINOS Y DEFINICIONES
ACS: Reactivos grado Analítico, frecuentemente utilizados, por su garantía
de funcionalidad en el laboratorio y cumplimiento con las normas de la ACS,
de la nominación en ingles, American Chemical Society.
ADN: (ácido desoxirribonucleico) macromolécula constituida por
monómeros denominados nucleótidos, cada uno constituido por un radical
fosfato, un azúcar de cinco carbonos (dexosiribosa) y una base nitrogenada
(adenina, timina, citoxina, o guanina); esta molécula es portadora de toda
178
la información genética que pasa de una generación a la siguiente, y
contiene todas las instrucciones necesarias para la formación de un
organismo nuevo, así como para el control de todas las actividades de las
células durante el tiempo de vida del organismo.
BTS: De su nombre en inglés, Beltsville Thawing Solution. Es un diluyente
para semen porcino que evita los procesos degenerativos luego de la
colección del semen, como pérdida de movilidad, alteraciones del acrosoma
y descondensación del material cromatínico. Dispone de una fuente de
azúcares y tampones capaces de mantener el pH en rangos fisiológicos y
controlan la acidificación del medio.
c.s.p: cantidad suficiente para.
Fragmentación de ADN: Presencia de roturas en el ADN del
espermatozoide tanto en la cadena simple como en la doble hélice, las
cuales se dan en los enlaces disulfuro y fosfodiéster principalmente.
Se conocen algunos factores que pueden producir daño irreversible en el
ADN del espermatozoide como son: generación de radicales libres de
oxígeno ó estrés oxidativo, empaquetamiento anormal de la cromatina
(errores en la sustitución de histonas por protaminas), deficiencias en la
recombinación, apoptosis tras la salida del espermatozoide a los túbulos.
Existen causas externas que pueden provocar o potenciar los efectos
anteriores, dentro de estas se encuentran la temperatura y contaminación
ambiental, la temperatura testicular elevada, la criptorquidia, procesos
inflamatorios o infección del tracto genital, el cáncer, los episodios febriles y
el estrés.
Halotech ®: Es un test sencillo que tiene su origen en una variante del
protocolo para evaluar dispersión de la cromatina espermática (SCD, de la
179
denominación en inglés Sperm Chromatin Dispersion), empleado en
humano (Fernández et al., 2003).
PBS: solución salina fosfato-bufferada (de su nominación en inglés: Phosphate buffered saline).
MÉTODO:
PRINCIPIO Y DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
La evaluación de la fragmentación del ADN es de particular importancia,
dado que esta molécula es determinante para el buen desarrollo desarrollo
del embrión, y por tanto para lo lograr una buena prolificidad. Los
eyaculados porcinos con un IDF ≥ 15%, no son recomendables para
inseminación artificial; es decir el conteo final de los espermatozoides con
ADN normal debe ser por lo menos del 85%.
El funcionamiento del Halotech ® está basado en la respuesta diferencial
del núcleo de los espermatozoides fragmentados y no fragmentados a un
tratamiento de desproteinización con una solución desnaturalizante ácida,
esta respuesta se puede evidenciar al microscopio, gracias a que los
espermatozoides con ADN fragmentado presentan un halo alrededor del
núcleo, de un color más tenue que este, debido a la desnaturalización del
ADN, y aquellos con ADN no fragmentado aparecen como una estructura
de forma ovalada, de color oscuro sólido, sin ese halo o con una corona
muy tenue y delgada a su alrededor, debido a que son resistentes a la
desnaturalización.
180
REACTIVOS (Pureza, concentración y preparación)
Kit Halotech ®:
2.2.1.1.1. Agarosa al 0,7%
2.2.1.1.2. Solución de lisis (β-mercaptoetanol)
Agua Tipo II. Colorante de Wright
Alcohol Etílico absoluto anhidro (CH3CH2OH) 99,9% de pureza,
ACS.
Cloruro de sodio cristal (NaCl) 99, 6 % de pureza, A.C.S.
Cloruro de potasio (KCl) 99,5% de pureza, A.C.S.
Fosfato de sodio bibásico seco (NaHPO4.nH2O) 92% de pureza
A.C.S.
Potasio fosfato monobásico (KH2PO4) 98% de pureza, A.C.S.
Glucosa anhidra. PRS-CODEX
Citrato de sodio bihidrato (Na3C6H5O7.2H2O) 99 % de pureza, A.C.S.
Cloruro de potasio (KCl) 99,5% de pureza, A.C.S.
Sulfato de kanamicina (C18H36N4O11H2O4S) para cultivo celular
Bicarbonato de sodio (NaHCO3) 99% de pureza, A.C.S.
EDTA ((Ethylenedinitrilo) tetraacetic acid) (C10H16N2O8) 99% de
pureza, para cultivo celular.
Kanamicina sulfato (C18H36N4O11H2O4S), para cultivo celular
Solución BTS (Beltsville Thawing Solution (w/v): se disuelven 37 g de
glucosa, 6 g de citrato de sodio, 1,25 g de bicarbonato de sodio, 1,25
g de EDTA, 0,75 g de cloruro de potasio y kanamicina al 7% (70 mg
de kanamicina en agua desmineralizada Tipo II c.s.p. 1000 mL.
Solución Buffer fosfato (PBS, de la denominación en inglés
Phosphate Buffer Solution) (w/v): se Disolver 8,032 g de NaCl, 0,201
g de KCl, 1,25 g de Na2HPO4, 0,204 g de KH2PO4 en 1000 mL de
agua desmineralizada Tipo II.
181
Colorante Wright 50%: La solución de Wright se mezcla con
una solución amortiguadora de fosfato (1:1). Esta solución se debe
realizar 2 horas antes de utilizar para atemperarla.
Solución de Alcohol Etílico al 70% (v/v): 700,7 mL de alcohol etílico
absoluto al 99,9% adicionar agua tipo II c.s.p. 1000 mL.
EQUIPOS Y MATERIALES:
Balanza semianalítica
Micropipeta de 100-1000 µL (puntas desechables)
Micropipeta de 1-10 µL (puntas desechables).
Microscopio de campo claro con objetivo de 100X
Cabina de extracción
Contador manual con capacidad mínima de conteo 500
Viales desechables de plástico de 1,5 mL, con tapa.
Portaobjetos pretratados (provistos por el kit) y laminilla de
22x22 mm
Frascos de tapa rosca estéril de 50 mL
Baño maría a 37°C
Agitador vortex
Refrigerador a 4°C
Guantes de nitrilo
Recipientes de plástico para incubación horizontal
PREPARACIÓN Y PRESERVACIÓN DE MUESTRAS
El material a analizar es una contramuestra de semen diluido refrigerado,
preparada en cada granja y transportada al laboratorio de acuerdo con sus
propios protocolos. Los criterios básicos aplicados son: dosis seminales de
80 a 100 mL con 2,5-3 x109 células, empacadas en recipientes plásticos
estériles bien cerrados y completamente identificados, refrigeradas de 15°C a
17,7°C, y enviadas al laboratorio inmediatamente después de procesadas.
182
PROCEDIMIENTO
Inclusión del semen en el microgel de agarosa: Diluir la muestra de semen (fresco, diluido–refrigerado, ó congelado) en
diluyente BTS hasta una concentración final de 5–10x106
espermatozoides/mL.
Fundir la agarosa colocando el vial con este reactivo en un horno
microondas durante 40 s.
Colocar un vial con agarosa y un vial con 12,5 µL de la muestra de semen
colocando los viales con este reactivo en un baño María a 37°C durante 5
minutos.
Añadir 25 µL de agarosa atemperada al vial con la muestra de semen
diluido y mezclar bien mediante agitación en vortex.
Depositar 2µl de la mezcla de semen diluido y agarosa en un portaobjetos
ubicado en posición horizontal, cubrir con una laminilla, y presionar
suavemente con el dedo sin hacer burbujas de aire.
Solidificar la muestra llevando el portaobjetos a refrigeración a 4°C durante
5 minutos, colocándolo en una placa de vidrio o de metal.
