EFECTO DE LA INOCULACIÓN DE BACTERIAS ENDÓFITAS EN EL ...
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EFECTO DE LA INOCULACIÓN DE BACTERIAS ENDÓFITAS EN EL CULTIVO DE ARROZ, SOBRE LA TOLERANCIA AL DAÑO CAUSADO POR Rhizoctonia solani Kühn Greivin Mauricio Rojas Granados TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE PROFESIONAL DE INGENIERO AGRÓNOMO CON EL GRADO DE LICENCIADO EN AGRONOMÍA ESCUELA DE AGRONOMIA FACULTAD DE CIENCIAS AGROALIMENTARIAS UNIVERSIDAD DE COSTA RICA 2018
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EFECTO DE LA INOCULACIÓN DE BACTERIAS ENDÓFITAS EN EL
CULTIVO DE ARROZ, SOBRE LA TOLERANCIA AL DAÑO CAUSADO
POR Rhizoctonia solani Kühn
Greivin Mauricio Rojas Granados
TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE PROFESIONAL DE INGENIERO AGRÓNOMO CON EL GRADO DE LICENCIADO
EN AGRONOMÍA
ESCUELA DE AGRONOMIA FACULTAD DE CIENCIAS
AGROALIMENTARIAS UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
2018
II
Agradecimientos
A Dios, por bendecirme en todos los aspectos de mi vida desde
siempre y hasta el día de hoy. A mi familia por darme siempre el apoyo
necesario para soñar en convertirme en un profesional. Al profesor y amigo;
M. Sc. Oscar Castro Zúñiga, por su invaluable interés de transmitir su vasto
conocimiento y aceptar dirigir este proyecto de tesis, su dedicación y
profesionalismo los llevaré siempre presentes como el mejor de los
ejemplos a seguir en el desarrollo de mi persona como profesional. A la Dra.
Lidieth Uribe Lorío y Dra. María del Milagro Granados Montero y M.Sc.
Álvaro Azofeifa Delgado, por su apoyo y aceptar ser parte del comité
evaluador de este trabajo. A Lic.Gabriela Chinchilla Salazar por su valioso
apoyo durante el desarrollo experimental de la investigación. A M.Sc. Juan
Ramón Navarro Flores por su paciencia y profesionalismo con la que me
ayudó enormemente. A M.Sc. Guillermo Vargas Cartagena por la
colaboración en el desarrollo de la tesis con su vasto conocimiento en el
tema. A mis compañeros de carrera en cada uno de los cursos, todos fueron
de suma importancia para forjar cada aspecto necesario de mi formación
integral, a ellos debo no solo los aprendizajes académicos, sino muchas
experiencias que atesoro en mi memoria con mucha nostalgia y
satisfacción.
III
Dedicatoria
A mis padres: Félix Ángel Rojas Conejo y Grey Granados Garita. A mis
hermanos: Alejandro, Paulino, Ana Beatriz y Moisés, por estar conmigo en
todo momento y apoyarme en las decisiones que he tomado durante todo
este proceso de formación académica. A Verónica Castro Barrantes, por ser
la persona que me motivó a iniciar y concluir este proyecto de vida, su
apoyo incondicional fue de mucho valor para mí.
IV
Índice general
Acta de aprobación ....................................................................................... I
Agradecimientos .......................................................................................... II
Dedicatoria................................................................................................... III
Índice general .............................................................................................. IV
Lista de Cuadros ......................................................................................... VI
Lista de Figuras.......................................................................................... VII
Resumen ....................................................................................................... 1
Abstract ........................................................................................................ 2
Introducción ................................................................................................. 3
Antecedentes................................................................................................ 5
Generalidades del cultivo de arroz ............................................................. 5
El cultivo de arroz en Costa Rica ................................................................ 5
Principales enfermedades del arroz ........................................................... 6
Generalidades de R. Solani ........................................................................ 7
Ciclo de vida de R. solani ........................................................................... 9
R. solani en arroz ...................................................................................... 10
Bacterias endófitas ................................................................................... 11
Bacterias endófitas para el control biológico ............................................ 11
Objetivos ..................................................................................................... 13
Objetivo general ........................................................................................ 13
Objetivos específicos ................................................................................ 13
Materiales y métodos................................................................................. 14
Inoculación de las bacterias ...................................................................... 14
Siembra del arroz ...................................................................................... 16
V
Inoculación del patógeno R. solani ........................................................... 17
Diseño experimental y análisis estadístico ............................................... 21
Resultados y discusión ............................................................................. 22
Determinación de la presencia de bacterias endófitas en suelo y raíz en
los diferentes tratamientos, así como del patógeno R. solani. en las zonas
de inoculación. .......................................................................................... 22
Incidencia de síntomas de R. solani ......................................................... 23
Severidad del daño causado por R. solani ............................................... 24
Determinación de la presencia de R. solani en tejidos con presencia de
lesión de los diferentes tratamientos ........................................................ 26
Peso seco de raíz de las plantas de arroz utilizadas en ensayo 1 ........... 27
Conclusiones y recomendaciones ........................................................... 33
Conclusión ................................................................................................ 33
Recomendaciones .................................................................................... 33
Bibliografía ................................................................................................. 34
VI
Lista de Cuadros
Cuadro 1. Hectáreas del total de fincas por provincia, destinadas al cultivo
de arroz por extensión sembrada y cosechada en Costa Rica. 6
Cuadro 2. Código e identificación de las cepas de bacterias utilizadas para
evaluar la tolerancia al daño causado por R. solani en plantas de arroz. 15
Cuadro 3. Porcentaje de incidencia del daño causado por el hongo R.
solani, en plantas de arroz variedad Palmar 18 tratadas con bacterias 23
Cuadro 4. Valores medios obtenidos de las diferentes variables evaluadas
en el primer experimento. 30
Cuadro 5. Valores medios (sin diferencias significativas estadísticamente)
obtenidos de las diferentes variables evaluadas en el segundo experimento.
