Documentos SEQC 2009

Documentos de la SEQC 2009

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Domicilio Social SEQC: c/ Padilla, 323. Despacho 68, 08025 Barcelona. Tel. 934 462 670. Fax 934 462 672 correo-e: [email protected]. http://www.seqc.es. Edita: Publicaciones Nacionales Técnicas y Extranjeras, S.A. Redacción: c/ Padilla, 323 08025 Barcelona. Tel. 934 462 820 Fax. 934 462 064 Impresión: Trajecte. Depósito legal: B-33169/09. ISSN: 2013-5750

SumarioProcedimiento recomendado para la calibración de termómetros en el laboratorio clínicoComité CientíficoComisión de MetrologíaDocumento G. Fase 3. Versión 2Preparado por: J. Batista Castellví

Criterios para la selección de un modelo de automatización del laboratorioComité CientíficoComisión de Instrumentación y Sistemas AnalíticosDocumento A. Fase 3. Versión 2Preparado por: JL Bedini Chesa, S. Esteve Pablador, L. García Beltrán, JM Gasalla Herraiz, C. Macías Blanco, M. Martínez Casademont, JM Moreno Cebeira, V. Martínez Vázquez, B. Prieto García, G. Serrano Olmedo, J. Torres Nicolau

Recomendaciones preanalíticas para la medición del equilibrio ácido-base y gases en sangreComité CientíficoComisión de Magnitudes Biológicas relacionadas con la Urgencia MédicaDocumento H. Fase 3. Versión 5Preparado por: X. Navarro Segarra, JL Marín Soria, A. Buño Soto, R. Díaz García, A. Galán Ortega, P. Guevara Ramírez, E. Guillén Campuzano, M. Muñoz Pérez, P. Oliver Sáez, N. del Río Barcenilla

Técnicas para la preparación de semen en reproducción asistidaComité CientíficoComisión de Seminología y Técnicas de Reproducción AsistidaDocumento C. Fase 3. Versión 4Preparado por: I. Sánchez, C. Mar, JA Castilla, M. Marcos, I. Martín, A. Galán, MI Jiménez, JM Moreno, MG Serrano, I. García-Cobaleda, C. Aulesa, V. Lozano, C. Sánchez, J. de Montserrat

Recomendaciones para la estimación de la incertidumbre de medida en el laboratorio clínicoComité CientíficoComisión de MetrologíaDocumento H. Fase 3. Versión 2Preparado por: FJ Gella Tomás, F. Canalias Reverter, S. Izquierdo Álvarez, V. Martínez Vázquez, M. Sánchez Manrique

Recomendaciones para el estudio de las gammapatías monoclonalesDocumento de consenso. Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular (SEQC) y Asociación Española de Hematología y Hemoterapia (AEHH)Comité CientíficoComisión de Proteínas (SEQC) y Grupo Español de Mieloma (AEHH)Documento I. Fase 3. Versión 3Preparado por: C. Martínez-Brú, R. García Sanz, J. Martínez-López

Recomendaciones para la calibración de material volumétrico en el laboratorio clínicoComité CientíficoComisión de MetrologíaDocumento E. Fase 3. Versión 2Preparado por: R. Ruíz Morer

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Fotografía de portada: Núria Insa

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ÍNDICE

0. Introducción1. Objeto y campo de aplicación2. Normas para consulta3. Definiciones4. Requisitos metrológicos: criterios de aceptación5. Procedimiento 5.1 Patrones 5.2 Condiciones previas 5.3 Procedimiento de calibración 5.4 Cálculo del error sistemático y de la incertidumbre de

medida 5.5 Frecuencia de calibración6. Aplicaciones7. BibliografíaAnexo 1. Cálculo de la incertidumbreAnexo 2. Ejemplo de resultados de calibración

0. INTRODUCCIÓN

Los termómetros que se utilizan para mediciones de temperaturas que pudieran afectar, directa o indirectamente, la calidad de los resultados generados en el laboratorio, deberían estar apropiada-mente calibrados.

Según las normas para la gestión de la calidad ISO 15189 e ISO 9001, los laboratorios clínicos deben establecer una programación que controle y demuestre periódicamente que sus instrumentos de me-dida se encuentran calibrados y mantener documentos que describan los procedimientos de calibración y los criterios de aceptación, así como informes que contengan datos de las calibraciones efectuadas.

1. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

Este documento describe un procedimiento para calibrar los termómetros de columna de líquido y los termómetros digitales por el método de comparación, en el intervalo de temperaturas comprendido entre 0 y 100 ºC. Aunque determinados termómetros permiten intervalos de medida mayores, no se considera útil ampliar el campo de aplicación de esta recomendación a otras temperaturas.

2. NORMAS PARA CONSULTA

● Asociación Española de Normalización. Sistemas de gestión de la calidad. Requisitos. UNE-EN ISO 9001:2000. Madrid: AENOR; 2000.

● Asociación Española de Normalización. Laboratorios Clínicos. Requisitos particulares relativos a la calidad y la competencia. UNE-EN-ISO 15189 :2003. Madrid : AENOR ; 2003.

● Centro Español de Metrología. Vocabulario internacional de términos fundamentales y generales de metrología (VIM). Madrid: Ministerio de Obras Públicas, Transportes y Medio Ambiente; 1994.

3. DEFINICIONES

3.1 CalibraciónConjunto de operaciones que establecen, en condiciones especi-

ficadas, la relación entre los valores de una magnitud indicados por un instrumento de medida o un sistema de medida, o los valores representados por una medida materializada o por un material de referencia, y los valores correspondientes de esa magnitud realizados por patrones (VIM).

3.2. Error máximo permitido (de un instrumento de medida)

Valor extremo de un error permitido por especificaciones, regla-mentos, etc. para un instrumento de medida dado (VIM).

3.3. Error sistemáticoMedia que resultaría de un número infinito de medidas del mismo

mensurando realizadas bajo condiciones de repetibilidad menos un valor verdadero del mensurando (VIM).

NOTA: Para obtener una estimación, se realiza un número finito de medi-ciones y se utiliza un valor convencionalmente verdadero del mensurando.

3.4. Escala (de un instrumento de medida)Conjunto ordenado de trazos con cualquier numeración asociada,

que forma parte de un dispositivo indicador de un instrumento de medida (VIM).

3.5. Exactitud de un instrumento de medidaAptitud de un instrumento de medida para dar respuestas próximas

a un valor verdadero (VIM).

Procedimiento recomendado para la calibración de termómetros en el laboratorio clínicoSociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología MolecularComité CientíficoComisión de Metrología1

Documento G. Fase 3. Versión 2

Preparado por:J. Batista Castellví

1Composición de la ComisiónJ. Batista Castellví, F. Canalias Reverter, F. J. Gella Tomás, B. González de la Presa, R. Ruiz Morer, M. Sánchez Manrique (Presidente).

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Procedimiento recomendado para la calibración de termómetros en el laboratorio clínico

3.6. ImprecisiónCoeficiente de variación de un conjunto de resultados obtenidos al

medir repetidamente un mensurando con un mismo procedimiento de medida.

3.7. Incertidumbre de medidaParámetro, asociado al resultado de una medición, que caracte-

riza la dispersión de los valores que podrían razonablemente ser atribuidos al mensurando (VIM).

3.8. Intervalo de medidaMódulo de la diferencia entre dos límites de un rango nominal (VIM).

3.9. PatrónMedida materializada, instrumento de medida, material de referencia o

sistema de medida destinado a definir, conservar o reproducir una unidad o uno o varios valores de una magnitud para que sirvan de referencia (VIM).

3.10. ResoluciónLa menor diferencia de indicación de un dispositivo visualizador que

puede percibirse de forma significativa (VIM)

3.11. TrazabilidadPropiedad del resultado de una medición o de un patrón tal que pueda

relacionarse con referencias determinadas, generalmente a patrones na-cionales o internacionales, por medio de una cadena ininterrumpida de comparaciones teniendo todas las incertidumbres determinadas (VIM).

3.12. Valor convencionalmente verdadero (de una magnitud)

Valor atribuido a una magnitud particular y aceptado, algunas veces por convenio, como teniendo una incertidumbre apropiada para un uso dado (VIM).

NOTA: También es denominado “valor convencional”.

4. REQUISITOS METROLÓGICOS: CRITERIOS DE ACEPTACIÓN

El error máximo de medida de temperatura permitido (EMP) en el laboratorio clínico depende sustancialmente del objeto de la medición. De forma general pueden establecerse las siguientes categorías:

A. Mediciones de temperatura de incubación que pueden afectar al valor de la concentración catalítica de una enzima o la medición del pH en la sangre.

B. Mediciones de temperatura de incubación de cultivos celulares.C. Otras mediciones de temperatura, por ejemplo, en áreas de

almacenaje.

Teniendo en cuenta el estado actual de la tecnología de los instrumentos para la medición de temperatura utilizables en los laboratorios clínicos, se recomiendan los requisitos para el error máximo permitido de las mediciones de temperatura que se mues-tran en la siguiente tabla. Estos valores deben considerarse como una aproximación razonable y aplicable a muchas situaciones del

laboratorio clínico. No obstante, determinadas circunstancias pueden exigir requisitos más o menos estrictos que los aquí recomendados.

Categoría EMP (ºC)

A 0,5

B 1,0

C 2,0

Para cada termómetro del laboratorio deben establecerse las medidas que con dicho instrumento se efectúan y asignarle como error máximo permitido el más estricto de las categorías de medida que se realizan con el mismo. El error máximo permitido se utilizará como criterio de aceptación de las calibraciones.

5. PROCEDIMIENTO

5.1 Patrones Para la calibración por el método de comparación debe utilizarse

como patrón un termómetro de resolución adecuada y previamente calibrado con referencia a la Escala Internacional de Temperatura de 1990, EIT-90. Se recomienda usar un termómetro digital con sonda de resistencia de platino del tipo PT 100, acompañado de un certificado de calibración expedido por un laboratorio acreditado o un instituto nacional de metrología, debiendo constar en dicho certificado la trazabilidad a patrón de referencia, la incertidumbre expandida y el factor (o probabilidad) de cobertura que se ha utili-zado en la cálculo de incertidumbre expandida.

5.2 Condiciones previasLa comparación de temperaturas se efectúa en un baño líquido

de agua, glicerina o aceite mineral. El recipiente ha de tener las dimensiones adecuadas al tamaño de los termómetros utilizados, con un volumen de líquido de al menos 100 veces el volumen del termómetro a calibrar. El baño ha de ser de temperatura programable y estable, con agitación constante para garantizar la uniformidad en todo el baño.

Los termómetros están diseñados para indicar temperaturas correctamente cuando el bulbo y la columna están totalmente inmersos en el medio a medir (1 cm de columna puede estar fuera del medio para poder efectuar la lectura). Cuando se va a utilizar un termómetro de inmersión parcial, éste debe ser sumergido en el baño de calibración a la misma profundidad de uso.

5.3 Procedimiento de calibración a) Seleccionar la temperatura a la que se desee calibrar el termó-

metro. Para ello escoger la temperatura de uso o tres temperaturas que abarquen la escala del termómetro a calibrar. Se recomienda realizar la calibración a temperaturas crecientes.

b) Sumergir el termómetro a calibrar y la sonda patrón. Colo-carlos cerca pero con suficiente espacio entre ellos para asegurar la circulación del líquido.

c) Esperar que la temperatura se estabilice y leer la indicación de temperatura en ambos termómetros, 5 veces, de forma alternativa y dejando unos 10 segundos entre lecturas. Anotar las indicaciones del patrón (tPi ) y las indicaciones del termómetro a calibrar (tXi).



5.4 Cálculo del error sistemático y de la incertidumbre de medida

Los cálculos descritos se realizan para cada una de las tempera-turas de calibración.

a) Calcular la media (tP) y (tX). El valor medio del termómetro

patrón (tP) se ha de corregir por la desviación (si existe) indicada en el certificado.

b) Calcular la desviación típica (sp) y (sx)c) Calcular el error sistemático (ES)

ES = tP – tX

d) Calcular la incertidumbre combinada expandida para una pro-babilidad de cobertura de aproximadamente el 95% (Uc) aplicando la siguiente ecuación:

Uc = 2 x sp2+ sx

2 + 0,084 x rp2 + 0,084 x rx

2 + 0,25 x Up2

En el anexo 1 se detalla el origen y significado de los términos de esta ecuación.

e) Evaluar los resultados. La suma del valor absoluto de ES con la de Uc debe ser inferior o igual al error máximo permitido. Estas condiciones son aplicables a cada temperatura de calibración.

5.5 Frecuencia de calibración La frecuencia de calibración de un termómetro depende de

las características del instrumento y del uso a que se somete. En

general es suficiente calibrar los termómetros una vez al año. También deberían calibrarse siempre que exista alguna sospecha de funcionamiento incorrecto o después de haber sido sometidos a temperaturas inadecuadas u otra situación que se piense que puede comprometer su funcionamiento.

6. APLICACIONES

El proceso de calibración de los termómetros permite obtener evidencia objetiva de que, cuando se utiliza el instrumento para efectuar mediciones de temperatura, no se cometen errores inadmi-sibles, esto es, superiores el error máximo permitido.

Es posible que se obtengan resultados insatisfactorios en alguno de los puntos de calibración. Esto no cuestiona todas las mediciones que se efectuaron con anterioridad con el mismo termómetro, sino tan sólo aquéllas cercanas al punto de calibración para el que se obtuvieron resultados anómalos. El instrumento puede utilizarse restringiendo su intervalo de medida o variando el error máximo permitido en función de la escala de medida.

7. BIBLIOGRAFÍA

- Centro Español de Metrología. Procedimiento TH-004 para la calibración de termómetros de columna de líquido de inmersión total. Madrid: Minis- terio de Industria y Energía; Edición 0, 2004.- National Institute of Standards and Technology (NIST). Description and use of a precision thermometer for the clinical laboratory, SRM 934. Washington; NIST special publication 260-113; 1990.

Anexo 1. Cálculo de la incertidumbre

Las medidas realizadas con el termómetro, tienen las siguientes fuentes de incertidumbre (u):

a) Incertidumbre asociada a la dispersión de las lecturas sp y sx se calcula a partir de la desviación típica (s) de 5 medidas repetidas.b) Incertidumbre asociada a la resolución (ur): la resolución del termómetro patrón (rp) y la del termómetro a calibrar (rX) ocasionan errores

aleatorios de redondeo. La amplitud de la distribución de posibles errores es igual a la resolución y, en ese intervalo, cualquier valor tiene las mismas probabilidades de producirse (distribución rectangular o uniforme). En este tipo de distribución, la desviación típica es igual a la amplitud de la distribución dividida por la raíz cuadrada de 12.

Incertidumbre asociada a la resolución del termómetro patrón

urp = rp / 12 = 0,29 rp

Incertidumbre asociada a la resolución del termómetro a calibrar

urx = rx / 12 = 0,29 rx

c) La incertidumbre asociada a la calibración del termómetro patrón: Se calcula a partir de los datos que proporciona el certificado del termómetro patrón. La incertidumbre expandida (generalmente para el 95% de confianza) con un valor del factor de cobertura empleado (habitualmente kp = 2) es:

d) Otros componentes de la incertidumbre como por ejemplo el asociado a la deriva de las sondas y los termómetros, así como la homo-geneidad y estabilidad del baño, pueden ser ignorados por su escasa relevancia en las aplicaciones habituales del laboratorio clínico.

e) La incertidumbre combinada típica (uc) se calcula a partir de la suma de cuadrados de las incertidumbres de cada componente:

uc = sp2+ sx

2 + urp2 + urx

2 + up2

uc = sp2+ sx

2 + 0,084 x rp2 + 0,084 x rx

2 + 0,25 x Up2

f) La incertidumbre combinada expandida (Uc) para el intervalo de confianza de aproximadamente el 95% resulta de multiplicar la anterior por el factor de cobertura 2.

Uc = 2 x sp2+ sx

2 + 0,084 x rp2 + 0,084 x rx

2 + 0,25 x Up2

up Up Up

kp 2= =



Procedimiento recomendado para la calibración de termómetros en el laboratorio clínico

Anexo 2. Ejemplo

Calibración de un termómetro de columna de mercurio de categoría A, a la temperatura de 60 ºC

● Características de la sonda de calibración

Sonda de resistencia de platino PT100Incertidumbre de calibración (Up): 0,020 ºCResolución (rp): 0,001 ºC

● Características del termómetro a calibrar

Termómetro de columna mercurio, de inmersión totalRango de medida: 0-100 ºCResolución (rx): 0,1 ºC

● Incertidumbre asociada a la dispersión de las lecturas calculada a partir de la desviación típica de 5 medidas repetidas.

tP = 60,138 ºCsP = 0,00117 ºC

tX = 60,11 ºCsX = 0,0316 ºC

● Incertidumbre asociada a la resolución de los dos termómetros

urp = 0,29 rp = 0,29 x 0,001 urx = 0,29 rx = 0,29 x 0,1

● Incertidumbre asociada a la calibración del termómetro patrón

up = 0,020 / 2

• Incertidumbre combinada expandida

Uc = 2 x sP2 + sX

2 + 0,084 x rp2 + 0,084 x rx

2 + 0,25 x Up2

Uc = 2 x 0,001172 + 0,03162 + 0,084 x 0,0012 + 0,084 x 0,12 + 0,25 x 0,020 2

Uc = 0,088

Cálculo del error sistemático (ES)

ES = tP - tX | ES | = 60,138 - 60,110 = 0,030 ºC

Error total en la medida del termómetro a calibrar

|ES + Uc|= 0,030+0,088 = 0,119 ºC|ES + Uc | < 0,5 ºC

Resultado conforme



Criterios para la selección de un modelo de automatización del laboratorioSociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología MolecularComité CientíficoComisión de Instrumentación y Sistemas AnalíticosDocumento A. Fase 3. Versión 2

Preparado por: JL Bedini Chesa, S Esteve Poblador, L García Beltrán, JM Gasalla Herraiz, C Macías Blanco, M Martínez Casademont, JM Moreno Cebeira, V Martínez Vázquez, B Prieto García, G Serrano Olmedo, J Torres Nicolau

ÍNDICE

0. Introducción 1. Objeto y campo de aplicación 2. Modelos de automatización 3. Fase preanalítica 3.1. Identificación de los pacientes: hospitalizados y ambulatorios 3.2. Tipos de contenedores 3.3. Identificación de la muestra 3.4. Configuración 3.5. Trazabilidad4. Fase Analítica 4.1. Versatilidad de la automatización en la fase analítica 4.2. Gestión de prioridades 4.3. Control de la integridad de las muestras 4.4. Gestión de muestras especiales una vez dentro del proceso

analítico 4.5. Gestión de los módulos del sistema automatizado 4.6. Acceso a la información generada sobre la muestra a

tiempo real y validación técnica de resultados 4.7. Control de la calibración y controles de calidad 4.8. Recursos humanos necesarios para la gestión y manteni-

miento del sistema de automatización en la fase ana- lítica

5. Fase Postanalítica 5.1. Recuperación de muestras ya procesadas 5.2. Archivo de muestras. Indicación de caducidad o días de

conservación 5.3. Capacidad de almacenamiento 5.4. Trazabilidad de las muestras 5.5. Conexión de los autoanalizadores con el sistema de in-

formación del laboratorio 6. Conclusiones 7. Bibliografía

0. INTRODUCCIÓN

Los avances tecnológicos desarrollados en los últimos años pueden condicionar la aparición e implantación de nuevos siste-mas organizativos, que permitirán agrupar la actividad de varias especialidades del laboratorio clínico, de manera que compartan espacio físico, recursos humanos y técnicos.

Las constantes mejoras en la instrumentación han conducido a un incremento notable de la capacidad productiva del laboratorio clínico. La automatización ha permitido hacer más con menos y los nuevos descubrimientos científicos han creado, a su vez, nuevas necesidades y procedimientos que han repercutido en un aumento de la demanda de servicios al laboratorio clínico, los cuales se ven sometidos a la presión de los usuarios para la puesta a punto de nuevos procedimientos diagnósticos.

En este complejo escenario, los profesionales de los laboratorios no pueden además olvidar su misión, que consistirá, fundamental-mente, en adecuar la tecnología necesaria para el estudio de fluidos y tejidos del cuerpo humano, con el fin de servir de apoyo a la clínica, proporcionándole información fiable y útil para el correcto diagnóstico de las enfermedades, para el seguimiento evolutivo de las mismas y para el control de la eficacia de la terapéutica aplicada.

A la hora de seleccionar un modelo de automatización se estudiará la fiabilidad y la practicabilidad de las soluciones disponibles. La fiabilidad nos habla de la capacidad que tiene un sistema para man-tener una adecuada calidad analítica (veracidad e incertidumbre) a lo largo del tiempo. Por otro lado, la practicabilidad es un índice de información sobre las prestaciones del modelo de interés bajo las condiciones particulares del laboratorio donde se implanta.

Para conocer las prestaciones del sistema, nos basaremos en la información proporcionada por el fabricante, en la experiencia de otros usuarios y en las publicaciones de evaluaciones de cada modelo.

Pero también será imprescindible considerar las características de cada laboratorio: los puntos fuertes a conservar y, si es posible, mejorar, los aspectos que claramente precisan una mejora o un re-planteamiento y aquellas innovaciones que deseamos implementar. Será de utilidad crear un guión en el que se incluyan todos estos aspectos, para que podamos ir reflejando una a una las soluciones que nos aporta cada modelo de automatización y las impresio-nes que nos suscitan en caso de que podamos valorar diferentes opciones aplicadas en otros laboratorios que compartan nuestras características básicas.


Este documento recoge una serie de aspectos a considerar para la selección de un modelo de automatización. No es objeto de este documento la revisión exhaustiva de todas y cada una de las posibles soluciones existentes en el mercado, sino el aportar unas

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Criterios para la selección de un modelo de automatización del laboratorio

recomendaciones que faciliten establecer cuál sería el modelo más adecuado para un laboratorio concreto.

2. MODELOS DE AUTOMATIZACIÓN

El concepto de organización de laboratorio unificado (core lab) ha variado en los últimos años como consecuencia del progreso tecnológico.

Pueden distinguirse dos modelos claramente diferenciados de core lab: el laboratorio totalmente automatizado y el laboratorio automatizado modular. En cualquiera de los dos casos, el laboratorio central obtiene beneficios cuando lleva acoplada toda la gestión del proceso preanalítico.

2.1. Laboratorio totalmente automatizadoMuchos de los desarrollos en el campo de la automatización total

pueden atribuirse al Dr. M. Sasaki responsable del primer laborato-rio que se creó bajo esta concepción, en la Kochi Medical School de Japón, en 1984. Desde entonces, alrededor de 140 laboratorios japoneses han seguido este esquema.

El gran número de muestras que procesaban estos centros, una tecnología que en aquellos momentos parecía definitivamente consolidada y el problema que se había planteado por la escasez de personal técnico, permitían plantear esquemas organizativos rígidos y poco flexibles, en los que se conectaban diferentes analizadores a un sistema automatizado de transporte de muestras, en algunas ocasiones diseñados por los propios laboratorios.

Fuera de Japón, existen pocos laboratorios que hayan adoptado este modelo de automatización global, fundamentalmente en EE.UU y Canadá.

En Europa, estos planteamientos han tenido, hasta el momento, poca repercusión real. Han sido pioneros en la puesta en marcha de sistemas totalmente automatizados los hospitales de Leuven (Holanda), Regensburg (Alemania), Helsinki (Finlandia), el nuevo Hospital Pompidou de París (Francia), y el Hospital Clínico de Barcelona (España).

Quizás la escasa implantación de esta modalidad se deba a una serie de factores que es necesario tener en cuenta:

• Necesidad de una fuerte inversión inicial. • Escasa incidencia de la cadena de transporte sobre las presta-

ciones reales de los instrumentos.• Diferencias notables entre los modelos organizativos europeos

y los de EEUU y Japón.• En la mayoría de los Sistemas Sanitarios Europeos, escasa

capacidad para aumentar la actividad del laboratorio mediante la adquisición de nuevas cuotas de mercado.

• Escasa flexibilidad y modularidad, sobre todo en los sistemas de primera generación, la mayoría de ellos totalmente cerrados.

• Dependencia para la conexión de nueva tecnología, de la capacidad de entendimiento entre los fabricantes de sistemas de transporte y los de instrumentos analíticos.

• Dificultades en la comunicación entre el Sistema Informático de Laboratorio (SIL) y el sistema de gestión de la cadena de transporte.

• No es totalmente adecuado para la gestión integral de la urgencia, por lo que en ocasiones puede requerirse un circuito diferenciado.

• Necesidad de un espacio adecuado.• Dificultad de gestionar y organizar, desde una única y nueva

estructura organizativa, personal y actividades asistenciales per-tenecientes a diferentes servicios y especialidades de laboratorio.

Y como ventajas:

• Permite la gestión integral de la muestra. Sobre todo en cuanto a trazabilidad, custodia, seguridad biológica y gestión de la fase postanalítica.

• Representa un ahorro considerable en el número de tubos, al tener unidos a la cadena los sistemas que comparten la misma muestra.

• Permite la preparación de muestras para ser procesadas en equipos off-line de la cadena.

• Permite la conexión de distintos sistemas de inmunoanálisis con lo que se puede conseguir un panel muy completo.

• Permite la mayor optimización de recursos humanos.

2.2. Laboratorio automatizado modularEn los últimos años, la evolución de la tecnología ligada a los

laboratorios ha planteado propuestas más flexibles, de tipo modular, que permiten a los laboratorios adaptarse mejor a futuros cambios importantes, tanto de tecnología como de estructura organizativa de trabajo.