Retirar la laminilla deslizándola suavemente con el dedo
Lisis y deshidratación de la muestra
Agregar solución de lisis atemperada a temperatura ambiente (20-22°C) por dos
horas a la preparación obtenida en el paso.
Incubar durante 7 minutos a temperatura ambiente en cabina extractora.
Lavar con agua tipo II con la ayuda de una micropipeta de 100-1000 µL durante 5
minutos con el fin de remover los residuos de solución de lisis.
183
Deshidratar en posición horizontal la preparación mediante dos adiciones
sucesivas, de dos minutos cada una, de etanol al 70% y 100%, y secar al aire libre
(la lámina seca se puede almacenar por varios meses a temperatura ambiente en
un lugar seco).
Tinción
Colorear la preparación en posición horizontal cubriéndola con 2 ml de colorante
de Wright al 50%, durante 10 minutos, lavar brevemente con abundante agua tipo
II para eliminar el exceso de solución y secar al aire libre.
Evaluar la calidad de la preparación en microscopio de campo claro con objetivo
de 40x, para establecer la necesidad de reforzar la tinción (repitiendo el paso
anterior) o de suavizarla mediante lavado con agua tipo II.
Evaluación en el microscopio
Evaluar 500 espermatozoides en un microscopio de campo claro a 40x, según
los siguientes criterios:
- Espermatozoides con ADN fragmentado: aquellos cuyo núcleo posee un
halo con un espesor igual o mayor a su diámetro menor.
- Espermatozoides con ADN sin fragmentar: aquellos cuyo núcleo no posee
halo o cuando el espesor del halo es menor a la tercera parte de su
diámetro menor.
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
El índice de fragmentación de ADN se calculo en 500 espermatozoides,
determinando el porcentaje de ADN fragmentado, si es >15% la muestra no es
viable para inseminación.
184
BIBLIOGRAFIA Enciso, M. C. López – Fernández, J. Fernández, P. García, A. Gosálbez and J. Gosálvez. 2006. A new method to analyze boar sperm DNA fragmentation under bright-field or fluorescence microscopy. Theriogenology 65: 308–316. Boe-Hansen, G.B., P. Chrstensen, D. Vibjerg, M.B.F. Nielsen and A.M. Hedeboe. 2008. Sperm chromatin structure integrity in liquid stored boar semen and its relationships with field fertility. Theriogenology. 69: 728–736 Pérez-Llano, B., P. García-Casado, R. Sala, A. Gosálbez, C. López-Fernández and J. Gosálvez. 2006. Estado de fragmentación del ADN seminal de verracos españoles. j. suis. 29: 16-23. Fernández, JL, Muriel L, Rivero MT, Goyanes V, Vazquez R, Alvarez JG. 2003. The sperm chromatin dispersion test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation. 2003. J Androl. 24(1):59-66.
185
DETERMINACIÓN DE INTEGRIDAD ACROSÓMICA
DESCRIPTORES: Semen porcino; calidad seminal; Integridad funcional de la membrana plasmática
OBJETO
Esta norma describe la determinación de la integridad funcional de la
membrana plasmática en semen porcino, mediante el método más utilizado
internacionalmente llamado test corto de hinchazón hipoosmótica (HOST,
de su nombre en inglés short hypoosmotic swelling test) y evaluación
celular en microscopio de contraste de fases. Los resultados relacionados
con ella pueden ser empleados en diversas disciplinas y actividades
relacionadas con la producción porcina.
TÉRMINOS Y DEFINICIONES
Membrana plasmática: es una bicapa lipídica que delimita al
espermatozoide y se encarga de la protección de las estructuras internas y
del intercambio con el medio extracelular. Hipoosmótico: es la propiedad de presión de una solución que esta
relacionada con la baja concentración de soluto de la misma
ACS: Grado Reactivo Analítico. Son aquellos productos que cumplen con
las normas de la ACS (American Chemical Society) son los más
frecuentemente utilizados; cuando una empresa confiable hace referencia a
ellos, es garantía de su funcionalidad en el laboratorio.
PRS-CODEX: Productos que satisfacen los requisitos establecidos en las
farmacopeas más utilizados en la industria farmacéutica como son la
186
Farmacopea Europea (Ph.Eur), la Farmacopea Británica (BP) y la
Farmacopea de los Estados Unidos (USP)
C.s.p: cantidad suficiente para.
MÉTODO 1: TEST DE HINCHAZÓN HIPOOSMÓTICA Y EVALUACIÓN CELULAR EN MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES
PRINCIPIO Y DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
La función principal del espermatozoide es la fecundación, y para llevar a
cabo este proceso su membrana debe estar íntegra y funcionalmente activa
(Pérez-Llano et al., 2009), debido a que esta participa no solo en el
metabolismo celular, sino, en los procesos de capacitación, reacción
acrosómica y unión entre gametos; por tanto la funcionalidad de la
membrana es un indicador de la capacidad fecundante del espermatozoide
(Jeyendran et al., 1984). El test de hinchazon hipoosmótica es una prueba
que determina la funcionalidad de la membrana plasmática, mediante
exposición de los espermatozoides en un medio hipoosmótico (Vazquez et
al., 1997; Pérez-Llano et al., 2001), debido a que la exposición de estos a
condiciones hipoosmóticas produce aumento de la entrada de agua en un
intento de alcanzar el equilibrio osmótico, lo cual aumenta el volumen de la
célula (Jeyendran et al., 1984). La presencia de colas hinchadas es signo
de que el paso a través de la membrana se da normalmente.
REACTIVOS (Pureza, concentración y preparación)
Agua desmineralizada Tipo II.
Sodio Citrato tribásico biidrato (Na3C6H5O7.2H2O) 99% de pureza.
D(-)Fructosa (O.CH2(CH.OH)3.C(OH).CH2OH)
Cloruro de sodio (NaCl) BAKER ANALYZED ACS.
Formaldehido, solución al 37% (HCHO) BAKER ANALYZED ACS.
187
Solución de Cloruro de sodio (NaCl) al 0,9% en agua desmineralizada Tipo II
(w/v): 900 mg de Cloruro de sodio (NaCl) y agua desmineralizada Tipo II c.s.p.
100 mL. Utilizar inmediatamente después de la preparación.
Solución salina formolada al 0,3% (v/v): 0,3 mL de formaldehido, solución al
37% (HCHO) y 99,7 mL de solución de Cloruro de sodio (NaCl) al 0,9%.
Almacenar en recipiente de vidrio bien cerrado, a 4°C por un periodo no mayor
a un mes para prevenir contaminación.
Solución hipoosmótica a 75 mOsm/Kg (p/v): 0,245 g de citrato de sodio, 0,450
g de fructosa y agua tipo II c.s.p. 100 mL
EQUIPOS Y MATERIALES
Balanza semianalítica
Micropipeta de 100-1000 µL (puntas desechables)
Micropipeta de 1-10 µL (puntas desechables)
Microscopio de contraste de fases con objetivo de 40 X
Baño maría
Vortex
Contador manual con capacidad mínima de conteo 100
Viales desechables de plástico de 1,5 mL, con tapa.
Portaobjetos de vidrio de 75x25 mm y laminilla de 22x22 mm
Frasco de tapa rosca estéril de 50 mL
Guantes de nitrilo
PREPARACIÓN Y PRESERVACIÓN DE MUESTRAS
El material a analizar es una contramuestra de semen diluido refrigerado,
preparada en cada granja y transportada al laboratorio de acuerdo con sus propios
protocolos. Los criterios básicos aplicados son: dosis seminales de 80 a 100 mL
con 2,5-3 x109 células, empacadas en recipientes plásticos estériles bien cerrados
188
y completamente identificados, refrigeradas a 15-17,7 °C, y enviadas al laboratorio
inmediatamente después de procesadas.