31
VII
Lista de Figuras
Figura 1. Estructura micelial de R. solani aislado de arroz. 1) Septos, 2)
ramificaciones en ángulo recto y 3) constricciones. 8
Figura 2. Esclerocio de R. solani, en medio de cultivo PDA. 8
Figura 3. Ciclo de vida de R. solani en el cultivo de arroz. Tomado de:
(Taheri y Tarighi, 2010) 9
Figura 4. Semillas de arroz embebidas en las suspensiones bacterianas de
concentración correspondiente a un estándar de Mc Farland número 1
(equivalente a 3 x 108 bacterias/mL). 16
Figura 5. A) Bandejas y B) potes utilizados para la siembra de arroz en los
ensayos realizados. 17
Figura 6. Placa petri con cultivo de hongo R. solani, y discos (encerrado en
círculo) utilizados para la inoculación de la paja de arroz. 18
Figura 7. Inoculación R. solani en la base de plantas de arroz en el primer
ensayo realizado. 19
Figura 8. Inoculación del R. solani en plantas de arroz en la parte aérea en
el segundo ensayo realizado. 20
Figura 9. Túnel plástico construido dentro del invernadero con el fin de dar
condiciones necesarias para la infección de R. solani. 20
VIII
Figura 10. Cultivo de bacterias tomados a los 70 días, ( A) suelo y B) raíz)
provenientes de muestras de los diferentes tratamientos, aislados al final de
la prueba. 22
Figura 11. Valores medios del índice de severidad del daño causado por el
hongo R. solani en plantas de arroz tratadas con diferentes cepas de
bacterias endófitas. 24
Figura 12. Lesión (encerrada en círculos) causada por R. solani R. solani
en plantas de arroz tratadas con diferentes cepas de bacterias endófitas. 26
Figura 13. Aislamiento del hongo R. solani provenientes de las zonas
afectadas (secciones de hojas (encerrada en círculo)) de las plantas de
arroz utilizadas en la prueba. 27
Figura 14. Medias de peso seco de raíz en plantas de arroz tratadas con
diferentes cepas de bacterias endófitas en el ensayo 1. 28
Resumen
Se investigó el efecto de la inoculación de bacterias endófitas en el
cultivo de plantas de arroz (variedad Palmar 18) sobre la tolerancia al daño
causado por el hongo fitopatógeno Rhizoctonia solani Kühn. El estudio se
realizó en la Universidad de Costa Rica, sede Rodrigo Facio, San Pedro,
San José. Se utilizaron cepas de bacterias endófitas aisladas de plantas de
arroz Palmar 18 (identificadas como PCA 3, PCA 21, PCA 6, PCA 36, PCA
20, PCA 43, PCA 9 y PCA 4), que en investigaciones anteriores han tenido
un efecto inhibitorio sobre el desarrollo del hongo en condiciones in vitro. Se
realizaron dos ensayos en diferentes momentos. En ambos, se evaluó el
peso fresco y seco de la parte aérea y raíz de las plantas, así como la
incidencia (%) y la severidad (índice) de la enfermedad. La incidencia de la
enfermedad fue del 100% en todos los tratamientos evaluados. Se
encontraron diferencias significativas en el peso seco de las plantas
evaluadas en el ensayo 2. El tratamiento de "control comercial" fue el que
mostró el índice más bajo de daño causado por el hongo.
2
Abstract
The effect of the inoculation of endophyte bacteria in rice plants crop
(Palmar 18 variety) on the tolerance to damage caused by the
phytopathogenic fungus Rhizoctonia solani Kühn was investigated. The
study was carried out at the University of Costa Rica, Rodrigo Facio, located
in San Pedro, San José. There were used strains of endophyte bacteria
isolated from rice plants Palmar 18 (identified as PCA 3, PCA 21, PCA 6,
PCA 36, PCA 20, PCA 43, PCA 9 and PCA 4), were used in the trial, those
showed inhibitory effect on the development of the fungus in in-vitro
conditions. Two trials were carried out at different moments. In both of the
trials, the dry and fresh weight of the aerial part and root of the plants were
measured, as well as the incidence (%) and the severity (rate) of the
disease. The incidence of the disease was 100% in all the treatments
measure. Significant differences were found in the dry weight of the plants
evaluated in trial 2. The treatment of "commercial control" was the one that
showed the lowest rate of damage caused by the fungus.
3
Introducción
El arroz es el alimento básico predominante para 17 países de Asia y
el Pacífico, nueve países de América del Norte y del Sur y ocho países de
África. Este cereal proporciona el 20 por ciento del suministro de energía
alimentaria del mundo (FAO, 2004).
En Centroamérica, se estima que existe un área destinada a la
siembra de arroz de 250 000 hectáreas, con una producción aproximada de
1.000.000 toneladas métricas y generando unos 300 000 empleos. De esta
área, 66.000 hectáreas corresponden a Costa Rica, donde este cereal
forma parte importante de la dieta, con un consumo per cápita de 52 kg
(Rojas, 2014).
Como la mayoría de los cultivos, el arroz (Oryza sativa) no está
exento del ataque de plagas y enfermedades, las cuales lo pueden afectar
desde la germinación hasta su madurez, comprometiendo así los
rendimientos (Gutiérrez y Cúndom, 2013).