En este modelo la instrumentación se agrupa en “islas” o módulos de automatización (work-cells), atendiendo a criterios tecnológicos o de tipo de muestra, de manera que se crean áreas, físicamente independientes, para atender:

• Área de preanalítica, con clasificación, centrifugación, pre-paración de alícuotas y sistemas de carga (racks) de los distintos analizadores, de las propias work-cells, o de equipos situados en otras áreas del laboratorio.

• Determinaciones en sangre total, suero, plasma, orina o líquidos biológicos.

• Bioquímica básica, inmunoanálisis homogéneos y heterogéneos.

Algunas de estas work-cells, poseen su propio sistema de transporte mecánico de muestras entre los diferentes módulos incorporados o están constituidas por un solo instrumento modular.

• Hematimetría. Pueden agrupar más de un equipo, sistema de transporte de muestras propio e incluso sistemas de preparación y teñido automático de extensiones de sangre.

• Coagulación básica.

Como ventajas de este sistema se pueden considerar:

• Menor inversión inicial.• Mayor flexibilidad en la elección de los instrumentos analíticos.• Resolución de problemas de la fase preanalítíca.• No necesita grandes instalaciones.• Permite una mejor gestión de la urgencia.• Menores limitaciones arquitectónicas.

Como inconvenientes:

• No permite la gestión integral de la muestra. Sobre todo en cuanto a trazabilidad, custodia y gestión de la fase postanalítica, sin un desarrollo informático especialmente dedicado a tal fin.• En los sistemas separados, o se transporta el tubo manualmente, de un analizador a otro, o no hay un ahorro significativo en el número de alícuotas.• Los sistemas modulares integrados, son totalmente cerrados, al igual que los que se sustentan sobre un solo equipo modular. No permiten la consolidación del inmunoanálisis, al tener que limitarse al panel desarrollado por el fabricante.



En los siguientes apartados se revisará cada una de las tres fases que comprende la tarea de un laboratorio clínico, a fin de establecer los puntos donde repercute de manera especial la automatización del mismo.

3. FASE PREANALÍTICA

La fase preanalítica es el conjunto de operaciones que se realizan desde que se recibe la petición hasta que se inicia la fase analítica.

Esta fase requiere más del 57 % del tiempo necesario para dar respuesta a la demanda de una petición analítica, frente al 25% de la fase analítica (Godolphin 1990).

También es en dicha fase donde se producen el máximo número de errores, entre el 32 y 75%, según los trabajos consultados (Bonini 2002) y donde hay más riesgo en la manipulación de los especímenes.

Algunas ventajas de automatizar la preanalítica son:

• Mayor bioseguridad: al no existir manipulación de la muestra• Trazabilidad del proceso• Liberación de personal a tareas más productivas• Estandarización de procesos: menos errores• Mejor gestión de la muestra: menos tubos por extracción

Por todo ello, en estos últimos años se ha planteado la necesidad de automatización de dicha fase. Los principales aspectos a tener en cuenta son:

3.1 Identificación de los pacientes: hospitalizados y ambulatorios

Es deseable la identificación de los pacientes con la tarjeta sani-taria. Si esta carece de fotografía, será necesario el DNI, pasaporte, etc. Este proceso debería realizarse en Admisión de Pacientes en el mismo momento del ingreso o de la extracción.

En todo paciente la identificación es imprescindible, tanto en el momento de la extracción como durante los procesos preanalítico, analítico y postanalítico, para así solventar posibles incidencias que requieran localizar al paciente.

La mayor parte de los sistemas presentes en el mercado ofrecen la posibilidad de identificar al paciente mediante un brazalete, basado en código de barras, banda magnética o microchip, con conexiones WIFI soportadas por programas informáticos instalados en PDAs o Tablets PC. Estos sistemas permiten introducir los datos identi-ficativos del extractor (mediante un código personal), así como el momento de la extracción en tiempo real.

Sería deseable que este proceso se realizara de manera inseparable (espacio y tiempo) del etiquetado de los contenedores para realizar la extracción. Si esto no es posible o el receptor de especímenes y el extractor no son la misma persona, sería deseable que el procedi-miento de identificación positiva se realizara en cada fase. De este modo se garantizaría la trazabilidad paciente-petición-espécimen

3.2 Tipos de contenedoresSegún las necesidades del Laboratorio, se debe considerar la

posibilidad de manejar otros tipos de contenedores distintos al tubo (vasos, portaobjetos, cultivos, etc.), aunque en estos especímenes de menor frecuencia no parece recomendable su automatización.

En el caso de que solamente se manejen tubos, el posible uso simultáneo de tubos de diferentes características (medida, fondos redondos o cónicos, etc.), vendrá limitado principalmente por la

longitud, diámetro y tipo de tapón del tubo en los procesos de lectura del sistema de identificación, centrifugación, destaponado y posterior retaponado. Es aconsejable la estandarización del tubo según los diferentes especímenes (suero, sangre total, orina, etc.).

3.3 Identificación de la muestraExisten principalmente dos opciones para la identificación de los

especímenes: 1) código de barras, y 2) identificación por radiofre-cuencia combinado con código de barras.

Es imprescindible valorar tanto la calidad del papel empleado para generar la etiqueta autoadhesiva identificativa como la de la impresión del código de barras, de manera que sea nítida y robusta al rayado. Los códigos de barras son leídos repetidamente y se debe mantener la calidad durante todo el proceso.

En el caso de la utilización de radiofrecuencia es necesario pre-venir la retirada manual de los tubos de los contenedores, con la resultante pérdida de información (Melanson 2007).

Algunos sistemas preanalíticos pueden diferenciar las muestras de un paciente con el mismo código de barras por: la forma-tamaño del tubo, el color del tapón, el rack en el que se introducen al sistema o soluciones mixtas (Ej. tamaño tubo + color tapón).

3.3.1 Tipos de códigos de barras que soporta el sistemaAnte la multitud de formatos de código de barras disponibles,

conviene seleccionar el que presente mejores características para cada laboratorio (versatilidad, información…), el que admita la generación de un dígito de control (permite chequear la aparición de errores durante la impresión/interpretación del mismo) y el que pueda ser leído por todos los equipos relacionados del laboratorio.

Es recomendable considerar la capacidad de compresión de los códigos en función de las necesidades y la calidad de los lectores de los diferentes equipos disponibles en el laboratorio. Algunos sistemas soportan códigos de barra bidimensionales, con lectores específicos, permitiendo una cantidad de información muy superior.

3.3.2 Información de las etiquetas con el código de barras

Las etiquetas con el código de barras deben contener idealmente la siguiente información:

Identificación del paciente: NombreIdentificador unívoco del paciente (número de historia clínica,

CIP, NSS…)SexoFecha de nacimiento

Identificación de la muestra: Centro de procedencia (Ej. prefijo alfanumérico)

Número de petición (numérico)Prioridad de la muestra (banda de color o sufijo)Destino de distribuciónFecha y hora de extracciónMomento de la extracción (basal, 30’, valle o pico, etc.)

Identificación del contenedor: Tipo de contenedor (tubo primario, frasco 24 horas).

Tamaño/Volumen (tubo largo, tubo corto, microtubo, etc.)Aditivo (seco con o sin gel, EDTA, citrato, heparina,etc.)Conservante (HCl, Carbonato, etc.)




Condiciones de conservación (luz, temperatura, etc.)Fecha de caducidad

3.3.3 Información de las etiquetas secundarias y alícuotas

Tanto si se generan etiquetas secundarias para placas de cultivo, concentradores de orina, tubos para precipitación o pretratamiento de muestras, como para tubos secundarios (alícuotas) su identifi-cación deberá mantener la misma información que la etiqueta del tubo primario, cambiando el destino de distribución, de modo que sea posible su trazabilidad al paciente.

3.3.4 Gestión de la identificación de muestras en extracciones realizadas fuera del laboratorio

La opción ideal sería que el sistema pudiera generar las etiquetas personalizadas y específicas de contenedor en cualquier punto de extracción, de modo que se utilizara el mismo sistema que en el laboratorio.

Si la infraestructura no lo permite, existen múltiples alternativas como las etiquetas preimpresas (no personalizadas) que indican el tipo de muestra o etiquetas preimpresas sin ninguna otra informa-ción, diferenciando el espécimen por indicadores indirectos (color del tapón o anillos de color).

En todos los casos sería recomendable poder identificar el centro donde se realizó la extracción.

3.3.5 Etiquetado automático de los contenedores primarios y secundarios

El sistema debería ser capaz de etiquetar automáticamente los contenedores estándar (tubos primarios y secundarios para alícuotas) minimizando así los errores de pre o postetiquetado manual, quedando reservado éste a los contenedores no estándar (placas de cultivo, etc.).

3.4 ConfiguraciónEl diseño en la automatización de la fase preanalítica dependerá

del modelo general de automatización escogido (ver apdo. 2 Mo-delos de automatización) y cada laboratorio deberá estudiar cuál se adecua más a sus necesidades (Reynolds 2002, Holman 2002):

• Si se opta por el laboratorio totalmente automatizado, la automa-tización será en todas las fases (preanalítica, analítica y postanalítica).

• Si el modelo es el laboratorio automatizado modular, podremos distinguir dos configuraciones de automatización posibles de la fase preanalítica: el clasificador-alicuotador individualizado, sin conexión a ningún analizador, o varios módulos (destaponado, centrífuga, etc.) unidos a uno o varios analizadores.

Aunque la progresiva automatización de todos los especímenes mejoran la calidad y la eficiencia del laboratorio (Dadoun 2002), hay especímenes como gases en sangre, banco de sangre, etc., o muestras con condiciones críticas de oscuridad o temperatura, que pueden no ser fácilmente automatizados, si bien ya existen algunas iniciativas en la línea de automatizar la carga de muestras para el estudio ácido-base y gasometría.

3.4.1 Soportes (racks) para los diferentes especímenes

Existen en la actualidad una amplia variedad de soportes para los diferentes especímenes, aunque el soporte para cinco tubos o

“rack” es uno de los más extendidos. El tipo de soporte dependerá principalmente de cada analizador, pero el sistema deberá poder gestionar eficientemente los diferentes tipos de soportes utilizados.

3.4.2 Clasificación y pretratamiento de los especímenes

El sistema debería identificar (clasificar) los especímenes que re-quieran pretratamiento (centrifugación, destaponado, alicuotado, pre-dilución, precipitación, etc.) y los que no lo precisen (Ej. hemograma).

Para ello el sistema debería obtener información sobre el con-tenedor del espécimen (mediante prefijos o sufijos en el código de barras, color del tapón, reconocimiento de imagen del tamaño y forma del tubo, etc.), su origen (muestras centrifugadas en puestos remotos de extracción o extraídas in situ), prioridad (muestras ur-gentes, preferentes o no prioritarias) y cuál será su próximo destino (destaponado, centrifugación, procesamiento directo, seroteca, etc.).

Una vez identificados los requerimientos de los especímenes, deberían ser dirigidos a bandejas de clasificación para: pretrata-miento, puestos de trabajo o instrumento encargado del siguiente proceso. En los casos en que el destino sea un pretratamiento, una vez realizado éste, volverá a analizar los nuevos requerimientos y los enviará a su nuevo destino.

3.4.3 Centrifugación selectiva de especímenesLa centrifugación suele ser una fase crítica dentro de la auto-

matización preanalítica, ya que puede convertirse en un auténtico “cuello de botella” para el sistema.

Si se decide su inclusión dentro de la cadena de automatización, se deberían tener en cuenta las siguientes consideraciones:

● Prioridad de la muestra: Si incluye muestras urgentes habrá que adaptar la puesta en marcha automática de la centrífuga por tiempo máximo de espera o por la llegada de alguna muestra de alta prioridad. Si sólo se incluyen muestras de prioridad normal, se pueden establecer sistemas de trabajo por lotes (completado de posiciones) o por definición de tiempo de espera máximo.

● Condiciones de centrifugación: El sistema debería poder identificar por la información del contenedor qué características de centrifugación requiere (temperatura máxima, revoluciones y tiempo) y, en el caso de disponer de una única centrífuga, ser capaz de adaptarla a los requerimiento específicos del lote de especímenes a tratar (4 ºC para PTH, 37 ºC para crioglobulinas, y condiciones de tiempo y RPM según se trate de plasma para test de coagulación, orinas o sueros). Es posible definir unos parámetros de centrifuga-ción que nos permitan centrifugar conjuntamente muestras para la obtención de suero, plasma para coagulación y orinas.

3.4.4. Destaponado/retaponado del tubo primarioLa mayoría de los sistemas automáticos poseen unidades de

destaponado, pero no todos están adaptados para cualquier tipo de tapón (rosca, goma, etc.). Esta característica puede condicionar el tipo o tipos de tubo o contenedor a utilizar.

El retaponado suele hacerse con tapones de plástico o taponado térmico con tapas metálicas.

3.4.5. AlicuotadoEn el alicuotado automático se valorará la utilización de pipeta

desechable para cada muestra, la existencia de sensor de nivel del módulo de alicuotado y la presencia de detector de coágulos.



Es importante valorar la modalidad de pipeteo, ya que es preferible, por optimización de tiempos, la aspiración de gran volumen de muestra en la pipeta y posterior dispensación en varias alícuotas (Holman 2002), que la aspiración y dispensación individual para cada alícuota.

3.4.5.1Volumen de las alícuotas

El sistema debe adaptar el volumen de cada alícuota a los re-querimientos del destino y al número de pruebas a realizar en cada petición. Se tendrá en cuenta un volumen muerto (específico del analizador), la suma de los volúmenes requeridos para las determi-naciones solicitadas y un volumen para repeticiones.

En casos de muestras de escaso volumen el sistema debería con-sultar con el responsable la prioridad de preparación de alícuotas. Esto que podría establecerse de manera genérica (por ej. marca-dores tumorales en pacientes oncológicos, hormonas en pacientes procedentes de consulta de endocrinología), debería al menos confirmarse por el usuario o poder seleccionar individualmente las alícuotas prioritarias (serología en muestra prediálisis de un paciente oncológico)

3.4.5.2 Retaponado de alícuotas

Si es necesaria la preparación de alícuotas, el sistema debería ser capaz de taparlas una vez generadas, ya sea por el propio alicuotador, o por un módulo independiente de taponado.

El retaponado suele hacerse con tapones de plástico o taponado térmico con tapas metálicas.

3.4.5.3 pRepaRación de alícuotas en condiciones óptimas de conseRVación de la muestRa

El sistema debería ser capaz de procesar las alícuotas en condi-ciones adecuadas para evitar la concentración (taponado inmedia-to), fotodegradación (procesamiento tras paneles de metacrilato oscurecido), termodegradación (los soportes de tubos primarios y alícuotas deberían estar refrigerados) y/o contaminación del espé-cimen (puntas desechables).

Aún así, las muestras con condiciones críticas de oscuridad o temperatura pueden no ser fácilmente automatizadas.

3.5 Trazabilidad

3.5.1 Comprobación de entrada de tubos y otros recipientes al sistema preanalítico

El sistema debe confirmar de manera positiva la entrada de cada uno de los especímenes de la petición al sistema.

En función de las incidencias detectadas (falta de petición, petición con datos incompletos, petición duplicada, falta de algún espécimen, sobra algún espécimen, especímenes duplicados, muestras cortas, presencia de coágulos o calidad inadecuada de la muestra) el sis-tema debería iniciar acciones automáticas de corrección (ejemplo: rechazo de muestra duplicada o no solicitada), o avisar al operador para la toma de decisiones (ejemplo: recentrifugación, reimpresión de etiquetas no legibles, etc.).

El proceso de destaponamiento automatizado (en aquellos sistemas que lo posean), no debería realizarse antes del chequeo de llegada, para poder tomar acciones sobre las muestras con incidencias antes de haberlas destaponado.

Será posible la consulta en cualquier momento del estado de la petición y cada uno de sus especímenes y alícuotas, dejando traza de todos y cada uno de los procesos realizados sobre ellos.

3.5.2 Registro de tiempos preanalíticosTodo sistema preanalítico debería mantener un registro (Rynning

2007) de los tiempos en los que se realizan todas y cada una de las acciones sobre cada espécimen, comenzando por el momento de la extracción / recogida de muestra, y finalizando en el momento de su llegada al analizador.

Se registrarán todos los tiempos de manipulaciones intermedias (centrifugación, destaponado, alicuotado y redireccionamiento a los diversos destinos).

4. FASE ANALÍTICA

Al igual que en cualquier otra fase, en la evaluación de un sistema de automatización debemos plantearnos una reflexión previa acerca de las características de nuestra fase analítica actual para que la automatización se adecue a las características y posibilidades de nuestro laboratorio, y no el laboratorio a ella. Con este objetivo es útil realizar un esquema del flujo de trabajo actual respecto a esta fase. Este esquema debe incluir:

• El tiempo de la jornada laboral que se dedica a la fase analítica diaria y semanalmente (por ejemplo habrá que tener en cuenta turnos de tarde y turnos de fin de semana, si se diese el caso)

• Una valoración de la carga de la fase analítica a lo largo de la jornada laboral: ¿tenemos picos de trabajo o es continuo?

• Incremento del volumen de muestras o del panel de determina-ciones que se espera a corto y medio plazo

• Mantenimiento de los analizadores: a qué hora y/o día se realizan, cuánta inversión de tiempo supone, si se dispone de analizadores “reflejos” que permitan alternar los mantenimientos

• Frecuencia de las calibraciones y de los controles• Tiempos de respuesta pactados: habrá que tener en cuenta si el

laboratorio recibe muestras para su análisis en una sola tanda o si las va recibiendo “en goteo” y si realiza peticiones urgentes

• Problemas técnicos frecuentes: filtros atascados, fallo de fotó-metro, desajuste de agujas, etcétera.

Una vez hemos caracterizado el trabajo que realizamos rutinaria-mente en la fase analítica habrá que plantearse cuáles son los puntos débiles que hemos encontrado y cómo esperamos mejorarlos y, asimismo, qué cualidades y calidades deseamos preservar.

Sería recomendable que, con este diseño de lo que tenemos ac-tualmente y lo que queremos implementar, diseñásemos un guión de las características que debería cumplir un sistema automatizado en cuanto a la fase analítica. Puntos fundamentales a incluir en este “plan ideal” serían los siguientes:

4.1 Versatilidad de la automatización en la fase analítica

Un sistema automatizado no debe suponer una limitación en cuanto a incluir analizadores de diferentes casas comerciales, en la adaptación del software propio del sistema de automatización a la gestión que nosotros queremos realizar del mismo o en la inversión de tiempo que supone el mantenimiento y chequeo del propio sistema.

4.1.1 Posibilidad de conectar los analizadores elegidos a una cadena

Existen dos formas diferentes de entrada de muestras a una cadena, ambas compatibles con la conexión de diferentes analizadores a la misma:




• Si el tubo o la alícuota se introduce directamente en la cadena, se disminuye el tiempo de circulación de las muestras, así como el tiempo de cola en cada analizador.

• Si existe un brazo robótico que introduce las muestras en la cadena, pueden sacarse las muestras de la cadena temporalmente.

A la hora de valorar la opción más adecuada para un laboratorio concreto, se tendrá en cuenta la existencia de especímenes poten-cialmente no transportables en cadena y el impacto que genera su entrada manual en cada una de las alternativas antes mencionadas.

4.1.2 Tiempo necesario para empezar a emitir resultados desde el encendido del sistema (tiempo de respuesta)

Es conveniente establecer el tiempo que requiere el sistema para su puesta en funcionamiento, lo que significa estimar un tiempo mí-nimo y un tiempo máximo en función de la organización del trabajo. Para ello, hay que conocer el tiempo necesario para la realización de los mantenimientos programados (diario, semanal y mensual), así como para efectuar la carga de reactivos. Esto dependerá de las características de los equipos y del laboratorio, de modo que podrá contemplarse la posibilidad de un modelo de laboratorio de 24 horas.

En cualquier caso, la valoración del tiempo de puesta en marcha quedará matizada en función de los requerimientos de parada del propio sistema (averías, mantenimientos programados y preventivos,…).

4.1.3 Posibilidad de carga de reactivos durante el funcionamiento del sistema

En función del volumen de muestras que procesemos quizás no sea suficiente con una carga de reactivos al comienzo de la jorna-da. Este puede ser un punto limitante, si para la carga de nuevos reactivos es necesario que el sistema se pare, por lo que habrá que considerar cuál es el tiempo máximo que se consumiría en ese caso.

4.1.4 Capacidad de incorporar instrumentación de diversa procedencia

Punto clave a tener en cuenta en el caso de aquellos laboratorios que elijan diferentes casas comerciales para la misma o para dife-rentes áreas analíticas del laboratorio, por el posible conflicto que podría crearse no sólo en la instalación del sistema automatizado, sino también en las conexiones informáticas de los diferentes sistemas y en la transmisión bidireccional de la información entre cada analizador y el sistema informático.

Habrá que considerar si se desea una integración total de los sistemas mediante conexión a un mismo proceso automatizado, o bien, una integración parcial.

4.1.5 Capacidad de incorporar nuevas técnicas con la misma instrumentación

Se valorará la disponibilidad de canales abiertos, para incorpo-rar técnicas de otras casas comerciales. Para ello, será importante conocer el panel de pruebas, por tanto las pruebas problemáticas y las que no es posible realizar.

4.1.6 Capacidad de ampliación y facilidad de renovaciónSe deberá prever el posible aumento de la carga de trabajo, y por

tanto, la posibilidad de añadir otros analizadores u otros módulos a los ya disponibles. Será necesario plantear la posibilidad de com-paginar distintas versiones de analizadores.

4.1.7 Integración de diferentes áreas del laboratorioSe debe tener en cuenta qué áreas sería interesante integrar en

la automatización, y la mejora que supone respecto a mantenerlas como áreas independientes. A su vez, se tendrá en cuenta cómo in-fluye su integración en la fluidez de la fase analítica de una muestra. Por ejemplo, aquellas áreas que emplean el mismo tipo de muestra pueden considerarse “integrables” en un modelo de automatización común con la ventaja de poder reducir el volumen de muestra que se necesitará extraer al paciente, así como el espacio necesario para el almacenamiento de las muestras una vez procesadas. La valoración de estas y otras ventajas, no obstante, quedará supeditada a la garantía que ofrezca el sistema en lo que se refiere a ausencia de contaminaciones cruzadas y habrá en todo caso que evaluar cómo afecta la integración al tiempo de respuesta establecido como óptimo para cada área.

Habitualmente las áreas se agrupan por metodologías (fotometría, turbidimetría, inmunoquímica,…), aunque actualmente existen modulares que pueden integrar varias metodologías.

4.1.8 Accesibilidad a las muestras durante la fase analítica

En un sistema totalmente automatizado, no sería necesario acceder a las muestras una vez introducidas en el proceso analítico, al menos hasta el fin de esta fase. Sin embargo, son múltiples las situaciones en las que es necesario recuperar una muestra, haya terminado o no su análisis. Por ello, es importante conocer si nuestro sistema dispone de un mecanismo de recuperación de muestras en esta fase, si registra esta recuperación, y cómo afecta al proceso de análisis una vez se reincorpora la muestra al sistema. En algunos casos la solución pasa por que el sistema haga una alícuota y deje liberado el tubo primario.

En este punto una cuestión a valorar es el sistema utilizado para la aspiración de la muestra en cada analizador integrado. Existen sistemas en los que la muestra circulante es introducida en el anali-zador mediante un brazo robotizado, lo que supone un “secuestro” temporal de la muestra, aunque tiene la ventaja de reducir las colas de espera que se generan en aquellos sistemas que aspiran el volumen teórico necesario cuando el tubo llega al analizador.

4.1.9 Manejo de diferentes tipos de contenedores y/o muestras

Un requisito importante de un sistema de automatización es la posibilidad de gestionar conjuntamente diferentes tipos de mues-tras y/o especímenes, así como distintos tipos de contenedores. Es necesario valorar la solución que el sistema ofrece para las mues-tras especiales, ya sea por su escaso volumen o por otras causas (pediátricas, líquidos biológicos, orinas, …).

Es interesante, asimismo, conocer si el sistema de automatización permitirá reducir el número y/o el volumen de muestras o especí-menes requeridos.

En el caso de laboratorios en los que es frecuente el manejo de volúmenes escasos (hospitales pediátricos, unidades de quemados, etc.) hay que considerar si el sistema de automatización puede gestionar este tipo de muestras conjuntamente con el resto de las muestras o si necesitarán una gestión específica: pasarlas a otro tipo de contenedor, etiquetado especial, etc. Además, sería deseable dis-poner de un sistema de aviso respecto a la integridad de las mismas.

4.1.10 Taponado/destaponado de tubos Lo ideal sería trabajar con tubos tapados para una mejor conserva-

ción de la muestra. Si no es posible, se tendrá en cuenta si se trabaja



con el tubo primario o con alícuotas. En el primer caso se valorará que el sistema pueda destapar tubos que hayan sido centrifugados previamente por el sistema o externamente. En cada caso habrá que conocer la estabilidad de las muestras, las condiciones de almacena-miento de las mismas durante el proceso analítico y la facilidad de su localización (organización manual, informatizada o robotizada).

Otro punto es la necesidad de retapar los tubos una vez procesa-dos y en este caso habrá que tener de nuevo en cuenta si se trata de contenedores primarios o alícuotas.

4.1.11 Posibilidad de asumir un aumento en el panel de pruebas y/o en el número de peticiones

La versatilidad del sistema de automatización debe verse también reflejada en la posibilidad de aumentar el número de determinaciones a realizar ya que es raro el laboratorio que no aumenta su oferta a medio plazo. Es además importante tener en cuenta que si se ajustan mucho las prestaciones del sistema al volumen de muestras en un momento dado, una variación del mismo puede significar que el sistema no lo asuma eficazmente.