PROCEDIMIENTO Preparación de la prueba Homogenizar manualmente la muestra de semen invirtiendo suavemente el frasco
y depositar 1,5 mL en un vial, depositar 1 mL de solución hipoosmótica en un
segundo vial y 0,5 mL de solución salina formolada en un tercer vial. Dejar el vial
con semen a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego disponerlo junto
con la solución hipoosmótica, por separado, en un baño maría a temperatura
ambiente y encenderlo para subir progresivamente hasta 37°C en 10 a 15
minutos. Después de subir hasta 37°C, transferir 350 µL de semen al vial con la
solución hipoosmótica, dejar por 5 minutos a esta misma temperatura y
seguidamente depositar 350 µL de esta mezcla al vial con la solución salina
formolada. Agitar la esta ultima mezcla en vortex y trasferir 5 µL a un portaobjetos
colocar laminilla y dejar en reposo por 2 minutos
Observación en el microscopio Se realiza la observación de la suspensión después del tiempo de reposo. Se
hace 1 conteo de 100 espermatozoides clasificando de acuerdo a su respuesta al
estrés osmótico así: los espermatozoides con la cola enrollada se consideran host
positivos y los espermatozoides con la cola recta se consideran host negativos.
PRESENTACIÓN DE LOS RESULTADOS
La integridad integridad funcional de la membrana plasmática se cuantifica
promediando el conteo de cada una de las clasificaciones.
Se reporta la suma de los porcentajes de espermatozoides Host positivos que
corresponden a los espermatozoides con integridad funcional de la membrana.
189
BIBLIOGRAFIA
Pérez-Llano, B., G. Reguera, P. García-Casado. 2009. Changes in subpopulations of boar sperm defined according to viability and plasma and acrosome membrane status observed during storage at 15°C. Theriogenology 71: 311–317.
Pérez-Llano, B., .J.L. Lorenzo, P. Yenes, A. Trejo, P. García-Casado. 2001. A short hypoosmotic swelling test for the prediction of boar sperm Fertility. Theriogenology 56:387-398. Jeyendran, R. S., H. H. Van der Ven, M. Perez-Pelaez, B. G. Crabo and L. J. D. Zaneveld. 1984. Development of an assay to assess the functional integrity of the human sperm membrane and its relationship to other semen characteristics. J Reprod. Fert. 70:219-228.
190
DETERMINACIÓN DE MORFOLOGÍA ESPERMÁTICA DESCRIPTORES: Semen porcino; calidad seminal;
morfología espermática OBJETO
Esta Norma describe la determinación de la morfología espermática en semen
porcino, mediante el método de fijación en solución salina formolada y
visualización en microscopio de campo claro, contraste de fases y contraste de
interferencia. Los resultados relacionados con ella pueden ser empleados en
diversas disciplinas y actividades relacionadas con la producción porcina.
TÉRMINOS Y DEFINICIONES
- Morfología espermática: método de evaluación de las características
morfológicas de la cabeza, del tracto intermedio y de la cola del
espermatozoide.
- ACS: Reactivos grado Analítico, frecuentemente utilizados, por su
garantía de funcionalidad en el laboratorio y cumplimiento con las
normas de la ACS, de la nominación en ingles, American Chemical
Society.
- Cabeza: Parte anterior del espermatozoide, de forma aplanada y oval,
de 7 µm de longitud, que contiene el núcleo celular con el material
genético y el acrosoma (dos tercios anteriores).
- Tracto intermedio: Estructura cilíndrica que conecta la cabeza con la
cola de espermatozoide, de 0,7 µm de longitud, compuesta
191
especialmente por gran cantidad de mitocondrias organizadas de
manera específica, y relacionada con la función motriz del
espermatozoide.
- Cola: flagelo de 37,4 µm de longitud, que proporciona movilidad al
espermatozoide. - Cabeza suelta: Cabeza separada del tracto intermedio y de la cola. - Cabeza piriforme: Cabeza en forma de pera, con la parte anterior más
ancha que la posterior. - Macrocabeza: cabeza de tamaño mayor al normal. - Microcabeza: cabeza de tamaño menor al normal.
- Tracto intermedio doble: Presencia de dos tractos intermedios en un
espermatozoide.
- Tracto intermedio engrosado: Tracto intermedio con un diámetro
mayor al normal.
- Tracto intermedio excéntrico: Tracto intermedio insertado en la
cabeza fuera del punto de unión central.
- Tracto intermedio lazo: Tracto intermedio con dos plegamientos.
- Cola en escalera: Cola con uno o varios puntos de fractura en forma
angular.
- Cola en látigo: Plegamiento circular de la cola en un ángulo de 180°.
- Cola en lazo: Formación de un círculo completo en el extremo de la
cola.
192
- Cola en ovillo: Enrollamiento total de la cola.
- Gota citoplásmica: Es un remanente del citoplasma celular ubicado en
la pieza intermedia. En condiciones normales se elimina despues del
proceso de maduración en el epidídimo.
- Gota citoplásmica proximal: Gota ubicada cerca a la unión del tracto
intermedio con la cabeza.
- Gota citoplásmica distal: Gota ubicada cerca a la unión del tracto
intermedio con la cola.
- Aglutinación espermática: Agrupamiento de espermatozoides, que le
impide a la célula su normal funcionamiento.
- c.s.p.: Cantidad suficiente para.
MÉTODO:
PRINCIPIO Y DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
La evaluación de la morfología espermática guarda relación directa con la mayoría
de los factores relacionados con la producción seminal, a saber: genética, edad y
estado de salud del macho, nutrición, y procesamiento del semen; su importancia
se deriva de la marcada relación con descarte de dosis seminales y de machos, y
por tanto, con bajo rendimiento de los centros de producción de material seminal,
y del proceso de producción de carne porcina, en general. Los eyaculados
porcinos con menos de 70% de espermatozoides con morfología normal no son
recomendables para la inseminación artificial.
REACTIVOS (Pureza, concentración y preparación) Agua desmineralizada Tipo II
193
Cloruro de sodio (NaCl) BAKER ANALYZED ACS.
Formaldehido, solución al 37% (HCHO) BAKER ANALYZED ACS.
Solución de Cloruro de sodio (NaCl) al 0,9% en agua desmineralizada Tipo
II (w/v): 900 mg de Cloruro de sodio (NaCl) y agua desmineralizada Tipo II
c.s.p. 100 mL. Utilizar inmediatamente después de la preparación.
Solución salina formolada al 0,3% (v/v): 0,3 mL de formaldehido, solución al
37% (HCHO) y 99,7 mL de solución de Cloruro de sodio (NaCl) al 0,9%.
Almacenar en recipiente de vidrio bien cerrado, a 4°C por un periodo no
mayor a un mes para prevenir contaminación.
EQUIPOS Y MATERIALES
Balanza semianalítica
Micropipeta de 1- 10 µL (puntas desechables)
Micropipeta de 100- 1000 µL (puntas desechables)
Microscopio de contraste de fases con objetivo de 40 x
Agitador magnético para tubos de ensayo
Viales desechables de 1,5 mL, de plástico, con tapa.
Frasco de tapa rosca estéril
Contador manual con capacidad mínima de conteo 300
Portaobjetos de vidrio de 75x25 mm y laminilla de 22x22 mm
PREPARACIÓN Y PRESERVACIÓN DE MUESTRAS
El material a analizar es una contramuestra de semen diluido refrigerado,
preparada en cada granja y transportada al laboratorio de acuerdo con sus
propios protocolos. Los criterios básicos aplicados son: dosis seminales de 80 a
100 mL con 2,5-3 x109 células, empacadas en recipientes plásticos estériles bien
cerrados y completamente identificados, refrigeradas de 15°C a 17,7°C, y
enviadas al laboratorio inmediatamente después de procesadas.
194
PROCEDIMIENTO
Preparación de la muestra
Depositar 200 µL de semen y 200 µL de solución salina formolada en un vial
plástico de 1,5 mL, agitar en agitador magnético por 5 s, transferir 10 µL a un
portaobjetos de vidrio, colocar cubreobjetos y dejar en reposo por lo menos 2
min.