R. solani es considerado el hongo causante de la segunda
enfermedad más importante en el cultivo de arroz (Martínez et al, 2008).
La infección inicia cuando los propágulos de micelio o esclerocios
entran en contacto con los tejidos de la planta; generalmente, diseminados
por el agua. Las lesiones pueden desarrollarse en la vaina principalmente al
finalizar la etapa de macollamiento, la cual, aproximadamente, se encuentra
entre los días 55 y 60 después de la germinación (Tinoco y Acuña 2016).
Los principales síntomas provocados por la enfermedad causada por
R. solani se concentran en las hojas (en casos severos en el limbo de
estas). El centro de las hojas se forma una lesión que se torna color blanco
grisáceo con bordes pardos y si se presentan varias manchas en la hoja,
generalmente esta llega a necrosarse. (Sree y Zhou, 2018).
Hasta ahora el principal combate para R. solani ha sido el uso de
fungicidas, acompañado de algunas prácticas culturales. Sin embargo, ya
se ha investigado sobre el efecto de controladores biológicos de la
4
enfermedad, tal es el caso del uso de Bacillus sp. y Trichoderma. (Muñoz et
al, 2001).
Es así como el combate biológico se perfila como una alternativa al
uso excesivo de agroquímicos y el efecto colateral que estos tienen también
sobre el medio ambiente (Dilantha et al, 2005)
Los microrganismos endófitos se mencionan como agentes de control
para fitopatógenos en diversos cultivos. Se ha comprobado que los
mecanismos de control biológico mediado por bacterias endófitas están
basados en diferentes formas las cuales incluyen: antibiosis, la competencia
por los nutrientes y nichos y la resistencia sistémica inducida (ISR). (Pérez y
Chamorro, 2013)
Se ha demostrado qué aislamientos de bacterias endófitas de
plantas, tienen un efecto inhibitorio en el desarrollo de R. solani a nivel in
vitro por lo que es importante realizar pruebas a nivel de campo para
determinar el efecto de las mismas cuando son inoculadas en plantas
(Martínez et al, 2015)
La presente investigación pretende determinar si existe un efecto
significativo con respecto a la generación de tolerancia al ataque de R.
solani, en arroz, inoculado con bacterias endófitas aisladas de plantas del
mismo cultivo y que mostraron inhibición del desarrollo de este hongo en
medio PDA. Con esto se espera generar información que contribuya al
manejo integral del combate de este hongo.
5
Antecedentes
Generalidades del cultivo de arroz
El arroz pertenece a la División: Angiospermae, Clase: Monoco-
tyledonea Orden: Glumiflorae, Tribu: Oryzeae, Familia: Poaceae
(gramineae) (Acevedo et al, 2006). Casi todas las variedades cultivadas
derivan de la especie Oryza sativa (Gonzáles, 2006) y es un cultivo
domesticado desde hace más de 10 000 años, con su centro de origen en
Asia, que llega a América en el período de la colonización europea
(Marchesi, 2016).
El cultivo de arroz en Costa Rica
En Costa Rica, el arroz que se produce, solo satisface entre el 50 y
60% de la demanda nacional, por lo que en los últimos años se ha estado
importando el grano en granza (Tinoco y Acuña 2016). Las provincias de
Guanacaste y Puntarenas son las que más área destinan para la siembra
de este cultivo según el censo agropecuario realizado en el 2014 (Cuadro 1)
(INEC, 2015).
6
Cuadro 1. Hectáreas del total de fincas por provincia, destinadas al cultivo
de arroz por extensión sembrada y cosechada en Costa Rica.
PROVINCIA EXTENSION (hectáreas)
SEMBRADA COSECHADA
San José 308,2 268,8
Alajuela 11 609,3 10 066,0
Cartago 22,6 22,1
Heredia 237,7 236,2
Guanacaste 24 313,0 23 102,2
Puntarenas 20 948,0 17 369,9
Limón 1 100,9 947,2
Fuente: INEC. VI Censo Nacional Agropecuario, 2014.
El arroz se considera un cultivo óptimo de zonas húmedas del trópico
o de climas con temperatura alta. En Costa Rica se cultiva arroz desde el
nivel del mar hasta 850 msnm (MAG, 2004). Por lo tanto, las extensas
zonas en el país con condiciones favorables para el desarrollo del arroz, así
como su alta demanda ha hecho que se convierta en el cultivo anual con
mayor área de extensión sembrada y cosechada a nivel nacional (INEC,
2015).
Principales enfermedades del arroz
Entre las enfermedades más importantes que el cultivo de arroz
presenta en Costa Rica, se encuentran: piriculariosis (Pyricularia oryzae
(Cav)), escaldado de la hoja (Microdochium albescens (Thümen)), añublo o
tizón de la vaina (Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk. o Rhizoctonia solani
7
Kühn), pudrición fungosa de la vaina (Sarocladium oryzae Sawada), pudrición
bacterial de la vaina del arroz (Pseudomonas fuscovaginae Miyajima)
cercóspora o mancha línea (Sphaerulina oryzina Hara), Helmintosporium
(Bipolaris oryzae (Breda de Haan) Shoemaker) y Falso carbón del grano
(Ustilaginoidea virens (Cooke) Takah) (MAG, 2004).
Generalidades de R. Solani
R. solani se ha clasificado en 14 grupos de anastomosis (GA), del
GA1 al GA13, que se anastomosan sólo con individuos del mismo grupo, y
el GA-BI, que incluye aislamientos capaces de fusionarse entre ellos y con
otros grupos (González et al., 2006).