4.2 Gestión de prioridadesLos requerimientos en la gestión de prioridades serán más o menos

estrictos, dependiendo si se trata de un laboratorio que sólo trabaja la rutina, o si integra la urgencia (24 horas de trabajo continuado). Esta gestión también será diferente si la secuencia de recepción de muestras es un goteo continuo o picos de recepción a determinadas horas. Además, si se integran diferentes áreas de laboratorio, es muy importante conocer si el sistema está totalmente libre de posibles contaminaciones, en cuyo caso no será necesaria la priorización de determinadas muestras (ej: serología), así como establecer qué pruebas se desea informar con un tiempo de respuesta mínimo.

4.2.1 Priorización de muestras según procedenciaEs importante priorizar las muestras en función de su proceden-

cia, o incluso del diagnóstico del paciente. Por tanto el sistema de automatización tendrá que ser capaz de gestionar prioridades en base a las necesidades y podrá hacerlo con diferentes sistemas que tendremos que valorar según los requerimientos: gestión preana-lítica totalmente automatizada (mediante racks predefinidos como prioritarios o mediante etiquetas de color) o por gestión del software analítico (comunicación directa con el SIL). Si están integradas en el mismo laboratorio la rutina y la urgencia, se valorará el utilizar distintos equipos, o equipos con rotor para las muestras prioritarias.

4.2.2 Priorización de determinaciones si el volumen de la muestras es insuficiente

En primer lugar, será necesario conocer el volumen requerido para la realización de cada prueba, y sería valioso un sistema que permita reconocer ese volumen mínimo de modo que, en caso de resultar insuficiente, la muestra sea gestionada con base en un algoritmo preestablecido según servicios de procedencia y diagnósticos, que priorice la realización de determinadas pruebas.

4.2.3 Influencia de la integración de la urgencia en los tiempos de respuesta

Primero se debe definir el tiempo de respuesta deseado para las urgencias, ya que no es lo mismo una muestra urgente con un tiempo de respuesta (emisión de resultados) máximo de una hora que de tres horas. Es más, puede darse el caso de que el laboratorio tenga

que gestionar distintos tipos de urgencias: de UCI, hospitalizados, FIV, etcétera.

Si se integra la urgencia habrá que conocer cómo se gestionan estas muestras y cómo afecta esto al tiempo de respuesta tanto de las muestras urgentes como de las no urgentes.

Puede gestionarse previamente desde la fase preanalítica, dis-poniendo de estas muestras en racks o bandejas específicas y tener una zona reservada para su carga. En este caso habrá que valorar la posible pérdida de eficacia en la carga de muestras. Otro tipo de gestión sería informatizada mediante la comunicación con el SIL, en cuyo caso habrá que tener en cuenta si todas las muestras que se cargan en nuestro sistema se registran previamente de modo adecuado en el SIL.

4.2.4. Priorización de la entrada de muestras para prevenir contaminaciones

En caso de integrar diferentes áreas del laboratorio en el sistema de automatización, puede ser necesario definir rutas diferentes de entrada de los tubos a los analizadores en función de las peticiones.

Se podrán utilizar alícuotas diferentes para cada analizador o bien, puntas desechables. Si no se van a realizar alícuotas en todo el proceso, la mejor solución será utilizar puntas desechables; pero si esta previsto realizar alícuotas, se considerará una para muestras potencialmente contaminantes.

4.2.5 Eficacia en cuanto a gestión de pruebas reflejas, diluciones y/o comprobaciones

Durante la fase analítica será necesario realizar nuevas determi-naciones de una muestra en proceso o ya analizada, para realizar pruebas reflejas, diluciones, repeticiones o comprobaciones. Para ello, será preciso conocer la capacidad que tiene de mantener un volumen predefinido de reserva en el analizador o el tiempo máximo estimado que debe permanecer una muestra en la zona de descarga antes de ser retirada del sistema. Algunos analiza-dores disponen de un sistema de “rerun” automático cuando la muestra todavía está en el equipo; aunque también hay sistemas informáticos que gestionan la recuperación de las muestras una vez han salido del analizador.

4.3 Control de la integridad de las muestrasSi se persigue una verdadera automatización total de la fase ana-

lítica, ésta debe incluir un mecanismo de valoración de la integridad de la muestra que incorpore:

• Detección de fibrina• Detección y cuantificación (índices numéricos) de interferencias

por hemólisis, lipemia e ictericia• Detección del nivel de muestra• Volumen muerto requerido

Y todo ello debe estar informatizado de manera que se disponga de estos datos durante la validación de resultados.

4.4 Gestión de muestras especiales una vez dentro del proceso analítico

Es importante conocer qué ocurre con los tubos con múltiples rutas, tubos duplicados (no será necesario procesarlos) y tubos sin identificar.




4.5 Gestión de los módulos del sistema automatizado

4.5.1 ReactivosEs importante para la versatilidad del sistema de automatización la

posibilidad de cargar reactivos sin necesidad de parar el sistema. Aunque en general esta capacidad está ligada y depende de los analizadores y no de los sistemas de automatización, para valorar el impacto de gasto de recursos que supone la carga de reactivos, habrá que tener en cuenta:

• Si requieren reconstitución previa (liofilizados) o están listos para el uso

• Las necesidades de conservación (humedad, temperatura) en el compartimento de reactivos antes de utilizarlos y una vez abiertos

• La capacidad de almacenaje que tiene el analizador• Caducidades de los reactivos (una vez reconstituidos y/o una

vez abiertos).

En un sistema automatizado se debe tener información en tiempo real de los reactivos disponibles en cada uno de los analizadores que estén integrados y esta información incluirá: caducidad, número de lote, fecha de calibración, controles, volumen disponible en los analizadores de modo individual y en conjunto, etcétera.

4.5.2 Velocidad de procesamientoDe todo lo expuesto hasta ahora se deduce que habrá un parámetro

que englobará todas las especificaciones mencionadas, que es la velocidad de procesamiento.

Se deberá conocer el número de determinaciones a la hora en condiciones de rutina, así como el tiempo necesario para obtener un resultado urgente, teniendo en cuenta una situación de carga máxima del sistema. En la velocidad de procesamiento influirá qué constituyentes han sido solicitados.

Será necesario adaptar o modificar las prioridades de análisis según la carga de trabajo en un determinado analizador para evitar “cuellos de botella”, para lo que será importante conocer la capacidad de entrada de muestras en los distintos equipos.

4.6 Acceso a la información generada sobre la muestra a tiempo real y validación técnica de resultados

Una vez que la muestra está dentro del sistema de automatización es muy importante, para la trazabilidad de la misma y de los resultados que se obtengan, la posibilidad de gestionar los datos generados por la muestra durante el análisis a tiempo real y que exista un sistema intuitivo, sencillo y global que indique el estado de la muestra en cada momento. Con esta información se nos debe facilitar la posibilidad de realizar una validación técnica de resultados, ya sea manual o in-formatizada mediante algoritmos, y disponer de un sistema de avisos para aquellos resultados no normales o no esperados.

Se deben considerar los siguientes aspectos:

• Posibilidad de crear, modificar o anular datos de una muestra durante el análisis.

• Acceso a los resultados en tiempo real, y conocer la hora exacta a la que han sido generados.

• Posibilidad de generar textos predeterminados según algoritmos adaptados a perfiles de resultados concretos. Por ejemplo,

comentarios a determinadas pruebas para muestras hemolizadas, lipémicas o ictéricas.

• Registro por fechas, de todos los mantenimientos, incidencias y averías.

• Registro por fechas, de lotes y caducidades de controles y calibradores.

• Capacidad de almacenar, por fechas, resultados de pacientes, controles y calibraciones.

El resultado de una prueba puede contener errores importantes debidos a problemas en cualquiera de los elementos que intervie-nen en la realización de la misma (muestras, materiales, reactivos, calibradores, instrumentos, personal, etc.). El personal técnico normalmente dispone de un procedimiento que le indica las com-probaciones o acciones que debe realizar (repeticiones, diluciones, calibraciones, cambios de reactivos, avisos, etc.) en función de determinados criterios basados normalmente en valores o rangos de resultados, de alarmas de los equipos o de resultados del control de calidad. Esto es lo que se suele denominar validación técnica para distinguirla de la validación facultativa.

Los sistemas analíticos automatizados deben de tener la capacidad de realizar estos procesos de una forma rápida y eficaz, facilitando toda la información necesaria para una correcta realización de la validación técnica.

Tras la validación técnica de los resultados el autoanalizador debe de permitir visualizarlos de forma clara, si es necesario como en el caso de controles y calibradores en forma de gráficos (de evolución por ejemplo) y ofrecer la posibilidad de imprimirlos en papel cuantas veces sean necesarias.

Resultados anómalosSe deben establecer «límites de alarma» en el instrumento que

obligan a una acción inmediata de comprobación o de aviso al facul-tativo responsable. Los técnicos encargados de la validación técnica deben conocer los «límites de alarma» y la actuación consecuente.

El autoanalizador debe ser capaz de realizar de forma automática algunas acciones (repeticiones, generación de nuevas pruebas, anu-lación de pruebas) tras la orden emitida por el sistema informático del laboratorio.

4.7 Control de la calibración y controles de calidad

En cuanto a la calidad del análisis es fundamental la gestión de las calibraciones y de los controles de calidad. Por tanto, habrá que tener en cuenta:

• Si la calibración es automática con frecuencia preestablecida o manual a demanda

• El tiempo requerido para la calibración: preparación de material, análisis de los calibradores, exportación y valoración de datos, controles de calidad programados, etc.

• La posibilidad de visualizar la curva de calibración final y las acumuladas.

• La edición de unidades de calibración• Programación de los controles de calidad según algoritmos

disponibles (cada cierto tiempo, cada determinado número de mues-tras,…), valores de referencia, alarmas, criterios para su aceptación (basados en diagnóstico, gráficas Levey-Jennings, coeficiente de variación biológico intraindividual,…).

• Control de la absorbancia de los blancos de reacción.



Por otra parte, dado que en estos sistemas automatizados pueden utilizarse varios analizadores que realicen las mismas determinaciones y una muestra puede tener que ser analizada en varios aparatos, resulta muy importante asegurar la trazabilidad entre las calibraciones y las determinaciones realizadas en cada muestra. En el sistema deberá quedar registrado cuáles son los calibradores y controles con los que aseguramos la trazabilidad de las determinaciones que realizamos a cada muestra.

4.8 Recursos humanos necesarios para la gestión y mantenimiento del sistema de automatización en la fase analítica

La automatización de la fase analítica suele conllevar una reorganización de recursos humanos definiendo nuevas tareas y responsabilidades. Así, hay que tener en cuenta:

4.8.1 Personas necesarias para el funcionamiento del sistema y cualificación necesaria

Será necesario conocer los horarios de todo el personal, la orga-nización varía según sea personal fijo o a turnos.

4.8.2 Formación de personalCon todo nuevo sistema es necesario un periodo de familiariza-

ción que puede ser muy variable en el tiempo y que si no se valora adecuadamente puede generar en el personal dedicado al sistema de automatización desconfianza y desasosiego.

Debería haber una formación inicial para la puesta en marcha del sistema, y una continua para la actualización.

4.8.3 Mantenimientos del sistemaExisten dos tipos de mantenimientos a realizar en el sistema: los

que realizará el servicio técnico de la casa comercial del sistema de automatización y/o de los analizadores y los mantenimientos que realizarán los técnicos del laboratorio. Estos deben quedar claramente establecidos y se tendrán en cuenta para la gestión del sistema.

4.8.4 Servicio técnico especializado para la resolución de incidencias

Al igual que cada analizador tendrá establecido un servicio técnico de apoyo para la resolución de incidencias, el sistema de automa-tización debe tener su propio servicio (on-line y/o presencial) para solventar cualquier problema o fallo que pueda surgir en el mismo y deberá quedar claramente establecido el horario y las personas responsables de la cobertura de este servicio.

Se valorará:

• La disponibilidad de servicio técnico 24 horas o vía on line.• Asistencia cercana e inmediata.• Existencia de soporte de aplicaciones, diagnóstico y resolución

de incidencias a tiempo real.• Servicio de formación a cargo de la casa comercial encargada

del sistema de automatización o de los analizadores aislados.

5. FASE POSTANALÍTICA

5.1 Recuperación de muestras ya procesadasEl sistema automático debe ofrecer la posibilidad de cargar mues-

tras a posteriori, evitando interrupciones en la rutina y asegurando una rápida disponibilidad de los resultados.

Los autoanalizadores deben llevar incorporado un sistema que per-mita la dilución automática postanálisis con posibilidad de diversas diluciones para la repetición de las muestras, cuando sea necesaria.

Capacidad de repetición de parámetros de modo automático tras la orden emitida durante el proceso de validación.

Los tubos finalizados son almacenados automática o manualmente, o destruidos. Los tubos con pruebas pendientes vuelven a la fase preanalítica, mediante:

• Sistema manual• Sistema automatizado/robotizado

5.2 Archivo de muestrasUna vez terminado su procesamiento, las muestras son almace-

nadas por periodos de tiempo variables con el fin de realizar com-probaciones y ofrecer al clínico la posibilidad de solicitar nuevas pruebas a la vista de los resultados. Otras veces las muestras se guardan con fines científicos o legales.

Debido a que en los grandes laboratorios se manejan miles de muestras diariamente, resulta muy útil que sea el SIL el que gestione los archivos de muestras.

La gestión de los archivos de muestras implica la creación y el mantenimiento de un número variable de almacenes en los que cada muestra ocupa un lugar fijo asignado de forma manual o automática y controlado por el sistema informático.

Existen funciones de búsqueda de muestras o grupos de muestras con determinados criterios.

En algunos casos existen instrumentos automáticos de archivo de muestras, que son controlados por el sistema informático.

Características de calidad. En todos los laboratorios deben existir:

1. Archivo temporal de muestras/especímenes. 2. Archivo indefinido de muestras/especímenes.

El tiempo y las condiciones del archivo de muestras deben adap-tarse al reflejado para cada una de las magnitudes analíticas en la cartera de servicios.

En cuanto a la temperatura de conservación, será importante establecer si las muestras tienen que ser mantenidas refrigeradas (4 ºC) o congeladas (-20 ºC, o – 80 ºC) en función de los parámetros a analizar.

Indicación de caducidad o días de conservación

Temperatura ambiente:Todas las muestras que se vayan a analizar inmediatamente o sangre total para obtener suero o plasma

Refrigeración (4 – 6 ºC):Suero, plasma y muestras para análisis bacteriológico que no se vayan a analizar antes de 4 horas

Congelación a -20 ºC:Suero o plasma que se vaya a almacenar a largo plazo

En ocasiones se precisa la utilización de conservantes

5.3 Capacidad de almacenamiento El almacenamiento refrigerado de muestras con recuperación

automática puede mejorar el flujo de trabajo, especialmente para aquellas muestras que necesitan ampliar algún parámetro.




Sólo dos fabricantes ofrecen esta posibilidad en la actualidad, pero hay otros muchos trabajando en ello. Es importante determinar qué muestras es necesario almacenar (tubo primario o alícuota), cuánto tiempo empleamos en la recuperación automática de la muestra, y los mecanismos para corregir un funcionamiento defectuoso. La dimensión del laboratorio, el volumen de pruebas y el número de ampliaciones son importantes para determinar el coste-beneficio de este tipo de almacenamiento.

El almacenamiento de la muestra primaria y de las posibles alícuotas generadas en el laboratorio, debe hacerse de acuerdo con una política aprobada.

5.3.1 Sistema de taponadoEn aquellos sistemas que no requieran el destapado de los tubos o

alícuotas para su procesamiento, o bien sean capaces de retaponarlos a posteriori, se garantizará mejor la integridad de los constituyentes durante el almacenamiento de las muestras.

5.4 Trazabilidad de las muestrasEl sistema debe permitir localizar en todo momento una muestra

concreta. En el caso de muestras ya procesadas que pueden ser requeridas para un reanálisis, ampliación de pruebas solicitadas, etc, será el propio sistema informático el que facilitará esta tarea.

5.5 Conexión de los autoanalizadores con el sistema de información del laboratorio

Cuando se utilizan equipos informáticos o equipo de análisis automatizado para la toma, procesado, registro, informe de labo-ratorio, almacenamiento o recuperación de los datos de análisis, el laboratorio se debe asegurar de que:

a) el software informático, incluyendo el que está incorporado en el equipo, se documenta y valida de forma adecuada para su utilización en la instalación;

b) se establecen e implementan procedimientos para proteger la integridad de los datos en todo momento;

c) los equipos informáticos y el equipo automatizado se mantie-nen para asegurar su funcionamiento apropiado y se proporcionan las condiciones ambientales y de funcionamiento necesarias para mantener la integridad de los datos;

d) los programas y rutinas informáticos están adecuadamente protegidos para impedir el acceso, alteración o destrucción por personal ocasional o personas no autorizadas.

El equipo, incluyendo el hardware, el software, los materiales de referencia, los reactivos y otros materiales fungibles, y los sistemas analíticos se deben proteger contra desajustes o alteraciones que puedan invalidar los resultados de los análisis.

Es fundamental minimizar el riesgo de problemas o errores a la hora de transmitir los resultados desde el autonalizador al sistema informático del laboratorio.

Dicha conexión puede efectuarse de tres modos diferentes:

• Directamente a los puertos de los terminales del laboratorio• Centralizadas en un servidor de terminales usando cableado

estructurado• Mediante un sistema de concentración de información

(middleware) que se conecta, por un lado, con el SIL y, por otro, con los distintos analizadores integrados en el sistema de automatización.

En un modelo de laboratorio altamente automatizado, un fallo del sistema de información de la cadena puede provocar una importante incidencia en cada una de las etapas anteriormente descritas. Por tanto, será interesante que el diálogo entre los módulos analíticos y el sistema informático sea lo más eficaz posible, alertando enseguida de cualquier fallo en las conexiones. Sólo así se podrá garantizar que una incidencia informática no desencadene retrasos innecesarios en la emisión de los resultados. Será necesario establecer cuáles son los equipos críticos del sistema, y evaluar su capacidad de trabajo en modo manual, así como establecer las pautas a seguir en caso de que sea preciso recuperar resultados ya obtenidos para realizar un volcado de datos al sistema informático del laboratorio, una vez se haya restablecido su correcto funcionamiento.

Por otra parte, los sistemas analíticos deben tener una extensa capacidad de almacenamiento de datos de resultados de pacientes, calibraciones y controles de calidad. Si el operador puede transferir todos esos datos directamente a un CD-ROM u otro dispositivo de almacenamiento, como un disco duro externo, para facilitar su archivo y almacenamiento, las prestaciones del autoanalizador aumentan considerablemente.

También se valorará la capacidad del sistema de exportar los datos (tanto resultados de pacientes como de control de calidad) de una forma accesible para su posterior manejo en una base de datos externa o un programa estadístico.

Por último, el sistema debe asegurar la integridad de los resulta-dos una vez terminado el proceso analítico, registrando cualquier modificación realizada a posteriori e identificando en todo momento al usuario que la realiza mediante contraseñas personalizadas. El software ha de estar validado considerando las normas de calidad y protección de datos vigentes.

6. CONCLUSIONES

En los últimos años los avances en la informática, y por tanto, en la automatización han dado un vuelco a la idea tradicional que se tenía de laboratorio clínico.

Los hospitales cada vez invierten más en realizar una gestión que les permita reducir costes, por ello un correcto planteamiento inicial a la hora de programar un nuevo laboratorio puede ser fundamental para obtener beneficios a largo plazo.

La fase preanalítica automatizada poco a poco va implantándose, pues se minimizan los errores que muy frecuentemente se cometen en esta etapa.

La fase analítica aunque actualmente es la más automatizada, podría mejorarse estudiando las distintas posibilidades existentes en el mercado, así como nuestra situación actual y el tipo de laboratorio que nos gustaría o nos sería posible tener.

La fase postanalítica, quizás es la peor resuelta, pero ya existen muchas opciones en el mercado que habría que estudiar

Por tanto, los sistemas de automatización global, en un futuro cercano serán indispensables en cualquier laboratorio clínico, pues además de las muchas ventajas que aportan, nos permiten obtener la información necesaria para la certificación y acreditación.

7. BIBLIOGRAFÍA

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Fabricante X*

Etapa preanalíticaIdentificación de pacientesIdentificación de especímenesSistema de numeración de especímenesIdentificación de tipo de muestraCódigos de barras que soporta el sistemaPosibilidad de impresión de etiquetas (para contenedores, personalizadas, para alícuotas…)Identificación de especímenes cuya extracción es externa al laboratorioEtiquetado automático de los contenedores primariosClasificación y pretratamiento de especímenesTrazabilidad

Fabricante X*Etapa analíticaPosibilidad de integrar el sistema en una cadenaEquipos disponibles y metodologías empleadasPanel de pruebasPosibilidad de canales abiertosPosibilidad ampliar: - pruebas - equiposPruebas problemáticasPruebas imposibles

Reactivos: • información de caducidades y lotes • preparación y conservación • presentaciones disponibles • frecuencia de calibración

Mantenimiento: - tiempo necesario - manual/automático

Índice hemólisis, lipemia e ictericiaDetección fibrinaDetección volumenResolución muestras especiales: • contaminantes • líquidos biológicos • orinas

Posibilidad de: • dilución • repetición y comprobación • pruebas reflejas

Tiempo de obtención resultados: • rutina • urgencia

Posibilidad de intercalar las urgencias

- Melanson SE, Lindeman NI, Jarolim P. Selecting automation for the clinical chemistry laboratory. Arch Pathol Lab Med 2007;131:1063-9.- Park JW, Koo SH, Park BK, Kwon GC. Three-year experience in using total laboratory automation system. Southeast Asian J Trop;ed Public Health 2002;33:68-73.- Reynolds P. Laboratory automation: Simplifying the process up front. Medical Laboratory Observer 2002;34:32-6.- Rynning M, Wentzel-Larsen T, Bolann BJ. A model for an uncertainty budget for preanalytical variables in clinical chemistry analyses. Clin Chem 2007;53:1343-8.- Sasaki M, Kageoka T, Ogura K, Kataoka H, Ueta T. Sugihara S. Total laboratory automation in Japan: past, present and the future. Clin Chim Acta 1998;278:217-27.- Seaberg RS, Stallone RO, Statland BE. The role of total laboratory automation in a consolidated laboratory network. Clin Chem 2000;46:751-6.

Anexo. Listado de aspectos a tener en cuenta al comparar modelos de automatización con vistas a la selección del más adecuado a las necesidades del laboratorio




Calibradores: • preparación • estabilidad • información de lotes y caducidades • frecuencia y programación

Controles: • preparación • estabilidad • información de lotes y caducidades • frecuencia y programación

Almacenaje de resultados de pacientes, controles y calibraciones

Posibilidad de intervención manual en el sistema

Servicio técnico

Servicio de aplicacionesSoftwareTrazabilidad

Fabricante X*

Etapa postanalíticaRecuperación de muestras ya procesadas

Capacidad de almacenamiento de muestrasCondiciones de refrigeraciónRetaponado de tubos

TrazabilidadDiálogo con el SILAutonomía y capacidad de volcado de datosTipo de conexionesCapacidad de almacenamiento de datos

Versatilidad del soporte informático para la exportación de datos

* El número de fabricantes consultados debería ser al menos 3 (establecer una columna para cada fabricante).



Por otro lado, las variaciones de la ventilación pulmonar y del proceso de la respiración determinan variaciones en la presión parcial de los gases sanguíneos (pO2 y pCO2) que llevan implícitos cambios en el equilibrio ácido-base.

Existen diversos procesos nosológicos cuyo manejo puede beneficiarse de la medición del pH, pO2 y pCO2. En general, esta práctica está justificada cuando se desea evaluar la capacidad de oxigenación del paciente, el buen funcionamiento de los procesos de ventilación pulmonar y respiración (intercambio de gases), el equilibrio ácido-base y controlar la oxigenoterapia.

Dado que la medición de estas magnitudes puede estar asociada a procesos patológicos que pueden comprometer de manera impor-tante la vida del paciente y que en función de este resultado pueden iniciarse maniobras diagnósticas o terapéuticas invasivas para él, la calidad del resultado entregado es especialmente importante y por ello conviene conocer las causas potenciales de un resultado inexacto.


Este documento establece recomendaciones para una correcta obtención, conservación, transporte y preparación de las muestras de sangre destinadas a la medición del pH, la pO2 y la pCO2. De igual modo, se revisan las posibles fuentes de variabilidad o error originadas en la fase preanalítica que pueden afectar al resultado del análisis. No es objeto de este documento la revisión profunda de la técnica de extracción para los diferentes tipos de muestra.

3. CONSIDERACIONES PREANALÍTICAS Y FUENTES DE ERROR

Los resultados de los análisis de gases sanguíneos son susceptibles de sufrir diversos tipos de errores preanalíticos debido a una praxis incorrecta en su obtención y manipulación antes de su procesamiento o en su preparación en el mismo laboratorio. La responsabilidad de reducir la incidencia de errores preanalíticos recae fundamentalmente en el laboratorio, que debe suministrar procedimientos escritos deta-llando los requisitos de la muestra y su manipulación. Los procedi-mientos deben ser reunidos en un manual que debe estar disponible para el personal del laboratorio y en todas las áreas de recogida de muestras (enfermería, quirófano, etc.). Estos procedimientos deben incluir apartados sobre la verificación y preparación del paciente, la identificación y transporte de la muestra y sobre los factores

Recomendaciones preanalíticas para la medición del equilibrio ácido-base y gases en sangreSociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología MolecularComité CientíficoComisión de Magnitudes Biológicas relacionadas con la Urgencia MédicaDocumento H. Fase 3. Versión 5

Preparado por:X. Navarro Segarra, J. L. Marín Soria, A. Buño Soto, R. Díaz García, A. Galán Ortega, P. Guevara Ramírez, E. Guillén Campuzano, M. Muñoz Pérez, P. Oliver Sáez, N. del Río Barcenilla.

ÍNDICE

1. Introducción2. Objeto y campo de aplicación3. Consideraciones preanalíticas y fuentes de error 3.1. Contenedores 3.2. Anticoagulantes 3.2.1. Tipo 3.2.2. Proporción 3.2.3. Errores atribuibles al anticoagulante 3.3. Muestra: obtención y tipos 3.3.1. Sangre venosa 3.3.2. Sangre arterial 3.3.3. Sangre capilar “arterializada” 3.3.4. Errores durante el procedimiento de obtención 3.4. Manejo y conservación de la muestra 3.4.1. Errores derivados de la conservación y transporte4. Recomendaciones5. Bibliografía

1. INTRODUCCIÓN

Un aspecto crítico de la fisiología humana es la capacidad del organismo para preservar la homeostasis o equilibrio fisiológico. La importancia de la homeostasis de la concentración de hidrogeniones (H+) radica, entre otros procesos fundamentales para la vida, en su implicación directa o indirecta en múltiples reacciones celulares, en la conformación de las proteínas y en el intercambio de iones a través de las membranas celulares. Tanto una excesiva alcalinidad como una excesiva acidez son incompatibles con la vida por lo que el pH debe mantenerse en un estrecho margen (6,8 a 7,8), aún más estrecho cuando se trata de los valores considerados fisiológicos (7,35 a 7,45). No es fácil medir la concentración de hidrogeniones en los tejidos, pero los cambios que tienen lugar en éstos pueden interpretarse a través de las variaciones de pH que se producen en la sangre.

El pH del medio interno se mantiene estable gracias a los tampones o sistemas amortiguadores que existen en dicho medio, el más im-portante de todos ellos es el sistema formado por el ácido carbónico y el bicarbonato, ya que mediante la modificación de la ventilación pulmonar o de la reabsorción tubular renal pueden modificarse la pCO2 y la concentración de bicarbonato respectivamente.

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Recomendaciones preanalíticas para la medición del equilibrio ácido-base y gases en sangre

preanalíticos que la afectan de modo directo, como por ejemplo una anticoagulación inadecuada, la posible dilución por la heparina, la punción venosa en lugar de arterial, un lavado deficiente de la vía del catéter, contaminación con aire o la conservación incorrecta.

3.1. ContenedoresSe han evaluado y recomendado muchos tipos de recipientes. Uno

de los primeros fue la jeringa de vidrio, que probablemente debe considerarse un recipiente de “referencia” con el que comparar la exactitud de otro tipo de recipientes (jeringas de plástico regulares, jeringas de plástico “especializadas” y los tubos capilares). El vidrio es un material inerte e impermeable a los gases, lo que convertiría a las jeringas de vidrio en el dispositivo óptimo para la obtención de la muestra si no fuera por sus diversas desventajas. Entre éstas destacan la necesidad de esterilizarlas adecuadamente si van a reuti-lizarse, la posibilidad de rotura y un coste inicial relativamente alto.

Los dispositivos usados mayoritariamente son las jeringas estándar de plástico (polipropileno) de 1 a 5 mL y las jeringas de plástico diseñadas específicamente para contener una muestra destinada a la medición de gases en sangre. Todas ellas eliminan la necesidad de esterilizar el dispositivo, son más baratas y relativamente irrom-pibles. Su principal desventaja técnica es el intercambio de gases a través del plástico (pues se trata de un material permeable) que puede representar un problema importante según el tipo de plástico, las presiones parciales de los gases del espécimen, la temperatura y el tiempo de conservación. Cuanto mayor es la diferencia existente entre la pO2 y pCO2 de la sangre y la del aire ambiental, mayor es la posibilidad de intercambio entre ambos medios (1,2).

Las jeringas de plástico diseñadas especialmente para el análisis de gases incorporan ventajas técnicas como el émbolo elevable, que se desplaza debido a la presión arterial y la heparinización previa del dispositivo, muchas veces con heparina cristalina que minimiza los errores por dilución pudiéndose obtener muestras de pequeño volúmen de de manera fácil.

Otro tipo de recipiente aceptable para recoger y transportar la muestra son los tubos capilares especiales de vidrio heparinizados, siempre que se sellen convenientemente. Sin embargo, la variable proporción de sangre capilar que pueden contener, además de la dificultad que ofrecen para una óptima homogeneización (3), pueden conducir a errores de difícil estimación.

3.2. Anticoagulantes

3.2.1. TipoLa medición de pH, pO2 y pCO2 debe efectuarse en sangre

homogeneizada tratada con heparina (sódica o de litio) liofilizada o líquida, a una concentración de 1.000 UI/mL, al ser éste el an-ticoagulante de elección. Los oxalatos, citratos y el EDTA no son aceptables para estos fines. La heparina de mayor concentración (5.000 ó 10.000 UI/mL) no debería usarse ya que puede alterar el pH (dado su carácter ácido) y el calcio iónico (por su efecto quelante) (4). El pH de la heparina sódica estará aproximadamente entre 6 y 8 (5). En el caso de la heparina líquida la pCO2 y la pO2 suelen tener valores cercanos al aire ambiente (pCO2=7,5 mm Hg y pO2=160 mm Hg). Las jeringas que contienen heparina liofilizada (congelada y desecada) presentan notables ventajas: a) ahorro de tiempo, ya que no es necesario humidificar previamente el cuerpo de la jeringa con heparina líquida y b) no se plantean problemas de dilución por el exceso de anticoagulante.

3.2.2. ProporciónEl volumen de heparina utilizado debe ser alrededor del 5%

del volumen total de la muestra y nunca superior al 10%. Se ha demostrado que 200 µL de heparina sódica o de litio (1.000 UI/mL) evitan la coagulación de 5 mL de sangre (alcanzando una con-centración final de 40 UI/mL) sin afectar la medición de pH, pO2, pCO2 (18-21). En el caso del uso de jeringas convencionales donde la heparinización deba realizarla el usuario, puede ser recomendable lavar la jeringa con un chorro de heparina sódica o de litio (1.000 IU/mL) y vaciarla luego (lo que deja aproximadamente un volumen residual de 0,1 mL en una jeringa estándar de 2 mL). Esto permite la anticoagulación adecuada de una muestra de 2 a 4 mL de sangre y asegura que el anticoagulante no sea añadido en exceso pudiendo alterar el resultado (4, 7).

3.2.3. Errores atribuibles al anticoagulanteEl efecto interferente del anticoagulante sobre la muestra de sangre

puede producirse por quelación o por dilución si se usa un preparado líquido añadido en exceso en jeringas corrientes no heparinizadas. Los fenómenos de interferencia son particularmente probables cuando el volumen de muestra es muy bajo respecto al de anticoagulante, situa-ción frecuente en la realización de gasometrías por diversos motivos.

La interferencia por dilución debida al exceso de heparina produce una disminución de la pCO2 en la muestra al equilibrarse los gases de la muestra con los de un líquido con una composición similar al aire ambiental (este efecto se puede observar con diluciones superiores al 10%). La concentración de bicarbonato y exceso de base (parámetros calculados a partir de la pCO2) también se verán afectados. El pH es muy resistente a este efecto de dilución (incluso con diluciones del 50%) y la pO2 puede incrementarse si la dilución es alta (35-50%) (18-21).

Otra fuente de error preanalítico es la deficiente dosificación de heparina (en jeringas no heparinizadas por el fabricante). Como efecto, se producirá la coagulación de la muestra que dejará de ser homogénea y, por tanto, adecuada para su fin. La presencia de coágu-los dará lugar a mediciones inexactas por el paso de microcoágulos al sistema analítico que interfirieren el contacto del electrodo con la muestra. Por otro lado, los microcoágulos pueden inutilizar el sistema, demorando la atención urgente de otros pacientes.

La interferencia por quelación producirá una disminución de la concentración del ión calcio si los centros de enlace de la heparina no están convenientemente saturados o tamponados con este ión (heparinas equilibradas con electrolitos) (2,11).

El incremento de la presión osmótica del plasma al añadir una sustancia seca que no atraviesa las membranas (como la heparina), produce una disminución del agua intraeritrocitaria con la posible disminución del VCM y aumento de la CHCM (12).

3.3 Muestra: obtención y tiposDeben seguirse todas aquellas recomendaciones dirigidas a la

práctica segura de los diferentes tipos de punción, así como aquellas maniobras dirigidas a impedir daños colaterales sobre el paciente. En el proceso de recogida de la muestra, debe prestarse especial atención a los procedimientos básicos de identificación del paciente, identificación de la procedencia del espécimen (arterial, venosa o capilar) y, por supuesto, el seguimiento de una correcta técnica extractora (1,3,4,8).

Debe explicarse correctamente al paciente el fin de la prueba, la no necesidad de restringir la ingestión de alimentos o líquidos y,



durante la extracción, la posibilidad de aparición de dolor pulsátil en el caso de la punción arterial, así como la necesidad de respirar normalmente (1,3,8). El paciente debe estar en un estado de equili-brio ventilatorio antes y durante la extracción para asegurar que la muestra es representativa del estado del paciente. Debe evitarse, por tanto, la ansiedad y el dolor. El paciente que respira espontáneamente debe mantenerse en reposo durante 15 min. y en caso de respiración asistida u oxigenoterapia no deben introducirse cambios al menos 30 minutos antes de la extracción. Debe escogerse el decúbito su-pino que asegura una correcta y homogénea ventilación pulmonar.

3.3.1 Sangre venosaLas muestras de sangre venosa se recomiendan para valorar el

estado del equilibrio ácido-base del paciente y no son válidas para conocer el estado de oxigenación del mismo (9).

En algunos casos se utilizan, de forma adicional a la muestra arterial, muestras venosas mixtas extraídas a partir de un catéter de Swan-Ganz (arteria pulmonar) para evaluar la pO2, saturación de O2, la diferencia arterio-venosa de la concentración de O2 en sangre venosa mixta, la función pulmonar (shunt) y el consumo de oxígeno.

3.3.2. Sangre arterialLa sangre arterial resulta el espécimen preferido para el estudio

de los gases sanguíneos y equilibrio ácido-base. Las arterias son conductos en los que, en esencia, no se produce intercambio gaseoso y por lo tanto una muestra arterial tiene el mismo pH, pCO2 y pO2 que la sangre del ventrículo del que procede. Así pues, refleja de forma precisa la fisiología ácido-básica y el estado de oxigenación del organismo, derivado de la fisiología pulmonar.

La extracción puede realizarse bien por punción directa de la arteria o a partir de un catéter arterial. El lugar preferido para la punción suele ser la arteria radial. Para asegurarse de la existencia de un correcto flujo colateral por la arteria cubital se utiliza la ma-niobra de Allen modificada (1) que, con un procedimiento simple, permite evaluar la existencia de dicho flujo. Otros lugares de punción, cuando la arteria radial no es adecuada, son la humeral, la pedía y la femoral como última opción.

3.3.3. Sangre capilar arterializadaLa sangre capilar, cuidadosamente recogida, puede manejarse

de manera muy semejante a la sangre arterial contando, además, con la ventaja de requerir sólo pequeñas cantidades de ésta para la determinación. El uso de sangre capilar para la medición de gases y del equilibrio ácido base puede ser necesario cuando la punción arterial es muy difícil o está contraindicada (recién nacidos, personas obesas, quemados, pacientes en síncope, etc.). La muestra deberá ser sangre capilar “arterializada”, para ello debe conseguirse una vasodilatación local por masaje y calentamiento del lecho capilar con agua a una temperatura # 42° C durante 10 a 15 minutos (3,4).

3.3.4. Errores durante el procedimiento de obtenciónUna mala praxis en la obtención de la muestra de sangre venosa

puede hacer que esa muestra sólo refleje el equilibrio ácido-base de una extremidad y no del organismo en su totalidad. En el caso de obtención de una muestra de origen venoso, al ser una extracción destinada a la medición del equilibrio ácido-base, debe tenerse especial precaución con el uso del torniquete. La oclusión produ-cida debe minimizarse, de lo contrario la anoxia hística producirá alteraciones en las magnitudes medidas (acidemia, incremento del

lactato) (2,4,9). Es preferible, por lo tanto, la extracción de muestras capilares y arteriales para obtener resultados sistémicos del equili-brio ácido-base y de las presiones parciales de los gases en sangre.

Si se usan catéteres permanentes o cánulas para la toma de muestras, debe ponerse especial atención en que el fluido o las soluciones de lavado se eliminen completamente del sistema. La contaminación de la muestra con líquido procedente de una perfusión determinará la disminución de los valores de la pCO2 y la obtención de valores de pO2 cercanos a los 150 mm Hg al equilibrarse los gases de la muestra con los del líquido en perfusión, cuyas presiones son cercanas al aire ambiental (10).

La sangre debe recogerse en condiciones anaerobias para impedir el intercambio de gases con el aire circundante y debe sellarse el contenedor para asegurar el mantenimiento de la anaerobiosis. En ningún caso la muestra debe quedar sellada por una aguja sino por un tapón o mecanismo diseñado específicamente para sellar la muestra, mantener la anaerobiosis y evitar cualquier riesgo biológico poten-cial. Puesto que el aire ambiente contiene una pCO2 prácticamente nula y una pO2 de alrededor de 150 mm Hg, la presencia de aire en la muestra tenderá a reducir la pCO2 (produciendo un aumento en el pH) y a aumentar o disminuir la pO2 equilibrando la muestra con el aire ambiente (10). Por lo tanto, sea cual sea el origen de la muestra, deberá impedirse la formación de burbujas que representan una fuente de error en la medición de los gases sanguíneos al alterar las presiones parciales de éstos en la muestra. Este efecto es mayor cuanto mayor es la superficie de contacto aire/sangre (burbujas pequeñas y múltiples) y se manifiesta sobre todo en la pO2 (11).

Cuando se toman muestras capilares arterializadas, la primera gota se debe eliminar pues ésta es rica en fluido extracelular y puede ser una causa de mediciones erróneas al alterar la concentración de ciertos electrolitos como el potasio o producir interferencias por dilución. Además, debe dejarse fluir la sangre siguiente en un capilar heparinizado sin exprimir, pues de hacerlo se produce un vertido de productos a partir del componente intra y extracelular que pueden alterar el valor de diversas magnitudes.

3.4. Manejo y conservación de la muestraIdealmente, la muestra destinada a la medición de pH, pO2, pCO2

debe procesarse inmediatamente tras su extracción. Cuando esto no es posible, deben contemplarse las siguientes recomendaciones generales, destinadas a paliar las desviaciones en los resultados debidas al proceso de conservación (6,13):

• Las muestras en jeringas de plástico destinadas a la medición de pH y gases en sangre deben medirse dentro de los 30 minutos tras su extracción. La conservación de la jeringa de plástico en agua–hielo producirá cambios en las presiones parciales de los gases sanguíneos (sobre todo en la pO2), debido a un aumento del gradiente entre la muestra y el aire exterior al producirse una disminución relativa del O2 en la muestra debido al enfriamiento (aumenta la solubilidad del O2 y aumenta la afinidad de la hemoglobina por el O2). Por lo tanto, si el análisis se puede realizar en un plazo de 30 minutos es mejor la conservación a temperatura ambiente.

• Si no puede garantizarse la medición en los 30 minutos siguientes a la obtención de la muestra, ésta debe recogerse en recipiente de cristal y almacenarse en agua–hielo (0-4º C) hasta su análisis. Los resultados son estables durante al menos una hora.

• La sangre que se obtiene para el estudio del gradiente alveolo-arterial o de “shunt” debe analizarse dentro de los cinco minutos que suceden a su extracción independientemente de la temperatura de conservación.



Recomendaciones preanalíticas para la medición del equilibrio ácido-base y gases en sangre

• Debería utilizarse la jeringa de vidrio conservada en agua-hielo cuando el paciente presente leucocitosis o trombocitosis, ya que para ralentizar el consumo de oxígeno por estas células, debe enfriarse la muestra con los condicionantes explicados en el primer punto. De no existir la posibilidad de jeringa de vidrio puede usarse la de plástico analizando la muestra inmediatamente.

Para la medición de la pO2, pCO2 y del equilibrio ácido-base, es necesario que las muestras sean homogeneizadas cuidadosamente antes de las mediciones para evitar la sedimentación. La homoge-neización debe ser más intensa cuando la muestra se ha sometido a enfriamiento. Las muestras en capilares de vidrio deberán volver a mezclarse moviendo la barrita de metal desde un extremo a otro del tubo durante unos 10 segundos. Las jeringas de vidrio o plástico deberán invertirse 10 veces y luego agitarse mediante giros sobre los dos ejes del recipiente de la muestra durante 60 segundos. Durante el mezclado no debería formarse ninguna burbuja o espacio muerto (4).

Para detectar y evitar la presencia de coágulos deben despreciarse de 100 a 200 µL de la jeringa. La existencia de coágulos puede dar lugar a mediciones inexactas al interferir sobre el electrodo directamente. Además, al despreciar estas primeras gotas se purga la sangre en la jeringa evitando la introducción de burbujas de aire en el instrumento.

3.4.1. Errores derivados de la conservación y transporteLas muestras obtenidas para la medición de la presión parcial de

gases en la sangre y equilibrio ácido-base pueden afectarse durante la conservación y transporte debido a los siguientes procesos (2,11,13):

a) Metabolismo de las células de la sangre: la glicólisis, prin-cipalmente en los eritrocitos, ocasiona la formación de lactato y cambios en el pH, bicarbonato y exceso de base hacia el intervalo de la acidosis metabólica. El consumo de oxígeno por los leucocitos (0,1 mL de oxígeno de 100 mL de sangre en 10 min. a temperatura corporal) y plaquetas disminuye la pO2 y aumenta la pCO2. La caída en pO2 se acelera si en la muestra original la pO2 estaba elevada. Los procesos metabólicos pueden reducirse enfriando la muestra (10).

b) Intercambio de gases: Como se ha mencionado, los materiales plásticos no son absolutamente impermeables a los gases, mientras que los capilares y jeringas de vidrio permanecen sin alteraciones en los gases durante al menos una hora si se conservan en hielo-agua. En las jeringas de plástico, se producen cambios después de pocos minutos de obtenida la muestra en la pO2 (incrementos mayoritariamente). Se ha podido demostrar que la entrada de O2 a la jeringa de plástico es mayor cuando se refrigera la muestra que cuando permanece a temperatura ambiente. Este fenómeno no afecta a las jeringas o capilares de cristal (2,13,14,15).

c) Sedimentación celular: se ha demostrado variabilidad de la medida en las magnitudes pH, pO2 y pCO2 cuando se compara la fracción rica en células con la fracción rica en plasma. Este fraccionamiento es fruto de la sedimentación de la muestra du-rante el transporte o espera en el propio laboratorio, por lo que es fundamental la homogeneización de la muestra previamente al análisis (11).

4. RECOMENDACIONES

Se resumen los principales factores a tener en cuenta en el análisis de las muestras destinadas a la medición del equilibrio ácido-base y gases en sangre.

1) Contenedor• Se recomienda el uso de jeringas de plástico específicamente diseñadas

para gasometrías tratadas con heparina seca equilibrada con electrolitos.

2) Anticoagulante• Se recomienda heparina seca equilibrada con electrolitos con

el fin de evitar errores por dilución.• La dosificación de heparina deberá prevenir la coagulación y evitar

efectos de dilución, por ello cuando se use heparina líquida la dosis será de 40 µL de heparina sódica o de litio (1.000 UI/mL) por cada mililitro de sangre (alcanzando una concentración final de 40 UI/mL).

3) Muestra• La muestra debe representar el estado de ventilación del pa-

ciente, por lo tanto el paciente que respira espontáneamente debe hallarse estable y no deben introducirse cambios en la media hora que precede a la extracción en el que está sometido a ventilación asistida o en tratamiento con oxigenoterapia.

• La sangre arterial es el espécimen preferido para el estudio de los gases sanguíneos.

• Las muestras de sangre venosa sólo se recomiendan para valorar el estado del equilibrio ácido-base del paciente y no son válidas para conocer el estado de oxigenación.

• La sangre capilar “arterializada” es válida para la valoración del equilibrio ácido-base y presiones parciales de los gases y puede utilizarse cuando la extracción arterial es difícil o está contraindicada.

4) Estado de la muestra: burbujas y coágulosLa muestra debe conservarse en anaerobiosis, para ello deben

extraerse las burbujas que se hayan generado durante la extracción y sellar convenientemente el contenedor. Se recomienda rechazar la muestra ante la presencia de burbujas o coágulos visibles.

5) Conservación: tiempo y temperatura• Contenedores de plástico: deben analizarse lo antes posible. La

demora en el análisis no debe exceder los 30 minutos tras la extrac-ción, conservándose a temperatura ambiente. Cuando se esperan pO2 elevadas o en estudios especiales (gradiente alveolo-arterial o shunt) deben analizarse antes de cinco minutos.

• Contenedores de vidrio: deben analizarse antes de 30 minutos tras la extracción. Si no fuera posible, se conservarán a 0-4º C en agua-hielo no más de una hora. Cuando se esperan pO2 elevadas o en estudios especiales (gradiente alveolo-arterial o shunt) deben analizarse antes de cinco minutos.

6) Preparación de la muestra: homogeneización y purga de la jeringaLa alícuota de la muestra que se transferirá al analizador debe ser

homogénea y representativa de la muestra. Para ello debe homogenei-zarse adecuadamente la muestra y despreciar las primeras gotas para asegurar la ausencia de coágulos y eliminar cualquier burbuja residual.

5. BIBLIOGRAFÍA

1. NCCLS. Procedures for the collection of arterial blood specimens; Approved Standard. 4th Edition. H11-A4. 20042. Preanalytical aspects in STAT analysis. Müller-Plathe O. Blood gas news 1998, vol. 7, nº 13. NCCLS. Procedures and devices for the collection of diagnostic capillary blood specimens; Approved Standard. 5th Edition. H4-A5. 20044. NCCLS. Blood gas and pH analysis and related measurements; Approved Guideline. C46-A. 2001



5. Approved IFCC recommendations on whole blood sampling, transport, and storage for simultaneous determination of pH, blood gases, and electrolytes. Burnett RW, Covington AK, Fogh-Andersen N, Külpmann WR, Maas AHJ, Müller-Plathe O, Siggaard-Andersen O, van Kessel AL, Wimberley PD, Zijlstra WG. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1995; 33: 247 – 536. NCCLS. Blood gas pre-analytical considerations: specimen collection, calibration and controls. C27-A. 19937. Química clínica, técnicas de laboratorio-fisiopatología-métodos de análisis; teoría, análisis y correlación. Kaplan L.A., Pesce A.J. Buenos Aires, Argentina. Edit. Médica Panamericana; 19888. Recommendations for collection of skin puncture blood from children, with special reference to production of reference values. Alström T, Dahl M, Gräsbeck R, Hagenfeldt L, Hertz H, Hjelm M, Järvenpää AL, Kantero R, Larsson A, Leskinen EE. Scand J Clin Lab Invest 1987; 47: 199-2059. NCCLS. Procedures for the collection of diagnostic blood specimens by venipuncture; approved standard. H3-A5. 5th Ed. 200310. Clinical application of blood gases. Shapiro, B.A.; Harrison, R.A.; Walton, J.R. 2ª ed. Year Book Medical Publisher, Chicago, 197711. Clark CG, Rayfield JM, Clague AE, Preanalytical errors in simultaneous blood gas, electrolyte and metabolite analysis. Blood Gas News 1998; 7: 12–5 12. Obtención de muestras sanguíneas de calidad analítica. Mejoría continua de la etapa preanalítica. Luis Morán Villatoro. Edit. Panamericana, 2001

13. Effects of syringe material, sample storage time and temperature on blood gases and oxygen saturation in arterialised human blood samples. Knowles TP, Mullin RA, Hunter JA, Douce FH. Respiratory care. 2006; 51: 732-614. Changes in oxygen measurements when whole blood is stored in iced plastic or glass syringes. Mahoney JJ, Harvey JA, Wong RJ, Van Kessel AL. Clin Chem 1991; 37: 1244-815. Stability of pO2, pCO2 and pH in heparinized whole blood samples: influence of storage temperature with regard to leukocyte count and syringe material. Schmidt C, Müller-Plathe O. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1992; 30:767-7316. www.radiometer.es. Diciembre 200717. www.deep-picture.com/Preanalytical. Diciembre 200718. Sampling and storing of blood for determination of acid-base status. Siggaard-Andersen O. Scand J Clin & Lab Invest. 1961; 13: 196-20419. Hamilton RD, Crockett RJ, Alpers JH. Arterial blood-gas analysis: potential errors due to the addition of heparin. Anaesth Intensive care. 1978; 6: 251-520. Dake MD, Peters J, Teague R. The effect of heparin dilution on arterial blood-gas analysis. Western J Med. 1984; 140: 792-321. Hutchison AS, Ralston SH, Dryburgh FJ, Small M, Fogelman I. Too much heparin: possible source of error in blood-gas analysis. BMJ. 1983; 287: 1131-2



Técnicas para la preparación de semen en reproducción asistidaSociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología MolecularComité CientíficoComisión de Seminología y Técnicas de Reproducción AsistidaDocumento C. Fase 3. Versión 4

Preparado por: I. Sánchez, C. Mar, JA. Castilla, M. Marcos, I. Martín, A. Galán, MI. Jiménez, JM. Moreno, MG. Serrano, I. García-Cobaleda, C. Aulesa, V. Lozano, C Sánchez, J de Montserrat

ÍNDICE

1. Introducción 2. Objeto y campo de aplicación 3. Bases fisiológicas de la capacitación del espermatozoide 4. Objetivo de las técnicas de preparación de semen 5. Preparación del semen 5.1. Materiales y medios necesarios: 5.2. Métodos de preparación del semen: 5.2.1. Migración 5.2.2. Gradientes de densidad 5.3. Muestra 5.3.1. Semen fresco 5.3.2. Semen congelado 5.4. Resultados 6. Recomendaciones 7. Conclusiones 8. Bibliografía

1. INTRODUCCIÓN

La preparación de los espermatozoides es un requisito previo para la realización de cualquier técnica de reproducción asistida, incluyendo la inseminación artificial. Persigue dos objetivos:

1. Eliminar el plasma seminal que contiene sustancias inhibidoras de la capacitación, prostaglandinas, agentes infecciosos y proteínas antigénicas.

2. Separar los espermatozoides móviles de los inmóviles, de los leu-cocitos, de las células germinales inmaduras y de otras células redondas.

La finalidad de este proceso es seleccionar los espermatozoides móviles morfológicamente normales y mejorar la calidad de los mismos, porque disminuye la liberación de linfoquinas y reduce la formación de radicales libres (1). El resultado de la preparación, junto con otros factores dependientes de la mujer, determinará la técnica de reproducción asistida a aplicar en cada caso (2).

El adecuado procesamiento de la muestra va a influir en la capa-cidad fecundante del espermatozoide, tanto in vivo como in vitro y será fundamental para el éxito de la reproducción asistida (3,4).


Los laboratorios clínicos, en respuesta a la creciente necesidad, deben ofrecer en su cartera de servicios técnicas de preparación de semen para reproducción asistida.

El objeto de este documento es establecer unas recomendaciones para la realización de las técnicas de recuperación de espermatozoides móviles.

El campo de aplicación de esta técnica es:

1. Diagnóstico, en el estudio básico de la pareja estéril. 2. Tratamiento, preparación del semen para la técnica de repro-

ducción asistida de elección.3. Selección de espermatozoides para pruebas funcionales.

3. BASES FISIOLÓGICAS DE LA CAPACI-TACIÓN DE LOS ESPERMATOZOIDES

Los espermatozoides de todos los mamíferos placentarios son incapaces de fecundar el ovocito directamente desde el eyaculado, y deben experimentar un proceso en el que se producen cambios mo-leculares denominados capacitación. Los espermatozoides adquieren la capacidad de fecundar el ovocito después de haber permanecido durante un tiempo en el tracto genital femenino.

Actualmente no se conocen todos los sucesos implicados en el comple-jo proceso de la capacitación. Se diferencian las siguientes etapas (5,6):

1. Fluidificación de la membrana celular debido a modificaciones de la estructura lipídica.

2. Flujo de Ca++ hacia la cabeza y flagelo del espermatozoide.3. Generación de cantidades controladas de especies reactivas

de oxígeno4. Fosforilación de proteínas en los residuos de serina, treonina

y tirosina.

La modificación de los esteroles de la membrana plasmática del espermatozoide se inicia tras la retirada del plasma seminal (7). Sustancias captadoras como la albúmina localizadas en el moco cervical actuarían facilitando los cambios en el componente lipídico de la membrana del espermatozoide (8).

En condiciones in vivo los espermatozoides móviles se separan del resto del eyaculado por migración activa a través del moco cervical. La capacitación de los espermatozoides se puede conseguir in vitro, si son sometidos durante el tiempo necesario, a unas condiciones de cultivo que faciliten y aporten los cambios y las señales de trans-ducción de forma semejante a las condiciones in vivo (8).

La capacitación es un fenómeno reversible necesario para la inducción del movimiento hiperactivo, la capacidad de interactuar con la zona pelúcida, la reacción acrosómica y el inicio de la fusión con el ovocito (5).

4. OBJETIVOS DE LAS TÉCNICAS DE PREPARACIÓN DE SEMEN

El plasma seminal puede contener agentes infecciosos que deben eliminarse antes de cualquier técnica de reproducción asistida, ya que

04 doc prep semen en .indd 23 28/09/2009 15:20:38


son susceptibles de provocar infecciones en la mujer y contaminar los cultivos de ovocitos y embriones (9).

El contacto durante un tiempo prolongado de los espermatozoides con el plasma seminal produce un efecto adverso, puede impedir de forma permanente la fecundación. Así la separación de los espermatozoides del plasma seminal debe realizarse lo más rápido y eficazmente posible (3,10).

Por lo tanto los objetivos de las técnicas de preparación de semen serán:

1. Separar los espermatozoides del plasma seminal que contiene sustancias decapacitantes, prostaglandinas y linfoquinas.

2. Retirar los espermatozoides muertos, leucocitos, células re-dondas y agentes infecciosos.

3. Aportar un medio de cultivo que contenga moléculas captadoras de esteroles (albúmina) y una composición iónica que apoye la ho-meostasis del espermatozoide y facilite las señales de transducción (calcio, bicarbonato) (8).

5. PREPARACIÓN DEL SEMEN

5.1 Materiales y medios necesariosTodos los materiales empleados así como los medios de cultivo

deben ser estériles y manejarse en condiciones de asepsia, en cam-pana de flujo laminar. Los medios de cultivo han de atemperarse antes de su uso y tener la certificación CE.

Los medios de cultivo deben tener una osmolalidad entre 280-300 mOsm/kg. El pH debe mantenerse en un rango entre 7.2-7.4, para ello es necesario utilizar medios tamponados. Los tampones más utilizados son: HEPES, fosfato o bicarbonato. Los medios tampo-nados con bicarbonato necesitan una atmósfera rica en CO2 y una temperatura de 37ºC para que se mantenga el equilibrio iónico, por lo que tienen que usarse en estufa con temperatura y CO2 controlados.

Además los medios deben tener una concentración de calcio, bicarbonato y proteínas específica para que los espermatozoides adquieran la capacidad de fecundar.

Los medios para la preparación de semen son de dos tipos:

1. Medios para preparación de gradientes.Los más usados contienen una suspensión coloidal de partículas

de sílice unidas de forma covalente a moléculas de silano y se preparan en solución isotónica.

2. Medios de lavado y cultivo. Se recomienda utilizar medios que no requieran CO2, porque la

mayor parte del proceso se realiza en atmósfera aire. Los medios específicos para semen suelen estar tamponados con HEPES y pueden usarse en atmósfera aérea. Contienen proteínas, mayoritariamente albúmina que actúa como captadora y transportadora de moléculas, así como la concentración de sales necesaria para la homeostasis del espermatozoide y en la mayoría de los casos gentamicina como agente bacteriostático.

5.2 Métodos de preparación del semenLos métodos incluyen desde la simple dilución y centrifugación

hasta técnicas más complicadas.

1. Dilución y lavado del semen2. Migración3. Gradientes de densidad4. Adherencia-Filtración5. Métodos avanzados: anticuerpos monoclonales, tecnología de

microesferas (anexina V magnetic-activated cell sorting), electro-foresis, ácido hialurónico, dextrano…

Los métodos que utilizan solo lavado, deberían abandonarse y emplear técnicas más seguras de preparación de espermatozoides (4). Para los métodos de migración el movimiento del espermatozoide es un requisito esencial. En los métodos de adherencia-filtración, es necesaria la com-binación de la movilidad de los espermatozoides con la adherencia a las matrices de filtración (lana de vidrio, sefadex) (11). Los gradientes de densidad separan los espermatozoides en función de su punto isopícnico. Los métodos avanzados se desarrollan para investigación.

De todos los métodos, los que realmente tienen utilidad clínica son los de migración y gradientes de densidad, el resto no se exponen en el documento.

5.2.1 MigraciónSe basan en la capacidad de movimiento de los espermatozoides, de

migrar desde el semen al medio cultivo. Dentro de esta categoría existen dos formas principales Swim Up directo y Swim Up convencional.

5.2.1.1 Swim Up directo

El semen licuado se deposita debajo o sobre un medio de cultivo y los espermatozoides con buena movilidad se dirigen al medio de cultivo de forma semejante al proceso in vivo a través del moco cervical.

El proceso consta de varias fases:

1. Colocar aproximadamente 250 µL de semen licuado en el fondo de un tubo no cónico (para aumentar la superficie de contacto). Uti-lizar tantos tubos como sea necesario para mejorar la recuperación de los espermatozoides.

2. Depositar sobre el semen 500 µL de medio de cultivo resbalando por las paredes del tubo, con cuidado de que no se mezcle con el semen.

3. Dejar en un incubador a 37ºC formando un ángulo de 45º, para aumentar la interfase, durante un tiempo entre 30-60 minutos dependiendo de la calidad del semen. No más tiempo para evitar la contaminación con plasma seminal (10)

4. Pasado este tiempo aspirar aproximadamente 300 µL de medio de cultivo, con cuidado de no aspirar semen (para lo cual durante todo el proceso se debe mantener el ángulo del tubo). Si hay más de un tubo de una misma muestra se unifica todo el aspirado en un único tubo.

5. Si el volumen obtenido es mayor de 500 µL, valorar el grado de movilidad y la concentración de los espermatozoides. Centrifugar y llevar a un volumen final de 300-500 µL para inseminar.

5.2.1.2 Swim Up convencional

Se basa en el mismo principio pero requiere un primer paso de lavado

1. Añadir medio de lavado en una proporción v/v, homogeneizar.2. Centrifugar durante 10 minutos a 500 g. Se recomienda una

centrífuga de cabezal fijo para que el botón celular tenga una amplia superficie de contacto con el medio de cultivo.

3. Retirar el sobrenadante con cuidado de no aspirar el botón celular.4. Añadir resbalando lentamente por las paredes del tubo 500 µL

de medio de lavado.

Continuar el proceso desde el punto 3 del método anterior.El inconveniente de estos métodos es que los espermatozoides inma-

duros y el resto de las células permanecen en contacto durante todo el proceso con los espermatozoides maduros y pueden producir efectos adversos sobre estos. Además muchos de los espermatozoides móviles pueden quedar atrapados en el fondo del sedimento y no alcanzar nunca el medio de cultivo (4). La ventaja respecto del método anterior es que disminuye la contaminación con el plasma seminal (10).



Técnicas para la preparación de semen en reproducción asistida

Para mejorar la tasa de recuperación de espermatozoides móviles se puede fraccionar la muestra en varios tubos, procesarlos siguiendo el protocolo y unificar el aspirado de cada tubo en un único tubo. Se debe valorar y si es necesario, se centrifugará y resuspenderá en un volumen entre 300-500 µL de medio de cultivo para inseminar.

5.2.2 Gradientes de densidad Los gradientes de densidad disgregan las partículas en función de

su densidad de flotación. Los diferentes componentes se separan hasta alcanzar una posición en la que su densidad sea igual a la de su entorno (situación de flotabilidad neutra), donde ya no se desplaza más. Los esper-matozoides maduros son células compactadas y alcanzan el gradiente de mayor densidad (el fondo del tubo). El plasma seminal permanece flotando sobre el gradiente de menor densidad y las células, los espermatozoides inmaduros y muertos se sitúan en la interfase entre los dos gradientes.

Los gradientes de densidad utilizados actualmente parten de una suspensión coloidal de partículas de sílice unidas de forma covalente a moléculas de silano, se utilizan de forma discontinua en soluciones isotónicas a una concentración del 80 y del 40% y pueden adquirirse ya preparadas.

Se recomienda utilizar volúmenes de 0,5-1 mL de cada gradiente de concentración. Se preparan los tubos que sean necesarios por muestra teniendo en cuenta que no se debe depositar más de 1,5 mL de semen por tubo.

1. Dispensar 0,5 mL del gradiente de 40% en un tubo cónico, a continuación con una jeringa de 1 mL conectada a una aguja larga de carga, depositar 0,5 mL del gradiente de 80% en el fondo del tubo (cono), muy despacio para que el gradiente de 40% suba y queden bien definidas las dos capas.

2. Decantar el semen licuado, resbalando por las paredes de los tubos, con cuidado de no romper la interfase. El semen debe quedar encima del gradiente de 40%.

3. Centrifugar a 300 g durante 20 minutos.4. Aspirar las distintas capas con una pipeta pasteur en la

zona del menisco para evitar alterar las interfases y las posibles contaminaciones, hasta alcanzar claramente el gradiente de 80%, donde se encuentra el sedimento con los espermatozoides maduros. Repetir el proceso con todos los tubos de la misma muestra.

5. Cambiar de pipeta, al aspirar el/los sedimentos. Transferir a un único tubo nuevo (para evitar contaminaciones) con 1-2 mL de medio de lavado, homogeneizar y centrifugar a 500 g durante 10 min.

6. Retirar todo el sobrenadante, con cuidado de no aspirar el botón celular.

7. Resuspender en 300-500 µL de medio de cultivo.

5.3 Muestra

5.3.1 Semen frescoLa muestra de semen debe recogerse siguiendo las recomenda-

ciones de la fase preanalítica previamente publicadas (12).Pasados 30 minutos de la eyaculación separar una alícuota de semen

para su valoración siguiendo las recomendaciones de la ESHRE (13).

5.3.2 Semen congeladoEn aquellas situaciones en las que no se puede emplear semen

fresco se puede recurrir a semen congelado. Existen dos tipos de muestras de semen criopreservadas:

• Semen criopreservado antes de iniciar terapias que pueden comprometer la capacidad reproductora del paciente, cuando exista dificultad para conseguir coordinar el momento de la inseminación con la recogida del semen, parejas serodiscor-dantes, etc.

• Semen de donante. En determinadas circunstancias como son oligozoospermias severas, ausencia de espermatozoides en testícu-lo, enfermedades hereditarias en las que el varón es el portador y mujeres sin pareja masculina.

La muestra de semen criopreservada contiene un agente criopro-tector que debe ser retirado antes de utilizarla para cualquier técnica de reproducción asistida.

La forma habitual para descongelar el semen es dejar las pajuelas de seguridad biológica a temperatura ambiente durante 10 minutos.

1. Decantar el contenido de las pajuelas en un tubo estéril.2. Diluir (aproximadamente a 1/5) en medio de lavado. La dilución

debe ser un proceso lento para evitar el choque osmótico (14). Se añaden lentamente, homogeneizando, durante al menos 10 minutos (gota a gota) 4,5 mL de medio de lavado, para que se produzca el equilibrio osmótico sin daño para el espermatozoide.

3. Procesar igual que el semen fresco, preferiblemente por gra-dientes de densidad.

Una vez descongelado el semen y antes de procesarlo debe valorarse la concentración y el grado de movilidad de los esper-matozoides.

5.4 ResultadosUna vez terminada la técnica hay que calcular el porcentaje de

espermatozoides con movilidad progresiva y realizar el recuento de los mismos siguiendo las directrices de la ESHRE (13).

Los resultados se obtienen multiplicando el tanto por ciento de espermatozoides con movilidad progresiva, por los millones de espermatozoides recuperados y por el volumen final. Se expresará como millones de espermatozoides recuperados con movilidad progresiva. Si el semen se va a utilizar para inseminación artificial se informará como millones inseminados y se calcularán multipli-cando por el volumen inseminado.

En caso de utilizar parte del volumen eyaculado, los resultados deben expresarse en función del volumen utilizado, y multiplicarse por el factor de corrección.

La relación del total de espermatozoides presentes en el eyacu-lado con el número de espermatozoides móviles recuperados, se expresa como porcentaje de recuperación (4) y se calcula con la siguiente formula:

Porcentaje de recuperación = [(VF x CF x REM)/(VU x CI x IEM) ]x 100VF= volumen finalCF= concentración final de espermatozoides REM= tasa de espermatozoides con movilidad progresiva recuperadosVU= volumen semen utilizadoCI= concentración inicial de espermatozoides IEM=tasa de espermatozoides con movilidad progresiva en el eyaculado

6. RECOMENDACIONES

Para el correcto desarrollo de este proceso se debe tener en cuenta las siguientes recomendaciones:



• Utilizar siempre material estéril.• Deben utilizarse pipetas Pasteur en lugar de agujas para aspirar

espermatozoides.• La preparación del semen debe comenzar no más tarde de 30

minutos de la eyaculación, ya que la capacidad de fecundar el ovocito puede verse afectada.

• Aspirar siempre las diferentes fases en la zona del menisco para no alterarlas.

• No mezclar plasma seminal con los espermatozoides recuperados, puede impedir la capacitación.

• Si el semen preparado va ser utilizado para inseminación artificial, deberá usarse lo antes posible.

• Diluir muy lentamente el semen descongelado. • Centrifugar siempre a los g recomendados.

Cálculo de los g de una centrifuga:g= 0.0000112 x r x N2

g= fuerza centrifuga en el fondo del tubor= radio de la centrifuga en cmN= revoluciones /minuto

7. CONCLUSIONES

El papel de los parámetros seminales como factor pronóstico en la fertilidad masculina está actualmente sometido a debate (2,15,16). Se ha propuesto el test de recuperación de espermatozoides móviles (REM) en el estudio de la pareja estéril como prueba para distinguir que parejas se beneficiarán de la inseminación artificial y cuales no, porque incluye la concentración, la movilidad así como los efectos del procesamiento de los espermatozoides (17,18).

Es difícil establecer un número mínimo de espermatozoides recu-perados para realizar inseminaciones intraútero y obtener una tasa de gestación adecuada. Los niveles umbral en los distintos trabajos oscilan desde 0.8 a 5 millones. No se ha podido identificar un umbral óptimo de REM que permita aconsejar a las parejas. Se requieren estudios adicionales para evaluar la capacidad predictiva del REM en los estudios de fertilidad (19). Algunos autores proponen que cada centro establezca su punto de corte en función de datos clínicos y de laboratorio de cada centro (17,18).

Una revisión Cochrane sobre las diferentes técnicas de preparación de semen concluye (20):

1. En cuanto a resultados clínicos (tasa de embarazo/tasa de recién nacidos vivos). No hay evidencia científica suficiente para recomendar una técnica de preparación de semen, al considerar resultados de los ensayos cuasialeatorios, la técnica de gradientes de densidad puede parecer mejor, pero necesita confirmarse con ensayos clínicos aleatorios.

2. Respecto a los parámetros seminales tras la preparación de semen. La técnica de gradientes parece mejor en cuanto a concen-tración de espermatozoides y a tasa de recuperación de esperma-tozoides móviles, mientras que la técnica de swim up recupera los espermatozoides con mejor movilidad, y en cuanto a la morfología no se encontraron preferencias. En términos generales la técnica de gradientes puede parecer superior, aunque debe confirmarse con ensayos clínicos de calidad

Debido a que no existe una conclusión definitiva para definir que característica del semen puede predecir la capacidad de fecundar, algunos autores proponen el uso de pruebas adicionales de función

espermática en el estudio de infertilidad, capaces de predecir el em-barazo con alta especificidad y valor predictivo positivo en parejas con subfertilidad masculina (reacción acrosómica, unión a la zona pelúcida HZA) (1,19,21).

8. BIBLIOGRAFIA

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Recomendaciones para la estimación de la incertidumbre de medida en el laboratorio clínico Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología MolecularComité CientíficoComisión de MetrologíaDocumento H. Fase 3. Versión 2

Preparado por:F.J. Gella Tomás, F. Canalias Reverter, S. Izquierdo Álvarez, V. Martínez Vázquez, M. Sánchez Manrique

ÍNDICE

0. Introducción1. Objeto y campo de aplicación2. Normas para consulta3. Definiciones4. Fuentes de incertidumbre 4.1 Definición del mensurando 4.2 Imprecisión 4.3 Valor asignado al calibrador 4.4 Error sistemático5. Cálculo de la incertidumbre6. Interpretación7. Aplicaciones8. Limitaciones9. Bibliografía

0. INTRODUCCIÓN

Los resultados que proporciona el laboratorio clínico deben ser exactos (veraces y precisos) para que permitan una interpretación clínica correcta y para que sean comparables con resultados ante-riores o posteriores y entre distintos laboratorios.

Tradicionalmente se ha relacionado la exactitud con el error de medida. No obstante, el error de medida de los resultados del labo-ratorio clínico es casi siempre desconocido. En cambio, es posible atribuir una incertidumbre de medida y una trazabilidad metrológica a cada resultado. La incertidumbre es una expresión numérica del grado de duda del resultado. La trazabilidad relaciona el resultado con referencias establecidas permitiendo su reproducibilidad en el tiempo y entre laboratorios (1,2).

En la estimación de la incertidumbre de medida se asume que cualquier error sistemático es eliminado, corregido o ignorado, se evalúan los efectos aleatorios sobre el resultado de una medida y se establece un intervalo en el que se encuentra el valor verdadero de la magnitud medida con un determinado nivel de confianza (3).

La norma para la acreditación de laboratorios ISO 15189 requiere una estimación de la incertidumbre de los resultados. La apropiada metodología para estimar la incertidumbre se describe en la Guía para la Expresión de la Incertidumbre de Medida (GUM). La GUM (4) fue desarrollada de forma conjunta por diversos organismos internacionales de normalización y metrología para su utilización en laboratorios de calibración y ensayo y aplicada a medidas físicas o de análisis químico. En la actualidad, la GUM es de difícil aplica-ción a las medidas que se realizan en el laboratorio clínico, aunque

pueden mantenerse sus principios generales (5,6). Por otra parte, la complejidad y el coste de obtener una estimación de la incertidumbre de medida deben ser proporcionales con los requisitos de calidad aplicables a la utilización clínica de los resultados.


Este documento proporciona recomendaciones para la estimación de la incertidumbre de medida en los laboratorios clínicos, teniendo en cuenta las limitaciones que son propias de las mediciones bio-lógicas y los principios básicos de la GUM.

La incertidumbre de medida no se aplica a las pruebas de tipo cualitativo, en las que el resultado no es un valor numérico.

2. NORMAS PARA CONSULTA

• Centro Español de Metrología. Vocabulario internacional de términos fundamentales y generales de metrología (VIM). Madrid: Ministerio de Obras Públicas, Transportes y Medio Ambiente;1994.

• Asociación Española de Normalización (AENOR). Productos sanitarios para diagnóstico in vitro. Medición de magnitudes en muestras de origen biológico. Trazabilidad metrológica de los valores asignados a los calibradores y a los materiales de control. UNE-EN ISO 17511. Madrid : AENOR ; 2004.

• Asociación Española de Normalización (AENOR). Laboratorios Clínicos. Requisitos particulares relativos a la calidad y la compe-tencia. UNE-EN-ISO 15189. Madrid : AENOR ; 2007.

• Directiva 98/79/CE del Parlamento Europeo y del Consejo sobre Productos Sanitarios para Diagnóstico In Vitro. Diario Oficial de las Comunidades Europeas L 331/1.

3. DEFINICIONES

3.1 AnalitoComponente que se indica en el nombre de una magnitud mensurable

3.2 CalibraciónConjunto de operaciones que establecen, en condiciones especi-

ficadas, la relación entre los valores de una magnitud indicados por un instrumento de medida o un sistema de medida, o los valores representados por una medida materializada o por un material de referencia, y los valores correspondientes de esa magnitud realizados por patrones (VIM)

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3.3 CalibradorMaterial de referencia cuyo valor se utiliza como variable inde-

pendiente en una función de calibración (ISO 17511)

NOTA: Existe una jerarquía metrológica de calibradores (ver ISO 17511)

3.4 Error máximo permitido Valor extremo de un error permitido por especificaciones, re-

glamentos, etc. (VIM)

NOTA: También denominado “error máximo tolerable” o “límite de error permitido”

3.5 Error sistemáticoMedia que resultaría de un número infinito de medidas del mismo

mensurando realizadas bajo condiciones de repetibilidad menos un valor verdadero del mensurando (VIM)

NOTA: Para obtener una estimación, se realiza un número finito de mediciones y se utiliza un valor convencionalmente verdadero del mensurando.NOTA: También llamado “desviación” y “sesgo”

3.6 Exactitud (de medida)Grado de concordancia entre el resultado de una medición y un

valor verdadero del mensurando (VIM)

3.7 ImprecisiónCoeficiente de variación de un conjunto de resultados obtenidos al medir

repetidamente un mensurando con un mismo procedimiento de medida

3.8 Imprecisión interdiariaImprecisión observada en un laboratorio a partir de resultados

obtenidos en días diferentes

NOTA: Los resultados pueden estar afectados por distintas cali-braciones (calibración diaria, semanal, etc.), distintos operadores, distintos lotes de calibradores y distintos lotes de reactivos

3.9 Incertidumbre de medidaParámetro, asociado al resultado de una medición, que caracte-


3.10 Magnitud (mensurable)Atributo de un fenómeno, cuerpo o sustancia, que es susceptible de

ser distinguido cualitativamente y determinado cuantitativamente (VIM)

3.11 MensurandoMagnitud particular sometida a una medida (VIM)

3.12 Procedimiento de medidaConjunto de operaciones, descritas de forma específica, utiliza-

das en la ejecución de mediciones particulares según un método dado (VIM)

NOTA: Existe una jerarquía metrológica de procedimientos de medida (ver ISO 17511)

3.13 Trazabilidad (metrológica)Propiedad del resultado de una medición o de un patrón tal que

pueda relacionarse con referencias determinadas, generalmente a patrones nacionales o internacionales, por medio de una cadena ininterrumpida de comparaciones teniendo todas las incertidumbres determinadas (VIM)

4. FUENTES DE INCERTIDUMBRE

Son fuentes que contribuyen a la incertidumbre de un resultado las siguientes: obtención de la muestra, preparación de la muestra, calibradores o materiales de referencia, magnitudes de entrada (por ejemplo, absorbancias), equipo instrumental empleado, condiciones ambientales, estabilidad de la muestra y cambios de operarios.

La incertidumbre relacionada con la obtención y preparación de la muestra es de dificil estimación y debe ser reducida mediante la rigurosa normalización de procedimientos. En este documento solo se consideran las fuentes de incertidumbre de la fase analítica, que se inicia cuando la muestra interacciona con el primer paso técnico del procedimiento de medida (por ejemplo, colocar la muestra en un analizador) y termina con la obtención de un valor numérico, resultado de la medida.

Los principales componentes de la incertidumbre de la fase ana-lítica corresponden a la indefinición del mensurando, la estabilidad de la muestra en el sistema de medida, la calibración, los volúmenes dispensados, el lote de reactivos, el equipo instrumental, los opera-rios y las condiciones ambientales. En los apartados siguientes, se comentan con mayor detalle los principales componentes.

La incertidumbre de medida es un parámetro que se asocia especí-ficamente a cada resultado. En los laboratorios clínicos, es imposible realizar una estimación particular de la incertidumbre de medida para cada mensurando de cada muestra, por lo que se realiza una estimación general de la incertidumbre de medida para un mensurando definido y para valores del mismo cercanos a los de decisión clínica.

4.1. Definición del mensurandoEl mensurando se define mediante los siguientes parámetros:

a) Analito a medir. Por ejemplo: proteína, ion sodio, colesterol, antiestreptolisina O, hemoglobina, número de leucocitos, etc.

b) Sistema. Por ejemplo: suero, orina, sangre venosa, líquido pleural, etc.c) Tipo de magnitud y unidad. Por ejemplo: concentración de

sustancia (mmol/L), concentración de masa (g/L), concentración catalítica (nkat/L), etc.

d) Procedimiento de medida. Habitualmente descrito en un pro-cedimiento documentado de trabajo o similar.

La existencia de diferentes formas moleculares del analito puede introducir incertidumbre en los resultados. Esta fuente de incertidumbre puede reducirse o eliminarse mediante la cuidadosa definición del procedimiento de medida, ya que pueden reaccionar de diferente manera con unas u otras formas moleculares.

Otra fuente de incertidumbre relacionada con la definición del mensurando son las posibles reacciones cruzadas e interfe-rencias que pueden ocurrir con algunas muestras y que deben estar identificadas y documentadas para prevenir, en lo posible, su influencia.

En resumen, la incertidumbre ocasionada por la indefinición del mensurando no puede ser cuantificada, pero puede ser reducida o eliminada mediante la detallada especificación del mensurando.



Recomendaciones para la estimación de la incertidumbre de medida en el laboratorio clínico

4.2. ImprecisiónLa mayor parte de los componentes de la incertidumbre de me-

dida de la fase analítica se encuentran contenidos en la estimación de la imprecisión interdiaria (CVid) que normalmente se obtiene empleando materiales de control.

Esta estimación debe realizarse con el suficiente número de datos para recoger las diferentes fuentes de incertidumbre que aplican. Se recomienda un mínimo de 6 meses de datos y una nueva estimación cada año. En el periodo de recogida de datos, deberían incluirse varias calibraciones para recoger la incertidumbre generada por el proceso de calibración. En cambio no es necesario utilizar distintos lotes de calibrador si se dispone de la incertidumbre del valor asignado.

La estimación del CVid debe realizarse para un valor del mensu-rando cercano a los valores de decisión clínica.

4.3. Valor asignado al calibradorEl laboratorio clínico debe conocer la incertidumbre y la traza-

bilidad metrológica de los valores asignados a los materiales de calibración que utiliza. Como habitualmente se trata de materiales comerciales, el fabricante debe proporcionar estos datos (Directiva 98/79/CE). Junto con el valor de incertidumbre debe especificarse también el factor de cobertura empleado. Normalmente, la incer-tidumbre se expresa como incertidumbre expandida (U) para un nivel de confianza del 95% (factor de cobertura = 2).

La incertidumbre estándar (u) se calcula dividiendo U por el factor de cobertura.

La u relativa (%) del valor asignado al calibrador no debería variar excesivamente lote a lote y debería ser generalmente más baja que el CVid.

4.4. Error sistemáticoLa estimación de la incertidumbre de medida asume que cualquier

error sistemático significativo del procedimiento de medida ha sido eliminado, corregido o es ignorado (4,6,7). La identificación de un eventual error sistemático debería realizarse durante la validación del procedimiento de medida.

Cuando se corrige un error sistemático mediante un factor, la corrección tiene una incertidumbre asociada (ufc) que debe ser con-siderada en el cálculo de la incertidumbre de medida combinada1.

Los errores sistemáticos ocasionados en el uso rutinario del pro-cedimiento de medida por las inevitables diferencias entre distintas calibraciones se comportan de forma aleatoria a largo plazo, con lo que este componente de la incertidumbre se recoge en el CVid.

5. CÁLCULO DE LA INCERTIDUMBRE

La incertidumbre se calcula combinando sus diversas fuentes. Para ello, los laboratorios clínicos deberían definir cada mensu-rando, especificando el procedimiento de medida, y realizar para cada uno de ellos el cálculo de la incertidumbre combinada a partir de los datos de control interno de la calidad y otros datos, según la siguiente fórmula:

Donde:uc: incertidumbre estándar combinada relativa (%)CVid: imprecisión (coeficiente de variación) interdiariaucal: incertidumbre estandar relativa (%) del valor asignado al

calibrador (ver 4.3)

ufc: incertidumbre estandar relativa (%) del factor empleado para corregir un error sistemático1.

Se recomienda expresar la incertidumbre combinada para un nivel de confianza del 95% (incertidumbre expandida, Uc). Para ello, se multiplica el valor de uc por k = 2.

La incertidumbre expandida relativa debe expresarse con dos cifras significativas, por ejemplo: 4,2%, 16%.

6. INTERPRETACIÓN

La estimación de la incertidumbre de medida proporciona una indicación cuantitativa del nivel de duda que el laboratorio tiene en cada resultado y es por tanto un elemento clave en el sistema de calidad analítico de los laboratorios clínicos.

La incertidumbre expandida relativa de un mensurando debería ser inferior a dos tercios del error máximo permitido. En caso de que fuera superior, deberían estudiarse con mayor detalle las diferentes fuentes de incertidumbre, identificar las más significativas y realizar las acciones oportunas para reducirlas.

7. APLICACIONES

La incertidumbre de medida debe ser utilizada principalmente para la:

• Selección de procedimientos de medida que cumplan las especificaciones de exactitud.

• Interpretación objetiva de la significación de un cambio entre dos valores consecutivos de una magnitud bioquímica.

• Interpretación objetiva de la significación de un resultado en comparación con un valor de decisión clínica

8. LIMITACIONES

El valor de la incertidumbre de medida varía con la concentración del mensurando y puede ser sustancialmente diferente para con-centraciones muy bajas o muy altas del analito. Por este motivo se recomienda realizar su estimación para una concentración cercana a los valores de decisión clínica.

Los materiales de control que se utilizan para estimar la impreci-sión interdiaria pueden no ser representativos del comportamiento analítico que tienen las muestras de los pacientes.

9. BIBLIOGRAFÍA

1. Gella FJ. Recomendaciones para la utilización de calibradores con trazabilidad metrológica en el laboratorio clínico. Quim Clin 2005; 24:474-6.2. Gella FJ. Trazabilidad metrológica y laboratorio clínico. Ed Cont Lab Clin 2004; 8:1-11.3. National Pathology Accreditation Advisory Council. Requirements for the estimation of measurement uncertainty (2007 edition). Australia 2007.4. Guide to the expression of uncertainty in measurement (1995). ISO Geneva.5. White GH, Farrance I. Uncertainty of measurement in quantitative medical testing. A laboratory implementation guide. Clin Biochem Rev 2004; 25:suppl (ii).6. Kristiansen J. The guide to the expression of uncertainty in measurement approach for estimating uncertainty: An appraisal. Clin Chem 2003; 49:1822-9.7. Thienpont LM. Calculation of measurement uncertainty – Why bias should be treated separately. Clin Chem 2008; 54:1587-8.

1La comisión de Metrología publicará próximamente recomendaciones para la estimación del error sistemático y para la estimación de la incertidumbre asociada a su corrección (ufc)



Recomendaciones para el estudio de las gammapatías monoclonales Documento de consenso

Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular (SEQC) y Asociación Española de Hematología y Hemoterapia (AEHH)Comité CientíficoComisión de Proteínas1 (SEQC) y Grupo Español de Mieloma2 (AEHH)Documento I. Fase 3. Versión 3

Preparado por: C. Martínez-Brú, R. García Sanz y J. Martínez-López

1Composición de la Comisión de Proteínas de la SEQC: Mª C. Cárdenas Fernández, M. Cortés Rius, M. Fernández García, M. García-Montes (asociado), I. Llompart Alabern, C. Martínez-Brú (Presidente), D. Pérez Surribas, T. Rodríguez González, C.Valldecabres Ortiz, JA. Viedma Contreras, E. Zapico Muñiz.2Composición del Grupo Español de Mieloma de la AEHH: A. Alegre, J.Bargay, J. Besalduch, J, Bladé, Mª T. Cibeira, F. de Arriba, J. de la Rubia, J. Díaz-Mediavilla, J. García-Laraña, R. García-Sanz, M. Hernández-García, JJ. Lahuerta, J. Martínez-López, R. Martínez-Martínez, Mª V. Mateos, A. Oriol, F. Prosper, L. Rosiñol, JF. San Miguel, A. Sureda

ÍNDICE

0. Introducción1. Objeto y campo de aplicación2. Metodología 2.1 Estudio en suero 2.1.1 Detección del componente o proteína monoclonal 2.1.1.1 Electroforesis en soporte sólido 2.1.1.2 Electroforesis capilar 2.1.1.3 Cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas 2.1.2 Identificación del componente o proteína monoclonal 2.1.2.1 Inmunofijación 2.1.2.2 Inmunosustracción e inmunotipado 2.1.3 Medida 2.1.3.1 Densitometría 2.1.3.2 Espectrofotometría UV 2.2 Estudio en orina 2.2.1 Detección 2.2.1.1 Electroforesis en gel de agarosa 2.2.1.2 Electroforesis capilar 2.2.1.3 Medida de distintas proteínas en orina 2.2.2 Identificación 2.2.3 Medida 2.2.4 Tipo de muestra de orina3. Requerimientos clínicos 3.1 En el momento del diagnóstico 3.1.1 Detección del componente monoclonal 3.1.2 Identificación del componente monoclonal 3.1.3 Medida del componente monoclonal 3.2 En el seguimiento de los MM quiescentes, MM en fase de

“plateau” y GMSI 3.3 En el seguimiento de pacientes bajo tratamiento 3.4 En recaídas o progresiones de pacientes previamente tratados4. Requerimientos analíticos

4.1 Detección del componente monoclonal 4.2 Identificación del componente monoclonal 4.3 Medida del componente monoclonal5. Metodología recomendada 5.1 Detección (cribado) del componente monoclonal 5.2 Identificación del componente monoclonal 5.3 Medida del componente monoclonal 5.4 Estudio en orina 5.5 Monitorización de MM en tratamiento 5.6 Monitorización de MM quiescentes, GMSI y MM en fase

de “plateau” 5.7 Detección de recidivas y casos específicos con escasa

síntesis de proteína monoclonal6. Propuesta de protocolo de seguimiento7. Conclusiones8. Bibliografía

0. INTRODUCCIÓN

Las gammapatías monoclonales (GM) constituyen un conjunto de trastornos diversos asociados a una proliferación de células B maduras (1,2). Se caracterizan (con alguna excepción como es el caso del mieloma no secretor) por la secreción de moléculas de inmunog-lobulinas (intactas o fragmentos) homogéneas desde el punto de vista inmunoquímico y electroforético, a las que habitualmente se conoce como componente monoclonal (CM) (1). Aunque en la mayoría de los casos las GM no tienen consecuencias clínicas importantes a lo largo de la vida del individuo, en ocasiones se producen manifesta-ciones clínicas debido a la proliferación celular clonal neoplásica o al efecto biológico de la proteína monoclonal sobre diferentes órganos o sistemas.

Las condiciones clínicas que se asocian a gammapatías monoclona-les se listan en la tabla I (modificada de Merlini, Aguzzi y Whicher) (3).

06 recom gammapatías monoclonales.indd 30 28/09/2009 15:32:42


Recomendaciones para el estudio de las gammapatías monoclonales

Las dos entidades clínicas sintomáticas más importantes asociadas a trastornos de células B maduras son el mieloma múltiple (MM) y la macroglobulinemia de Waldenström (MW). En estos casos la GM es clínicamente sintomática, ya sea debido a la proliferación neoplásica de células B o a sus efectos patológicos directos sobre algún órgano diana. Sin embargo, estas dos enfermedades representan una proporción relativamente pequeña de todos los CM detectados en el laboratorio.

En contraposición a estos casos, existe una serie de GM que cursan de manera asintomática o, si son secundarias, con una clínica sólo relacionada con la propia enfermedad de base. Dentro de este grupo de GM, se encuentran las gammapatías monoclonales de signifi-cado incierto (GMSI) que corresponden a aquellos procesos con presencia de una proteína monoclonal con carácter permanente y de concentración estable en el tiempo. Para establecer este diagnóstico es imprescindible que no haya síntomas o lesiones propias de MM, MW o deterioro orgánico por depósito de sustancia amiloide o inmunoglobulinas. Además, es necesario descartar la presencia de otros síndromes linfoproliferativos como leucemia linfoide crónica o linfomas, así como la presencia de diversos trastornos asociados con gammapatía monoclonal transitoria (1) (tabla I). En este sentido, una característica esencial de las GMSI es la estabilidad de la situación clínica y de las magnitudes biológicas. Los criterios que permiten establecer el diagnóstico diferencial entre GMSI, MM quiescente y MM sintomático se detallan en la tabla II (4).

Aunque la GMSI puede considerarse una etapa premaligna del MM (5), la tasa de progresión de GMSI a MM sintomático es de tan sólo un 1% anual (6).

Por su parte, el MM (aproximadamente, 1.1% de todos los tipos de cánceres y entre un 10% y un 15% de los de tipo hematológico

(2)), ocasiona un 2% de todas las muertes atribuibles a cáncer y posee el índice de mortalidad más elevado de todos los cánceres

(1). No obstante, la aparición de nuevos tratamientos ha hecho que la mediana de supervivencia haya subido hasta los 5 años (7) y en algunas series llegue a superar los 8 años (8). Además, se han establecido nuevos criterios diagnósticos, a la vez que un Sistema

Internacional de Estratificación (ISS) ha ido sustituyendo el sistema clásico de Durie y Salmon (9,10). Sin embargo, a pesar de haberse introducido nuevos tipos de tratamiento, el MM sigue siendo una enfermedad incurable. Puesto que la concentración de la inmuno-globulina monoclonal está relacionada directamente con la masa del clon de células que la produce (con la excepción del mieloma no secretor), el CM constituye un marcador bioquímico esencial tanto en el momento del diagnóstico del MM (10,11) como en la monitorización y en la evaluación de la respuesta al tratamiento (los cambios en la concentración del componente monoclonal representan el principal indicador utilizado en la evaluación de la respuesta al tratamiento (1)).

La contribución del laboratorio al estudio de las GM es determi-nante para su correcto diagnóstico y seguimiento. El diagnóstico de una GM supone la realización de una electroforesis de proteínas séricas y urinarias seguida, en caso de sospecharse un CM, de un estudio inmunoquímico que permite identificar el isotipo de inmu-noglobulina implicada en dicho CM, con su posterior cuantificación. La interpretación de la electroforesis de proteínas por un profesional experto es imprescindible puesto que un porcentaje no despreciable de GM se diagnostica en el laboratorio por la detección de un CM en la electroforesis.

Los métodos citados anteriormente permiten, en la mayoría de los casos, detectar e identificar las proteínas monoclonales. Sin embargo, en una minoría de casos en los que la población de células plasmáticas no sintetiza o secreta proteína monoclonal en cantidad suficiente, es posible que ésta no llegue a ser detectada o identificada. Así, la sensibilidad de los procedimientos hasta aquí comentados puede resultar eventualmente insuficiente ante entidades clínicas tales como MM no secretores, síndrome de POEMS, MM secretores de cadenas ligeras, amiloidosis AL, o MM de inmunoglobulinas (Ig) intactas o enteras que responden favorablemente al tratamiento y entran en respuesta completa.

Por todo lo expuesto anteriormente, el laboratorio debe dispo-ner de métodos analíticos y estrategias que permitan la detección, identificación y medida de los CM con las máximas garantías de

Clínicamente manifiestas Sin clínicaDerivadas de enfermedades malignas de las células B Mieloma Múltiple y sus variantes Mieloma sintomático Mieloma quiescente, latente o asintomático Mieloma no secretor Leucemia de células plasmáticas Mieloma Osteosclerótico (POEMS) Plasmocitoma Óseo Solitario Extramedular Otros procesos linfoproliferativos Macroglobulinemia de Waldenström Linfoma No Hodgkin Leucemia linfocítica crónica Enfermedad de cadenas pesadas (α, γ, μ)

Gammapatías monoclonales transitorias Infecciones (víricas o bacterianas) Enfermedades autoinmunes Estados de inmunodeficiencia transitorios Reconstitución de la médula ósea después de un trasplante de progenitores hematopoyéticos

Enfermedades relacionadas con la presencia de CM Crioglobulinemia Amiloidosis AL Enfermedad por depósito de cadenas ligeras o pesadas Polineuropatías secundarias a CM Crioaglutininas

Gammapatías monoclonales de significado incierto (GMSI)

Tabla I. Condiciones clínicas asociadas a gammapatía monoclonal

*CM: componente monoclonal



fiabilidad y sensibilidad, aplicando cada uno de ellos según el tipo de gammapatía monoclonal y el momento evolutivo de cada enfermedad. Así, se puede garantizar una óptima monitorización de los pacientes con MM, que permita una categorización exacta del grado de respuesta al tratamiento y asegure simultáneamente la detección precoz de recidivas.


El presente documento pretende establecer las características de los métodos analíticos habitualmente empleados para la detección, identifi-cación y medida de los componentes monoclonales, citando su sensibi-lidad analítica, y recomendando las mejores opciones analíticas para el diagnóstico y seguimiento de las gammapatías monoclonales. Asimismo, se define la estrategia de laboratorio que se debería seguir ante la detec-ción de un componente monoclonal en la electroforesis, estableciendo la periodicidad con la que debe realizarse el seguimiento analítico del paciente, de acuerdo con el tipo de gammapatía monoclonal (ya se trate de MM o de GMSI), y el tratamiento al que esté sometido el paciente.

2. METODOLOGÍA

Para el estudio analítico correcto de las GM deben analizarse muestras de suero y de orina. En ambos casos debe pasarse por una

primera fase de detección del CM, una posterior de identificación y finalmente una de cuantificación o medida del CM (12). Cabe desta-car aquí que aunque hay autores que sostienen que la detección de cadenas ligeras libres en suero puede desplazar al estudio en orina, esta posibilidad no cuenta aún con evidencia científica suficiente y por el momento sigue siendo necesario el estudio del CM en orina (13), tal como acaba de ratificarse recientemente en el XIIth International Myeloma Workshop celebrado en Washington (14).

2.1 Estudio en suero

2.1.1. Detección del componente o proteína monoclonalLa electroforesis de proteínas séricas constituye, por norma gene-

ral, el primer paso en la búsqueda de CM. Es recomendable procesar suero en lugar de plasma para así obviar la presencia de fibrinógeno, con movilidad electroforética similar a la de algunas inmunoglo-bulinas. Los CM suelen migrar en la zona γ de la electroforesis, si bien pueden aparecer en cualquier región electroforética, desde la zona α1 hasta el extremo más catódico de la región γ (6) , sobrepo-niéndose o no a cualquiera de las zonas normalmente observadas en la electroforesis. Por ello, es necesario que la interpretación final del proteinograma corra a cargo de un profesional de laboratorio experimentado. Debe analizarse el trazado electroforético para observar el aspecto y la localización del pico monoclonal, ya que

Tabla II. Criterios diagnósticos y diagnóstico diferencial de las gammapatías monoclonales DEFINICIÓN DE GAMMAPATÍAS MONOCLONALES

Gammapatía Monoclonal de Significado Incierto (GMSI)

Mieloma asintomático (Mieloma Múltiple Quiescente)

Mieloma Múltiple sintomático

CM <30 g/L en suero ≥ 30 g/L en suero y/o presente en orina Presente b

y o oPlasmocitosis medular <10% >10% >10% b

y y yDaño orgánico a Ausente Ausente Presente

a) Daño orgánico o lesión tisular relacionada con el Mieloma o con la proliferación de células plasmáticas: anemia con reducción de la Hb de al menos 20 g/L respecto al nivel normal o nivel de Hb <100 g/L; y/o aumento del calcio sérico >0.25 mmol/L (1 mg/dL) por encima de lo normal o cifra absoluta de Ca >2.75 mmol/L (11 mg/dL); y/o lesiones óseas líticas u osteoporosis con fracturas compresivas no atribuibles a otra causa; y/o insuficiencia renal (creatinina >173 μmol/L (2 mg/dL). [Se resume con el acrónimo inglés CRAB: Calcium increase, Renal impairment, Anemia and Bone lesion]. También se incluirían otros signos/síntomas menos frecuentes: hiperviscosidad sintomática; amiloidosis y/o infecciones bacterianas recurrentes (>2 episodios graves –con ingreso – en 12 meses).b) En caso de mieloma múltiple sintomático no se requiere un nivel mínimo de componente monoclonal o infiltración plasmocitaria de la médula ósea, siempre y cuando ambos hallazgos coexistan con la presencia de daño orgánico.

DISCRASIAS DE CÉLULAS PLASMÁTICAS ESPECIALESMieloma no secretor Plasmocitoma solitario del hueso Plasmocitoma extramedular

Componente monoclonal

Ausente (Inmunofijación negativa) Presente o ausente Presente o ausente

y y yPlasmocitosis medular

≥10% o presencia de plasmocitoma Ausente Ausente

y y yDaño orgánico Presente Ausente Ausente

y y

Otros

Área de destrucción única, debida a infiltración por células plasmáticas clonalesSeriada ósea radiológica normal

Presencia de tumoración de células plasmáticas clonales Seriada ósea radiológica normal




resulta imprescindible para estudiar la evolución del componente a lo largo del tiempo, con o sin tratamiento. Sólo de este modo se puede distinguir bien si las modificaciones de la zona donde migra el CM son debidas a variaciones en el CM o a alteraciones de la fracción policlonal de las inmunoglobulinas, pues su significado puede ser completamente opuesto.

2.1.1.1. ElEctroforEsis En soportE sólido

En este tipo de electroforesis la resolución final obtenida está fuertemente influenciada por el tipo de soporte empleado y por las características físicas de la técnica electroforética (pH, voltaje, temperatura, etc.). La sensibilidad analítica alcanzada varía en función del colorante empleado (de mayor a menor sensibilidad, violeta ácido, azul brillante de Coomassie y negro amido). En caso de optar por este tipo de electroforesis, el soporte recomendado es el gel de agarosa (prácticamente ha quedado obsoleta la electroforesis en acetato de celulosa) utilizando cualquiera de los tres colorantes aquí mencionados. La evaluación del trazado electroforético supone una inspección visual del gel, y posteriormente se valora las distintas fracciones por densitometría (evalúa la intensidad de la coloración de cada una de las zonas del gel de acuerdo a la diferente afinidad que tienen las proteínas por el colorante).

2.1.1.2. ElEctroforEsis capilar

Constituye una alternativa electroforética de creciente implanta-ción en los laboratorios clínicos, y es el método mayoritariamente empleado entre los participantes en el Programa de Garantía de la Calidad de los Laboratorios Clínicos de la Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular, en el año 2007 (15). Se realiza en sistemas totalmente automatizados que emplean volúmenes muy reducidos de muestra y aplican un elevado voltaje. La resolución que proporcionan estos sistemas es similar a la obtenida con geles de agarosa. La diferencia esencial respecto a una electroforesis en soporte sólido estriba en que no se realiza tinción alguna. La me-dida de las diferentes fracciones se realiza por espectrofotometría directa en la zona UV, y se interpreta directamente el espectro de absorción. La electroforesis capilar constituye una muy buena opción electroforética para el estudio de las GM en suero, especialmente en centros con un gran número de muestras.

Con ambas técnicas electroforéticas pueden observarse trazados que lleven a interpretaciones erróneas (falsos positivos y falsos negativos) que se resumen en la tabla III. Este fenómeno puede incluso observarse más frecuentemente si se opta por un método electroforético de alta resolución. Por ello, aunque esta última opción proporciona una mayor sensibilidad analítica, no debería

considerarse como método de primera línea en la detección de componentes monoclonales.

2.1.1.3. cadEnas ligEras librEs dE inmunoglobulinas En suEro

Las cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas pueden medirse en suero por un método específico basado en una reacción inmu-noquímica (Ag-Ac) (16). El procedimiento implica la medida de los dos tipos (kappa –κ- y lambda –λ-) de cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas con dos antisueros específicos distintos y con el posterior cálculo del cociente κ/λ, que es el que permite sospechar monoclonalidad, aunque no puede confirmarla. Es importante saber que en la conformación normal de la inmunoglobulina, la asocia-ción de las cadenas ligeras y pesadas enmascara ciertos epitopos de la cadena ligera que quedan expuestos cuando ésta se encuentra circulando libremente, y son estos epitopos los que se utilizan para la producción del antisuero específico anti-cadenas ligeras libres. El principal inconveniente del método es la falta de estandarización (17) (no existe material de referencia internacional) y la falta de experiencia que existe sobre este componente biológico, dado que su empleo en el laboratorio clínico es relativamente reciente. Además, están descritos diferentes intervalos de referencia según el tipo de analizador utilizado para la medida de las cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas, motivo por el cual cada laboratorio debería de establecerse sus propios valores de referencia (18).

La principal utilidad de la medida de las cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas en suero es la de poder identificar aquellas situaciones en las que la proteína monoclonal sintetizada y secretada en la circulación está presente a concentraciones no detectables por electroforesis o por un método inmunoquímico de identificación (detección negativa e identificación negativa), tales como mielo-mas no secretores o poco secretores, amiloidosis, enfermedad por depósito de cadenas ligeras, síndrome de POEMS, mielomas con buena respuesta al tratamiento y algunos mielomas secretores de cadenas ligeras. La presencia de un cociente κ/λ alterado en estas situaciones permite mantener un elevado índice de sospecha de persistencia de la proteína monoclonal y puede facilitar diagnósticos difíciles así como un seguimiento más objetivo de estos casos; ade-más constituye un marcador tanto del grado de respuesta alcanzado con el tratamiento como de detección precoz de recidivas (19,20).

Recientemente han sido publicadas unas recomendaciones inter-nacionales en las que se resume las principales indicaciones de la medida de las cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas en suero (21): 1) en el diagnóstico, su uso juntamente con la electroforesis y la inmunofijación (inmunosustracción o inmunotipado) permite alcanzar mayor sensibilidad; 2) presenta valor pronóstico en la gran

Falsos positivos(se informa de un CM que no existe)

Falsos negativos(no se informa de un CM que sí existe)

Fibrinógeno (y sus productos de degradación) CM débilProteína C reactiva CM débil superpuesto a una bandaVariantes fenotípicas de proteínas (transferrina, C3, α1-antitripsina, hemoglobina)

Inmunoglobulinas monoclonales polimerizadas (banda de aspecto policlonal)

Muestras contaminadas y muestras sometidas a procesos repetidos de congelación / descongelación Crioglobulinas

Administración endovenosa de contrastes iodados

Tabla III. Interpretaciones erróneas en la electroforesis

* CM: componente monoclonal* C3: fracción C3 del complemento



mayoría de discrasias de células plasmáticas; 3) permite un segui-miento objetivo en gammapatías con escasa secreción de proteína monoclonal; 4) en los MM tratados es necesaria la normalización del cociente κ/λ para determinar la denominada Respuesta Completa estricta (CRe). Ello ha hecho que el grupo internacional de mielo-ma haya recomendado utilizar esta metodología (21). En GMSI, se ha descrito que la presencia de un cociente κ/λ sérico alterado constituye un factor de riesgo de progresión hacia malignidad (22).

2.1.2. Identificación del componente o proteína monoclonal

Todos los métodos de identificación se basan en la combinación de una separación de las proteínas por electroforesis y una reacción inmunoquímica con antisueros específicos (anti-γ, anti-α, anti-μ, anti-κ, anti-λ). El antisuero utilizado (afinidad, avidez, título) cons-tituye una variable fundamental de los métodos inmunoquímicos. Si no se produce reacción con los antisueros anti-γ, anti-α, anti-μ, y sí se produce con anti-κ o anti-λ debe enfrentarse la muestra a otros antisueros (anti-d, anti-κ y anti-λ libres, y anti-e).

La inmunoelectroforesis no se recomienda como método de identificación de los componentes monoclonales detectados por electroforesis al poseer menor resolución, practicabilidad y rapi-dez analíticas que los otros métodos, y ofrecer problemas en su interpretación.

2.1.2.1. inmunofijación

El método de identificación más extendido entre los laboratorios clínicos es la inmunofijación (IFE), debido a sus buenas prestaciones analíticas y facilidad de interpretación. Este fue el método mayo-ritariamente empleado entre los participantes en el Programa de Garantía de la Calidad de los Laboratorios Clínicos de la Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular, en el año 2007 (15). La inmunofijación consiste en la separación de las pro-teínas por electroforesis en gel de agarosa, seguida de una segunda etapa de inmunoprecipitación de la proteína monoclonal con los anticuerpos específicos. El gel consta de seis canales de reacción, aplicándose muestra en cada uno de ellos para que se produzca la migración electroforética; posteriormente, en cada canal se aplica un anticuerpo determinado. Finalmente, debe procederse a la tinción del gel (violeta ácido, azul brillante de Coommassie, negro amido) y consiguiente decoloración. Igual que sucede con una electroforesis convencional, los resultados se ven influenciados por las condiciones electroforéticas y el tipo de colorante empleado.

Es importante destacar aquí que se trata de la técnica convencional más sensible de la que se dispone. Aunque su elevada sensibilidad generalmente no es necesaria en el momento del diagnóstico, resulta esencial para evaluar la respuesta terapéutica en aquellos pacientes con MM o MW con elevado grado de respuesta al tratamiento, ya que en muchos pacientes el componente monoclonal no se detecta por electroforesis, pero sí se identifica por inmunofijación.

2.1.2.2. inmunosustracción E inmunotipado

Estos métodos de identificación de CM se han desarrollado simultáneamente a la implantación de la electroforesis capilar, y se han adaptado al mismo sistema electroforético. El principio del método consiste en realizar una electroforesis después de que la posible proteína monoclonal haya reaccionado con antisueros específicos en los pocillos del analizador preparados para tal uso. Así, al final de todo el estudio, a cada muestra sospechosa de tener un CM se le habrá realizado una primera electroforesis capilar

(detección de CM) seguida de una reacción inmunoquímica y de una segunda electroforesis capilar que permitirá concluir el proceso. Como ventajas de estos métodos frente a la inmunofijación, puede destacarse su practicabilidad y su rapidez, puesto que se trata de un procedimiento totalmente automatizado. Como inconveniente principal destaca el hecho de que bandas muy débiles o muy tenues (sospechadas a través de la inspección del primer trazado electrofo-rético) que levantan dudas respecto a su monoclonalidad, pueden no quedar perfectamente categorizadas. Otro inconveniente importante de estos dos métodos es que los sistemas capilares actuales no están todavía adaptados para enfrentar la muestra de suero frente a otros tipos de anticuerpos distintos de anti-γ, anti-α, anti-μ, anti-κ y anti-λ, y por lo tanto en caso de duda, debe procederse a realizar una inmunofijación.

Cabe destacar que, cuando existe una fuerte sospecha clínica de gammapatía monoclonal maligna, o para confirmar una remisión completa de un paciente con MM, debe siempre realizarse inmu-nofijación del suero y la orina, aunque la electroforesis no evidencie la presencia de un componente monoclonal.

2.1.3. Medida del componente o proteína monoclonalPara la medida del CM el laboratorio clínico puede optar por dos

principios de medida que son la densitometría (realizada tras una electroforesis en gel de agarosa) y la espectrofotometría directa en la zona UV (realizada a 200 nm ó 214 nm, según el sistema, tras una electroforesis capilar). En cualquier caso, debe aplicarse siempre la misma estrategia de medida del CM, para evitar que el empleo de diferentes principios de medida pueda incidir en las decisiones clínicas.

Respecto a los métodos inmunoquímicos como turbidimetría y nefelometría, si bien con muy buenas prestaciones analíticas, no son los adecuados para medir la proteína monoclonal debido a que los antisueros empleados reconocen tanto la inmunoglobulina mo-noclonal como la policlonal, y por lo tanto no deben ser utilizados con esta finalidad. Sin embargo, pueden considerarse como métodos complementarios a los que se comentan a continuación.

2.1.3.1. dEnsitomEtría

En el caso de la electroforesis en gel de agarosa, posteriormente a la inspección visual cuidadosa para detectar bandas con signos de monoclonalidad (aún a bajas concentraciones), se procede a una lectura densitométrica del gel que proporciona una estimación cuan-titativa de la concentración de proteína monoclonal (ya que refleja la cantidad de colorante fijado a la proteína). Las principales limita-ciones del procedimiento se manifiestan en la medida de CM débiles sobre fondo de inmunoglobulinas policlonales y en la subjetividad para decidir los puntos de corte del área correspondiente al CM.

2.1.3.2. EspEctrofotomEtría uVEn el caso de emplear la electroforesis capilar, la visualización

de un componente monoclonal se completa con una integración del área bajo la curva de dicho pico obtenida por espectrofotometría en la zona UV. Este principio de medida presenta una mayor exactitud en la medida de la proteína monoclonal puesto que la absorbancia a 200 nm ó 214 nm es directamente proporcional a la cantidad de enlace peptídico de la muestra. Sin embargo, los problemas citados en el apartado anterior se reproducen también en este caso (medición de un CM pequeño sobre un fondo policlonal, decisión arbitraria de los puntos de corte de la banda y medida de las inmunoglobulinas monoclonales pero también de las policlonales).




2.2. Estudio en orinaEn la orina, la finalidad del estudio analítico de las GM radica

en detectar e identificar la presencia de cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas monoclonales (proteinuria de Bence-Jones).

2.2.1. DetecciónLos métodos de detección del CM en suero sirven también para la

detección del CM en orina, aunque con las adaptaciones pertinentes. Así como el estudio de las gammapatías monoclonales en suero es bastante uniforme entre los distintos laboratorios, en el caso de la orina, las estrategias varían de un laboratorio a otro. Las opciones más empleadas se listan a continuación:

2.2.1.1. ElEctroforEsis En gEl dE agarosa Puede realizarse, ya sea de manera convencional (concen-

trando la muestra en función de la concentración de proteínas en la misma) ya sea de alta resolución. Se pueden emplear distintos colorantes, aunque el Violeta Ácido es el que ofrece mayor sensibilidad.

2.2.1.2. ElEctroforEsis capilar

Si bien es una metodología ampliamente utilizada para la detección de CM en suero, su uso para las muestras de orina es limitada, debido a su más reciente adaptación. Aunque no se dispone actualmente de estudios comparativos contrastados en orina, es posible que a medida que se extienda su uso, la elec-troforesis capilar constituya una buena alternativa metodológica para el estudio del CM en orina. En caso de utilizar esta meto-dología, debe procederse previamente a una diálisis de la orina para eliminar sustancias interferentes presentes en la muestra y que absorben en la región UV.

2.2.1.3. mEdida dE distintas protEínas En orina

La medida de la concentración de distintas proteínas en orina (albúmina, inmunoglobulina G, α1-microglobulina, cadenas ligeras libres o totales de inmunoglobulinas) y el cálculo posterior de diver-sos cocientes (cociente entre suma de proteínas individuales como albúmina, inmunoglobulina G y α1-microglobulina, y la proteína total; cociente κ/λ -totales o libres-) permite sospechar la presencia de proteinuria de Bence Jones (23,24) .

2.2.2. IdentificaciónLa presencia de cadenas ligeras libres monoclonales en orina

(proteinuria de Bence-Jones) debe confirmarse por un método inmunoquímico. Los métodos de identificación del CM en suero (inmunofijación, inmunosustracción o inmunotipado) sirven también para la identificación del CM en orina, con las consiguientes adaptaciones. Nuevamente, la elección de la metodología deberá basarse en las necesidades de sensibilidad para la muestra concreta (por ejemplo, si la determinación se lleva a cabo para confirmar una respuesta completa en un mieloma que presentaba proteinuria monoclonal, se requerirá inmunofijación).

Puede optarse ya sea por una combinación de un antisuero anti-cadenas pesadas (γ,α,μ), además de los antisueros frente a cadenas ligeras totales de tipo κ y de tipo λ (por lo tanto tres antisueros distintos), ya sea por el empleo de antisueros anti-cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas de tipo κ y de tipo λ (dos antisueros).

2.2.3. MedidaLa medida del componente monoclonal en orina ofrece mayores

dificultades que en suero. Pueden emplearse la densitometría y la espectrofotometría UV, aunque no están exentas de inconvenientes. La espectrofotometría UV es problemática debido a la presencia en la orina de numerosas sustancias que absorben en la zona UV y requiere dializar previamente la muestra de orina para eliminar las interferencias. Además, en ambos casos, debe utilizarse un proce-dimiento capaz de medir todas las proteínas en orina (albúmina, globulinas y proteínas de baja masa molar como las cadenas ligeras de inmunoglobulinas).

Quizás aquí tengan un valor añadido los métodos inmunoquímicos (nefelometría y turbidimetría), concretamente para medir cadenas ligeras de inmunoglobulinas en los casos en que existe una protei-nuria de Bence Jones. Aunque los antisueros comercializados para la medida de la concentración de cadenas ligeras (libres o totales) de inmunoglobulinas reconocen tanto las cadenas ligeras monoclonales como las policlonales, estos métodos permiten un seguimiento más objetivo de la cantidad de cadenas ligeras que se excretan por orina.

2.2.4. Tipo de muestra de orinaLa medida de proteínas en orina se ha realizado tradicionalmente

en orina de 24 horas. Los diversos inconvenientes (tanto para el paciente como para el laboratorio) de trabajar con orina de 24 horas convierten lo que sería la muestra ideal para obviar la variabilidad intraindividual en la excreción diaria de proteínas en una muestra difícil de obtener correctamente, y lo que es más importante, con la posibilidad de poder llevar a confusión en la interpretación de los resultados de la medida de distintas magnitudes proteicas. Son diversos los estudios que avalan la posibilidad de utilizar muestras aleatorias de orina, expresando los resultados en función de la crea-tinina de la muestra (25,26). El cociente proteína/creatinina permite corregir las posibles variaciones en la concentración de la orina. Distintas sociedades científicas y grupos de expertos recomiendan el uso de muestras de orina aisladas para la medida de la proteinuria (27,28). En el caso concreto de la proteinuria de Bence Jones, las guías de práctica clínica vigentes siguen expresando la proteinuria como cantidad excretada (gramos o miligramos por 24 horas). Por otra parte, debido a que existe cierto grado de degradación enzimá-tica bacteriana de las cadenas ligeras de inmunoglobulinas, algunos grupos de expertos recomiendan el uso de la segunda muestra del día (29) (expresando la proteinuria en función de la concentración de la creatinina de la muestra), para así descartar aquella orina que durante toda la noche ha ido acumulándose en la vejiga urinaria. Inevitablemente, el hecho de utilizar muestras de orina aisladas y expresar los resultados de la proteinuria en función de la creatinina de la muestra, hace necesario definir unos nuevos valores discri-minantes equivalentes a los establecidos en las guías de práctica clínica actuales, en el contexto de las gammapatías monoclonales.

3. REQUERIMIENTOS CLÍNICOS

3.1. En el momento del diagnóstico

3.1.1. Detección del componente monoclonalAnte la sospecha de una gammapatía monoclonal, es imprescin-

dible que el clínico disponga desde el momento del diagnóstico, de una electroforesis de proteínas en suero con el gráfico del trazado electroforético. Ello facilita el seguimiento del CM durante la



evolución, ya sea bajo tratamiento (para constatar su descenso) o en abstención terapéutica (para controlar un posible ascenso). Dada la mayor resolución gráfica de la electroforesis capilar, este es el método preferido desde el punto de vista clínico.

En todos los casos se necesita también el estudio de proteínas en orina, no sólo para identificar los casos de gammapatías mono-clonales de cadenas ligeras, sino también para complementar el estudio diagnóstico en gammapatías con CM de inmunoglobulinas intactas o enteras. La proteinuria de Bence Jones puede tener un valor pronóstico y evolutivo relevante (de hecho, hasta el 60% de los MM de inmunoglobulina intacta tiene proteinuria de Bence Jones).

Puesto que la observación del pico monoclonal en el trazado electroforético constituye para el clínico la mejor forma de evaluar la gammapatía monoclonal, es recomendable incorporar el gráfico del trazado electroforético al informe del laboratorio.

3.1.2. Identificación del componente monoclonalUna vez detectado el CM, es necesario identificar conveniente-

mente el isotipo de inmunoglobulina que lo integra (cadena pesada y cadena ligera). Si bien en ciertos casos la medida por nefelometría o turbidimetría de las inmunoglobulinas y de las cadenas ligeras totales permite intuir el tipo de inmunoglobulina que conforma el CM, no puede nunca obviarse la identificación del CM por inmunofijación, inmunosustracción o inmunotipado. En caso de que no se haya podido detectar el CM por electroforesis pero persista la sospecha clínica de gammapatía monoclonal, es obligatorio proceder a una inmunofija-ción de la muestra. Esto puede suceder en los siguientes supuestos:

• Mieloma múltiple oligosecretor y no secretor• Amiloidosis primaria tipo AL• Enfermedad por depósito de cadenas ligeras• Mieloma osteosclerótico o síndrome de POEMS• Plasmocitoma solitario (óseo o extraóseo)• Polineuropatías por componente monoclonal• Crioglobulinemias y Síndrome por crioaglutininas

Sólo después de comprobar que no se aprecia CM por electro-foresis ni por inmunofijación, que el cociente κ/λ sérico es normal y que no existe proteinuria de Bence Jones, se podría excluir un diagnóstico de gammapatía monoclonal.

3.1.3. Medida del componente monoclonalJunto a la electroforesis de proteínas debe proporcionarse la con-

centración de proteínas y la concentración de cada una de las distintas fracciones del proteinograma; es altamente recomendable que el labo-ratorio no proporcione únicamente datos expresados en porcentajes.

Siempre que la morfología y la migración del CM lo permitan, la medida del componente monoclonal debe realizarse a partir de la electroforesis, delimitando el pico en el trazado y ajustando el área para su determinación de forma individual, separada del resto de las regiones. Pese a la subjetividad que implica este método, es el más fiable desde el punto de vista clínico.

La medida de inmunoglobulinas por métodos como la nefe-lometría o la turbidimetría puede resultar un método comple-mentario a la electroforesis, concretamente en casos en que la delimitación del área del CM resulta difícil (CM sobre fondo policlonal o superpuesto a otras regiones del proteinograma), y es de ayuda en el seguimiento de los pacientes para conocer la respuesta alcanzada cuando el CM no se puede cuantificar por electroforesis.

Respecto a la medida de cadenas ligeras libres de inmunoglo-bulinas, puede resultar de interés la determinación absoluta de la cadena ligera libre perteneciente al clon tumoral en MM secretores de cadenas ligeras y en Amiloidosis AL (21). Sin embargo, aunque ya hay numerosos estudios que avalan su uso, todavía no existe suficiente experiencia como para hacer una recomendación firme respecto a su empleo generalizado en este apartado.

3.2. En el seguimiento de los MM quiescentes, MM en fase de plateau y GMSI

La característica esencial de estos casos es que los pacientes están asintomáticos aunque presentan un CM medible. Estos pacientes son seguidos durante mucho tiempo, muchas veces años e incluso decenios, sin que precisen tratamiento alguno. Aparte de la vigilancia que hay que prestar sobre la posible aparición de síntomas y signos clínicos, el seguimiento se basa en la observación del componente monoclonal. Debe prestarse especial atención al posible aumento de la concentración del CM (se producirá seguramente en algún momento u otro en el curso de la enfermedad), aunque por lo general con elevaciones poco apreciables. Por ello, es fundamental medir con la máxima exactitud el componente monoclonal para asegurar que el valor obtenido corresponde al CM y que las posibles variaciones respecto a concentraciones anteriores son debidas exclusivamente a variaciones en la concentración del CM (y no a otras alteraciones como expansiones policlonales o cambios en la elección de los puntos de corte del proteinograma).

En este apartado, no es necesario identificar el CM de manera repetida. Aunque la cuantificación de cada una de las inmuno-globulinas por nefelometría o turbidimetría no proporciona una medida exacta del componente monoclonal, al clínico le supone una información complementaria al proteinograma, especialmente cuando el CM es de tipo IgA o IgM. Si el paciente presenta una proteinuria de Bence Jones, la medida de cadenas ligeras (libres o totales) en orina es de gran ayuda.

Por otra parte, la periodicidad recomendada de los controles analíti-cos (electroforesis con medida del CM) varía según el tipo de paciente:

• Pacientes tratados que han alcanzado una fase de plateau

(o respuesta parcial sostenida): cada 1-3 meses, dependiendo del riesgo de progresión, de acuerdo a criterios clínicos.

• Pacientes con MM quiescente: - Pacientes con alto riesgo de progresión: cada 3 meses - Pacientes con bajo riesgo de progresión: cada 6 meses• Pacientes con GMSI: - Pacientes con alto riesgo de progresión: cada 3-6 meses. - Pacientes con bajo riesgo de progresión: cada 12 meses.• Pacientes con gammapatías asociadas a otras condiciones clí-

nicas: no necesitan seguimiento si desaparecen.

3.3. En el seguimiento de pacientes bajo tratamiento

En este apartado, la finalidad principal del tratamiento consiste en la reducción de la concentración del componente monoclonal. Por este motivo, en el seguimiento clínico, el objetivo primordial es evaluar esta pretendida reducción a través de su medida. Los protocolos clínicos persiguen, en principio, una respuesta objetiva ahora definida como “parcial” (RP). Esta respuesta parcial implica una reducción del CM en suero y en orina, mayor o igual al 50 y al 90%, respectivamente. Hay grupos que definen además la “respuesta parcial muy buena” (RPMB),




cuando la reducción en suero supera el 90%. De nuevo, la mejor for-ma de evaluar estas reducciones es midiendo el pico monoclonal en el trazado electroforético; la concentración de las inmunoglobulinas aporta una información complementaria al clínico (especialmente en casos IgA e IgM, y en los pacientes con proteinuria de Bence Jones).

Con los tratamientos actuales (que, además de los nuevos fármacos, incluyen altas dosis de quimioterapia y transplante de progenitores hematopoyéticos –TPH-), en muchos pacientes se consigue una reduc-ción de la concentración del CM que lo convierte en indetectable por electroforesis. Esta respuesta al tratamiento se asocia con una notable mejoría en la evolución de los pacientes y se obtiene en un 40-65% de los pacientes jóvenes (30) y en más del 35% de los mayores de 65 años (31). Sin embargo, en estos casos la sensibilidad del proteinograma es insuficiente para poder definir correctamente el grado de respuesta alcanzado y se hace necesario recurrir a técnicas más sensibles, como la inmunofijación. Así se define la RC como la situación en la que, aparte de conseguir mejoría clínica y desaparición de la plasmocitosis medular, el CM desaparece tanto en la electroforesis como en la inmu-nofijación. Los casos en los que el pico desaparece de la electroforesis pero permanece en la inmunofijación se consideran como “Respuestas casi Completas” (RcC). En la experiencia española, el porcentaje de casos que alcanza RC tras TPH es del 40%, mientras que para RcC es del 24%, y ello conlleva un pronóstico notablemente diferente (32). Por este motivo, debe realizarse una inmunofijación a todos los pa-cientes en tratamiento que presentan una electroforesis sin componente monoclonal. Además, dado que tras el TPH pueden aparecer bandas oligoclonales que compliquen la interpretación de la electroforesis e inmunofijación, es necesario que todos estos pacientes dispongan de una muestra anterior en la que se distinga bien el componente monoclonal para tomarlo como referencia y poder compararlo con la muestra en la que puede haber desparecido. Idealmente, la inmunofijación de referencia tendría que ser la del momento del diagnóstico.

Actualmente, el inmunotipado y la inmunosustracción no tienen sensibilidad suficiente para definir la respuesta completa ni cuentan con evidencias que respalden que la desaparición del CM con estos proce-dimientos tenga una relevancia clínica superior a la inmunofijación.

La utilización de la medida de cadenas ligeras libres de inmuno-globulinas ha proporcionado algunas evidencias sobre el hecho de que la normalización de su cociente supone una ventaja pronóstica relevante. Esto es especialmente atribuible a mielomas Bence Jones, Amiloidosis y MM no secretores, pero las evidencias respecto al mieloma de inmunoglobulina intacta son todavía poco consistentes. En cualquier caso, muchos grupos ya consideran un cociente κ/λ (libres) normal como criterio de respuesta y, de hecho, el Inter-nacional Myeloma Working Group (9) ha definido la Respuesta Completa estricta (RCe), en la que además de los criterios de RC citados anteriormente, se exige la normalización del cociente κ/λ y una inmunohistoquímica negativa en la médula ósea. No obstante, la utilidad de este nivel de respuesta todavía no ha sido validada en estudios multicéntricos, por lo que aunque sería deseable disponer de esta información, hoy por hoy no es todavía obligatoria. Resulta algo similar a lo que sucede con la RC inmunofenotípica y mole-cular, definida por citometría de flujo y por reacción en cadena de la polimerasa o PCR, cuya información parece muy útil (33), pero también necesita ser validada.

3.4. En recaídas o progresiones de pacientes previamente tratados

En estos casos el abordaje es semejante al momento del diagnóstico, por lo que la estrategia debe ser la misma (ver epígrafe 3.1). Sin

embargo, conviene recordar aquí que es posible que se produzcan fenómenos de escape, en los que las células plasmáticas sintetizan menores cantidades de cadenas pesadas pero mantienen la produc-ción de cadenas ligeras (se asiste a un cambio en el componente monoclonal en pacientes bajo seguimiento, generalmente tratados, de inmunoglobulina completa a sólo cadena ligera). Así, puede suceder que aunque parece que el paciente permanece estable (en relación a su CM en suero) en realidad está progresando con un aumento del componente monoclonal a expensas sólo de cadenas ligeras. Por lo tanto, es obligatorio realizar electroforesis e inmunofijación en suero (siendo también altamente recomendable medir las cadenas ligeras libres), y también medir la proteinuria de Bence Jones (34).

4. REQUERIMIENTOS ANALÍTICOS

4.1. Detección del componente monoclonalSea cual sea el método electroforético por el que se opte, existen unos

requisitos mínimos que garantizan una separación de elevada calidad (35):

• visualización de la banda tenue de prealbúmina• detección de ciertos estados de heterozigosis de la α1-antitripsina• visualización de los dos componentes principales de la zona α2

(haptoglobina y α2-macroglobulina)• visualización de los dos principales componentes de la zona

beta (transferrina y C3 nativo)• detección de componentes monoclonales de concentración igual

o inferior a 1 g/L y de oligoclonalidad en la zona gamma

Independientemente del tipo de soporte, y del colorante y del sistema empleado en el caso de usar gel de agarosa, el método seleccionado debe cumplir estas características. La sensibilidad metrológica de la electroforesis capilar es ligeramente superior a la de la electroforesis en gel de agarosa (siempre y cuando no se empleen tinciones espe-cíficas y no se trate de electroforesis de alta resolución). Empleando gel de agarosa y con cualquiera de los colorantes citados anterior-mente o con electroforesis capilar se alcanza la sensibilidad analítica citada previamente. Tal como se ha apuntado, es muy importante la interpretación final del proteinograma por parte de un profesional de laboratorio con experiencia demostrada en la técnica.

La electroforesis en gel de agarosa y la electroforesis capilar cumplen los objetivos analíticos de calidad en cuanto a la impre-cisión analítica de las distintas fracciones del proteinograma. En la tabla IV se expone los valores de la imprecisión analítica deseable y los de la variabilidad biológica (36).

La falta de datos referentes a variabilidad biológica de las cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas en suero dificulta el establecimien-to de estándares analíticos de imprecisión. En los distintos trabajos en los que se cita la imprecisión analítica interserie alcanzada, los coeficientes de variación son inferiores al 11% para ambos tipos de cadenas ligeras (37,38,39) aunque en algún caso (13) se alcanzan valores cercanos al 20%.

4.2. Identificación del componente monoclonalLas guías de práctica clínica de National Academy of Clinical

Biochemistry (NACB) (2) recomiendan que el método de iden-tificación de los CM en suero presente un límite de detección de 0,2 g/L. El límite de detección alcanzado con la IFE (negro amido – azul brillante de Coomassie o violeta ácido) para este tipo de muestra alcanza este nivel de sensibilidad. En el caso de la orina,



la sensibilidad para la detección de CM (esencialmente cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas) debe ser inferior a 10 mg/L.

4.3. Medida del componente monoclonalLas prestaciones analíticas relativas a la densitometría y la elec-

troforesis capilar se corresponden con las expuestas para la electro-foresis en gel de agarosa y la electroforesis capilar, respectivamente.

5. METODOLOGÍA RECOMENDADA

5.1. Detección (cribado) del componente monoclonal

• Indistintamente electroforesis en gel de agarosa o electroforesis capilar.

5.2. Identificación del componente monoclonal• Tanto en suero como en orina, es preferible la inmunofijación

a la inmunosustracción o al inmunotipado (concretamente en CM de baja concentración o en aquellos casos que requieren para su identificación de antisueros frente a IgD, IgE, cadenas ligeras libres).

• La inmunosustracción y el inmunotipado son válidos también para identificar el CM siempre y cuando éste no sea de baja concentración. En la inmunofijación el posible CM detectado por la electroforesis se pone de manifiesto por la reacción con el anticuerpo específico; se evidencia de esta manera una banda mejor coloreada y más fácil de identificar que la banda resultante de la electroforesis. Por el contrario, en la inmunosustración y el inmunotipado, se asiste a una eliminación del posible CM a consecuencia de la reacción con el anticuerpo específico.

5.3. Medida del componente monoclonal• Densitometría (gel de agarosa) o espectrofotometría UV (elec-

troforesis capilar)(preferentemente esta última).

5.4. Estudio en orina• Detección: electroforesis o cribado mediante la medida de

distintas proteínas urinarias.• Identificación: inmunofijación.• Medida: cualquiera de los comentados, si bien la medida por

métodos inmunoquímicos de cadenas ligeras de inmunoglobulinas (libres o totales) permite realizar un seguimiento más objetivo de la cantidad de cadenas ligeras excretada.

5.5. Monitorización de MM en tratamiento• Electroforesis y en caso de que persista el CM, medida del

mismo. Si no se observa CM pasar a la etapa siguiente.

• Inmunofijación: en caso de no visualizarse CM realizar la etapa siguiente.

• Medida de las cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas en suero y cálculo del cociente κ/λ (libres).

5.6. Monitorización de MM quiescentes, GMSI y MM en fase de plateau

• Electroforesis sérica con medida del CM, por densitometría o espectrofotometría asociada a electroforesis capilar.

5.7. Detección de recidivas y casos específicos con escasa síntesis de proteína monoclonal

• Inmunofijación, y en caso de no visualizarse CM saltar a la etapa siguiente.

• Medida de cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas en suero y cálculo del cociente κ/λ (libres).

6. PROPUESTA DE PROTOCOLO DE SEGUIMIENTO

En la figura 1 se muestra una estrategia general aplicable al estudio de los componentes monoclonales en el laboratorio y en la figura 2, una propuesta de seguimiento clínico de las gammapatías monoclonales. No obstante, las pautas de seguimiento clínico y analítico de las GM difieren según se trate de GMSI o de MM. En todos los casos, es recomendable remitir al laboratorio muestra de sangre y de orina a fin de asegurar un estudio exhaustivo.

En el caso de los MM no tratados, debe realizarse un seguimiento del CM cada 1-3-meses si hay alto riesgo de progresión o cada 6 meses si el riesgo es bajo. El estudio bioquímico supone la monitorización del CM mediante electroforesis con posterior medida del CM por densitometría o espectrofotometría UV. No es necesario repetir en cada control analítico la identificación del isotipo (la localización y correcta delimitación del pico en el trazado electroforético, y su medida ajustada son suficientes). Además, suele añadirse la medi-da de la concentración sérica de las inmunoglobulinas A, G y M (a menudo está reprimida la síntesis de las inmunoglobulinas no implicadas en el CM). En orina debe descartarse la presencia de proteinuria de Bence-Jones.

En MM bajo tratamiento, el seguimiento debe realizarse a intervalos de tiempo más reducidos, por norma general a las 4-5 semanas. Una vez alcanzada la respuesta, los controles se pueden espaciar a una determinación cada mes o cada tres meses según el riesgo de progresión. Se recomienda monitorizar el CM mediante electroforesis, añadiendo la inmunofijación si el CM ha desaparecido

Tabla IV. Especificaciones analíticas

CVIntra coeficiente de variación intraindividual - CVInter coeficiente de variación interindividual –CVa coeficiente de variación analítico - ES error sistemático - ET error total

Variación biológica Especificaciones deseablesCVIntra % CVInter % CVa % ES % ET %

Albúmina 3,1 4,2 1,6 1,3 3,9α1 11,4 22,6 5,7 6,3 15,7α2 10,3 12,7 5,2 4,1 12,6β 10,1 9,1 5,1 3,4 11,7γ 14,6 12,3 7,3 4,8 16,8

Figura 1. Propuesta de seguimiento analítico de los componentes monoclonales

Figura 2. Propuesta de seguimiento clínico de las gammapatías monoclonales




del trazado electroforético. En caso de que por ninguno de los dos procedimientos anteriores se ponga de manifiesto la presencia de la proteína monoclonal, se recomienda, aunque no sea obligatorio, me-dir las cadenas ligeras libres de inmunoglobulinas en suero. Conviene además determinar la concentración de las inmunoglobulinas A, G y M, y debe realizarse un estudio de la proteinuria de Bence-Jones.

En las GMSI clínicamente estables el seguimiento se realiza con carácter semestral o anual (según el riesgo de progresión) mediante electroforesis e inmunofijación, inmunosustracción o inmunotipado, y medida del CM por densitometría o espectrofotometría a UV, y se recomienda también determinar la concentración de las inmuno-globulinas A, G y M. Dado que el riesgo de progresión hacia MM sintomático es mayor en pacientes con GMSI con CM de tipo A o M, con concentraciones superiores a 15 g/L, con cociente sérico κ/λ (libres) patológico, con inmunoparesia o con menos de un 5% de plasmocitos medulares normales respecto a plasmocitos totales, se recomienda seguir a los pacientes que cumplan estos requisitos de

manera más continuada, cada 3 a 6 meses. También es altamente recomendable descartar la presencia de proteinuria de Bence-Jones.

Aquellas GM asociadas a otras condiciones clínicas (gammapa-tías monoclonales transitorias y enfermedades relacionadas con la presencia de CM) deben monitorizarse de acuerdo a la enfermedad de base en cuestión, requiriendo normalmente de electroforesis e identificación. En las GM transitorias, la desaparición progresiva del CM obliga a utilizar alguna técnica inmunoquímica de identificación (preferentemente inmunofijación) para confirmar definitivamente la normalización del trazado electroforético. En caso de que los controles se efectúen anualmente, sólo se recomienda repetir la inmunofijación si el pico monoclonal no se visualiza con facilidad en la electroforesis.

7. CONCLUSIONES

La contribución del laboratorio al estudio de las gammapatías monoclonales es determinante para su correcto diagnóstico y se-guimiento. Las opciones analíticas empleadas para el diagnóstico y la monitorización de las GM pueden resumirse en dos grandes metodologías: electroforesis e inmunofijación. Ambos tipos de estudios analíticos son imprescindibles para poder categorizar ade-cuadamente la gammapatía monoclonal en función del isotipo de inmunoglobulina y de la concentración del componente monoclonal.

Una vez diagnosticada la gammapatía monoclonal, no siempre es necesario pasar nuevamente por ambas etapas (detección e identifi-cación). Así, mientras no varíe el CM detectado en la electroforesis (ni en su morfología ni en su concentración), no es necesario repetir sistemáticamente el estudio inmunoquímico de identificación (in-munofijación, inmunosustracción o inmunotipado).

En los casos en que se aprecie una disminución marcada del CM, o en los que el CM se halle ya desde su inicio en una baja concen-tración, así como en la valoración de la respuesta al tratamiento es imprescindible realizar el estudio inmunoquímico (inmunofijación, inmunosustracción o inmunotipado), pudiéndose quizás obviar en estos casos la electroforesis convencional en los controles posteriores. Para poder confirmar la ausencia del CM, es obligatorio disponer de una inmunofijación negativa, ya que ésta es la técnica más sensible y la única que ha demostrado utilidad clínica contrastada.

Por otra parte, el estudio de la proteína monoclonal en orina es obligatorio.

Además, puesto que en las gammapatías monoclonales la pérdida del control sobre la regulación de la síntesis normal de inmunoglobulinas queda reflejada por la alteración del cociente sérico κ/λ (libres), la medida de dichas cadenas ligeras constituye una opción recomendable en aquellas situaciones en las que la proteína monoclonal sintetizada tiene una concentración muy baja (MM no secretor y oligosecretor, MM Bence Jones, Amiloidosis AL, algunos plasmocitomas. Síndrome de POEMS y MM en re-misión). La presencia de un cociente κ/λ (libres) alterado en estas situaciones permite mantener un elevado índice de sospecha sobre la persistencia de la proteína monoclonal y por lo tanto, podría ser un criterio de respuesta y un factor pronóstico.

8. BIBLIOGRAFÍA

1. The International Myeloma Working Group. Criteria for the classification of monoclonal gammopathies, multiple myeloma and related disorders: a report of the International Myeloma Working Group. Br J Haematol 2003; 121: 749-57.

Figura 1. Propuesta de seguimiento analítico de los componentes monoclonales

Figura 2. Propuesta de seguimiento clínico de las gammapatías monoclonales



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Recomendaciones para la calibración de material volumétrico en el laboratorio clínico*

Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular (SEQC) Comité CientíficoComisión de MetrologíaDocumento E. Fase 3. Versión 2

Preparado por: R. Ruíz Morer

Composición de la Comisión: J. Batista Castellví, F. Canalias Reverter, FJ. Gella Tomás, B. González de la Presa, R. Ruíz Morer, M. Sánchez Manrique (Presidenta)

* Este documento se publicó en su primera versión en Quim Clin 2006; 25:104-110, con varios errores que se explicaban en una fe de erratas posteriormente publicada en Quim Clin 2007; 26:85. Esta segunda versión difiere de la primera únicamente en que se han corregido los errores mencionados.

Índice

0 Introducción1 Objeto y campo de aplicación2 Normas para consulta3 Definiciones4 Requisitos metrológicos: criterios de aceptación5 Procedimiento 5.1 Patrones 5.2 Condiciones ambientales 5.3 Procedimiento de calibración 5.4 Cálculo del error sistemático y de la incertidumbre de medida 5.5 Frecuencia de calibración6 Aplicaciones7 BibliografíaAnexo 1. Cálculo de la incertidumbre

0 Introducción

Las pipetas que se utilizan para la dispensación de volúmenes que pudieran afectar, directa o indirectamente, la calidad de los resultados generados en el laboratorio, deberían estar apropiada-mente calibradas.

Según las normas para la gestión de la calidad ISO 15189 e ISO 9001, los laboratorios clínicos deben establecer una pro-gramación que controle y demuestre periódicamente que sus instrumentos de medida se encuentran calibrados y mantener documentos que describan los procedimientos de calibración y los criterios de aceptación, así como informes que contengan datos de las calibraciones efectuadas.

1 Objeto y campo de aplicación

La presente recomendación describe un procedimiento gravimé-trico para la calibración de pipetas y dispensadores mecánicos, de volúmenes superiores a 0,05 mL 2.

2 Normas para consulta

• Asociación Española de Normalización. Aparatos volumétri-cos accionados mediante pistón. Parte 1: Terminología, requisitos generales y recomendaciones de uso. UNE-EN-ISO 8655-1: 2002. Madrid: AENOR; 2002.

• Asociación Española de Normalización. Aparatos volumétricos accionados mediante pistón. Parte 2: Pipetas tipo pistón. UNE-EN-ISO 8655-2: 2002. Madrid: AENOR; 2002.

• Asociación Española de Normalización. Aparatos volumétricos accionados mediante pistón. Parte 5: Dispensadores. UNE-EN-ISO 8655-5: 2002. Madrid: AENOR; 2002.

• Asociación Española de Normalización. Aparatos volumétricos accionados mediante pistón. Parte 6: Métodos gravimétricos para la determinación del error de medición. UNE-EN-ISO 8655-6: 2002. Madrid: AENOR; 2002.

• Asociación Española de Normalización. Laboratorios Clínicos. Requisitos particulares relativos a la calidad y la competencia. UNE-EN-ISO 15189: 2003. Madrid: AENOR; 2003.

• Asociación Española de Normalización. Sistemas de gestión de la calidad. Requisitos. UNE-EN-ISO 9001:2000. Madrid: AENOR; 2000.

• Centro Español de Metrología. Vocabulario internacional de términos fundamentales y generales de metrología (VIM). Madrid: Ministerio de Obras Públicas, Transportes y Medio Ambiente; 1994.

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• Entidad Nacional de Acreditación. Expresión de la incertidum-bre de medida en las calibraciones. CEA-ENAC-LC/02 (Rev.1). Madrid: ENAC; 1998

• Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular. Comité Científico. Comisión de Metrología. Recomendaciones para la calibración de balanzas y para la estimación de la incertidumbre de las medidas de masa en el laboratorio clínico. Barcelona: Quim. Clín. 2004; 23: 35-39.

3 Definiciones

3.1. CalibraciónConjunto de operaciones que establecen, en condiciones especi-

ficadas, la relación entre los valores de una magnitud indicados por un instrumento de medida o un sistema de medida, o los valores representados por una medida materializada o por un material de referencia, y los valores correspondientes de esa magnitud realizados por patrones (VIM).

NOTA: En el caso de material volumétrico, es el conjunto de operaciones que establecen la relación entre el volumen dispensado y el volumen nominal o seleccionado correspondiente del aparato (ISO).

3.2. Error máximo permitido (de un instrumento de medida)

Valor extremo de un error permitido por especificaciones, regla-mentos, etc., para un instrumento de medida dado (VIM).

NOTA: En el caso de material volumétrico, es el valor extremo su-perior o inferior permitido para la desviación del volumen dispensado a partir del volumen nominal o el volumen seleccionado de un aparato volumétrico accionado mediante pistón (ISO).

3.3. Error sistemáticoMedia que resultaría de un número infinito de medidas del mismo

mensurando realizadas bajo condiciones de repetibilidad menos un valor verdadero del mensurando (VIM).

NOTA: En el caso de material volumétrico, es la diferencia entre el volumen dispensado y el volumen nominal o volumen seleccionado de un aparato volumétrico accionado mediante pistón (ISO).

3.4. Exactitud (de un instrumento de medida)Aptitud de un instrumento de medida para dar respuestas próximas

a un valor verdadero (VIM).

3.5. ImprecisiónCoeficiente de variación de un conjunto de resultados obtenidos al

medir repetidamente un mensurando con un mismo procedimiento de medida.

3.6. Incertidumbre de medidaParámetro, asociado al resultado de una medición, que caracte-


3.7. Intervalo de medidaMódulo de la diferencia entre dos límites de un rango nominal (VIM)

3.8. PatrónMedida materializada, instrumento de medida, material de referen-

cia o sistema de medida destinado a definir, conservar o reproducir una unidad o uno o varios valores de una magnitud para que sirvan de referencia (VIM).

3.9. Rango de indicaciónConjunto de valores limitado por las indicaciones extremas (VIM).

3.10. ResoluciónLa menor diferencia de indicación de un dispositivo visualizador

que puede percibirse de forma significativa (VIM).

3.11. TrazabilidadPropiedad del resultado de una medición o de un patrón tal que

pueda relacionarse con referencias determinadas, generalmente a patrones nacionales o internacionales, por medio de una cadena ininterrumpida de comparaciones teniendo todas las incertidumbres determinadas (VIM).

3.12. Valor nominalValor redondeado o aproximado de una característica de un

instrumento de medida que sirve de guía para su utilización (VIM).

4. Requisitos metrológicos: criterios de aceptación

El error máximo de medida de volumen permitido (EMP) en el laboratorio clínico depende sustancialmente del objeto de la medi-ción. De forma general pueden establecerse las siguientes categorías:

A. Mediciones de volumen que pueden afectar al valor de una magnitud de un patrón/calibrador o relacionadas con un proceso de calibración. Por ejemplo, en la reconstitución de un calibrador liofilizado.

B. Mediciones de volumen que pueden afectar al valor de una magnitud de un material de control o relacionadas con procesos de control/verificación. Por ejemplo, en la reconstitución de un control liofilizado

C. Mediciones de volumen que pueden afectar el valor de una magnitud de una muestra. Por ejemplo, en procedimientos de medida manuales o dilución de una muestra para su reproceso

D. Otras mediciones de volumen. Por ejemplo, en la preparación de disoluciones de reactivos.

Teniendo en cuenta el estado actual de la tecnología de los instru-mentos para la dispensación de volumen utilizables en los laboratorios clínicos, se recomiendan los requisitos para el error máximo permitido de las mediciones de volumen que se muestran en la siguiente tabla. Estos valores deben considerarse como una aproximación razonable y aplicable a muchas situaciones del laboratorio clínico. No obstante, determinadas circunstancias pueden exigir requisitos más o menos estrictos que los aquí recomendados.

2 Para volúmenes inferiores a 0,05 mL, la evaporación durante el proceso de calibración debe ser compensada por cálculo o tomar medidas adicionales para evitarla.

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Recomendaciones para la calibración de material volumétrico

5.4. Cálculo del error sistemático y de la incertidumbre de medida

a) Los cálculos se realizan individualmente para cada uno de los puntos de calibración4.

b) Calcular el valor medio (vm) y la desviación típica (si) de cada serie de 10 medidas.

c) Calcular el error sistemático relativo (ESrel), expresado en %, restando el valor nominal (vn) de la media obtenida para dicho volumen, y dividiendo posteriormente por el valor nominal.

d) Calcular la incertidumbre relativa combinada expandida para una probabilidad de cobertura de aproximadamente el 95% (Urel), expresada en %:

En el ANEXO-1 se detalla el origen de los términos de esta ecuación.e) Evaluar los resultados. La suma del valor absoluto de

ESrel con la Urel debe ser inferior o igual al error máximo per-mitido. Estas condiciones son aplicables a todos los puntos de calibración.

5.5. Frecuencia de calibraciónSe recomienda calibrar las pipetas y dispensadores cada 3 meses.También deberían calibrarse siempre que exista alguna sos-

pecha de funcionamiento incorrecto o de haber sido sometidas a algún trato inadecuado u otra situación que pueda comprometer su funcionamiento.

6. Aplicaciones

El proceso de calibración de las pipetas y dispensadores permite obtener evidencia objetiva de que, cuando se utiliza el instrumento para efectuar dispensaciones de volumen, no se cometen errores inadmisibles, esto es, superiores el error máximo permitido.

Es posible que, en el caso de las pipetas de volumen variable, se obtengan resultados insatisfactorios en alguno de los puntos de calibración (por ejemplo en el volumen de valor más bajo). Esto no cuestiona todas las mediciones que se efectuaron con anterioridad con la misma pipeta, sino tan sólo aquéllas cerca-nas al punto de calibración para el que se obtuvieron resultados anómalos. La pipeta puede utilizarse restringiendo su intervalo de medida o variando el error máximo permitido en función de la escala de medida.

7. Bibliografía

• Dybkaer R. Vocabulary for use in measurement procedures and description of reference materials inlaboratory medicine. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1997; 35:141-173.

categoría EMP (%)A 1B 2C 3D 5

Para cada pipeta o dispensador del laboratorio deben establecerse las medidas que con dicho instrumento se efectúan y asignarle como error máximo permitido el más estricto de las categorías de medida que se realizan con el mismo. El error máximo permitido se utilizará como criterio de aceptación de las calibraciones.

5. Procedimiento

5.1. PatronesPara la calibración de las pipetas debe utilizarse como patrón

una balanza previamente calibrada y de resolución adecuada para el volumen de la pipeta a calibrar.

La balanza puede ser calibrada por el propio laboratorio clí-nico3 o por una empresa externa, en cuyo caso la calibración debe acompañarse de un certificado de calibración expedido por un laboratorio acreditado o un instituto nacional de metrología, debiendo constar en dicho certificado la trazabilidad al patrón nacional, la incertidumbre expandida y el factor (o probabilidad) de cobertura que se ha utilizado en el cálculo de la incertidumbre expandida.

5.2. Condiciones ambientalesDeben evitarse situaciones ambientales extremas, procurando

que la calibración se realice bajo condiciones similares a las de uso de la pipeta. Evitar las corrientes de aire y reducir en lo posible la duración de la ejecución de las medidas u otras condiciones que pudieran favorecer la evaporación.

5.3. Procedimiento de calibraciónCuando la pipeta es de volumen variable, seleccionar para la

calibración el volumen mínimo, el volumen máximo y un volumen intermedio, y para cada uno de ellos proceder como sigue:

a) Antes de realizar la calibración debe llevarse a cabo una ins-pección visual de la balanza, comprobar que esté adecuadamente calibrada y llevar a cabo su limpieza, si es oportuno.

b) Colocar el recipiente de pesada en el plato de la balanza, pesarlo y anotar el valor de la tara (que se tendrá en cuenta para seleccionar la incertidumbre expandida correspondiente al punto de calibración de la balanza más cercano a la masa total que se mide). Realizar un ajuste a 0 de la tara.

c) Dispensar el volumen de agua destilada correspondiente al volumen nominal de la pipeta en el recipiente y anotar el valor de la pesada.

d) Repetir el apartado c 10 veces consecutivas.

3 Ver documento "Recomendaciones para la calibración de balanzas y para la estimación de la incertidumbre de masa en el laboratorio clínico.4 La Comisión de Metrología de la SEQC ha preparado una hoja de cálculo apropiada para estos fines y que puede ser obtenida en el sitio de la Comisión de Metrología de la web de la Sociedad

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Anexo 1. Cálculo de la incertidumbre

Las medidas realizadas con la pipeta, tienen las siguientes fuentes de incertidumbre (u):

a) Incertidumbre debida a la medida (ui). Los errores aleatorios de dispensación originan imprecisión en las medidas. Este componente de la incertidumbre puede ser calculado a partir de la desviación típica de las medidas repetidas (si).

ui = si

b) Incertidumbre debida a la resolución (ur). La resolución (r) de la pipeta ocasiona errores aleatorios de redondeo. La amplitud de la distribución de los posibles errores es igual a la resolución y, en ese intervalo, cualquier valor tiene las mismas probabilidades de producirse (distribución rectangular o uniforme). En este tipo de distribución, la desviación típica (sr) es igual a la amplitud de la distribución dividida por la raíz cuadrada de 12.

(En las pipetas de volumen fijo, el valor de resolución es 0).

c) Incertidumbre debida al patrón (up). Se calcula a partir de los datos que proporciona el certificado de calibración de la balanza: la incertidumbre expandida (Up) del punto de calibración de la balanza

5 En caso de disponer únicamente del valor de la incertidumbre relativa y expandida (Urel) respecto al punto de calibración de la balanza requerido, calcular Up mediante: Up = valor masa x Urel/100.6 Teniendo en cuenta el tamaño habitual del EMP, se ha considerado despreciable la diferencia entre volumen medido y el valor nominal.

más cercano a la masa total que se mide (incluyendo recipiente)5, generalmente para el 95% de confianza, y el valor del factor de cobertura empleado (habitualmente kp = 2)

d) Otros componentes de la incertidumbre, como el ocasionado por la presión del aire y la densidad del agua, pueden ser ignorados por su escasa relevancia en las aplicaciones habituales del laboratorio clínico.

La incertidumbre combinada típica (uc) puede calcularse a partir de la suma de cuadrados de las incertidumbres de cada componente:

y la incertidumbre combinada expandida (Uc) para el intervalo de confianza de aproximadamente el 95% resulta de multiplicar la anterior por el factor de cobertura 2.

Finalmente, la incertidumbre relativa combinada expandida (Urel) resulta de dividir la incertidumbre absoluta combinada expandida por el valor medio medido de cada punto de calibración (vm)6 y, multiplicándola por 100, se expresa en porcentaje.

Urel

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Sociedad Española de Bioquímica Clínicay Patología Molecular

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