Recuento celular
En microscopio de contraste de fases o de contraste de interferencia, con
objetivo de 40 x, se realiza un conteo de 300 espermatozoides, clasificados en
las siguientes categorías:
- Morfología normal
- Morfoanomalías de la cabeza: suelta, piriforme, macrocabeza y
microcabeza
- Morfoanomalías del tracto intermedio: doble, excéntrico, engrosado y lazo.
- Morfoanomalías de la cola: látigo, ovillo, escalera y lazo.
- Gotas citoplásmicas: proximal y distal.
- Espermatozoides aglutinados.
- Células de descamación.
PRESENTACIÓN DE LOS RESULTADOS
Reportar el porcentaje de espermatozoides de cada categoría. Las células de
descamación se reportan como el número total de células observadas.
195
BIBLIOGRAFÍA
Bonet S. 2011.-Criterios para Determinar la Calidad Espermática de un
Eyaculado:espermatozoides normales, maduros o funcionales. XXXII
Simposium anual ANAPORC.
Bonet S. 1990.- Immature and Aberrant Spermatozoa in the Ejaculate of
Sus domesticus. Animal Reproduction Science, 22: 67-80.
Corcuera B., de Alba C., Hernández-Gil R. y Sagüés A. 2002.- Identifying
abnormalities in boar semen. PIG progress, 18: Nro 5. Bonet S. 1990.
Immature and Aberrant Spermatozoa in the Ejaculate of Sus domesticus.
Animal Reproduction Science, 22: 67-80.
Díaz O., Mesa H, Valencia J.G, Gómez-Londoño G., y Henao-Uribe F.J.
2009. -Evaluación de la integridad acrosomal y la funcionalidad bioquímica
de la membrana espermática en cerdos reproductores con gotas
citoplásmicas persistentes. Rev. Cient.
(Maracaibo) v.19 n.5 Maracaibo oct. 2009.
Gómez, G., 2010.- Dinámica de la calidad seminal de verracos del centro-
occidente colombiano: Tesis, Universidad de Caldas, Maestría en Sistemas
de Producción Agropecuaria, Manizales, Colombia.
Lovercamp, K.W., Safransky, T.J. & Fischer, K.A., 2007.- High resolution
light microscopic evaluation of boar semen quality sperm cytoplasmic
droplet retention in relationship with boar fertility parameters.Arch Androl,
53: 219-228.
196
DETERMINACIÓN DE INTEGRIDAD ACROSÓMICA DESCRIPTORES: Semen porcino; calidad seminal;
Movilidad espermática OBJETO
Esta norma describe la determinación de la movilidad espermática en semen
porcino, mediante uno de los métodos más utilizados internacionalmente, que
consiste en un análisis seminal asistido por computador (CASA, de sus siglas en
inglés computer-assisted sperm analysis), el cual funciona con un software que
clasifica los espermios según sus diferentes aspectos de movimiento. Los
resultados relacionados con ella pueden ser empleados en diversas disciplinas y
actividades relacionadas con la producción porcina.
TÉRMINOS Y DEFINICIONES
ACS: Grado Reactivo Analítico. Son aquellos productos que cumplen con las
normas de la ACS (American Chemical Society) son los más frecuentemente
utilizados; cuando una empresa confiable hace referencia a ellos, es garantía de
su funcionalidad en el laboratorio.
PRS-CODEX: Productos que satisfacen los requisitos establecidos en las
farmacopeas más utilizados en la industria farmacéutica como son la Farmacopea
Europea (Ph.Eur), la Farmacopea Británica (BP) y la Farmacopea de los Estados
Unidos (USP)
C.s.p: cantidad suficiente para.
197
MÉTODO 1: EVALUACIÓN DE LA MOVILIDAD ESPERMÁTICA MEDIANTE UN SISTEMA DE ANALISIS SEMINAL ASISTIDO POR COMPUTADOR
PRINCIPIO Y DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO La movilidad espermática, se ha considerado que es un requisito fundamental
para la fecundación, debido a su relación con la penetración de la zona pelúcida
luego de la llegada de los espermatozoides al sitio de fecundación por la acción
contráctil el útero, esta junto con la morfología son los parámetros más
significativos para predecir el éxito de fertilización.
Tradicionalmente la movilidad ha sido evaluada en un microscopio de contraste de
fase por un técnico que otorga puntuaciones según su criterio, lo cual, da lugar
una interpretación subjetiva y de carácter individual; además, la variación de los
resultados entre técnicos dificulta estimar el efecto de la movilidad espermática en
la fertilidad in-vivo. Para sustraer la subjetividad en los análisis, se han generado
diferentes técnicas de evaluación como el sistema CASA que nos permite hacer
una evaluación objetiva de las características diferenciales entre cada una de las
células espermáticas. Los eyaculados porcinos con menos del 60% de movilidad progresiva y menos del
70 % de movilidad total, no son recomendables para inseminación artificial.
REACTIVOS (Pureza, concentración y preparación) Agua desmineralizada Tipo II.
Glucosa anhidra. PRS-CODEX
Citrato de sodio bihidrato (Na3C6H5O7.2H2O) 99 % de pureza, A.C.S.
Cloruro de potasio (KCl) 99,5% de pureza, A.C.S.
Sulfato de kanamicina (C18H36N4O11H2O4S) para cultivo celular
Bicarbonato de sodio (NaHCO3) 99% de pureza, A.C.S.
EDTA ((Ethylenedinitrilo) tetraacetic acid) (C10H16N2O8) 99% de pureza, para
cultivo celular.
Kanamicina sulfato (C18H36N4O11H2O4S), para cultivo celular
198
Solución BTS (Beltsville Thawing Solution (w/v): se disuelven 37 g de glucosa,
6 g de citrato de sodio, 1,25 g de bicarbonato de sodio, 1,25 g de EDTA, 0,75 g
de cloruro de potasio y kanamicina al 7% (70 mg de kanamicina en agua
desmineralizada Tipo II c.s.p. 1000 mL).
EQUIPOS Y MATERIALES
Balanza semianalítica
Micropipeta de 10-100 µL (puntas desechables)
Micropipeta de 1-10 µL (puntas desechables)
Microscopio de contraste de fases con objetivo de 10 X y cámara adaptada.
Computador
Software Sperm Class Analizer® v.5.1 MICROPTIC
Viales desechables de plástico de 1,5 mL, con tapa.
Guantes de nitrilo
Cámara leja de 20 micras de profundidad
Baño maría
Placa térmica
Vortex
PREPARACIÓN Y PRESERVACIÓN DE MUESTRAS
El material a analizar es una contramuestra de semen diluido refrigerado,
preparada en cada granja y transportada al laboratorio de acuerdo con sus propios
protocolos. Los criterios básicos aplicados son: dosis seminales de 80 a 100 mL
con 2,5-3 x109 células, empacadas en recipientes plásticos estériles bien cerrados
y completamente identificados, refrigeradas a 15-16 °C, y enviadas al laboratorio
inmediatamente después de procesadas.
199
PROCEDIMIENTO
Preparación de la suspensión
Homogenizar manualmente la muestra de semen durante un minuto y depositar
50 µl de semen e igual cantidad de BTS (relación 1:1 (V/V)) en un vial desechable
de plástico de 1,5 mL, con tapa. Agitar la preparación en vortex y llevar al baño
maría a 37°C durante 5 minutos, agitar nuevamente en vortex y trasferir 3 µL a
una cámara leja, dejar en reposo por 1 min. Las puntas y las cámaras leja deben
estar previamente atemperadas en placa térmica a 37°C.
Evaluación en el microscopio con el sistema SCA®
Se realiza el análisis de la suspensión después del tiempo de reposo. Previamente
se registra la información de la muestra como: identificación, pH, volumen, fecha y
hora de recogida, fecha de análisis, granja y línea genética del macho. Se evalúan
mínimo 4 campos (4 fotografías) y se cuentan mínimo 400. El software clasifica
cada espermatozoide según sus características individuales de movilidad y arroja
los resultados en porcentaje de cada una de las categorías de movilidad.