Este hongo, del grupo de anastomosis AG1-IA, constituye uno de los
grupos más importantes de la especie. Entre otras enfermedades, es el
causante del tizón de la vaina en el cultivo de arroz (O. sativa), la cual
produce pérdidas importantes en este cultivo (Gonzáles, 2006). En la
naturaleza, generalmente tiene reproducción asexual y existe
principalmente como micelio vegetativo (Figura 1) y / o esclerocio (Figura 2)
(Webster y Weber 2007).
8
Figura 1. Estructura micelial de R. solani aislado de arroz. 1) Septos,
2) ramificaciones en ángulo recto y 3) constricciones.
Fuente: Sree y Zhou, 2018.
Figura 2. Esclerocio de R. solani, en medio de cultivo PDA.
9
Ciclo de vida de R. solani
Este es un hongo necrotrófico que se disemina por medio del suelo y
tiene la capacidad de sobrevivir en los rastrojos de las plantas en forma de
esclerocios. Estas son estructuras reproductivas de color marrón oscuro y
pueden sobrevivir por varios años e infectar las plantas de arroz en la
interfase agua-planta en el campo inundado al producir micelio (Taheri y
Tarighi, 2010). (Su estado teleomórfico se conocía como Thanatephorus
cucumeris (Prado et al, 2001). A continuación, se detalla su ciclo de vida
(Figura 3)
Figura 3. Ciclo de vida de R. solani en el cultivo de arroz. Tomado de:
(Taheri y Tarighi, 2010)
10
En la figura se observa el ciclo de vida de R. solani. Los apresorios
(a) y cojines (b) en hojas de arroz. El cojin de la infección invade el tejido del
huésped para la formación de hifas (c). Posteriormente se observan los
síntomas de tizón de la vaina en los tejidos de la planta (d). Se da la
formación de esclerocios circulares blancos en las plantas de arroz
infectadas, que se vuelven de color marrón en la madurez (e). Las
basidiosporas (que rara vez se observan en la naturaleza) es la forma de
reproducirse sexualmente (f). Finalmente se da la germinación de los
esclerocios o las basiodiosporas en tejido huésped (g) (Taheri y Tarighi,
2010)
R. solani en arroz
R. solani es el agente causal del tizón de la vaina, enfermedad que en
una época era considerada secundaria; sin embargo, en muchos países se
ha convertido en una de las principales enfermedades del arroz.
Inicialmente la enfermedad era importante en regiones templadas donde la
deposición del rocío era significativa, sin embargo, el uso de variedades de
abundante follaje, plantaciones de alta densidad y el uso intensivo de
fertilizantes, han favorecido que la enfermedad se difunda a otras zonas
(FAO,2004)2.
En el momento que el cultivo de arroz entra en la etapa de
macollamiento, se dan ciertos cambios a nivel del microclima, los cuales son
provocados por el aumento en número y tamaño de los tallos por área, esto
hace que la humedad aumente y favorezca la infección de R. solani (Tinoco
y Acuña 2016).
En Costa Rica, una de las principales variedades de arroz sembrada,
corresponde a Palmar 18, que según Tinoco y Acuña (2016) se considera
como susceptible a la enfermedad causada por este hongo.
11
Bacterias endófitas
Las bacterias endófitas son organismos que viven sin causar daño en
el interior de células o tejidos de plantas superiores durante una parte de su
ciclo de vida, estas pueden encontrarse en diferentes tipos de tejidos
vegetales incluyendo los de las semillas, frutos, hojas, tubérculos y tallos
(ECURED, 2018).
El ingreso de las bacterias endófitas a la planta, se da principalmente
por la raíz, a través de los pelos radicales o en zonas de la rizodermis
donde comúnmente ocurren lesiones, así como en la zona próxima a la
punta de la raíz, a través de la zona de elongación y zona de diferenciación
(Reinhold y Hurek, 2011).
Bacterias endófitas para el control biológico
Las bacterias endófitas viven asintomáticamente dentro de los tejidos
de la planta y se han encontrado en casi todos los estudios de hasta la
fecha (Pérez et al, 2013). Según Rosenblueth y Romero (2006), en las
plantas que no se han logrado encontrar, se puede deber a que algunas
bacterias son difíciles de aislar. Estas bacterias no solo son inocuas para la
planta, sino que además pueden ofrecer beneficios a la misma. Tales
efectos se relacionan con la promoción del crecimiento mediante la
secreción de factores reguladores del crecimiento, competencia con
fitopatógenos por espacio y nutrientes, producción de sideróforos y
antibióticos, solubilización de fosfatos y fijación biológica de nitrógeno entre
otros (Echegoyen, 2015). Estas bacterias pueden habitar dentro de los
tejidos de las plantas sin causar daño alguno al hospedero, establecen
asociación simbiótica y producen grandes beneficios para las plantas (Pérez
y Chamorro, 2013).
Diversos estudios han demostrado que las bacterias endófitas son
fuentes potenciales de nuevos productos naturales para su utilización en la
agricultura. Existe una diversidad incalculable de estas, que presentan
12
actividad antimicrobiana al menos sobre algún fitopatógeno (Pérez et al,
2013).
Uribe et al (2017) evaluaron 44 cepas aisladas de arroz y de caña y
encontraron que 8 cepas inhibieron en medio de cultivo el crecimiento del
hongo R. solani, 5 cepas presentaron una inhibición moderada, 11 cepas
presentaron poca inhibición y 18 cepas no tuvieron ningún efecto.
En segmentos de plantas de arroz se han encontrado hasta 570
hongos endofíticos pertenecientes a 19 especies de hongos diferentes junto
con una especie de Streptomyces (Naik et al, 2009). Además, en algunas
plantas se ha logrado aislar cepas de bacterias endófitas, que han
mostraron inhibición del desarrollo de ciertos hongos como Fusarium
oxysporum, R. solani y Phytophthora infestans (Martínez 2015).