PRESENTACIÓN DE LOS RESULTADOS
La movilidad espermática se reporta en porcentaje de movilidad progresiva y total,
o en caso de ser requerido se reporta las características de velocidad y linealidad
del movimiento.
BIBLIOGRAFIA
Broekhuijse, M. L. W. J., E. Šoštarić, H. Feitsma, y B. M. Gadella. 2011. Additional value of
computer assisted semen analysis (CASA) compared to conventional motility assessments in pig artificial insemination. Theriogenology 76: 1473-‐1486.
200
Dott, H. M., y G. C. Foster. 1979. The estimation of sperm motility in semen, on a membrane slide, by measuring the area change frequency with an image analysing computer. J Reprod Fertil 55: 161-‐166.
Gil, M. C., M. Garcia-‐Herreros, F. J. Baron, I. M. Aparicio, A. J. Santos, y L. J. Garcia-‐Marin. 2009. Morphometry of porcine spermatozoa and its functional significance in relation with the motility parameters in fresh semen. Theriogenology 71: 254-‐263.
Langendijk, P., E. G. Bouwman, A. Kidson, R. N. Kirkwood, N. M. Soede, y B. Kemp. 2002.
Role of myometrial activity in sperm transport through the genital tract and in fertilization in sows. Reproduction 123: 683-‐690.
Langendijk, P., N. M. Soede, y B. Kemp. 2005. Uterine activity, sperm transport, and the role of boar stimuli around insemination in sows. Theriogenology 63: 500-‐513.
Maes, D., T. Rijsselaere, P. Vyt, A. Sokolowska, W. Deley, y A. Van Soom. 2010. Comparison of five different methods to assess the concentration of boar semen. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift 79: 42-‐47.
201
DETERMINACIÓN DE SUPERVIVENCIA ESPERMÁTICA DESCRIPTORES: Semen porcino; calidad seminal;
Supervivencia espermática OBJETO
Esta norma describe la determinación de la supervivencia espermática en semen
porcino, mediante dos de los métodos más utilizados internacionalmente, a saber:
coloración con Eosina-Nigrosina y evaluación celular en microscopio de campo
claro; y coloración con PI–SYBR-14 y evaluación celular en microscopio de
fluorescencia. Los resultados relacionados con ellas pueden ser empleados en
diversas disciplinas y actividades relacionadas con la producción porcina.
TÉRMINOS Y DEFINICIONES
Supervivencia espermática: método de evaluación de la integridad estructural de
las membranas espermáticas.
ACS: Grado Reactivo Analítico. Son aquellos productos que cumplen con las
normas de la ACS (American Chemical Society) son los más frecuentemente
utilizados; cuando una empresa confiable hace referencia a ellos, es garantía de
su funcionalidad en el laboratorio.
PRS-CODEX: Productos que satisfacen los requisitos establecidos en las
farmacopeas más utilizados en la industria farmacéutica como son la Farmacopea
Europea (Ph.Eur), la Farmacopea Británica (BP) y la Farmacopea de los Estados
Unidos (USP).
202
Biological Stain Commission: comisión encargada de garantizar la calidad de
los colorantes a través de pruebas independientes de acuerdo a la química
adecuada y rigurosa, y a criterios de desempeño.
C.s.p: cantidad suficiente para.BSA: Albumina sérica bovina. Es una proteína
plasmática extraída del suero bovino, ampliamente usada en muchos
procedimientos de bioquímica y como nutriente en cultivos celulares. Usualmente
se agrega como fuente de proteínas a los medios de cultivo, para proteger a las
células de sustancias tóxicas y para reducir la tensión superficial del medio,
evitando que células se adhieran al instrumental.
BTS: De su nombre en inglés, Beltsville Thawing Solution. La Solución Beltsville
de descongelación es un diluyente para semen porcino que evita los procesos
degenerativos luego del eyaculado como pérdida de motilidad, alteraciones del
acrosoma y descondensación del material cromatínico. Dispone de una fuente de
azúcares para buena motilidad en el momento de la inseminación y tampones que
disponen de grupos ionizables positivos y negativos capaces de mantener el pH
en rangos fisiológicos y controlan la acidificación del medio.
METODO 1: COLORACIÓN CON EOSINA-NIGROSINA Y EVALUACIÓN CELULAR EN MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO.
PRINCIPIO Y DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
La supervivencia espermática es una prueba de gran importancia ya que evalúa
la integridad estructural de la membrana plasmática y discrimina entre
espermatozoides vivos y muertos. La integridad de la membrana no sólo es
importante para asegurar el metabolismo celular, sino que los cambios en sus
propiedades son decisivos en el proceso de capacitación y fecundación. El
fundamento de la prueba, se basa en que la membrana intacta de una célula viva
impide el paso de la Eosina al interior de la misma, mientras que células con la
membrana estructuralmente dañadas permiten el paso del colorante y la tinción de
203
la célula. Los eyaculados porcinos con menos del 80% de espermatozoides vivos
no son recomendables para inseminación artificial.
REACTIVOS (Pureza, concentración y preparación)
Agua desmineralizada Tipo II
Eosina B (C20H6N2O9Br2Na2O9) para microscopía, A.C.S.
Nigrosina certificado por la Biological Stain Commission.
Citrato de sodio bihidrato (Na3C6H5O7.2H2O) 99 % de pureza, A.C.S.
Solución de Eosina al 2% (w/v): se disuelven 0,2 g de Eosina, 0,3 g
de citrato de sodio en agua desmineralizada Tipo II c.s.p. 10 mL. no
agitar la solución antes de usar.
Solución de nigrosina al 10% (w/v): Disolver 1 g de Nigrosina en
agua desmineralizada Tipo II c.s.p. 100 mL. no agitar las solución
antes de usar.
EQUIPOS Y MATERIALES
Balanza semianalítica
Micropipeta de 0,5-10 µL (puntas desechables)
Microscopio de campo claro con objetivo de 40 x
Contador manual con capacidad mínima de conteo 100
Portaobjetos de vidrio de 75x25 mm
Frasco de tapa rosca estéril de 50 mL
Guantes de nitrilo
PREPARACIÓN Y PRESERVACIÓN DE MUESTRAS
El material a analizar es una contramuestra de semen diluido refrigerado,
preparada en cada granja y transportada al laboratorio de acuerdo con sus
propios protocolos. Los criterios básicos aplicados son: dosis seminales de
80 a 100 mL con 2,5-3 x109 células, empacadas en recipientes plásticos
estériles bien cerrados y completamente identificados, refrigeradas a 15-
17,7°C, y enviadas al laboratorio inmediatamente después de procesadas.
204
PROCEDIMIENTO Preparación de la suspensión
Homogenizar manualmente la muestra de semen y depositar 6 µL de
semen en un extremo del portaobjeto; luego se coloca una gota con 2 µL de
Eosina sobre el semen y seguidamente se colocan 6 µL de Nigrosina.
Luego se mezcla brevemente el semen y los colorantes con la parte
transversal de una punta desechable y con esta misma se realiza un
extendido sobre el portaobjetos. Esperar hasta que se seque el extendido
antes de realizar la lectura en el microscopio.
Observación en el microscopio
Se realiza la observación del extendido después del tiempo de secado. Se
hace 1 conteo de 100 espermatozoides clasificando los espermatozoides
en coloreados o vivos, y no coloreados o muertos. Como se muestra en la
figura 1
PRESENTACIÓN DE LOS RESULTADOS
El resultado de supervivencia espermática se reporta en porcentaje de
espermatozoides vivos o no coloreados.
METODO 2: COLORACIÓN CON PI-SYBR14 Y EVALUACIÓN CELULAR EN MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
PRINCIPIO Y DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
Con este método se pueden distinguir y cuantificar fácilmente las células
vivas y muertas; los dos colorantes reaccionan con el DNA y se exitan con
la misma longitud de onda. El Yoduro de propidio (PI, de la nominación en
inglés: propidium iodide) es un colorante que tiene la propiedad de
205
atravesar la membrana plasmática permeable (dañada) o en proceso de
degeneración, para unirse y teñir el ADN celular, sirviendo de indicador del
daño de la membrana. Cuando el PI penetra la célula, emite una
fluorescencia roja en la cabeza del espermatozoide. El SYBR-14 es capaz
de atravesar membranas celulares intactas y por tanto permite identificar la
población de espermatozoides viables, los cuales emiten fluorescencia
verde en su cabeza. Ambas coloraciones se detectan mediante microscopía
de fluorescencia con un filtro de 488nm.
REACTIVOS (Pureza, concentración y preparación)
Agua desmineralizada Tipo II
LIVE/DEAD Sperm Viability Kit (L-7011) Molecular Probes:
Solución stock de SYBR-14: 100 µL de una solución 1 mM en DMSO.
Solución stock de PI: 5 mL de una solución 2,4mM en agua.
HEPES (C8H18N2O4S) pureza del 95%, ACS.
Albumina sérica bovina (BSA, de su denominación en inglés: Albumin from
bovine serum) pureza del 96% ACS.
Cloruro de sodio cristal (NaCl) 99, 6 % de pureza, A.C.S.
Glucosa anhidra. PRS-CODEX
Citrato de sodio bihidrato (Na3C6H5O7.2H2O) 99 % de pureza, A.C.S.
Cloruro de potasio (KCl) 99,5% de pureza, A.C.S
Sulfato de kanamicina (C18H36N4O11H2O4S) para cultivo celular
Bicarbonato de sodio (NaHCO3) 99% de pureza, A.C.S.
EDTA ((Ethylenedinitrilo) tetraacetic acid) (C10H16N2O8) 99% de pureza, para
cultivo celular.
206
Buffer HEPES (w/v): se disuelven 0,25 g de HEPES, 0,88 g de cloruro de sodio
y Albumina sérica bovina al 10% (10,42 g) en agua desmineralizada tipo II
c.s.p. 100 mL.
Solución de trabajo de SYBR14: Se disuelve 10 µL de solución stock de SYBR-
14 en 500 µL de buffer HEPES dilución 1:50. Esta solución se debe preparar el
mismo día de realizar la prueba, no se debe almacenar ni reutilizar; la solución
de PI se utiliza sin realizar ninguna dilución.
Solución BTS (Beltsville Thawing Solution (w/v): se disuelven 37 g de glucosa,
6 g de citrato de sodio, 1,25 g de bicarbonato de sodio, 1,25 g de EDTA, 0,75 g
de cloruro de potasio y kanamicina al 7% (70 mg de kanamicina en agua
desmineralizada Tipo II c.s.p. 1000 mL).
EQUIPOS Y MATERIALES
Balanza semianalítica
Micropipeta de 100-1000 µL (puntas desechables)
Micropipeta de 1-10 µL (puntas desechables)
Microscopio epifluorescencia con Filtro de 488 nm y con objetivo de 100 x
Contador manual con capacidad mínima de conteo 100
Viales desechables de plástico de 1,5 mL, con tapa.
Portaobjetos de vidrio de 75x25 mm y laminilla de 22x22 mm
Frasco de tapa rosca estéril de 50 mL
Guantes de nitrilo
Baño maría a 36-38°C
Nevera de almacenamiento a -20°C
207
PREPARACIÓN Y PRESERVACIÓN DE MUESTRAS
El material a analizar es una contramuestra de semen diluido refrigerado,
preparada en cada granja y transportada al laboratorio de acuerdo con sus propios
protocolos. Los criterios básicos aplicados son: dosis seminales de 80 a 100 mL
con 2,5-3 x109 células, empacadas en recipientes plásticos estériles bien cerrados
y completamente identificados, refrigeradas a 15-17,7°C, y enviadas al laboratorio
inmediatamente después de procesadas.
PROCEDIMIENTO
Hacer una dilución de la muestra de semen en BTS a una concentración de 5x 106
espermatozoides/mL y atemperarla a 36°C.
Agregar 5 µL de la solución de trabajo de SYBR-14 a 1 mL del semen diluido, para
una concentración final de 100 nM e incubar por 5 min a 36°C.
Agregar a la mezcla anterior 5 µL de PI a la muestra de semen, para una
concentración final de PI 12 µM e incubar por 5 min a 36°C.
Aplicar 5 µL de la mezcla en un portaobjetos de vidrio y colocar cubreobjetos.
Examinar las placas inmediatamente en un microscopio de epifluorescencia a
1000 X de magnificación, con un filtro de 488 nm, observando un mínimo de 200
espermatozoides por placa, para estimar la proporción de espermatozoides vivos y
muertos.
La microscopía de fluorescencia permite observar hasta 3 categorías celulares
diferentes:
1. células vivas que se tiñen con el SYBR-14, color verde
208
2. células muertas que tiñen con el PI, color rojo
3. células moribundas que tiñen simultáneamente de ambos colorantes.
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS El resultado en la prueba se presenta en porcentajes de cada una de las categorías celulares.
BIBLIOGRAFIA
Garner, D.L., and L.A. Johnson. 1995. Viability assessment of mammalian sperm using SYBR-14 and Propidium Iodide. Biology of Reproduction. 53: 276-284. Pérez-Llano, B., R. Sala, G. Reguera, and P. García-Casado. 2009. Changes in subpopulations of boar sperm defined according to viability and plasma and acrosome membrane status observed during storage at 15 ºC. Theriogenology 71: 311–317. Yi, Y.J., Z.H. Li, E.S. Kim, E.S. Song, H.B. Kim, P.Q. Cong, J.M. Lee, C.S. Park. 2008. Comparison of Motility, Acrosome, Viability and ATP of Boar Sperm with or without Cold Shock Resistance in Liquid Semen at 17°C and 4°C, and Frozen-thawed Semen. Asia-Australian Journal of Animal Science. 21 (2): 190 – 197.
209
FORMULARIO PARA LA EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LAS BÚSQUEDAS
FACTORES ASOCIADOS A LA PRESENTACIÓN DE GOTAS CITOPLASMICAS
EN ESPERMATOZOIDES DE CERDOS
Información General Código
1 Identificación de Referencia (endNote)
2 Autor 3 Año de
Publicación
4 Tipo de Publicación
5 Idioma 6 País donde se
realizó el estudio
7 Año del estudio
Calidad del Documento
SI No Código 8 Se presentan los criterios usados para la
determinación de tamaño de la muestra
9 Se encuentran los criterios de inclusión y exclusión de los animales en el estudio
10 Se describen o presentan los factores asociados a la presentación de las gotas citoplásmicas (variables)
11 Se encuentran las características de los animales estudiados.(Alojamiento, alimentación, entre otros)
12 Se incluyen detalles sobre la prevalencia de presentación de las gotas antes de iniciar el estudio
13 Se realiza una descripción de los protocolos de diagnóstico utilizados en el trabajo
14 Se describen tratamientos o intervenciónes en los animales.
15 Se describe la forma de selección de los grupos.
16 En la estructura jerárquica usada para el análisis se realizan evaluaciones repetidas
210
en un mismo macho. 17 La estadística usada en el análisis es
apropiada
Diseño del estudio y análisis
SI No Código
18 Se decribe o presenta el tipo de diseño experimental del estudio
19 Se define tipo de población estudida 20 Se indica el número de muestras de semen
evaludas.
21 Se presenta la edad de los verracos 22 Se encuentra la descripción del genotipo de
los verracos
23 Se tiene clara la unidad o nivel de análisis 24 Se indica el numero de tratamientos en los
grupos
25 Se especifica la duración del estudio (en meses)
26 Se tuvieron en cuenta las unidades experimentales perdidas en el estudio para la diferencia
27 Se especifica la frecuencia de realización de las evaluaciones seminales
28 Se describen o indican el o los método (s) usado(s) en la determinación de las gotas citoplásmicas.
211
Universidad de Caldas
Facultad de Ciencias Agropecuarias Doctorado en Ciencias Agrarias
Instituto de Biotecnología Agropecuaria
Efecto de las gotas citoplásmicas sobre la capacidad fecundante del espermatozoide en el cerdo
Objetivo: Determinar el efecto de las gotas citoplásmicas sobre la capacidad fecundante del espermatozoide en el cerdo.