13
Objetivos
Objetivo general
Determinar el efecto de la inoculación de bacterias endófitas en el
cultivo de arroz variedad Palmar 18, sobre la inducción de tolerancia al daño
causado por Rhizoctonia solani Kühn, para uso posterior como alternativa
dentro de un plan de manejo integrado de la enfermedad.
Objetivos específicos
• Determinar el efecto de la inoculación de bacterias endófitas, en el
peso fresco y seco de parte aérea y raíz, de plantas de arroz variedad
Palmar 18, inoculas con el hongo Rhizoctonia solani Kühn.
• Determinar el efecto de la inoculación de bacterias endófitas sobre la
incidencia y severidad del ataque de Rhizoctonia solani Kühn en las
plantas de arroz.
• Explicar la relación de las mediciones realizadas en las plantas de
arroz inoculadas con bacterias endófitas, con la tolerancia al daño
causado por Rhizoctonia solani Kühn.
14
Materiales y métodos
El experimento se llevó a cabo en el invernadero del Centro de
Investigación en Protección de Cultivos de la Universidad de Costa Rica,
ubicado en San Pedro de Montes de Oca, San José, Costa Rica.
El ensayo se realizó dos veces variando la metodología de aplicación
del hongo.
Inoculación de las bacterias
Las bacterias que se utilizaron para inocular las plantas de arroz,
fueron obtenidas del proyecto VI-733-B5-054 Inducción de la tolerancia al
estrés biótico y abiótico en plantas de arroz mediante el establecimiento de
simbiosis con microorganismos benéficos, realizado por el Área de
Microbiología Agrícola del Centro de Investigaciones Agronómicas de la
Universidad de Costa Rica.
Se realizaron diez tratamientos que correspondieron a la inoculación
de ocho diferentes bacterias (Cuadro 2) en arroz, y 2 testigos (ausencia de
bacteria (testigo absoluto) y testigo comercial (fungicida Amistar 300 g/Ha,
aplicado 5 días antes de la inoculación del hongo R. solani).
15
CODIGO IDENTIFICACIÓN
PCA 3 Lysinobacillus macroides
PCA 4 Bacillus altitudinis
PCA 6 Bacillus cereus
PCA 9 Stenotrophomonas maltophilia
PCA 20 Pseudomonas azotoformans
PCA 21 Pantoea sp.
PCA 36 Bacillus subtilis
PCA 43 Serratia marcescens
Fuente: Uribe et al (2017)
Se utilizaron semillas de arroz Palmar 18, variedad desarrollada por la
empresa SENOMISA.
Las semillas de arroz correspondientes a cada tratamiento se
mantuvieron embebidas en solución bacteriana (Figura 4) durante 18 horas.
esto se colocaron en una suspensión de concentración correspondiente a
un estándar de Mc Farland número 1 (equivalente a 3 x 108 bacterias/mL).
En cuanto a las semillas del testigo comercial y el absoluto, estas se
colocaron en agua destilada. Además de la inmersión, cada 15 días y hasta
el día de la inoculación del hongo fitopatógeno, se realizaron inoculaciones
de dichas bacterias al suelo, con un volumen de 5 ml por planta, de la
suspensión bacteriana similar al estándar Mc Farland número 1, cada 15
días.
Cuadro 2. Código e identificación de las cepas de bacterias utilizadas para evaluar la
tolerancia al daño causado por R. solani en plantas de arroz.
16
Figura 4. Semillas de arroz embebidas en las suspensiones
bacterianas de concentración correspondiente a un estándar de Mc
Farland número 1 (equivalente a 3 x 108 bacterias/mL).
Siembra del arroz
Las semillas de arroz se sembraron en bandejas plásticas con celdas
de 17 cc y se trasplantaron a potes de un volumen de 650 cc, donde se
colocó una planta por pote. Se utilizó un suelo vertisol de una finca arrocera
de Nandayure, Guanacaste, tanto para las bandejas como para los potes.
Dicho suelo no se esterilizó y por medio de análisis de laboratorio se
descartó la presencia de trichodermas. Se fertilizó 10 días después del
trasplante con una fórmula 18-46-0 en una dosis de 32 kg/ha y se aplicó
riego a los potes para mantener el suelo cercano a capacidad de campo
durante todo el desarrollo de la planta.
17
Figura 5. A) Bandejas y B) potes utilizados para la siembra de arroz
en los ensayos realizados.
Inoculación del patógeno R. solani
La cepa de R. solani utilizadas en el experimento, fueron facilitadas
por el Instituto Nacional de Innovación Agropecuaria (INTA), dicha cepa fue
aislada de arroz variedad Palmar 18.
Para la inoculación del patógeno se emplearon dos métodos: Uso de
discos de un cultivo del hongo en PDA colocados directamente sobre la
planta y uso de paja de arroz inoculada con el hongo (ensayo 1). Uso de
paja de arroz (ensayo 2).
El hongo se cultivó en PDA durante 10 días y discos de 5 mm de
diámetro se utilizaron para inocular directamente la planta o para inocular la
paja de arroz.
Para la inoculación de la paja de arroz se tomaron 10 gramos del
material y se colocaron en bolsas plásticas, se le agregó agua destilada (5
ml por bolsa) y se realizó un autoclavado para su esterilización (20 minutos
a 121 Celsius y 15 libras de presión). Una vez esterilizada, cada bolsa con
paja se inoculó con 10 discos (Figura 6) de R. solani y se incubó en una
cámara oscura durante 10 días a temperatura ambiente, donde se observó
crecimiento abundante de micelio. Posteriormente, se agregaron los trozos
de paja (inoculada con el hongo) entre la macolla de la planta de arroz en el
18
momento de máximo macollamiento (esto se dio aproximadamente entre los
días 55 y 60 después de la germinación).
Figura 6. Placa petri con cultivo de hongo R. solani, y discos
(encerrado en círculo) utilizados para la inoculación de la paja de
arroz.
En el primer ensayo se realizaron tres inoculaciones del hongo en
intervalos de 10 días, en las dos primeras el hongo se aplicó directamente
en el tejido de la planta colocando dos discos de 5 mm de diámetro (Figura
6) del hongo R. solani crecido en PDA, y una última inoculación en la que se
aplicó paja de arroz inoculada a 10 cm, aproximadamente, de la base del
tallo (Figura 7), manteniendo la humedad de la zona de inoculación con
algodón, una vez inoculadas con la paja de arroz las plantas se colocaron
dentro de un túnel hecho de plástico de invernadero (Figura 8).
En el segundo ensayo se realizó una sola inoculación utilizando paja
de arroz, que se aplicó a la altura de la primera hoja desarrollada (Figura 9),
en este caso se colocó papel toalla para mantener la humedad. En este
19
ensayo las plantas se colocaron dentro del túnel durante todo el
experimento.
Figura 7. Inoculación R. solani en la base de plantas de arroz en el
primer ensayo realizado.
20
Figura 8. Inoculación del R. solani en plantas de arroz en la parte
aérea en el segundo ensayo realizado.
Figura 9. Túnel plástico construido dentro del invernadero con el fin
de dar condiciones necesarias para la infección de R. solani.
21
Diseño experimental y análisis estadístico
El diseño experimental utilizado fue un irrestricto al azar, donde se
utilizaron 4 repeticiones por tratamiento y 5 plantas por repetición.
Se midió el porcentaje de incidencia (número de plantas en las que se
presentó los síntomas de la enfermedad/ total de plantas evaluadas).
Asimismo, se midió la severidad, donde se estimó un índice calculado
como longitud de la lesión, dividida por la longitud del culmo en mm
multiplicado por nueve (Jia et al., 2007). La longitud del culmo se tomó
como la distancia entre la base de la planta y la base de la hoja más larga.
Al final de la prueba se realizó una evaluación de peso fresco y seco
de las plantas. Para esto, las plantas se colocaron en un horno de secado
durante 10 días. Para la medición de todos los pesos se utilizó una balanza
analítica.
Para el análisis de los datos, se realizó las pruebas de los supuestos
básicos de los análisis de varianza, las variables que no superaron esas
pruebas, fueran analizadas con metodologías no paramétricas (Kruskal
Wallis).
22
Resultados y discusión
Determinación de la presencia de bacterias endófitas en suelo y raíz en
los diferentes tratamientos, así como del patógeno R. solani. en las
zonas de inoculación.
La presencia de las bacterias endófitas en suelo y raíz fue confirmada
en todos los tratamientos donde estas fueron inoculadas, por medio de
aislamientos (Figura 10) realizados en la unidad de Microbiología Agrícola el
Centro de Investigaciones Agronómicas (CIA) de la Universidad de Costa
Rica. Esto se realizó en el momento de las evaluaciones destructivas.
Figura 10. Cultivo de bacterias tomados a los 70 días, ( A) suelo y B)
raíz) provenientes de muestras de los diferentes tratamientos,
aislados al final de la prueba.
Foto: Lidieth Uribe Lorío.
23
Incidencia de síntomas de R. solani
En el siguiente cuadro se muestra la incidencia del daño causado por
R. solani en ambos ensayos.
Cuadro 3. Porcentaje de incidencia del daño causado por el hongo R.
solani, en plantas de arroz variedad Palmar 18 tratadas con bacterias
endófitas.
Como se muestra en el cuadro anterior, la incidencia en el momento
de la evaluación de los síntomas del daño causado por el hongo se
presentó en el total de las plantas de todos los tratamientos, en ambos
ensayos. Esto sugiere que ninguna de las bacterias e incluso el fungicida
Ensayo 1 Ensayo 2
Tratamiento Incidencia (%) Tratamiento Incidencia (%)
PCA 20 100 PCA 20 100
PCA 21 100 PCA 21 100
PCA 3 100 PCA 3 100
PCA 36 100 PCA 36 100
PCA 4 100 PCA 4 100
PCA 43 100 PCA 43 100
PCA 6 100 PCA 6 100
PCA 9 100 PCA 9 100
Testigo absoluto 100 Testigo absoluto 100
Testigo comercial 100 Testigo comercial 100
24
utilizado como testigo comercial, lograron evitar el ingreso del patógeno en
la planta bajo estos métodos de inoculación (independientemente de la
severidad). Resultados similares encontró Prado et al (2001) en su
investigación para la evaluación de germoplasma de arroz y resistencia a R.
solani al utilizar una metodología de inoculación semejante. Por otra parte,
R. solani tiene un alto nivel de patogenicidad especialmente si la planta de
donde se aísla el hongo que será fuente de inóculo coincide en género y
especie con las plantas que se inoculan (Mosquera, 2010). Estos resultados
también son comparables con los obtenidos por Delgado et al. (2004),
quienes observaron que al utilizar diferentes métodos de inoculación de R.
solani en arroz la incidencia fue siempre cercana al 100%, lo que se
consideró óptimo para evaluar variables relacionadas a la tolerancia.
Severidad del daño causado por R. solani
En el siguiente gráfico, se muestra la severidad del daño causado por
R. solani en las plantas de arroz en el ensayo 2.
Figura 11. Valores medios del índice de severidad del daño causado
por el hongo R. solani en plantas de arroz tratadas con diferentes
cepas de bacterias endófitas.
25
En la Figura 11 se observa una diferencia significativa
estadísticamente, donde se presentó un menor daño causado por R. solani
en el testigo comercial con respecto a los demás tratamientos, lo que se
podría justificar con el efecto fungicida del producto comercial Amistar,
utilizado como control químico. El ingrediente activo de Amistar es una
azoxystrobina y el fungicida pertenece al grupo de los â-metoxiacrilatos
(estrobilurinas), con efectividad probada contra un amplio rango de hongos
pertenecientes a las familias de Ascomycetos, Basidiomycetos y Oomycetos
(Syngenta, 2017). Salazar (1999) realizó la evaluación de diferentes
fungicidas en el cultivo de arroz, en los que demostró la efectividad del
producto Amistar 50WG 0,4 kg/ha para el control de R. solani. Sree (2017)
en su investigación para determinar la eficacia de fungicidas para el manejo
de la enfermedad causada por R. solani, demostró la efectividad de la
azoxystrobina para reducir la severidad del tizón de la vaina en comparación
con el control no tratado.
En el caso de los tratamientos con cepas de bacterias endófitas,
estos no mostraron un efecto positivo en cuanto a una reducción en la
severidad del daño causado por R. solani, lo que sugiere que, mediante
este método de inoculación y las condiciones dadas durante el ensayo, las
bacterias no presentaron un efecto favorable sobre dicha variable.
La siguiente figura muestra el daño que se presentó en las plantas de
arroz en los diferentes tratamientos, la cual es característica del hongo R.
solani.
26
Figura 12. Lesión (encerrada en círculos) causada por R. solani R.
solani en plantas de arroz tratadas con diferentes cepas de bacterias
endófitas.
Determinación de la presencia de R. solani en tejidos con presencia de
lesión de los diferentes tratamientos
En el estudio se determinó que el daño causado en las plantas de
arroz fue consecuencia de la presencia de R. solani, por medio de
aislamientos del hongo (Figura 13) de las zonas afectadas de cada uno de
los tratamientos.
27
Figura 13. Aislamiento del hongo R. solani provenientes de las zonas
afectadas (secciones de hojas (encerrada en círculo)) de las plantas
de arroz utilizadas en la prueba.
Peso seco de raíz de las plantas de arroz utilizadas en ensayo 1
En el siguiente gráfico, se muestra los valores obtenidos en la
medición del peso seco de raíz en las plantas de arroz, inoculadas con las
diferentes cepas de bacterias endófitas, que corresponden a los
tratamientos del primer ensayo realizado.
28
Figura 14. Medias de peso seco de raíz en plantas de arroz tratadas
con diferentes cepas de bacterias endófitas en el ensayo 1.
En el gráfico anterior se observa una diferencia significativa
estadísticamente, en el tratamiento PCA 20 respecto a los demás, donde
este muestra un mayor peso.
El aumento del peso seco radical del tratamiento PCA20
(Pseudomonas azotoformans), como se observa en la Figura 16, se puede
atribuir al efecto estimulador del crecimiento que confieren algunas
bacterias endófitas, donde se destaca su potencial para la fijación biológica
de nitrógeno y su capacidad de producir distintas fitohormonas,
principalmente el AIA (ácido indol acético) así como la solubilización de
nutrientes minerales importantes para la producción de biomasa en las
plantas; entre ellos: manganeso, hierro, zinc y fósforo (Ríos et al, 2016).
Además, en el caso específico de Pseudomonas azotoformans, esta
se caracterizar por ser un agente de control biológico, como se ha
demostrado para el caso de Colletotrichum orbiculare en pepino o Fusarium
sp. en arroz, su efecto como controlador se relaciona con la presencia de 9
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
PCA 4 PCA 21 PCA 43 PCA 9 TESCMRCL
PCA 6 TESABSLT
PCA 36 PCA 3 PCA 20
RA
NG
O
TRATAMIENTOS
AB ABABC BC
BCC
D
ABABA
29
grupos de genes involucrados en la biosíntesis de metabolitos secundarios
(Fang et al, 2016).
También se han estudiado bacterias endófitas aisladas del cultivo de
arroz y se ha demostrado que estas tienen capacidad de producir auxinas a
niveles detectables que favorecen el crecimiento de las plantas y por lo
tanto de biomasa (Moronta, 2015). También, Vinchira 2015, concluyó que
algunas cepas de actinobacterias presentan propiedades asociadas a la
promoción directa e indirecta de crecimiento vegetal, lo que influye de forma
positiva en el crecimiento de plantas de arroz, en su investigación también
determinó que algunos de los mecanismos que influyen en este proceso son
la habilidad para solubilizar fosfatos y producir celulasas, así como la
producción de proteasas y sideróforos. Algunas investigaciones sugieren
que la presencia de sideróforos bacterianos favorece la captación de hierro
y clorofila, lo que repercute en plantas mejor desarrolladas (Van
Leeuwenhoek, 2011). Además de acelerar el crecimiento, desarrollo y el
aporte de N por medio de la fijación biológica de nitrógeno de las plantas,
las bacterias endófitas favorecen la movilización de elementos como el
fosforo (Pérez y Chamorro, 2012). Tsavkelova et al (2007), determinó en su
investigación que las bacterias endófitas, favorecen la producción de
biomasa de las plantas hospederas.
Con excepción de PCA 20 y PCA 3, los demás tratamientos no
mostraron una promoción positiva en cuando al desarrollo de raíz, por lo
que sería conveniente dar seguimiento a estas dos cepas en cuanto a esta
variable.
Aunque no se determinó una relación que sugiera un efecto positivo
entre la inoculación de las bacterias endófitas y la tolerancia al daño
causado por R. solani mediante los ensayos realizados, se debe tomar en
cuenta las diferencias encontradas en cuanto a peso seco donde PCA 20 y
PCA 3 mostraron un aumento positivo de biomasa de la parte radical, por lo
que sería conveniente dar seguimiento a estas cepas en un futuro, ya que
esta variable guarda una estrecha relación con el rendimiento final del
cultivo (Lázaro et al, 2014). Esto también fue determinado por Matiru y
30
Dakora, 2004, que en su investigación encontraron que los
microorganismos promueven desarrollo vegetal y tienen un papel clave en
la absorción de nutrientes, la tolerancia a estrés del ambiente y en general,
a mantener la salud de las raíces, lo que favorece el aumento de
rendimiento de los cultivos.
A continuación, se muestra la información obtenida en los ensayos 1
y 2 de variables, que; estadísticamente no mostraron diferencias
significativas, pero pueden tener importancia algunos de los
comportamientos de los tratamientos.
Cuadro 4. Valores medios obtenidos de las diferentes variables evaluadas
en el primer experimento.
Peso fresco aéreo Peso fresco raíz Peso seco aéreo Índice de daño
Tratamiento Media
(g)
Tratamiento Media
(g)
Tratamiento Media
(g)
Tratamiento Media
PCA 20 6.91 PCA 20 14.18 PCA 20 3.33 PCA 20 3.44
PCA 21 6.48 PCA 21 13.27 PCA 21 3.29 PCA 21 3.82
PCA 3 7.12 PCA 3 11.96 PCA 3 2.97 PCA 3 4.21
PCA 36 7.38 PCA 36 12.36 PCA 36 2.91 PCA 36 3.39
PCA 4 5.55 PCA 4 12.29 PCA 4 3.01 PCA 4 3.5
PCA 43 6.17 PCA 43 13.31 PCA 43 3.25 PCA 43 3.03
PCA 6 6.13 PCA 6 11.75 PCA 6 2.94 PCA 6 3.52
PCA 9 5.82 PCA 9 12.04 PCA 9 3.1 PCA 9 3.71
TES ABSLT 6.67 TES ABSLT 12.95 TES ABSLT 3.22 TES ABSLT 2.94
TES
CMRCL
6.54 TES
CMRCL
13.11 TES CMRCL 3.06 TES
CMRCL
3.55
31
Cuadro 5. Valores medios (sin diferencias significativas estadísticamente)
obtenidos de las diferentes variables evaluadas en el segundo experimento.
Peso fresco aéreo Peso seco raíz Peso seco aéreo Peso fresco raíz
Tratamiento Media
(g)
Tratamiento Media
(g)
Tratamiento Media
(g)
Tratamiento Media
(g)
PCA 20 7.53 PCA 20 0.31 PCA 20 2.13 PCA 20 2.3
PCA 21 7.67 PCA 21 0.31 PCA 21 1.82 PCA 21 1.77
PCA 3 7.77 PCA 3 0.28 PCA 3 1.98 PCA 3 1.66
PCA 36 8.32 PCA 36 0.35 PCA 36 2.17 PCA 36 2.01
PCA 4 7.6 PCA 4 0.33 PCA 4 2.23 PCA 4 2.46
PCA 43 7.19 PCA 43 0.33 PCA 43 2.19 PCA 43 2.23
PCA 6 6.86 PCA 6 0.32 PCA 6 2.11 PCA 6 1.85
PCA 9 7.15 PCA 9 0.29 PCA 9 1.93 PCA 9 2.27
TES ABSLT 8.32 TES ABSLT 0.41 TES ABSLT 2.11 TES ABSLT 2.69
TES
CMRCL
9.09 TES
CMRCL
0.33 TES
CMRCL
2.13 TES
CMRCL
2.29
32
De la información presentada en los Cuadros 4 y 5 se puede tomar en
cuenta algunas variables numéricas que sugieren una guía sobre cuales
cepas de bacterias pueden ser de interés para futuras investigaciones.
Como es el caso de peso seco aéreo del primer experimento, donde las
cepas PCA 20, PCA 21 y PCA 43 muestran mayor cantidad de masa
respecto a los demás tratamientos, lo cual puede ser justificado por el efeto
en la producción de biomasa inducido por bacterias, explicado
anteriormente por el efecto observado en el tratamiento PCA 20, en la
variable de peso seco de raíz (figura 14). En el caso de PCA 20 en la
variable de peso fresco de raíz, este aumento coincide con el del peso seco
de raíz del mismo ensayo donde PCA 20 mostró diferencias significativas
con respecto a los demás tratamientos (Figura 14).
33
Conclusiones y recomendaciones
Conclusión
Las cepas de bacterias Lysinobacillus macroides, Bacillus altitudinis,
Bacillus altitudinis, Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas
azotoformans, Pantoea sp. Bacillus subtilis, Serratia marcescens, bajo las
condiciones del ensayo, no demostraron efecto inhibitorio en cuanto a la
incidencia y severidad de daño causado por el hongo R. solani bajo el
método de inoculación utilizado.
Recomendaciones
Se recomienda considerar la inoculación de R. solani en las plantas
de arroz desde etapas más tempranas, lo que podría dar la oportunidad al
hongo de tener mayor influencia en las variables de peso de parte aérea y
raíz. Además, se recomienda realizar tratamientos con distintas cantidades
del inóculo y utilizar diferentes variedades de arroz.
34
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