Instrumento de recolección diario de temperatura y humedad
Nombre de la Granja: ______________________________________
semana 1
Lunes Martes Miércoles Jueves Viernes Sábado Domingo
Temp Hum Temp Hum Temp Hum Temp Hum Temp Hum Temp Hum Temp Hum
7:00 a.m 1:00 p.m
7:00 p.m
semana 2
Lunes Martes Miércoles Jueves Viernes Sábado Domingo
Temp Hum Temp Hum Temp Hum Temp Hum Temp Hum Temp Hum Temp Hum
7:00 a.m
1:00 p.m
7:00 p.m
semana 3
Lunes Martes Miércoles Jueves Viernes Sábado Domingo
Temp Hum Temp Hum Temp Hum Temp Hum Temp Hum Temp Hum Temp Hum
7:00 a.m
1:00 p.m
7:00 p.m
semana 4
Lunes Martes Miércoles Jueves Viernes Sábado Domingo
Temp Hum Temp Hum Temp Hum Temp Hum Temp Hum Temp Hum Temp Hum
7:00 a.m 1:00 p.m
7:00 p.m
Observaciones Universidad de Caldas
212
Facultad de Ciencias Agropecuarias Doctorado en Ciencias Agrarias
Instituto de Biotecnología Agropecuaria Efecto de las gotas citoplásmicas sobre la capacidad
fecundante del espermatozoide en el cerdo Objetivo: Determinar el efecto de las gotas citoplásmicas sobre la capacidad fecundante del espermatozoide en el cerdo.
INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE INFORMACIÓN EN GRANJA. Fecha: D_____ M_______ A_______
Nombre del técnico:
Teléfono
E mail
Componente de ubicación
Nombre de la granja _______________ Departamento ___________________ Municipio _______________________ Vereda ________________________ Latitud ________________________ Longitud ______________________ Altitud ________________________
Componente climático
Temperatura media en 0C: _______ Humedad relativa %: ________ Precipitación: ___________
Componente animal de la granja
Número total de machos:____________________________ Número de machos en servicio: _________________ Numero de machos de reemplazo: _______________
Centro de Inseminación: Si____ No______
213
Semen para auto consumo: Si_____ No______ Semen para Venta y auto consumo: Si____ No_____ Componente técnico Alojamiento de cada macho en m2: __________
Está en corral aislado: Si_____ No_____ Está el corral en el galpón de cerdas: Si ____, No ______
Tipo de Ventilación utilizada Natural_______ Artificial_______ , Ambas _______. Otra _____, Cual ______ Tipo de Luz utilizada: Natural ______, Artificial _______, Ambas _______. Otra _____, Cual ______ Altura de los muros: (m):_______________ Operarios:
Número total de operarios dedicados a los machos:
Cuantos son hombres: __________
Cuantos son mujeres: ______________
Número de operarios por cada macho: _____________
Tiempo con el reproductor Meses: D___ M____ A_____
Con que frecuencia se cambia o rota el operario: Semanal:_____,
Quincenal: _____, Mensual: _____, Otro Cual?_________, Nunca___
Fecha del último cambio de operario: D___ M____ A_____
Fecha de ingreso del operario mas antiguo: D___ M____ A_____
Fecha de ingreso del operario mas nuevo: D___ M____ A_____
Observaciones:
214
Componente animal (DILIGENCIAR POR CADA REPRODUCTOR)
Identificación del macho Raza o genotipo Edad (meses) Fecha ingreso
Los machos en la granja hacen ejercicio? Si___ No___ Tipo de ejercicio:
Caminar ______Detección de celo_______ Combina ______Otro______ Cual_______________________ • Frecuencia: Diario___ Semanal_____ • Tiempo de duración del ejercicio (minutos):____________ • Horario: A.M._____, A.M. P.M. _______, P.M._______ Cada cuanto se cambian los machos en la granja: _________________
Observaciones
Componente Reproductivo:
ID macho
Edad 1er eyaculado meses
Edad entrada en servicio. meses
Tiempo de servicio total meses
Tiempo de servicio en la granja (si es
Hora de eyaculación.
Frecuencia de eyaculación por semana
Se usa para detección de celo
Frecuencia de uso en la detección por semana
Tiempo de duración de la detección min.
1 a.m y
6 a.m y
6 pm.
1 2 3 > tres
Si
No
1 2 Mas de
30
60
> 60
215
nuevo). Meses
6 a.m
12 m
y 12 pm
3
Observaciones Componente Alimentación: Tipo de alimento suministrado regularmente a los machos:
Alimento comercial Gestación Lactancia Ceba Machos
Frecuencia de
suministro al día
Cantidad total Kg
Frecuencia suministro
al día
Cantidad total Kg
Frecuencia de
suministro al día
Cantidad total Kg
Frecuencia de
suministro al día
Cantidad total Kg
Una Dos Una Dos Una Dos Una Dos
Alimento propio Gestación Lactancia Ceba Machos
Frecuencia de
Cantidad total Kg
Frecuencia suministro
Cantidad total Kg
Frecuencia de
Cantidad total Kg
Frecuencia de
Cantidad total Kg
216
suministro al día
al día suministro al día
suministro al día
Una Dos Una Dos Una Dos Una Dos
Observaciones: Suplementación:
Tipo de suplementación: Vitaminas:______, Cuales:________ Cantidad en
gramos_______. Frecuencia: Diaria: ____, Semanal:
_____, Mensual: _______. Otra:______, Cual:________
Minerales:_______, Cuales:________ Cantidad en
gramos_______. Frecuencia: Diaria: ____, Semanal:
_____, Mensual: _______. Otra:______, Cual:________
Otra:_________, Cual:______________, Cantidad en
gramos_______. Frecuencia: Diaria: ____, Semanal:
_____, Mensual: _______. Otra:______, Cual:________
Componente Sanitario Vacunación: Si___ No__
Vacuna Frecuencia Tipo de vacuna Trimestral Semestral Anual
Parvovirosis – Leptospirosis – Erisipelosis
Mycoplasma
Peste porcina.
Parvovirosis
Leptospirosis
217
Observaciones: Vermifugación: Si__ No__
Frecuencia aplicación Vía aplicación Producto Trimestral Semestral Anual Oral Alimento
medicado Parenteral
Fenbendazol. Ivermectina. Triclorfon. Febantel. Levamisol.
Observaciones: Control de ectoparásitos Si___ No___
Frecuencia aplicación Vía aplicación Producto Quincenal Mensual Trimestral Aspersión Alimento
medicado Parenteral
Piretroides Carbamatos Organofosforados.
Observaciones: Control de moscas o insectos
Frecuencia aplicación Vía aplicación
218
Producto Quincenal Mensual Trimestral Aspersión Cebos Trampas Piretroides Organofosforados
Observaciones Medicamentos mas frecuentemente usado(S) en el tratamiento de los machos
Vía de medicación Medicamento Agua de bebida Alimento medicado Parenteral Penicilina Aminoglucósidos Cefalosporinas Sulfas Macrólidos Teraciclinas Quinolonas Fenicoles Diterpenicos Anti inflamatorios Bronco secretoliticos Suplementos Vitamínicos Sedantes
Motivo del tratamiento mas frecuente en la granja Fiebre, _____ cojera,_______ inapetencia,_______, tos,_____,
diarrea____, Otro:_____, Cual: ___________ Observaciones: Serologías
ID Serología Fecha Resultado Titulo Frecuencia
219
Macho Mensual Trimestral Semestral Anual Parvovirosis Leptospirosis Erisipelosis Mycoplasmosis Circovirus PRRS
FAVOR ENVIAR LOS RESULTADOS DE LAS SEROLOGIAS REALIZADAS A LOS MACHOS CADA QUE LLEGUEN LOS RESULTADOS. Observaciones:
220
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Doctorado en Ciencias Agrarias Instituto de Biotecnología Agropecuaria
Efecto de las gotas citoplásmicas sobre la capacidad fecundante del espermatozoide en el cerdo
Objetivo: Determinar e l efecto de las gotas c i toplásmicas sobre la capacidad fecundante del espermatozoide en el cerdo.
INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE INFORMACIÓN PARA NOVEDADES DE MACHO
DILIGENCIAR CADA QUE SUCEDA UN EVENTO O CAMBIO EN LA
RUTINA NORMAL DEL MACHO Fecha: D_____ M_______ A_______
Identificación del macho: _________________
Raza o genotipo: ________________________
Nombre de la granja: ____________________
Nombre del operario: ____________________
Alimentación
Fecha de inicio del cambio de alimentación: D:_______, M:_________,
A:___________
El cambio de alimentación fue: Temporal:_________,
Permanente:_____________
Si fue temporal: Fecha de inicio: D:_______, M:_________,
A:___________
Fecha final: D:_______, M:_________, A:
__________
Tipo de alimento: Comercial: Gestación_________, Levante:________,
Ceba_______. Cantidad en Kilos________
221
Propio: Gestación_________, Levante:________,
Ceba_______. Cantidad en Kilos________
Si fue permanente: Fecha de inicio: D:_______, M:_________,
A:___________
Alimento comercial Gestación Lactancia Ceba Machos
Frecuencia de
suministro al día
Cantidad total Kg
Frecuencia suministro
al día
Cantidad total Kg
Frecuencia de
suministro al día
Cantidad total Kg
Frecuencia de
suministro al día
Cantidad total Kg
Una Dos Una Dos Una Dos Una Dos
Alimento propio Gestación Lactancia Ceba Machos
Frecuencia de
suministro al día
Cantidad total Kg
Frecuencia suministro
al día
Cantidad total Kg
Frecuencia de
suministro al día
Cantidad total Kg
Frecuencia de
suministro al día
Cantidad total Kg
Una Dos Una Dos Una Dos Una Dos
Suplementación: Fecha de inicio de la suplementación: D:_______, M:_________,
A:___________
La suplementación fue: Temporal:_________, Permanente:_____________
Si fue temporal: Fecha de inicio: D:_______, M:_________,
A:___________
Fecha final: D:_______, M:_________, A:
__________
222
Tipo de suplementación: Vitaminas:______, Cantidad en gramos_______.
Cuales:__________________________
Minerales:_______, Cantidad en gramos:______.
Cuales:___________________________
Frecuencia: Diaria: ____, Semanal: _____, Mensual:
_______.
Otra:______, Cual:________
Frecuencia: Diaria: ____, Semanal: _____, Mensual:
_______. Otra:______, Cual:________
Si fue permanente: Fecha de inicio: D:_______, M:_________,
A:___________
Tipo de suplementación: Vitaminas:______, Cantidad en gramos_______.
Cuales:__________________________
Minerales:_______, Cantidad en gramos:______.
Cual___________________________
Otra: _____, Cual _________________,
Cantidad:_____________.
Frecuencia: Diaria: ____, Semanal: _____, Mensual:
_______. Otra:______, Cual:________
Observaciones:
223
Componente Sanitario Vacunación: Fecha: D:______, M:_______, A:__________
I.D Macho Vacuna Frecuencia Tipo de vacuna Trimestral Semestral Anual
Parvovirosis – Leptospirosis – Erisipelosis
Mycoplasma Peste porcina. Parvovirosis Leptospirosis
Observaciones: Vermifugación: Fecha: D:______, M:_______, A:__________
Producto Frecuencia aplicación Vía aplicación I.D
Macho Trimestral Semestral Anual Oral Alimento
medicado Parenteral
Fenbendazol. Ivermectina. Triclorfon. Febantel. Levamisol.
Observaciones: Control de ectoparásitos Fecha: D:______, M:_______, A:__________
Producto Quincena
l Mensual Trimestral Aspersión Alimento
medicado Parenteral
Piretroides
Carbamatos
Organofosforados
Observaciones:
224
Serologías FAVOR ENVIAR LOS RESULTADOS DE LAS SEROLOGIAS.
Serología Fecha Frecuencia
Mensual Trimestral Semestral
Parvovirosis
Leptospirosis
Erisipelosis
Mycoplasmosis
Circovirus
PRRS
Observaciones: Señale los medicamentos y la vía de medicación utilizados para tratamiento de los machos. Fecha: D:______, M:_______, A:__________
Vía de medicación Medicamento Agua de bebida Alimento medicado Parenteral Penicilina Aminoglucósidos Cefalosporinas Sulfas Macrólidos Teraciclinas Quinolonas Fenicoles Diterpenicos Anti inflamatorios Bronco secretoliticos Suplementos Vitamínicos Sedantes
Motivo del tratamiento:
Fiebre, _____ cojera,_______ inapetencia,_______, tos,_____, diarrea____
Otro:______. Cual:_______
Observaciones:
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Efecto de las gotas citoplásmicas sobre la capacidad fecundante del espermatozoide en el cerdo
Objetivo: Determinar el efecto de las gotas citoplásmicas sobre la capacidad fecundante del espermatozoide en el cerdo.
INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE INFORMACIÓN INDIVIDUAL PARA CAMBIO DE DIETA EN LOS MACHOS EN GRANJA
Fecha: D_____ M_______ A_______
Nombre de la granja: ____________________ Identificación del macho: __________________ Componente Alimentación
Cambio de dieta: Si___ No___ (Diligenciar cuando suceda) Tipo de alimento: Gestación,___, Lactancia, __ Ceba____ Machos
o Fecha: o Fecha inicio: D___ M____ A_____ o Fecha finalización: D___ M____ A_____
Suplementación: Si___ No___ (Diligenciar cuando suceda) Clase de suplemento: Proteínico___ Energético____ vitamínico___ Mineral_____ Cual?________________________ Frecuencia de suministro: Diario Semanal Cual_______ Cantidad en Kg. Fecha inicio: D___ M____ A_____ Fecha finalización D___ M____ A_____
Observaciones:
226
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Doctorado en Ciencias Agrarias Instituto de Biotecnología Agropecuaria
Efecto de las gotas citoplásmicas sobre la capacidad fecundante del espermatozoide en el cerdo
Objetivo: Determinar el efecto de las gotas citoplásmicas sobre la capacidad fecundante del espermatozoide en el cerdo.
INSTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE INFORMACIÓN INDIVIDUAL PARA ENFERMEDAD Y TRATAMIENTO DE MACHOS
Fecha: D_____ M_______ A_______
Nombre de la granja: ____________________ Identificación del macho: __________________ Enfermedades: Si, ______, No ________ • Fecha inicio de los síntomas: D___ M____ A_____
• Fecha inicio tratamiento: D___ M____ A_____
• Fecha fin tratamiento: D___ M____ A_____
Vacunación
Vacuna Frecuencia Tipo de vacuna Trimestral Semestral Anual
Parvovirosis – Leptospirosis – Erisipelosis
Mycoplasma Peste porcina. Parvovirosis Leptospirosis
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Vermifugación
Producto Oral Alimento medicado Parenteral Frecuencia Fenbendazol. Trimestral Semestral Anual Ivermectina. Triclorfon. Febantel. Levamisol.
Control de ectoparásitos Si___ No___
Producto Quincenal Mensual Trimestral Aspersión Alimento
medicado Parenteral
Piretroides Carbamatos
Organofosforados
Medicamento (s) suministrado (s)
Vía de medicación Medicamento Agua de bebida Alimento medicado Parenteral Penicilina Aminoglucósidos Cefalosporinas Sulfas Macrólidos Teraciclinas Quinolonas Fenicoles Diterpenicos Anti inflamatorios Bronco secretoliticos Suplementos Vitamínicos Sedantes
228
Motivo del tratamiento:
Fiebre,_____ cojera,_______ inapetencia,_______, tos,_____, diarrea____ Otros______, ¿Cual? _______________________________ Observaciones:
