UNIVERSIDAD DE COLIMADOCTORADO EN CIENCIAS: AREA CIENCIAS AGRICOLAS Y

FORESTALES

EFECTO DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO ENLOS PROCESOS DE ORGANOGÉNESIS Y

EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DE AGUACATE(Persea americana Mill . )

TESIS

Que para obtener el grado deDOCTOR EN CIENCIAS:

ÁREA CIENCIAS AGRÍCOLAS Y FORESTALES

Presenta:IGNACIO VIDALES FERNÁNDEZ

Asesores:DR. RAFAEL SALGADO GARCIGLIA

DR. MIGUEL ÁNGEL GÓMEZ LIM

TECOMÁN, COLIMA, MÉXICO. NOVIEMBRE DEL 2002

UNIVERSIDAD DE COLIMA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS

OFICIO No. 590/2002.

C. IGNACIO VIDALES FERNÁNDEZEGRESADO DEL DOCTORADO EN CIENCIASÁREA: CIENCIAS AGRICOLAS Y FORESTALESPRESENTE.

Con fundamento en el dictamen emitido por el jurado revisor del colegiado del área: deCiencias Agrícolas y Forestales de esta Facultad a mi cargo, de su trabajo de tesis de Doctorado yen virtud de que efectuó las correcciones y acató las sugerencias que le habían indicado losintegrantes del mismo, se le autoriza la impresión de la tesis " Efecto de los reguladores decrecimiento en los procesos de organogénesis y embriogénesis somática de aguacate (Perseaamericana Mill) ", misma que ha sido dirigida por los C.C. Dr. Rafael Salgado Garciglia,Profesor Investigador de la UMSNH.

Este documento reunió todas las características apropiadas como requisito parcial paraobtener el grado de Doctor en Ciencias; Area: Ciencias Agrícolas y Forestales y fue revisado encuanto a forma y contenido por los C.C. Dr. Miguel A. Gómez Lim, CINVESTAV-IPN UnidadIrapuato, Dr. Joel E. López Meza, Profesor- Investigador de la UMSNH, Dr. Roberto LezamaGutierrez y el Dr. Alfonso Pescador Rubio, Profesores-Investigadores de la Universidad deColima.

Sin otro particular de momento, me despido de usted muy cordialmente.

AGRADECIMIENTOS

Al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, a la

Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo y al Centro de Investigación y de

Estudios Avanzados del IPN por las facilidades proporcionadas para desarrollar la

presente investigación.

A la Fundación Produce Michoacán, A.C. por el apoyo económico en mis estudios de

doctorado y en la investigación que se presenta.

Mi profunda gratitud y reconocimiento al Dr. Rafael Salgado Garciglia por sus

consejos, orientaciones y excelente asesoría en el desarrollo de la tesis.

Al Dr. Miguel Ángel Gómez Lim por su apoyo en la interacción con investigadores

como el Dr. Richard E. Litz y Fernando Pliego Alfaro, así como en sus sugerencias y

asesoría en la tesis.

A los Doctores Joel Edmundo López Meza, Alfonso Pescador Rubio y Roberto

Lezama Gutiérrez por sus comentarios y sugerencias que indudablemente

enriquecieron el escrito final.

A todos mis compañeros del PICAF, muy especialmente a mi hermano José Agustín

Vidales Fernández y amigos Ercelia Ángel Palomares, Jesús García Magaña y Mario

Aguilar Ramírez, con quienes compartimos cursos, exámenes y horas de desvelo.

A mis compañeros del Campo Experimental Uruapan particularmente a los M.C. José

de la Luz Sánchez Pérez, José Alvarez Silva, José Luis Aguilera Montañez y José Luis

Rocha Arroyo, así como al Dr. Héctor Guillén Andrade y a la Sra. Evelia Capiz Villa,

por su apoyo y consejos.

DEDICATORIA

A MI REYNA Y QUERIDA COMPAÑERA:

Por su apoyo, comprensión y paciencia en los momentos

difíciles de la vida.

A MIS HIJOS:

CARLOS ALBERTO, CONSTANZA Y JUDITH

Por ser mi fortaleza y la razón de mi superación.

A MIS ABUELITOS Y PADRES:

IGNACIO (q.e.p.d.) Y JUANITA (q.e.p.d.); AGUSTÍN (q.e.p.d.) Y

ELVIRA

Por ser mi guía en el camino de la vida.

A MIS HERMANOS:

AGUSTÍN, GUADALUPE, ENRIQUE, ROSA, JOSÉ, ELVIRA, JESÚS,

HERLINDA, JUAN Y ADELAIDA.

Por la gran familia y unión que formamos.

CONTENIDO

Página

LISTA DE CUADROS i

LISTA DE FIGURAS iv

RESUMEN vii

SUMMARY viii

I. INTRODUCCIÓN 1

Hipótesis 5

Objetivo 5

II. REVISIÓN DE LITERATURA 7

2.1. Hormonas y reguladores de crecimiento 7

2.1.1. Auxinas 7

2.1.2. Citocininas 12

2.1.3. Giberelinas 17

2.1.4. Otras hormonas y reguladores de crecimiento 21

2.2. Bases moleculares de la acción hormonal 24

2.3. Micropropagación 31

2.3.1. Organogénesis 33

2.3.1.1. Organogénesis en aguacate 34

2.3.2. Embriogénesis somática 42

2.3.2.1. Embriogénesis somática en aguacate 45

2.4. Factores que intervienen en la morfogénesis in vitro 52

2.4.1. Inóculo o explante 53

2.4.2. Factores físicos 53

2.4.3. Factores químicos 55

Página

III. MATERIALES Y MÉTODOS 62

3.1. Localización del sitio de investigación 62

3.2. Material biológico 62

3.3. Reactivos utilizados 62

3.4. Organogénesís de aguacate criollo 63

3.4.1. Definición de las condiciones asépticas del explante 63

3.4.2. Prevención de necrosis del explante 64

3.4.3. Tipos y dosis de reguladores de crecimiento y otros

compuestos del medio de cultivo para lograr la

organogénesis in vitro de aguacate criollo 65

3.4.3.1. Inducción de brotes 65

3.4.3.2 Multiplicación de brotes obtenidos in vitro 67

3.4.3.3. Enraizamiento de brotes obtenidos in vitro 67

3.4.4. Aclimatación de plántulas de aguacate obtenidas

in vitro 68

3.5. Embriogénesis somática de aguacate cv. Hass 70

3.5.1. Desinfección de frutos y procedimientos de extracción

de la nucela 70

3.5.2. Productos y procedimientos para evitar la necrosis

oxidación de la nucela 70

3.5.3. Tipo y dosis de reguladores de crecimiento, para lograr

la embriogénesis somática de aguacate cv. Hass 71

3.5.3.1. Generación de callo embriogénico 71

3.5.3.2. Multiplicación y desarrollo de embriones

somáticos 71

3.5.3.3 Maduración de embriones somáticos 72

3.5.3.3.1. Análisis de almidón y glucosa de

embriones somáticos maduros 72

3.5.3.4. Germinación de embriones somáticos 73

Página

3.6. Condiciones de incubación de los explantes 74

3.7. Análisis estadístico 75

IV. RESULTADOS 76

4.1. Organogénesis de aguacate criollo 76

4.1.1. Desinfección externa 76

4.1.2. Desinfección interna 76

4.1.3. Prevención de necrosis del explante 80

4.1.4. Efecto de los reguladores de crecimiento y otros

compuestos del medio de cultivo en la organogénesis

in vitro de aguacate criollo 82

4.1.4.1. Iniciación o establecimiento in vitro de yemas

axilares 82

4.1.4.2. Multiplicación de brotes 85

4.1.4.3. Enraizamiento de brotes 92

4.1.5. Aclimatación de plántulas de aguacate criollo

obtenidas in vitro 94

4.2. Embriogénesis somática de aguacate cv. Hass 98

4.2.1. Efecto del ácido ascórbico, cisteína y luz en la

necrosis del tejido nucelar 98

4.2.2. Efecto de los reguladores de crecimiento y otros

componentes del medio de cultivo en la

embriogénesis somática 100

4.2.2.1. Inducción de callo embriogénico 100

4.2.2.2. Multiplicación y desarrollo de embriones

somáticos 102

4.2.2.3. Maduración de embriones somáticos 106

Página

4.2.2.3.1. Análisis de almidón y glucosa de

embriones somáticos maduros 110

4.2.2.4. Germinación de embriones somáticos maduros 110

V. DISCUSIÓN 113

5.1. Organogénesis de aguacate criollo 113

5.1.1. Condiciones óptimas de asepsia para el establecimiento

in vitro de yemas axilares de aguacate. 113

5.1.2. Prevención de necrosis de yemas axilares de aguacate. 114

5.1.3. Reguladores de crecimiento y otros compuestos del

medio de cultivo en la organogénesis in vitro de

aguacate. 114

5.2. Embriogénesis somática de aguacate cv. Hass 119

5.2.1. Prevención de necrosis de tejido nucelar de aguacate 119

5.2.2. Reguladores de crecimiento y otros compuestos del

medio de cultivo en la embriogénesis somática de

aguacate. 120

VI. CONCLUSIONES 125

VII. LITERATURA CITADA 126

ANEXOS 141

LISTA DE CUADROS

Cuadro No. Página1 Embriogénesis somática en frutales perennes y otras

especies de cultivo. 46

2 Respuesta al ambiente en la micropropagación convencional.16

3 Tratamientos evaluados en el estudio sobre concentración desales minerales MS, WPM y McCown's, en la fase deinducción de brotes. 66

4 Composición de sales minerales MS y modificadas enmacroelementos, utilizadas en pruebas de multiplicación yenraizamiento in vitro de brotes de aguacate. 68

5 Tratamientos evaluados en las nueve pruebas de aclimataciónde brotes de aguacate criollo obtenidos in vitro.

69

6 Porcentaje de contaminación y necrosis de yemas axilares deaguacate criollo a los 12 días del establecimiento en dosmedios de cultivo (A y B), en la prueba de dosis de Benlate.

77

7 Porcentaje de contaminación de yemas axilares de aguacatecriollo a diferentes días después del establecimiento portratamiento para permanencia continua y en etapas derecultivo a medio sin plaguicidas. 78

8 Porcentaje de contaminación y necrosis de yemas axilares deaguacate criollo a diferentes días después del establecimientopor tratamiento para permanencia continua con dosseveridades de desinfección superficial y en etapas derecultivo a medio sin plaguicidas. 79

9 Porcentaje de contaminación de yemas axilares de aguacatecriollo a 7 y 14 días del establecimiento, en estudio depretratamiento de explantes en solución con Benlate másAgrimicin 100 a diferentes tiempos de permanencia.

80

i

PáginaCuadro No.

10 Porcentaje de necrosis y brotación de yemas axilares deaguacate criollo por tratamiento en el estudio depretratamiento del explante con ácido ascórbico. 81

11 Porcentaje de brotación de yemas axilares de aguacate criolloa diferentes días por tratamiento en estudio sobreconcentración de tres sales minerales. 83

12 Prueba de comparación de medias (Tukey α = 0.01) para lavariable longitud del brote (mm) de yemas axilares deaguacate criollo, a los 127 días del establecimiento. 85

13 Número de brotes por explante y longitud del brote deaguacate criollo en los tratamientos de la interacción BA-AIBen sales modificadas completas (MS 100%) y MS 1/2 de suconcentración. 86

14 Comparación de medias Tukey (α = 0.05) en la variablenúmero de brotes promedio por frasco de aguacate criollo alos 25 y 85 días, en tratamiento con reguladores BA-AIB.

88

15 Comparación de medias Tukey (α = 0.05) en la variablelongitud promedio de brote de yemas axilares in vitro deaguacate criollo a los 85 días, en tratamientos conreguladores de crecimiento (BA-AIB). 89

16 Características cualitativas de los brotes in vitro de aguacatecriollo en los diferentes tratamientos a los 85 días delestablecimiento, en tratamientos con reguladores decrecimiento (BA-AIB). 90

17 Comparación de medias Tukey (α = 0.05) en la variablelongitud de raíz por brote de aguacate criollo a los 54 y 88 días,en prueba de enraizamiento de brotes in vitro con AIB einteracción AIB AG3. 93

18 Respuesta al enraizamiento de los brotes de aguacate criolloobtenidos in vitro a los 88 días del establecimiento, en pruebade dosis de AIB e interacción AIB-AG3. 93

19 Porcentaje de supervivencia de plántulas de aguacate en elestudio de dosis de Folicote. 96

ii

PáginaCuadro No.

20 Porcentaje de supervivencia de plántulas de aguacate en elestudio de preaclimatación con filtro bacteriológico encomparación a Folicote. 96

21 Prueba de comparación de medias Tukey (α = 0.05) en lavariable frecuencia de estomas en hojas de aguacate criollo.

97

22 Porcentaje de necrosis en tejido nucelar de aguacate cv. Hassen diferentes tratamientos de antioxidantes e intensidad deluz. 99

23 Porcentaje de formación de callo embriogénico en tejidonucelar de aguacate cv. Hass, color y diámetro en lostratamientos donde se formaron las estructurasembriogénicas. 101

24 Número de estructuras embrionarias (globulares yacorazonados) en callos de aguacate cv. Hass a los 20 díasdel establecimiento. Significancia estadística Tukey (α = 0.01). 104

25 Número y porcentajes de viabilidad de estructurasembrionarias de aguacate cv. Hass en sus diferentes fases,por cada 10 ml de medio, a los 20 días de cultivo. 106

26 Promedio de embriones somáticos maduros de aguacate cv.Hass por caja de petri, a los 36 días. Significancia estadísticaTukey (α = 0.01). 108

27 Promedio de embriones somáticos maduros de aguacate cv.Hass por caja de petri a los 23 días. Significancia estadísticaTukey (α = 0.01). 108

iii

LISTA DE FIGURAS

Figura No. Página1 Factores que pueden influir en el crecimiento y morfogénesis

de las plantas in vitro. 60

2 Número de brotes laterales en yemas axilares in vitro deaguacate criollo en MS 20% de sus sales, a los 127 días desu cultivo. 83

3 Crecimiento promedio (mm) del brote principal en yemasaxilares in vitro de aguacate en diferentes tratamientosevaluados y a 55, 72, 86, 100, 117 y 127 días delestablecimiento, estudio de concentración de tres salesminerales. 84

4 Brotes en yemas axilares in vitro de aguacate criollo conformación de callo en la base del explante y hojas deformes(MS 100% y BA 0.9 mg/I). 88

5 Brotes de aguacate criollo a partir de yemas axilares in vitrocon la mayor longitud de brote (MS 100%, sin reguladores). 90

6 Brotes de aguacate criollo a partir de yemas axilares in vitro,de color verde oscuro en el tratamiento 2 (MS 100% y 0.3 mg/lde BA). 91

7 Enraizamiento in vitro de brotes de aguacate criollo (MS 100%y 0.4 mg/1 de AIB), en prueba de dosis de AIB e interacciónAIB-AG3. 94

8 Plántulas de aguacate criollo micropropagadas en la fase detrasplante y aclimatación, tratadas con Folicote (ceras) 1 parteen 20 de agua. 95

9 Estomas de hojas de aguacate criollo árbol adulto (A) yde plántulas micropropagadas (B). 97

10 Tejido nucelar in vitro de aguacate cv. Hass sin necrosis(MS 50% y picloram 2 mg/I). 99

11 Callo embriogénico de aguacate cv. Hass (MS completo y 1012 mg/1 de picloram), después de 40 días de cultivo.

iv

Figura No. Página12 Necrosis en callo embriogénico de aguacate cv. Hass,

después de 60 días de cultivo. 102

13 Masas proembriogénicas (MPE) y estructuras globulares (EG)de aguacate cv. Hass a los 20 días del recultivo (MS 100% sinreguladores de crecimiento). 103

14 Estructuras embriogénicas acorazonados (EA) y en fase detorpedo (ET) en callos de aguacate cv. Hass, a los 20 días delrecultivo (MS 100% con 400 mg/1 de caseína). 105

15 Embriones somáticos maduros de aguacate cv. Hass (MS100% y 20 g/I de agar); A, a los 35 días del recultivo; B, a 40días del recultivo. 109

16 Embriones somáticos de aguacate cv. Hass para sugerminación en frascos de cultivo tipo magenta, en laspruebas de dosis adenina y tiempos de inmersión. 111

17 Germinación de embriones somáticos de aguacate cv. Hass;A, emisión de brotes en medio MS con BA-AIB (0.4-0.01 mg/I),a los 32 días; B, emisión de raíces en medio MS con BA-2,4-D(0.1-0.05 mg/l), a 55 días. 111

18 Plántula de aguacate cv. Hass a partir de embrión somáticoen medio MS con 0.3 mg/I de BA, después del recultivo previopor 90 días en medio con sales de Anderson modificadas ysin reguladores de crecimiento. 112

v

EFECTO DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO EN LOSPROCESOS DE ORGANOGÉNESIS Y EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA

DE AGUACATE(Persea americana Mill.)

Ignacio Vidales Fernández

Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima,Apartado postal No. 36, C.P. 28100, Tecomán, Colima, México

RESUMEN

El efecto de los reguladores de crecimiento sobre la morfogénesis in vitro deaguacate fue estudiado. La organogénesis se estableció en yemas axilares deaguacate criollo raza mexicana (Persea americana Mill. var. drymifolía), se logró laformación de brotes en MS 20% con 2 mg/1 de BA y 0.2 mg/l de AIB, mientras que labrotación múltiple en MS 100% con 0.3 mg/1 BA; el enraizamiento de los brotes fuehasta del 44.4% con 0.4 mg/1 de AIB; la aclimatación al 100% de supervivencia fue conla aplicación de ceras. La inducción de embriogénesis somática se obtuvo con tejidonucelar de aguacate cv. Hass, se generó callo embriogénico (MS 50%, 4 mg/Ide picloram y 0.4 mg/1 de AIB), multiplicación de masas proembriogénicas (MS 100%,sin reguladores de crecimiento), desarrollo de embriones somáticos (MS,con 400 mg/1 de caseína hidrolizada), maduración de embriones somáticos (MS, con 20g/I de agar-agar), y la germinación de éstos (10%) bajo un cultivo de dos fases:primero en un medio bajo en nitratos y sin reguladores; y posteriormente en medioMS con 0.3 mg/1 de BA.

PALABRAS CLAVE: Organogénesis, embriogénesis somática, aguacate,reguladores de crecimiento.

vii

SUMMARY

The effect of plant growth regulators on morphogenesis of avocado was studied. Theorganogenesis was established with axillary buds of avocado Mexican race (Perseaamericana Mill. var. drymifolia), the sprout buds in MS 20%, with BA and IBA at 2 and0.2 mg/1 each, while a multiple budding was obtained in MS 100% and BA 0.3 mg/I;sprouts rooting were 44.4% with IBA at 0.4 mg/l; the acclimatization at 100% survivalwas obtained with wax foliar applied. Somatic embryogenesis was induced withnucellar tissue of cv. Hass avocado, embryogenic callus was obtained (MS 50%,4 mg/l of picloram and 0.4 mg/1 of IBA), proembryogenic masses multiplication (MS100%, without plant growth regulators), developed somatic embryos (MS withhydrolyzed casein 400 mg/I); mature embryos (MS with agar-agar 20 g/I), and theembryos germination was 10%, with two phase culture: first in a Iow nitrate mediumwithout regulators; and after culturing in MS with BA 0.3 mgll.

KEY WORDS: Organogenesis, somatic embryogenesis, avocado, plant growthregulators.

viii

I. INTRODUCCIÓN

Por el tipo de polinización cruzada altamente heterocigótica que tiene el

aguacate (Persea americana Miller), en el sistema común de reproducción masiva no

se garantiza la pureza genética del patrón o portainjerto, solamente del injerto, por su

incremento vegetativo con la utilización de tejido somático. De ahí que resulte

imposible a través de la semilla multiplicar portaínjertos sobresalientes por sus

características agronómicas, desde el punto de vista de la perpetuación de los genes

deseables.

El germoplasma de aguacate que se ha seleccionado por su tolerancia a

enfermedades de la raíz, como Phytophthora cinnamomi Rands (KÖhne, 1992)

tradicionalmente se ha propagado con la técnica de Frolich (Frolich y Platt, 1972), un

procedimiento que requiere un injerto en patrón nodriza y etiolación del brote a

enraizar.

El aguacate presenta enfermedades severas que en casos extremos provocan

la muerte del árbol y en general, disminución en la producción que llega a alcanzar el

14% y una reducción en la calidad en un 10% (SAGAR-INIFAP, 1996). Las de mayor

importancia económica son seis: la antracnosis Colletotrichum gloeosporioides Penz,

roña Sphaceloma persea Jenkins, anillamiento causado por el complejo de bacterias y

hongos Pseudomonas sp., Xanthomonas sp., Corynebacterium sp., Alternaría sp.,

Diplodia sp., Dothiorella sp. y Pestalotia sp., tristeza P. cinnamomi, cáncer de tronco

y ramas Fusarium epishaeria Snyder y Hansen, P. boehmeriae Sawada y Nectria

galligena Snyder y Hansen, y enfermedades de postcosecha Diplodia natalensis Pole

evans, Rhizopus nigricans Ehr., Alternaria sp., Verticillum sp., Fusarium roseum

Snyder y Hansen, Colletotrichum gloeosporioides Penz y Sphaceloma persea

Jenkins (Vidales, 2001 b).

2

La obtención de un cultivar de aguacate resistente a enfermedades es urgente

y necesaria, ésto con la finalidad de evitar una catástrofe por la vulnerabilidad

genética que pudiera presentar el cultivar (cv.) Hass, ya que en la zona productora

del estado de Michoacán se depende en un 99% de este genotipo; así, con la

generación del nuevo cultivar se busca también disminuir los costos de producción y

reducir en gran medida la contaminación del ambiente, ya que solamente para el

control de la antracnosis se realizan de 5 a 7 aplicaciones de fungicidas al año, cuyo

costo fluctúa entre los 7 mil y 10 mil pesos por hectárea, y se emiten en la región

productora de aguacate aproximadamente 500 ton de productos químicos en la

prevención y control del patógeno.

Por otra parte, la colecta y conservación de germoplasma es urgente y

necesaria para recuperar los genes que se requieren en la formación de nuevos

cultivares de aguacate; instituciones como INIFAP y CICTAMEX han realizado

esfuerzos importantes en la colecta y conservación en campo, sin embargo el

mantenimiento de las colecciones demandan grandes erogaciones en mano de obra

y espacio, además de que están sujetas a altos riesgos de pérdida debido a

enfermedades, plagas y alteraciones del medio ambiente entre otras.

La biotecnología es una herramienta que se puede emplear para la obtención

de un cultivar resistente a enfermedades, bien sea mediante la formación de un

organismo transgénico o al generar variación somaclonal, en donde están presentes

las mutaciones, los cambios epigenéticos y el efecto del rejuvenecimiento fisiológico;

sin embargo, para utilizar estos mecanismos de mejoramiento genético in vitro se

requiere el sistema de regeneración de una planta completa a través de

embriogénesis somática y el sistema de organogénesis que permita la multiplicación,

el enraizamiento y la aclimatación de los genotipos transformados o seleccionados.

Con el cultivo de tejidos vegetales in vitro se proporcionan ventajas de calidad

sanitaria en la producción de planta de aguacate al ser utilizada como portainjerto o

injerto, se disminuye el tiempo para propagar un genotipo sobresaliente y se

3

garantiza la similitud genética del material parental, por reproducción clonal. Además

de las facilidades que ofrece este procedimiento en el mejoramiento genético y en la

preservación de germoplasma, la donación puede lograrse por injerto, enraizamiento

de estacas, micropropagación o embriogénesis somática (Bonga y Von Aderkas,

1992). La conservación in vitro es una opción para mantener el conjunto de genes

con menor riesgo, en forma más económica, disponibles para su utilización en

cualquier época del año y con alta seguridad sanitaria (Maruyama et al., 1996); no

obstante para lograrlo se demanda en primera instancia la definición de un sistema

de regeneración de plantas altamente eficiente y posteriormente trabajar en los

factores que influyen en el crecimiento y desarrollo del explante.

Un sistema de regeneración in vitro, bien sea a través de organogénesis o

embriogénesis somática, requiere de manera específica la definición de los

componentes de los medios de cultivo para sus diferentes etapas, por ser

determinantes en el crecimiento y desarrollo celular; las hormonas o reguladores de

crecimiento vegetal (auxinas, citocininas, giberelinas, etileno y ácido abscísico) son

muy importantes en los procesos de crecimiento o diferenciación (Salisbury y Ross,

1994) o en todos los aspectos del desarrollo (Klee y Estelle, 1991; Davis, 1995);

éstas son responsables en primer lugar de la distribución de los compuestos que la

planta biosintetiza y también determinan el crecimiento relativo de todos los órganos

de la planta.

En los procesos de morfogénesis in vitro son elementales las auxinas, las

citocininas y las giberelinas, ya que estimulan la elongación y división celular, según

la combinación y concentración de éstos. Los reportes de regeneración ín vitro,

indican que la respuesta del tejido depende del tipo de regulador de crecimiento y la

dosis utilizada, la cual es diferente para cada especie vegetal, por lo que no existe

una regla general para una respuesta morfogenética.

Como respuesta a un balance en la cantidad entre auxinas y citocininas, se

regula la dominancia apical o bien el crecimiento lateral; el efecto de la auxina sobre

4

la diferenciación vascular está bien establecido, la auxina afecta la formación de

xilema, ya que las plantas sobreproductoras de auxina contienen más elementos de

xilema, aunque las células son pequeñas; al incrementar la concentración de auxinas

se estimula la formación de raíces adventicias, pero la sobreproducción de esta

hormona puede llevar a un crecimiento epinástico de las hojas, debido a la inducción

del etileno, además de que las hojas son generalmente pequeñas y más estrechas

que las no tratadas. Una baja producción de auxina, en contraste, conduce a un

arrugamiento de la hoja, debido a un incompleto desarrollo del sistema vascular en

relación al resto de la hoja (Klee y Estelle, 1991). Lo anterior indica que existe una

interacción entre hormonas, y que tanto la sobreproducción como la deficiencia

influyen en la formación precisa de células y tejidos de la planta.

Con base en la carencia de un protocolo común de regeneración in vitro para

todas las plantas, es necesario continuar con investigaciones en diversas especies

vegetales, sobre todo en aquellas donde no se han encontrado las condiciones

óptimas del cultivo, para lograr procesos de organogénesis o embriogénesis

somática in vitro y así ofrecer un conocimiento más amplio que lleve a definir cuáles

son los factores determinantes en la regeneración de plantas in vitro.

Tal es el caso del aguacate, en el cual no ha sido posible optimizar la

regeneración in vitro en muchos de sus cultivares comerciales, por lo tanto en la

presente investigación se planteó utilizarlo como una planta modelo que permitiera

avanzar en el conocimiento de la respuesta morfogenética in vitro con la aplicación

de reguladores de crecimiento, particularmente en los procesos de organogénesis y

embriogénesis somática. El establecer sistemas de regeneración in vítro de esta

planta, permitiría la obtención de material bajo conservación in vitro, de plantas

mejoradas con alguna característica agronómica importante y de la propagación

masiva de injertos y portainjertos homogéneos (clonas).

5

Hipótesis

En base a lo anterior, en el presente estudio se partió de la siguiente hipótesis

de trabajo:

Al aplicar diferentes dosis y tipos de reguladores de crecimiento a cultivos

(tejidos) in vitro de aguacate, será posible activar la capacidad de regeneración de

plantas por los procesos de organogénesis y embriogénesis somática.

Así, los objetivos que se plantean son:

Objetivos

Objetivo general

Evaluar el efecto de los reguladores de crecimiento sobre la inducción y

desarrollo de la organogénesis y embriogénesis somática en aguacate.

Objetivos específicos

1. Determinar los procedimientos de desinfección y reducción de necrosis de

microestacas y frutos, para el establecimiento óptimo de los cultivos in vitro de

yemas axilares de aguacate criollo y tejido nucelar de aguacate cv. Hass,

respectivamente.

2. Evaluar el efecto de diferentes tipos y dosis de auxina, citocinina y giberelina

sobre la inducción, multiplicación y enraizamiento de brotes de las yemas

axilares de aguacate criollo.

6

3. Determinar la influencia del tipo y dosis de auxinas, citocíninas, giberelinas y

ácido abscísico (ABA) y otros componentes de los medios de cultivo para la

generación de callo embriogénico, multiplicación, desarrollo, maduración y

germinación de embriones somáticos.

3. Establecer las condiciones óptimas de cultivo durante el transplante y

aclimatación de plántulas de aguacate obtenidas in vitro, que permita el mayor

porcentaje de supervivencia y lograr plantas aclimatadas en el menor tiempo

posible.

7

II. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1. Hormonas y reguladores de crecimiento

Son compuestos orgánicos -diferentes de los nutrimentos- que en pequeñas

cantidades, fomentan, inhiben o modifican de alguna forma cualquier proceso

fisiológico vegetal (Weaver, 1990). Las hormonas vegetales se sintetizan en alguna

parte de la planta y se translocan a otra, en donde concentraciones muy bajas

causan una respuesta fisiológica, que promueve diferentes tipos de crecimiento; en

la actualidad, las auxinas, citocininas, giberelinas, inhibidores y retardadores del

crecimiento, etileno, ácido salicílico, triacontanol, brasinoesteroides, turgorinas y

poliaminas, son consideradas dentro del grupo de hormonas y reguladores de

crecimiento (Salisbury y Ross, 1994).

2.1.1. Auxinas

El ácido indolacético (AIA) fue la primera auxina natural identificada, y hoy es

considerada la principal auxina en plantas, otras auxinas naturales han sido

identificadas, se incluye al 4-CI-AIA y ácido indolbutírico (AIB). Existen auxinas

sintéticas, tales como el ácido 2,4-d i cl orofenoxi acético (2,4-D) y ácido naftalenacético

(ANA), las cuales en bioensayos inducen efectos similares a las auxínas naturales. Al

usar diversas concentraciones de auxina se ha demostrado que existen diferencias

en la sensibilidad a esta hormona (Sitbon y Perrot-Rechenmann, 1997).

La auxina es la hormona vegetal que influye en numerosos aspectos del

crecimiento y desarrollo (Chen et al., 1998; Guilfoyle et al., 1998), se incluye el

desarrollo vascular, iniciación de raíces laterales, dominancia apical, fototropismo,

gravitropismo, embriogénesís, maduración de frutos (Hobbie et al., 1994; Davis,

1995; Macdonald, 1997), senescencia, abscisión, floración, elongación y división

celular (McClure et al., 1989; Hooley, 1998; Eckardt, 2001).

8

Los efectos de las auxinas son generalmente divididos en dos principales

categorías: respuesta rápida tal como la elongación celular, ésta es una de las

respuestas hormonales más rápidas conocidas con un periodo latente de 10 a 25

minutos; y respuestas de término largo tal como la división celular, diferenciación, y

morfogénesis con un período latente de horas o días (Theologis, 1986). La iniciación

de la división celular ocurre de 10 a 24 horas después del tratamiento con auxina y la

diferenciación de células vasculares en 3 días (Macdonald, 1997).

El AlA se sintetiza a partir de compuestos tipo indol y las evidencias indican

que el AlA se produce a partir del aminoácido triptofano. Con plantas mutantes de

Arabidopsis, deficientes o que sobre expresan la síntesis de auxina, se ha revelado

que hay rutas de síntesis independientes de triptofano (Leyser, 1997). Esta y otras

investigaciones aseguran que esta auxina puede también producirse por una

variedad de rutas metabólicas que son activadas por varías señales del desarrollo o

del ambiente. Las más importantes son las vías metabólicas del corismato y

antranilato, dos rutas metabólicas secundarias importantes en plantas, aunque la ruta

de biosíntesis de AlA aun se desconoce (Dolan, 1998; Normanly y Bartel, 2000).

También se ha elucidado que el nivel de la auxina en los tejidos vegetales se

determina no solamente por la síntesis, sino por el transporte y su metabolismo

(conversión, conjugación, desconjugación y catabolismo). Con las técnicas de

cuantificación de compuestos marcados (radioisótopos), es posible monitorear en

plantas mutantes o transgénicas, el metabolismo del AlA (Normanly, 1997). Esta

hormona es activada primeramente como ácido libre y los niveles endógenos son

controlados in vivo a nivel de síntesis, conjugación y degradación. Estos procesos

pueden llevarse a cabo por la conjugación con azúcares, aminoácidos y pequeños

péptidos; y por la oxidación del grupo indol, enzimáticamente (AIA-oxidasa) o por luz

ultravioleta (UV) (Ostin et al., 1998).

La producción de la auxina se ha demostrado que ocurre primordialmente en

los ápices meristemáticos de tejido verde (tallos, primordios de hoja y hojas jóvenes).

9

Aunque se encuentra en grandes cantidades en ápices radicales, flores, frutos,

semillas y otras partes vegetativas, las evidencias indican que no se producen allí,

sino que son transportadas por los haces vasculares. El movimiento de la auxina

tanto en tallo como en raíz es lento (aprox. 1 cm/h), polar o unidireccional: hacia la

base (basipétalo) en tallos y hojas y hacia el ápice (basipétalo) en raíces (Lomax et

al., 1995). A diferencia de los fotosintatos y otros solutos, que se transportan a través

de los conductos como xilema y floema, el AlA es conducido vía células

parenquimatosas del floema y que rodean los tejidos vasculares. De esta manera, las

auxinas pueden ser transportadas por difusión de célula a célula, creándose un flujo

unidireccional. Además, el transporte de auxinas ocurre de célula a célula en la

región del cambium vascular (Jones, 1998; Raven et al., 1999).

El transporte polar de la auxina juega un papel importante en los procesos de

crecimiento regulados por esta hormona y en la formación del cotiledón durante el

desarrollo del embrión (Liu et al., 1993; Estelle, 1998). Ensayos de transporte de

auxina han sido usados para mostrar que los hipocotilos de embriones maduros

disectados de semillas de gimnospermas y angiospermas muestran un pronunciado

transporte polar de la auxina hacia el final de la raíz indiferentemente de su

orientación y, que este transporte es completamente bloqueado por ácido 2,3,5-

triyodobenzoico (TIBA) (Cooke y Cohen, 1993). El papel del transporte polar de auxina

en embriogénesis somática fue estudiado también por Schiavone y Cooke

(1987) en embriones somáticos de zanahoria con TIBA y un inhibidor de transporte

de auxina diferente, el ácido N-1-naftilftalámico (NPA); ambos inhibidores a una

concentración de 1 µM fueron eficientes para bloquear la capacidad de la

embriogénesis somática. El NPA actúa al romper la respuesta trópica, reducir la

dominancia apícal, inhibir la formación de yema floral y de raíz lateral (Estelle, 1998).

Cuando plántulas de Arabidopsis thaliana crecieron en luz sobre medio que contenía

1.0 µm de NPA, se inhibió la elongación de hipocotilo y de raíz, y el gravitropismo; sin

embargo, cuando crecieron en la oscuridad, el NPA rompió la respuesta a la gravedad

pero no afectó la elongación (Jensen et al., 1998).

10

Uno de los mejores estudios de respuesta de auxina es la rápida elongación de

secciones disectadas de coleoptilo, tallo o hipocotilo. De acuerdo a la hipótesis de

crecimiento ácido, la elongación celular en secciones del tallo es debida a la

acidificación inducida por auxina en la pared celular (Rayle y Cleland, 1992; Hobbie

et al., 1994). Estos últimos autores mencionan que fue demostrado que la aplicación

de auxina a tallos intactos de chícharo puede también inducir elongación, este

resultado in vivo sostiene la relevancia fisiológica de la auxina durante el crecimiento

o elongación, sin embargo, es poco claro como un crecimiento ácido contribuye a la

elongación inducida por auxina in vivo. Asimismo, indican que existe la idea de que la

acidificación de la pared celular es causada por la activación de la H+-ATPasa en la

membrana plasmática y que concentraciones fisiológicas de auxina (<µM) incrementan

la actividad de esta enzima en coleoptilos de maíz. Este incremento en la actividad de

la H+-ATPasa resulta en un incremento en el flujo de protones y por eso un mayor

potencial negativo en la membrana celular (hiperpolarización), sin embargo las

auxinas inactivan también la hiperpolarización producida en este sistema,

presumiblemente al activar la H+-ATPasa. Como las auxinas inactivas no inducen

crecimiento o elongación, este resultado sugiere que sólo la activación de la H+-

ATPasa no es suficiente para explicar ese efecto.

Aunque hay reportes de que la auxina por sí sola no es la responsable de la

elongación, la teoría ácida es la más aceptada (Keller y Volkenburg, 1998).

La dominancia apical se explica por la auxina producida en el meristemo

apical y transportado basipetalmente a los tejidos blanco, donde inhibe el crecimiento

de las ramas laterales (Jensen et al., 1998). En plantas leñosas, las auxinas

promueven la actividad del cambium vascular, estimulan la división celular, se

expanden las yemas por el movimiento de la auxina hacia los tallos y se forma tejido

vascular secundario, que da como resultado la brotación lateral (Rayen et al., 1999)

11

El papel de la auxina en la elongación celular y su posible interacción con

etileno y giberelina fue estudiada en el hipocotilo de Arabidopsis, cuando plántulas de

tipos silvestres cultivadas sobre medio que contenía distintas concentraciones de

auxina, el crecimiento del hipocotilo se inhibió, sin embargo, cuando los mutantes

axr1-12 y 35S-iaaL (los cuales tienen reducida respuesta a auxina) crecieron en las

mismas condiciones, la auxina fue capaz de promover el crecimiento del hipocotifo

(Collett et al., 2000). Estos mismos investigadores indican que cuando la respuesta a

etileno fue reducida usando los mutantes resistentes a etileno etr1 o el compuesto

aminoetoxivinilglicina (un inhíbidor de la síntesis de etileno), las respuestas a la auxina

fueron inalteradas o iguales, se indica que la auxina no inhibió la elongación

del hipocotilo por medio de etileno. En relación a las pruebas sobre las interacciones

entre auxina y giberelina, las mutantes de auxina crecieron sobre medio que contenía

giberelina y las mutantes de giberelina crecieron sobre medio con auxina; la

respuestas encontradas son las mismas a las plántulas de tipo silvestre en todos los

casos; en suma, 1 µM del inhibidor de transporte de la auxina NPA no altera la

respuesta de las plántulas de tipo silvestre a giberelina; dobles mutantes fueron

hechos entre mutantes de giberelina y auxina y los fenotipos de éstos parecen

aditivos; estos resultados indican que la auxina, la giberelina y el etileno actúan

independientemente en la elongación del hipocotilo.

Una de las aplicaciones prácticas de las auxinas es la estimulación de la

formación de raíces adventicias en segmentos disectados de plantas, lo que las ha

hecho comercialmente importantes. Las auxinas están involucradas también en la

formación de frutos y en la formación completa de las semillas. Actualmente se ha

estudiado el papel de las auxinas en las respuestas de defensa de las plantas, se

evidencia su acción en plantas enfermas por patógenos, enfermedades y por

factores del ambiente (estrés hídrico, por altas y bajas temperaturas, etc.) (Rayen et

al., 1999; Zolman et al., 2000).

12

2.1.2. Citocininas

En 1948, Skoog y Tsui descubrieron que la adenina junto con fosfato no sólo

contrarrestó los efectos inhibitorios de auxina sobre el crecimiento de la yema, sino

que promovió la formación de yemas y aumentó el crecimiento de tejido de callos. En

el año 1955, Miller y col., basados en los resultados de bíoensayos con tabaco,

obtuvieron de levadura (Saccharomyces cerevisiae) una pequeña cantidad del factor

citocinina altamente activo concentrado, el cuál aunque no identificado, muestra las

propiedades de una purina; fue descubierto que el ADN degradado de esperma de

arenque y autoclaveado fueron las dos fuentes de actividad de la citocinina; la

estructura química del material aislado (p.e. cinetina o 6-furfurilaminopurina) fue

deducido de la composición elemental (C10H9N5O) y de la degradación de productos

(adenina y ácido levulénico); aunque la cinetina posteriormente demostró ser un

artificio que surge espontáneamente en las preparaciones de ADN de

deoxiadenosina, su eficacia como citocinina en muy bajas concentraciones fue

irrefutable, y ésta es ampliamente usada como citocinina sintética en nuestros días

(Minorsky, 2001).

Las citocininas permanecen como uno de los grupos más misteriosos de las

hormonas vegetales, tienen una estructura química simple (N6-sustituto derivados de

adenina) e influyen en una gran variedad de eventos diferentes (Mikiashevichs y

Walden, 1997). La citocinina más activa encontrada naturalmente en plantas, fue

denominada zeatina (ZEA), ya que fue aislada por primera vez de mazorcas de maíz.

Se encuentra principalmente en tejidos de alta división celular, se incluyen semillas,

frutos, hojas, meristemos radicales, y en la savia de cortes realizados en plantas.

Debido a que los estudios en plantas han revelado que el papel fisiológico de las

citocininas está íntimamente relacionado con la presencia o ausencia de las auxinas,

éstas son aplicadas de manera comercial para modificar algunos efectos de las

auxinas, como la dominancia apical y la germinación de yemas o semillas.

13

Las citocininas están involucradas en el retraso de la senescencia de hojas, ya

que con una aplicación exógena de éstas en hojas que han iniciado amarillamiento,

se previene su caída natural. Las evidencias revelan que debido a la ruptura de tejido

vascular entre las hojas y el tallo principal, se evita el transporte de citocininas, las

cuales se acepta que son sintetizadas en los meristemos de las raíces y se

transportan por xilema hacia la parte aérea vegetal (Rayen et al., 1999).

Otras investigaciones han demostrado que la concentración de auxinas

aunado a la de citocininas, es la responsable de los primeros eventos de la

morfogénesis, ya que en células que presentan alta tasa de división celular, que

permanecen sin diferenciarse (células meristemáticas), se han encontrado altos

niveles de citocininas y en aquellas que sufren elongación celular (células en proceso

de diferenciación), el nivel más alto lo presentan las auxinas. En cultivos in vitro, se

ha generalizado el uso de alta concentración de auxinas para la formación de raíces

en tejidos no diferenciados y, al adicionar una alta concentración de citocinina se

determina la formación de brotes adventicios; en concentraciones iguales, el callo

continua proliferando sin presentar eventos de morfogénesis (Rayen et al., 1999). Sin

embargo, el tejido in vitro presenta diferencias en su capacidad de respuesta, por la

cantidad endógena de las hormonas y a las proteínas receptoras que existan en las

plantas, es variable en genotipo, edad, parte de la planta y etapa fenológica. Por lo

tanto, es necesario realizar estudios que lleven a conocer el tipo y dosis de

reguladores de crecimiento para cada tipo de planta o especies, como modelo para

la aplicación en diferentes razas, cultivares o variedades.

La aplicación de una dosis baja de citocinína a la yema apical de plantas que

crecieron en días cortos es otro tratamiento no inductivo que causa varios eventos

normalmente observados en el meristemo después de la inducción del fotoperiodo de

floración, tal como un incremento en la proporción y sincronización de la división

celular (Bernier et al., 1993); estudios de efectos causados por la aplicación exógena

de citocininas o, la expresión de genes bacteriales involucrados en la biosíntesis de

citocinina revelan que ellas interactúan con otras hormonas, en el control de la

14

división celular, la morfogénesis y el crecimiento de yemas laterales (Davies, 1995;

Cline, 1996), la iniciación y crecimiento de brotes, la senescencia de la hoja y el

desarrollo fotomorfogénico (Brandstatter y Kieber, 1998).

Las citocininas liberan a las semillas de la dormancia y a las yemas axilares de

la dominancia apical, además de que retrasan la senescencia de las hojas (Brault et

al., 1997); estas hormonas participan en el control de la división celular y

diferenciación, en bioensayos de cultivo de tejidos, los efectos de las citocininas

están bien definidos (Mok y Mok, 2001), ellas controlan la diferenciación de

cloroplastos por incremento de la expresión de genes nucleares que codifican

proteínas de cloroplasto; están involucradas además en la regulación de la expresión

de genes importantes como el gene de la subunidad pequeña de la enzima ribulosa

1,5-bifosfato carboxilasa (Rubisco) o el gene de la nitrato reductasa (Lu et al., 1990;

Brault et al., 1997).

Dewitte y col. (1999) estudiaron el papel de las citocininas en los procesos de

desarrollo tales como: iniciación foliar, inducción floral y formación de flores; para tal

efecto consideraron la distribución de las citocininas en ápices de brotes de tabaco

(Nicotiana tabacum L.) en distintas fases del desarrollo al utilizar inmunocitoquímica

unida a espectometría de masas cuantitativa; en contraste a los ápices vegetativos y

yemas florales, detectaron bases de citocinina libre (zeatina, dihidrozeatina, o

isopentiladenina) en ápices de transición preflorales; además observaron una

disminución de 3 veces en el contenido de ribósidos de citocinina (ribósido de

zeatina, ribósido dihidrozeatina e isopentiladenosina) durante esta fase de transición;

estos investigadores concluyeron que la formación de órganos (p.e. hojas y flores)

está caracterizada por un incremento en el contenido de citocinina, en contraste a los

muy bajos niveles de citocinina endógena encontrada en ápices de transición prefloral,

los cuales no demostraron organogénesis. Los análisis inmunocitoquímicos

revelaron disentimiento o no estar de acuerdo con la localización intracelular de las

bases de citocinina; la dihidrozeatina e isopentiladenina estuvieron principalmente en

el citoplasma y en el perinúcleo, mientras la zeatina mostró un claro corte de marcaje

15

nuclear; las citocininas no parecen actuar como efectos positivos en la fase de

transición prefloral en ápices de brotes de tabaco, además, las diferencias en la

distribución a nivel celular pueden indicar un papel fisiológico específico de zeatina

en los procesos del núcleo.

El tidiazuron (TDZ) es entre las substancias denominadas citocininas la más

activa en el cultivo de tejidos de plantas leñosas, lo cual facilita la eficiencia de la

micropropagación de muchas especies leñosas recalcitrantes. Bajas concentraciones

(<1µM) pueden inducir una gran proliferación axilar en comparación con otras

citocininas, sin embargo, TDZ puede inhibir la elongación de los brotes, en algunos

casos es necesario transferir brotes a un medio de elongación con un bajo nivel de

TDZ y/o una menor actividad de la citocinina. En concentraciones mayores a 1 µM, el

TDZ puede estimular la formación de callos, brotes adventicios o embriones

somáticos y el subsiguiente enraizamiento de microbrotes puede ser afectado o

ligeramente inhibido por una exposición previa a TDZ (Huetteman y Preece, 1993).

En relación a la síntesis de citocinina se tiene que en conversiones entre

bases de citocinina, nucleósidos y nucleótidos, generalmente las interconversiones

involucran enzimas comunes al metabolismo de las purinas, estas enzimas

usualmente tienen alta afinidad para adenina, adenosina y AMP; por ejemplo, la 5'-

nucleotidasa del germen de trigo y tomate convierte AMP a adenina y nucleótidos de

citocinina a bases de citocinina pero tienen alta afinidad a AMP (Mok y Mok, 2001).

Estos investigadores en su revisión mencionan que el conocimiento de la biosíntesis

de citocinina en plantas es muy limitado, generalmente es asumido que i6Ade y

zeatina tienen un origen común y que el primer producto de la biosíntesis es i6AMP,

aunque esta ruta metabólica parece lógica, particularmente en el conocimiento de la

acción del gene ipt de Agrobacterium tumefaciens.

Por muchos años, ha sido sujeto de debate el ARNt como una fuente de

citocinina; mediciones de la descomposición de ARNt indican que este proceso

puede contribuir arriba del 50% de las citocininas libres; frecuentemente

16

encontramos argumentos en contra de que el ARNt es una considerable fuente de

citocinina en el hecho que cis-zeatina es la principal citocinina en el ARNt, sin

embargo, este problema puede ser potencialmente resuelto por la isomerización de

cis-zeatina a trans-zeatina por cis-trans isomerasas; otra objeción es la naturaleza

general de la descomposición del ARNt, que ocurre en todos los tejidos, mientras la

producción de citocinina se localiza en las puntas de la raíz, meristemos de los

brotes y en semillas inmaduras, y debe ser altamente regulado (Mok y Mok, 2001).

Brandstatter y Kieber (1998) describen el análisis de dos genes homólogos,

ibc6 y ibc7 (inducidos por citocinina), que son inducidos minutos después de la

exposición a citocinina exógena; esta rápida inducción, acoplada con la insensibilidad

de inducción a ciclohexamida y la especificidad de la inducción por citocininas,

sugiere que ibc6 y ibc7 pueden ser genes de respuesta primaria a citocinina, las

secuencias de ibc6 y ibc7 son similares a dos componentes reguladores de

respuesta bacteria¡, estos resultados sugieren que ibc6 y ibc7 pueden estar

involucrados en una etapa temprana de sensibilidad a citocinina.

Existen una serie de mutantes identificados en Arabidopsis para citocininas,

tales como: amp1 con elevado nivel de citocinina, el stp1 y cyr1 resistentes a

citocinina y, cki1 y cki2 mutantes que proliferan y producen brotes en ausencia de

citocinina; ckil fue incapaz de producir raíces y flores normales y fue estéril, mientras

cki2 fue capaz de crear semillas, al formar callo tuvo la habilidad de crecer y formar

brotes en ausencia de citocinina; el msh mutante que también forma muchos brotes

en ausencia de citocinina pero no prolifera rápidamente (Miklashevichs y Walden,

1997). Sin embargo, por la carencia de mutantes biosintéticos y de señalización, el

papel regulador de las citocininas no está bien entendido; por ingeniería genética se

logró la expresión de la citocinina oxidasa en plantas de tabaco transgénico para

reducir su contenido de citocinina endógeno, las plantas deficientes en citocinina

desarrollaron brotes cortos con pequeños meristemos apicales y la producción de

células de la hoja fue solo del 3-4% respecto al tipo silvestre, al indicar un absoluto

requerimiento de citocininas para el crecimiento de la hoja; en contraste, los

17

meristemos radicales de las plantas transgénicas fueron agrandados y dieron

elevado crecimiento rápido y más ramificación de raíces, estos resultados sugieren

que las citocininas son un importante factor regulador de la actividad del meristemo

de la planta y morfogénesis, con papel contrario en brotes y raíces (Werner et al.,

2001).

2.1.3. Giberelinas

Las giberelinas se descubrieron por primera vez en Japón por Kurosawa en

1926, un fitopatólogo que estudió las enfermedades en arroz, específicamente la

nombrada como "bakanae" (plántula loca), las plántulas afectadas tenían una altura

que superaba en un 50% o más a las de las plantas sanas, pero formaban menos

semillas; la enfermedad era provocada por un hongo ascomiceto (Giberella fujikuroi

forma sexual y Fusarium moniliforme etapa asexual); Kurosawa demostró que la

causa era una sustancia termoestable y junto con sus colegas bosquejó las

propiedades químicas del material activo (Weaver, 1990). En la década de 1930,

Yabuta y Hayashi aislaron un compuesto activo del hongo, al que denominaron

giberelina (Salisbury y Ross, 1994).

Las giberelinas son una familia de compuestos terpenoides los cuales regulan

muchos aspectos del crecimiento y desarrollo de plantas, se incluye la germinación de

la semilla, elongación del tallo y peciolo, expansión foliar, floración, crecimiento de

semillas y fruto (Hooley, 1994; Blázquez et al., 1998; Hedden, 1999).

Estas hormonas vegetales han sido implicadas en el control de la floración en

varias especies. En Arabidopsis, una severa reducción de giberelinas endógenas

retrasa la floración en días largos y evita la floración en días cortos (Blázquez et al.,

1998), estos investigadores estudiaron como los efectos diferenciales de las

giberelinas sobre floración correlacionan con la expresión de LEAFY, un gen de

identidad del meristemo floral. Ellos encontraron que el fracaso de mutantes ga1-3

deficientes en giberelina para florecer en días cortos, fue paralelo a la ausencia de la

18

inducción del promotor LEAFY. Una conexión causal entre esos dos eventos fue

confirmada por la habilidad de un transgene LEAFY expresado constitutivamente

para restaurar la floración en mutantes ga-1 en días cortos; en contraste a días

cortos, el deterioro de la biosíntesis de giberelina causó simplemente una reducción

de la expresión LEAFY cuando las plantas crecieron en días largos o con sacarosa

en la oscuridad.

El efecto de la giberelina y del ácido abscisico (ABA) sobre la muerte celular

fue estudiada por Bethke y col. (1999), en células de aleurona de cebada (cv.

Himalaya); los protoplastos de aleurona incubados en ABA permanecen viables en

cultivo por un mínimo de 3 semanas, pero expuestos a giberelina inician una serie de

eventos que resultan en muerte, más del 70% de todos los protoplastos murieron

entre los 4 y 8 días después de la incubación en giberelina. La muerte ocurre después

de que las células llegan a ser altamente vacuoladas, se manifestó por una

abrupta perdida de integridad en la membrana del plasma seguida por una rápida

contracción de la célula muerta. La hidrólisis del ADN inicia antes de la muerte y

ocurre cuando el protoplasto cesa la producción de a-amilasa; la degradación del

ADN no resulta en acumulación de fragmentos discretos de bajo peso molecular, la

degradación del ADN y la muerte celular fue evitada por LY83583, un inhibidor de

señalización de giberelina en aleurona de cebada; Bethke y col. (1999) concluyen

que la muerte celular en células de aleurona es hormonalmente regulada y esta es la

etapa final de un programa de desarrollo que fomenta el éxito en el establecimiento

de un semillero.

Cowiing y Harberd (1999) realizaron experimentos en donde probaron la

hipótesis que la giberelina regula el crecimiento del hipocotilo al alterar la extensión

de la elongación de la célula del hipocotilo; en estos estudios usaron mutantes de A.

thaliana (L.) Heyhn., deficientes en giberelina y de respuesta alterada a esta

hormona, demostraron que la giberelina regula la elongación, en hipocotilos que

crecieron en luz como en oscuridad, se influyo en el promedio y la extensión final de

la elongación celular, sin embargo, los hipocotilos que crecieron en luz y oscuridad

19

exhibieron marcadas diferencias en la relación de respuesta a la dosis de giberelina.

La longitud de los hipocotilos que crecieron en oscuridad no es afectada por la

giberelina exógena, mientras que la longitud de los hipocotilos que crecieron en luz es

significativamente incrementada por la giberelina exógena; además los análisis

sugieren que la longitud del hipocotilo en el control de giberelina es cerrada a

saturación en hipocotilos que crecieron en oscuridad, pero no en hipocotilos que

crecieron en luz. Los resultados muestran que un gran rango de longitudes del

hipocotilo se logra vía la dosis dependiente de alteraciones reguladas por giberelina

en el rango de elongación de células del hipocotilo individuales.

La difusión de ácido giberélico (AG1, y AG3) desde el embrión, y la declinación

en el contenido de ABA del endospermo, fue asociado con la inducción de la

expresión del gene a-amilasa (EC 3.2.1.1.) en aleurona de granos de trigo (Triticum

aestivum L. cv. Maris Huntsman) germinados a 25°C; el escutelo parece ser el

principal sitio para la biosíntesis del ácido giberélico basado en (1) la abundancia de

AG 20-oxidasa en trigo, (2) el incremento en el contenido de giberelinas en la ruta

metabólica temprana AG 13-hidroxilación, y (3) la acumulación de ent-kaureno en

granos embebidos en la presencia de un inhibidor ent-kaureno oxidasa; además, la

iniciación de la biosíntesis de giberelina en el escutelo fue asociada con la inducción

de la expresión del gene de a-amilasa en el epitelio del escutelo, aunque los dos

eventos pueden no estar casualmente ligados (Appleford y Lenton, 1997).

De las 121 giberelinas que han sido identificadas en plantas y hongos,

relativamente pocas son consideradas que poseen actividad biológica intrínseca, las

giberelinas bioactivas más importantes para el crecimiento vegetativo y desarrollo

probablemente son AG1, y AG4, las cuales difieren en la presencia o ausencia,

respectivamente, de un grupo hidroxil en C-13 (Hedden, 1999).

Las giberelinas son productos de la ruta metabólica diterpenoide y su

formación es iniciada por la ciclización del común C20 precursor pirofosfato de

geranilgeranilo (GGPP). Este intermediario es sintetizado en plastidios a partir del

20

compuesto difosfato de isopentenilo, recientemente demostrado que deriva en estos

organelos a partir de 3-fosfato gliceraldehido y piruvato, más bien que de ácido

mevalónico, como previamente se asumió (Lichtenthaler et al., 1997).

En cultivo de tejidos vegetales, la ciclización de GGPP ocurre en proplastidios

y resulta en la formación de un hidrocarbono, ent-kaureno, en dos etapas del proceso

que requiere la actividad de dos enzimas: CPS, la cual produce el compuesto

intermedio copa¡¡¡ difosfato, y ent-kaureno cintasa; GGPP es sólo el precursor de

carotenoides y es incorporado en la clorofila; el ent-kaureno es convertido a

giberelinas, bioactivo por una serie de reacciones de oxidación, catalizadas por dos

tipos de enzimas. Las reacciones son catalizadas por monooxigenasa dependiente

de CitP450 y, en los brotes de tejidos de la mayoría de las plantas, surge AG12 y su

análogo AG53 13-hidroxilado; estos compuestos intermedios son metabolizados

además por dioxígenasas solubles, la cual usa ácido 2-oxoglutárico como un

cosubstrato; dos dioxigenasas son requeridas para convertir AG12 y AG53 por rutas

metabólicas paralelas a los productos bioactivos AG4 y AG1, respectivamente

(Hedden y Proebsting, 1999).

La ruta biosintética de las giberelinas activas biológicamente requieren la

acción de diterpeno ciclasas, mono-oxigenaras dependiente de citocromo P450 y

dioxigenasas dependiente de 2-oxoglutarato. Las dioxigenasas incluye a AG 20

oxidasa, 3β-hidroxilasa y 2β-hidroxilasa; la primera catálisis elimina el carbono-20, la

segunda catálisis la etapa final en la producción de las hormonas de crecimiento

activo, la cuál puede ser desactivada por la 2(3-hidroxilasa. Como una enzima

reguladora, la AG 20 oxidasa está siendo investigada como blanco por manipulación

genética de biosíntesis de la giberelina; resultados con especies modelos indican que

cambios considerables en el contenido de giberelina y en la morfología de la planta,

pueden ser obtenidos por la sobre-expresión de genes de la AG 20 oxidasa o al

reducir su expresión por introducción de secuencias antisentido de ADN (Hedden,

1999).

21

La biosíntesis de las giberelinas puede ser separada dentro de tres etapas de

acuerdo a la naturaleza de las enzimas involucradas y la correspondiente

localización en la célula: las terpeno ciclasas actuan en protoplastidios,

monooxigenasas asociadas con el retículo endoplasmático y dioxigenasas

localizadas en el citosol (Rademacher, 2000). Este autor también menciona que

existen cuatro diferentes tipos de inhibidores de la biosíntesis de giberelina, éstos

son: (a) compuestos tipo onium, tales como cloruro de clormequat, cloruro de

mepiquat, clorfonium, y AMO-1618, los cuales bloquean las cíclasas copalil-difosfato

sintasa y ent-kaureno sintasa, involucrada en las etapas tempranas del metabolismo

de giberelina; (b) compuestos con un heterociclo que contiene nitrógeno, p.e.

ancimidol, flurprimidol, tetciclasis, paclobutrazol, uniconazol-P e inabenfido, estos

retardadores bloquean a las monooxigenasas dependientes del citocromo P450, así

inhiben la oxidación del ent-kaureno en el ácido ent-kaurenoico; (c) estructura

simulada de ácido 2-oxoglutárico, el cual es el co-substrato de dihidrogenasas que

cataliza las etapas tardías de formación de giberelina, acilciclohexanediones, p.e.

prohexadione-Ca y trinexapac-etil y daminozida, bloquea particularmente la 3(3-

hidroxilación; (d) 16,17-dihidro-AG5 y estructuras relacionadas que probablemente

simulan al substrato precursor de giberelina de la misma dioxigenasa.

En Arabidopsis se han detectado cinco mutantes originales que presentan

enanismo como consecuencia de la deficiencia de giberelina (ag1-ag5); en la

mayoría de los casos el crecimiento de los mutantes fue restaurado de manera

normal por la introducción del gene de las plantas del tipo silvestre, dando inequívoca

evidencia que el gene cionado corresponde al locus mutante (Hedden y Proebsting,

1999).

2.1.4. Otras hormonas y reguladores de crecimiento

En este apartado se analizan inhibidores, retardadores del crecimiento y

etileno. Los inhibidores son un grupo muy variado de compuestos que tienen

diferentes efectos biológicos en las plantas. Hay procesos como la germinación de la

22

semilla, la supresión del crecimiento de brotes y el letargo de las yemas que los

inhibidores controlan, al menos en parte. Entre éstos se encuentran sustancias

orgánicas aromáticas como fenoles, flavonoides fenólicos y ácidos benzoicos,

además el ABA, hormona inhibitoria muy difundida en el reino vegetal (Weaver,

1990).

El ABA es una hormona vegetal que naturalmente se acumula en las plantas

bajo condiciones de estrés por sequía (Zeevaart y Creelman, 1988), esta

acumulación de ABA inicia el cerrado de los estomas, así reduce la planta el uso de

agua bajo condiciones de restricción de agua disponible (Grossnickle y Folk, 1994),

induce la dormancia en semillas y yemas e inhibe la elongación de la raíz (Anderson

et al., 1994).

La presencia del ABA fue esencial para expresar la embriogénesis potencial de

Picea glauca (Attree et al., 1991; Misra et al., 1993), se aceptó que pudo inducir la

resistencia a la deshidratación en plantas, este fue el caso; el ABA fue un elemento

más para enfatizar la relación entre el agua y la embriogénesis somática (Linossier et

al., 1995).

Las características morfológicas y fisiológicas de las plantas micropropagadas

de Delphinium cv. Princess Caroline fueron estudiadas por Santamaría y col. (1993),

las hojas producidas in vitro mostraron un pobre control de la pérdida de agua, la

cuál parece resultar de la respuesta restrictiva por el estoma y no de un pobre

desarrollo cuticular. Los estomas de las hojas producidas in vitro fueron más grandes

y más frecuentes que los producidos durante la aclimatación; a pesar del hecho de

que el estoma aislado de la epidermis de las hojas producidas in vitro reduce su

apertura cuando se expone a tratamientos de reducción de la turgencia, ellos no

cierran completamente. Esto, junto con una alta frecuencia estomática

medianamente explica el pobre. control de la pérdida de agua demostrada por las

hojas intactas producidas en cultivo cuando se exponen a aire seco; mientras las

hojas de las plantas aclimatadas demostraron casi un cierre completo con ABA,

23

bajos potenciales de agua, oscuridad y CO2, los estomas de las hojas producidas in

vitro reducen su apertura cuando se exponen a esos factores, pero solo a un límite;

por eso, los estomas de las hojas cultivadas in vitro parecen ser parcialmente

funcionales, pero alguna alteración fisiológica o anatómica impide que ellos cierren

completamente; los estomas de las hojas producidas in vitro fueron particularmente

insensibles al ABA, lo cuál parece estar en parte asociado con la alta concentración

de citocininas en el medio de cultivo. En el largo plazo, esta insensibilidad estomátíca

al ABA medianamente contribuye a la perdida de planta cuando las plántulas

micropropagadas son transferidas a suelo.

Así podemos resumir que el ABA es una potente molécula que ciertamente

modifica el patrón estomático, la pérdida de agua por la planta y probablemente actúa

para modificar el crecimiento de las hojas; la hormona es sintetizada en las hojas y en

las raíces de la planta y se puede mover libremente de la planta al suelo y del suelo a

la planta; puede sólo moverse rápidamente por la planta en el xilema y el floema y

ordena la partición entre diferentes compartimentos en diversos tejidos como una

función del pH (Sauter et al., 2001).

Los retardadores del crecimiento de las plantas, son compuestos que retrasan

la prolongación de los tallos, incrementan el color verde de las hojas y afectan

indirectamente la floración sin provocar deformaciones; retrasan la actividad

meristemática subapical que es la responsable de la elongación de los tallos, entre

estos se tienen AMO-1618, Phosphon-D y cloromequat (CCC) (Weaver, 1990).

El etileno (C2H4) es producido por todas las plantas superiores y en trazas

interactúa con otras hormonas vegetales, especialmente auxina. El etileno influye en

la maduración de frutos, abscisión, rompimiento de la dormancia, floración y

modificación de la expresión del sexo (Beyer et al., 1984), provoca epinastia de las

hojas al promover el alargamiento de las células del lado superior e inhibe la

elongación de tallos y raíces en dicotiledóneas, induce la senescencia de las flores,

estimula fuertemente la formación de flores femeninas en plantas de cucurbitáceas y

24

en algunas especies interrumpe la latencia de las semillas; el desprendimiento de

hojas, flores y frutos implica interacciones entre auxinas, etileno y ácido abscísico,

sin embargo, la promoción del crecimiento, las etapas iniciales de la producción de

raíces adventicias y muchos otros efectos de las auxinas parecen ser independientes

de la producción de etileno (Salisbury y Ross, 1994).

2.2. Bases moleculares de la acción hormonal

En 1986, Theologis menciona que el mecanismo primario de acción de las

hormonas vegetales en general, y de auxinas en particular, tipificado por el AlA,

continua sin clarificar a los 55 años de investigación intensa después del

descubrimiento del AlA. En su artículo este mismo autor concluye que es evidente

que la auxina induce ARNm específico en tejido de chícharo y soya. Esta rápida

inducción de ARNm se considera que interviene en la secreción de H+ y en la

elongación celular, posteriormente el ARNm regulado indirectamente por auxina,

puede codificar para proteínas asociadas con el sistema al conjugar aspartil por

auxina, ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC) sintetasa, celulasas y otras

hidrolasas, o polipéptidos necesarios para la división celular, diferenciación o

iniciación de meristemos adventicios (Theologis, 1986).

La mayoría de los trabajos pioneros sobre la acción de las hormonas utilizaron

acercamientos que involucraron: 1. Escisión de un órgano y substitución de éste con

alguna combinación de hormonas; 2. Escisión de un órgano o tejido y crecimiento in

vitro; y 3. Aplicación exógena de una hormona o inhibidor. Aunque las conclusiones de

estos estudios son correctas, el aprendizaje ha sido limitado. La aplicación

exógena de cualquier material biológico está sujeta a limitaciones de toma hacia

arriba, transporte, secuestro y metabolismo; además, es difícil cuantificar la cantidad

de material activo dentro del tejido, por estas razones ha sido difícil establecer una

relación directa entre una hormona y un proceso particular de desarrollo (Klee y

Estelle, 1991). Estos mismos autores indican que la biología molecular y la genética

desempeñan un papel importante en clarificar el conocimiento en la acción de las

25

hormonas, además de que el desarrollo de estudios moleculares para estudiar la

acción de las hormonas vegetales ha sido acompañado por un aumento en el uso de

mutantes para estudiar los procesos de las hormonas en plantas, los beneficios son

varios: primero, la caracterización fenotípica de mutantes de hormonas puede dar

información sobre el papel de las hormonas en la fisiología y desarrollo vegetal;

segundo, los mutantes pueden usarse para estudiar la bioquímica, biosíntesis y

acción de las hormonas; finalmente, en algunas especies mutantes vegetales pueden

utilizarse para aislar y caracterizar los genes requeridos por procesos hormonales .

La generación de un mutante está limitada a los medios para lograr

mutagénesis, a la viabilidad de los mutantes producidos y a un adecuado tamizado o

selección; actualmente, éstas no son restricciones obvias a la mutagénesis vegetal.

Los mutantes pueden ser creados por tratamiento con rayos X o etilmetanosulfonato

(EMS), o bien, un gene marcador o reportero puede ser transportado fuera con uno

u otro elemento de transporte o el T -ADN de Agrobacterium; la mutagénesis química

permite la creación de un gran número de mutantes independientes con relativa

facilidad, aunque los números de mutantes con gene etiquetado pueden ser

comúnmente limitados, ahí es la oportunidad de aislar y caracterizar el gene marcado

relativamente simple; las complicaciones inician con el tamizado para un fenotipo

mutante deseado y la viabilidad de los mutantes producidos (Miklashevichs y

Walden, 1997).

Un mecanismo de acción de las hormonas que fue referido para animales, pero que

recibió mucho apoyo por botánicos, es el que describen Salisbury y Ross

(1994), explican que se inicia con la unión de la hormona primaria a una proteína

receptora en la membrana plasmática de una célula blanco, enseguida, el complejo

hormona-receptor activa una enzima de membrana cercana denominada fosfolipasa

C, misma que hidroliza al 4,5-bifosfato de fosfatidilinositol, entre el glicerol y el fosfato

unido al carbono 1 de la porción fosfatada del inositol, de tal forma que se libera

1,4,5-trifosfato de inositol (IP3) y diacilglicerol (DAG), estos dos compuestos son

activos y pueden provocar una cascada de respuestas. El IP3 estimula la liberación

26

de Ca2+ vacuolar al citosol, que al incrementarse activa ciertas enzimas, se incluyen

varias proteína cinasas. El DAG no es soluble en agua (por los dos ácidos grasos

que aún contiene), por lo que realiza su función dentro de la membrana plasmática.

donde probablemente tiene gran movilidad; el DAG activa una enzima situada en la

membrana que se conoce como proteína cinasa C, enzima que utiliza ATP para

fosforilar ciertas enzimas que regulan diversas fases del metabolismo, la fosforilación

causa desactivación en algunas enzimas y activación en otras.

Rayen y col. (1999) indican que las hormonas interactúan con proteínas

específicas llamadas receptores, las cuales activan rutas de respuesta particulares.

Así las hormonas operan como señales químicas entre células, las células blanco

tienen mecanismos para (1) identificar la hormona específica, (2) medir la cantidad

que está presente, (3) transferir esta información vía rutas bioquímicas, y (4)

convertir la información en un conjunto complejo de cambios desarrollados. Las

células reconocen las hormonas vegetales al usar proteínas llamadas receptores de

hormonas; cada proteína receptora contiene un sitio de ligamiento de la hormona que

es específico para una hormona en particular. El ligamiento de la hormona al receptor

activa una ruta de respuesta en la célula y provoca un cambio en la

conformación de la proteína receptora; estos cambios permiten al receptor

interaccionar con otros componentes celulares, como algunas proteínas de

membrana, que pueden activar bombas de iones, o bien otras pueden actuar

abriendo canales de iones en la membrana.

Las bases moleculares de acción de las auxinas es un área de intenso estudio

(Harling et al., 1997), ya que evidencias bioquímicas y electrofisiológicas han

indicado que las auxinas pueden unir una variedad de proteínas vegetales (Jones,

1994), como la proteína 1 unida a auxina (ABP1) de maíz, que tiene las

características de ser un receptor que interviene en la hiperpolarización de la

membrana inducida por auxina. La hiperpolarización es un concepto que refleja la

estimulación de la expulsión de protón del citosol vía la H+-ATPasa y la acidificación

del apoplasto (Hager et al., 1991).

27

El ion calcio es importante en la acción de las hormonas, generalmente los

niveles en el citoplasma son muy bajos; sin embargo la estimulación hormonal de los

canales del ion calcio resulta en una elevación temporal de los niveles de calcio. El

ligamiento de calcio a los sitios de ligamiento-calcio de ciertas proteínas alteran la

actividad de esas proteínas, tanto como la actividad de las proteínas receptoras de

hormonas. Las proteínas cinasas son una clase de enzimas que pueden ser

activadas por calcio u otros "mensajeros secundarios" ; las proteínas cinasas pueden

modificar las proteínas "marcadas" al transferir grupos fosfatos en ciertos

aminoácidos de una proteína marcada y alterar su actividad (Rayen et al., 1999).

En relación a las hormonas en el control de genes específicos, los

investigadores anteriores mencionan que los mecanismos moleculares por los cuales

los genes individuales son encendidos y apagados en los núcleos eucarióticos no se

encuentran completamente entendidos, que un número de principios están

emergiendo, sin embargo, estos son comunes a vegetales y animales. Un gene

eucariótico está compuesto de una secuencia codificada, la cual específica la

secuencia de aminoácidos de los productos de proteína de genes, así como

secuencias reguladoras, las cuales son regiones de ADN que bordean la secuencia

codificada y juegan un papel regulador en la transcripción del gene. Las proteínas

llamadas factores reguladores de la transcripción pueden ligar directamente a

secuencias específicas de ADN dentro de una secuencia reguladora, al activar

(encender) o reprimir (apagar) un gene particular (Rayen et al., 1999).

La identificación del sitio celular de percepción de la hormona vegetal ha sido

problemático de demostrar, sin embargo, los reguladores de crecimiento vegetales

tales como el ácido giberélico (AG), ABA, y auxina son ácidos orgánicos pequeños

que pueden cruzar relativamente fácil las membranas biológicas en varias formas.

Cuando se adicionan al apoplasto, esas hormonas pueden rápidamente entrar a la

célula y podrían ser percibidas por receptores internos, al igual que las hormonas

esteroides de animales, ellas podrían sólo interactuar con receptores sobre la fase

externa de la membrana del plasma (Gilroy y Jones, 1994). Estos investigadores en

28

sus estudios con protoplastos aislados de capas de aleurona de cebada analizaron el

sitio de percepción de señal hormonal, en el cual los protoplastos respondieron a la

aplicación externa de AG3 con el incremento en la síntesis y secreción de a-amilasa,

expresión transitoria del gene reportero de la glucuronidasa encendido para los

elementos de respuesta a la hormona del promotor a-amilasa, y la vacuolación típica

de las células de aleurona tratadas con AG3. La aplicación externa de ABA podría

bloquear la estimulación de síntesis y secreción de a-amilasa, mientras la

microinyección arriba de 250 µM de ABA no fue efectiva para antagonizar el efecto

estimulatorio del AG3, resultados indicativos que el sitio de percepción del AG3 y ABA

en el protoplasto de aleurona de cebada es sobre la fase externa de la membrana del

plasma.

La senescencia de la hoja es un tipo de muerte celular programada que

constituye la fase final del desarrollo de la hoja, Gan y Amasino (1995) estudiaron

con plantas transgénicas de tabaco, que expresan el gene IPT, el desarrollo de un

sistema de inhibición de la senescencia; al controlar la expresión de IPT, un gene

que codifica la isopentenil transferasa (la enzima que cataliza la etapa limite-

promedio en la biosíntesis de la citocinina), con un promotor específico de la

senescencia, que resulta en la supresión de la senescencia de la hoja; las plantas

transgénicas que expresan este gen, no exhibieron el desarrollo anormal usualmente

asociado con la expresión IPT porque el sistema es autorregulado; debido a que es

producida suficiente citocinina para retardar la senescencia, la actividad del promotor

específico de senescencia es atenuada; las hojas con senescencia retardada

muestran una vida prolongada fotosintéticamente activas; este resultado demuestra

que de manera endógena se produce citocinina que regula la senescencia y

suministra un sistema para específicamente manipular el programa de senescencia.

Respecto a interacción entre hormonas, estudios sobre plantas enteras y

tejidos excisados han demostrado la existencia de sinergismo, antagonismo e

interacciones entre auxina y citocinina. En apoyo a la hipótesis que la auxina y

citocinina interactúan en múltiples planos, dos diferentes mutantes resistentes a

29

auxina de Arabidopsis, aux1 y axr1, los cuales sólo confieren la resistencia a

citocinina con respecto a la inhibición del crecimiento de la raíz, han demostrado que

operan en rutas de señalización separadas, esta evidencia genética sugiere que las

citocininas pueden interactuar con mínimo dos rutas independientes de señales de

transducción de auxina (Coenen y Lomax, 1997).

Las interacciones entre las hormonas vegetales auxina y citocinina por todas

las partes del desarrollo de la planta son complejas y las investigaciones genéticas de

la interdependencia de señalización de auxina y citocinina han sido limitadas

(Coenen y Lomax, 1998); estos investigadores caracterizaron la sensibilidad a la

citocinina en la mutante diageotrópica (dgt) de tomate (Lycopersicon esculentum

Mill.) en una amplitud de respuestas reguladas por auxina y citocinina. Las plántulas

dgt etioladas mostraron resistencia cruzada a citocinina con respecto a la elongación

de la raíz, pero los efectos de la citocinina sobre el crecimiento del hipocotilo y la

síntesis de etileno en esas plántulas no fue perjudicado por la mutación dgt, a las

siete semanas, el tipo silvestre verde y las plantas dgt fueron igualmente sensibles a

la citocinina con respecto al crecimiento de los brotes y la elongación de hipocotilo e

internudo; en la regeneración de órgano por cultivo de tejido de hipocotilo dgt los

explantes mostraron reducida sensibilidad a la auxina pero normal a la citocinina, y

los efectos de citocinina y la mutación fueron aditivos; sin embargo, aunque la

inducción de callos de hipocotilo dgt los explantes requirieron auxina y citocinina, el

callo dgt no mostró la típica concentración-dependiente de la estimulación del

crecimiento por auxina o citocinina observado en callo tipo silvestre; la resistencia

cruzada del mutante dgt a citocinina fue limitada a un pequeño subgrupo de procesos

de crecimiento regulados por auxina y citocinina afectado por la mutación dgt, se

indico que la auxina y citocinína regulan el crecimiento vegetal por medio de ambas

partes y rutas separadas de señalización.

En bioensayos con mezcla de BA y DPU (difenilurea) Christianson y

Hornbuckle (1999) no encontraron evidencia de competición para receptores de

citocinina; este resultado podría soportar las sugerencias que la citocinina fenilurea

30

actúa indirectamente, al alterar el metabolismo de la citocinina endógena, aunque

ellos favorecen otra interpretación, diferente u otros sistemas de respuesta a

citocinina. La inducción de yemas de los filamentos de protonema de musgo

involucra dos eventos mediados por citocinina, el número de yemas es controlado

por el segundo evento mediado por citocinina, si DPU fue pequeño o no afín por el

receptor al encender este segundo evento, tratamientos con DPU produce pocas o

ninguna yema, y el análisis cinético al usar número de yemas no encontró evidencias

por competición con BA, con base en sus resultados establecen la hipótesis que la

inducción de yemas en Funaria involucra dos receptores de citocinina químicamente

distintos.

Los elementos ocs son un grupo de elementos promotores que han sido

explotados por dos distintos grupos de patógenos de plantas, Agrobacterium y

ciertos virus, para expresar genes en plantas. Estos son una familia de secuencias de

ADN que relacionan 20-pb y son componentes importantes de los promotores de un

número de genes de Agrobacterium expresados en plantas, la expresión de dos

de esos genes, nopalína sintasa (nos) y manopina sintasa (mas), han mostrado ser

inducidos por la hormona auxina en plantas transgénicas (Zhang y Singh, 1994).

Los mecanismos moleculares de acción de las auxinas son pobremente

comprendidos, aunque avances recientes de estudios moleculares de genes

regulados por auxinas y acercamientos genéticos han contribuido para la

identificación de factores de transcripción, algunos con una función genética definida,

y en la demostración de la degradación de proteína regulada por la unión ubiquitin-

proteosoma, un papel clave en la acción de las auxinas (Leblanc et al., 1999). Dentro

de los últimos 10 años, acercamientos bioquímicos se han desarrollado con el

objetivo de identificar los receptores de auxinas, un número de compuestos solubles

y proteínas ligadas a auxinas en membranas asociadas han sido descritos, sin

embargo, en la mayoría de los casos su papel funcional en señalización, transporte,

o metabolismo de auxina no está claro (Jones, 1994; Venis y Napier, 1995). Aún la

31

función de la proteína ligada a la auxina más estudiada (ABP1) permanece difícil de

conseguir (Leblanc et al., 1999).

Para el mejor conocimiento del papel in vivo de la auxina endógena AIB, se

identificaron 14 mutantes de Arabidopsis que son resistentes a los efectos inhibitorios

de esta hormona sobre la elongación de la raíz, pero permanece sensible a la auxina

más abundante AlA. Estos mutantes tienen defectos en varias respuestas mediadas

a AIB, lo cual permitió agruparlas en cuatro clases de fenotipos. Para el desarrollo de

defectos en ausencia de sacarosa exógena se propone que algunos de estos

mutantes son perjudicados en el acortamiento de la cadena del ácido graso

peroxisomal e implican que la conversión de AIB a AlA es solo interrumpida (Zolman

et al., 2000).

La respuesta a la auxina incluye un crecimiento celular inicial rápido (dentro de

15 a 20 minutos) que puede involucrar cambios inducidos por auxina en pH y calcio y

una segunda fase que implica cambios inducidos por auxina en la expresión del gene;

los genes sensibles a auxina incluyen familias de genes de auxina (SAUR,

GH3 y Aux/IAA), los cuales tienen secuencias distintas conservadas de acción cis y

sus regiones promotoras, varios genes de la enzima glutation S-transferasa y un

gene para la ACC sintasa; la mayoría de las funciones en esos genes son

desconocidas (Eckardt, 2001).

En resumen, sobre señalización de las hormonas se menciona que éstas no

solamente controlan los principales aspectos del desarrollo, sino que también la

respuesta de las plantas al ambiente y que uno de los ensayos urgentes es sobre la

convergencia e interacción de varias rutas de hormonas (Bisseling y Weigel, 2001).

2.3. Micropropagación

El éxito de muchas técnicas in vitro en plantas superiores depende del éxito en

la regeneración de la planta, la aplicación de algunas técnicas, p. e. para el

32

aislamiento de mutantes y fusión de protoplastos in vitro, el cultivo de células está

limitado en muchas especies por la dificultad para regenerar plantas. La

regeneración de plantas es la piedra angular en la metodología del cultivo de tejidos,

sin ésta la hibridación de protoplastos, los estudios de crecimiento y diferenciación, la

generación de variabilidad genética, el cultivo de anteras, la donación comercial con

el propósito de una rápida multiplicación de especies deseables o difíciles de

propagar, la eliminación de enfermedades a través del cultivo de meristemos, y

muchos estudios de reguladores de crecimiento, serían imposibles de realizarse

(Tisserat, 1991).

También las dificultades de establecer cultivos asépticos de explantes maduros

de plantas leñosas está asociado con el necrosamiento de los explantes, la

contaminación microbiana y la oxidación fenólica, factores que limitan el progreso en

el desarrollo de la propagación in vitro de algunas especies (Guzmán y Gómez-Lim,

1997).

La "respuesta regeneradora" in vitro incluye la embriogénesis somática

(inducción de embriones somáticos) así como la organogénesis (formación de brotes

o raíces), procesos de morfogénesis que explantes in vitro seguirán para la

regeneración de una planta completa (Christianson y Warnick, 1988). La

organogénesis se origina por la formación inicial de meristemoides,

subsecuentemente primordios, brotes y finalmente la formación de raíces

adventicias; está se utiliza con mayor frecuencia debido a que se tiene un buen

conocimiento de su biología en un número considerable de especies (Vasil, 1994). La

embriogénesis somática es la formación de un embrión a partir de una célula, sin la

necesidad de la fusión de gametos (Zimmerman, 1993).

La regeneración de plantas a través del cultivo de tejidos puede establecerse

al usar uno de los tres métodos: cultivo de embriones, embriogénesis somática y

organogénesis; el cultivo de embriones es el cultivo aséptico de un embrión cigótico,

el embrión es obtenido de la semilla u óvulo y plantado sobre un ambiente substituto

33

del endospermo (por ejemplo, medio nutritivo); posteriormente el embrión desarrolla y

la germinación ocurre como debería ser desde la semilla (Tisserat, 1991).

El carácter totipotente de las células vegetales y tejidos puede ser expresado

por su habilidad para regenerar plantas vía embriogénesis u organogénesis, ambos

procesos conducen a la regeneración in vitro y son un prerrequisito para la

transformación genética. Sin embargo, la aplicación general de las técnicas de

transferencia de genes para el mejoramiento de cultivos puede no ser exitosamente

lograda si los procesos que dirigen la morfogénesis no son bien entendidos (Fortes y

Pais, 2000).

2.3.1. Organogénesis

La organogénesis consiste en un proceso morfológico secuencia) que se

traduce en la formación de órganos de novo, que se puede inducir reproduciblemente

a través de la manipulación química de los medios de cultivo (Villalobos, 1990; Pérez

et al., 1999)

En muchas ocasiones los explantes tienen la capacidad de desarrollar brotes,

raíces, o estructuras florales cuando se cultivan en un medio suplementado con sales

minerales, vitaminas, y una fuente de carbono pero sin hormonas vegetales. Este

proceso puede llamarse "organogénesis adventicia", la adición de hormonas

vegetales muchas veces puede facilitarlo, pero no son absolutamente requeridas. En

esta instancia, los precursores inmediatos de nuevos órganos son las células en el

explante mismo. El otro tipo de organogénesis es la no adventicia e involucra una

"desdiferenciación" del explante, formación de tejido calloso alrededor de la orilla del

corte del explante, y la inducción de órganos nuevos del tejido calloso recientemente

formado. El suplemento exógeno de fitohormonas no solamente controla los

procesos pero es necesario para que la organogénesis se presente (Christianson y

Warnick, 1988; Woodward, 1997).

34

Los primeros en demostrar que la organogénesis es controlada por el balance

entre auxinas y citocininas en el medio de cultivo fueron Skoog y Miller en 1957

(Minorsky, 2001). Un medio con mayor proporción de auxina en relación a citocinina

induce la formación de raíces, en tanto que en relación inversa se forman brotes y

con una relación intermedia auxina : citocinina se induce crecimiento desorganizado

como tejido calloso.

Frecuentemente es necesario eliminar las citocininas para el alargamiento y el

enraizamiento, según Von Arnold (1988) la capacidad de enraizamiento de las yemas

está altamente influenciada por la etapa juvenil de la planta madre y la fuente del

explante.

Los estudios de respuesta morfogenética in vitro se basan en combinaciones

diferentes de citocinína/auxina, p.e. al utilizar como explantes hojas de Duboisia

myoporoides y 65 combinaciones de citocinina/auxina se compararon los efectos

sobre la organogénesis; dos diferentes tipos de callos fueron inducidos dependiendo

de las combinaciones usadas para la inducción de callos; ningún brote con raíz fue

regenerado de los callos inducidos con 7 diferentes combinaciones citocinina/auxina

(Khanam et al., 2000).

2.3.1.1. Organogénesis en aguacate

Varios explantes de aguacate, desde embriones maduros e inmaduros,

meristemos y yemas axilares de plantas de vivero y árbol maduro, hoja, flor,

mesocarpo del fruto, pedúnculo, polen, cotiledón y protoplastos, han sido cultivados

in vitro. Sin embargo, los avances del cultivo de tejidos de aguacate está aún en

etapas tempranas (Pliego-Alfaro y Bergh, 1992; Mohamed-Yasseen, 1995a). Estos

investigadores señalan que promover la investigación en aguacate es una necesidad

para desarrollar sistemas de cultivo de tejidos con la ayuda de selección o

transferencia de algunos tratamientos deseables y la donación de las plantas

mejoradas. El cultivo de callos ha sido establecido en muchos explantes, pero la

35

formación de yemas adventicias de callos no fue lograda; la embriogénesis somática

fue obtenida de callo formado de embriones inmaduros (Skene y Barlass, 1983;

Money y Van -Staden, 1987; Pliego-Alfaro y Murashige, 1988); en cuanto a brotes y

formación de plantas, fueron logradas con éxito al usar ejes embrionarios (Mohamed-

Yasseen et al., 1992), y yemas axilares (Schall, 1987); aunque se requiere una

considerable investigación para desarrollar un protocolo exitoso de regeneración in

vitro y propagación de aguacate.

Al igual que todas las especies leñosas, el aguacate ha presentado

dificultades en su propagación in vitro. En 1976, Schroeder con el objetivo de

desarrollar técnicas para obtener material clonal de aguacate por cultivo de

meristemos apicales para patrones u otros propósitos y basado en reportes previos,

indicaba que los tejidos de casi todas las partes de la planta de aguacate pueden ser

cultivados in vitro como masas de callo. El comportamiento general del material

tomado como "yemas intactas" cuando es cultivado en medio, con un amplio rango

de nutrimentos, origina la formación de callo en la superficie del corte o en la periferia

de éste; ocasionalmente algunas yemas presentan algún crecimiento longitudinal y

eventualmente una proliferación de callo a una distancia de 4-5 mm; finalmente, se

observa que la etiolación de plántulas o plantas injertadas y la posterior obtención de

tejido (yemas) no ha desarrollado ventaja alguna, excepto un mesurado crecimiento

longitudinal pero con un callo masivo en la base del explante (Schroeder, 1976).

Nel y col. (1982) obtuvieron brotes de 3-5 cm de plántulas de 1 año de P.

indica, de éstos sembró pequeñas yemas de 5 mm con uno y dos nudos en medio

MS (Murashige y Skoog, 1962) que contenía ácido ascórbico (25 mg/I), ácido

giberélico (1mg/l), vitaminas y otros componentes; para el cultivo inicial y

subsiguiente multiplicación fue añadido BA a una concentración de 2 mg/I; el

enraizamiento fue inducido con 2 mg/l de AIB adicionado al medio; con este

procedimiento obtuvieron plántulas de 6 cm de altura en 5 semanas, las mismas que

se dividieron en entrenudos y recultivaron, desarrollaron hasta 12 brotes que

enraizaron en 3 semanas. De las plántulas con raíz 50% sobrevivieron después del

36

trasplante al suelo; sin embargo, con el cultivar Duke 7 el cultivo de tejidos no fue

éxitoso.

El portainjerto Duke 7 resistente a P. cinnamomi es ampliamente usado en

Sur África, pero su propagación por métodos convencionales es baja. En ensayos

con 3 diferentes tipos (fuente y edad) de explantes, 4 medios básicos de cultivo in

vitro y 20 combinaciones de auxina y citocinina, no se presentó enraizamiento en

todos los tratamientos. Sin embargo, de moderado a un extensivo crecimiento de

callo basal ocurrió en algunos tratamientos de BA y AIB, así como el crecimiento de

algunos brotes (Bower et al., 1983).

Al establecer in vitro embriones inmaduros de aguacate (P. americana) de

árboles de 15 años de edad del cultivar Fuerte, Skene y Barlass (1983) en Australia,

encontraron que embriones menores a 6 semanas de edad rara vez produjeron brotes

viables, y aunque algunas veces las hojas se expandieron cuando el BA (0.5

mg/l) estuvo presente, los tallos no presentaron elongación (alargamiento). Para

embriones de más de 6 semanas, el desarrollo fue extremadamente bajo.

impredecible e independiente del tratamiento, a menos de que BA fuera incluido en el

medio; en este estudio también utilizaron ejes embrionarios de semillas maduras del

cultivar Fuerte, los que respondieron rápidamente en medio MS líquido a la mitad de

sus sales con BA (0.5 mg/I); después de 19 días de cultivo, los brotes principales de

cada eje, y cuatro a cinco laterales sufrieron elongación. Estos brotes fueron

cortados después de los 40 días de cultivo y más brotes fueron estimulados a

elongación sobre los ejes embrionarios. Aunque los brotes cortados fueron lentos

para enraizar, el tratamiento alcalino (aplicación a la base de cada brote con 1 N de

NaOH por 20 segundos) estimuló de 30 - 50% de brotes a formar raíces.

González y Salazar (1984) utilizaron segmentos de tallo de P. americana var.

americana raza antillana, cultivados a partir de semilla y pre-tratados bajo tres

condiciones de luz (parcial , total y oscuridad), se establecieron en medio MS con

diferentes concentraciones de AIB, sólo o en combinaciones con cinetina (K); el

37

crecimiento de yemas axilares de segmentos no etiolados fue observado en medio

conformado por 0.3 mg/1 de AIB y 0.1 mg/1 de K, la formación de raíz fue inducida en

condiciones de iluminación total en medio con 7.5 mg/1 y 10 mg/1 de AIB.

González y col. (1985) emplearon segmentos de tallo de P. schiedeana

cultivados a partir de semillas y pre-tratados bajo tres condiciones de luminosidad

(oscuridad, luz parcial y total) e incubados en medio MS con diferentes

concentraciones de AIB sólo o combinado con K, para establecer esta especie no fue

necesario que los explantes recibieran pre-tratamiento con oscuridad e iluminación

parcial y total, ni fue necesario añadir carbón activado al medio base; el crecimiento

de yemas axilares lo observaron en un medio conformado por 0.1, 1.0 y 0.01 mg/1 de

AIB, en tanto que el crecimiento de yemas con expansión de hojas fue logrado con 1

mg/l de AIB+ 0.3 mg/l de K, 3 mg/1 de AIB+1 mg/l de K y 3 mg/1 de AIB + 0.01 mg/l

de K; plántulas completas fueron generadas en un medio con 1 mg/1 de AIB y 1 mg/l

de K.

En Nueva Zelanda, Cooper (1987) utilizó para su establecimiento in vitro

segmentos nodales con yemas axilares de plantas de semilla de aguacate (P.

americana) de los cultivares Hopkins y Hass, que crecieron en invernadero bajo luz

natural y posteriormente se colocaron en un cuarto obscuro (a 20°C y 50% de

humedad relativa) para producir brotes etiolados; cuando los explantes se

sumergieron en etanol al 95% por 2 a 5 segundos, se obtuvo una reducción de la

contaminación a niveles aceptables (0-16%); se estimuló el crecimiento de las yemas

axilares (65-85% de brotación en 4 semanas) con 1 mg/1 de BA en medio basa) (MB)

formado con sales minerales de medio para plantas leñosas (WPM) (Lloyd y

McCown, 1980), vitaminas, sacarosa (30 g/I) y agar bacteriológico (Davis, 7 g/¡). El

medio de multiplicación consistió en MB, AIB (0.1 mg/I) y BA (0.3 mg/I) donde solo se

logró el enraizamiento en los brotes con hojas grandes bien formadas que estuvieron

6 semanas en medio de multiplicación, para esta etapa se probó el enraizamiento in

vivo e in vitro, se encontró en el primero menor formación de callo y un enraizamiento

rápido (en 4 semanas del 80 al 100%), este tratamiento consistió en colocar los

38

brotes en una solución acuosa con 3,000 mg/I de ANA por 1 segundo y establecidos

inmediatamente en sustrato de piedra pómez: suelo de turba (50:50 v/v) bajo un

pabellón de una alta humedad, temperatura de 26°C y neblina intermitente (2

segundos cada 30 minutos). En este estudio también se realizaron pruebas para la

micropropagación de material adulto de Duke 7 sin resultados exitosos.

En 1987, Schall experimentó la propagación in vitro de P. americana cv.

Fuerte, utilizó como explantes plantas injertadas, tallos cortos de 2 a 4 años de edad,

sembrados en medio MS, mezcla de vitaminas de Morel, FeEDTA (25 mg/I),

NaH2PO4 (170 mg/I), mioinositol (100 mg/I) y sacarosa (30 g/l); logró la proliferación,

crecimiento y enraizamiento de brotes. El uso de BA de 5-10 mg/I en el medio de

cultivo fomentó la formación de tallos jóvenes, sin embargo, problemas como

necrosis, oxidación de explantes, ligados con la producción de etileno, estuvieron

presentes, las plántulas fueron transferidas al invernadero con un 80% de éxito.

Pliego-Alfaro y col. (1987) reportan que la necrosis apical fue la causa

principal de muerte de los brotes cuando se multiplicó por cultivo de tejidos los

portainjertos de aguacate IV-8 y GA-13; el uso de medio de doble fase o recultivos

múltiples a intervalos cortos, previno el problema antes indicado; la vitrificación fue

otro problema serio, especialmente cuando se usaron técnicas de doble fase de

medio. Estos investigadores cortaron brotes de 15 a 25 cm de longitud, removieron

las hojas, mismos que fueron esterilizados por inmersión en hipoclorito de sodio al

0.5% durante 10 minutos, inmediatamente después fueron divididos en trozos de 1-

1.5 cm que contenían yemas laterales; el medio de doble fase contenía las sales MS,

pero con macroelementos al 50% y otros componentes en las siguientes

concentraciones en mg/I: sacarosa (30,000), inositol (100), tiamina HCI (0.4) y agar

(8,000), la concentración de BA fue 0.65 mg/1 en medio semisólido y 0.1 mg/I en

medio líquido. El medio final de desarrollo para multiplicación del GA-13 incluyó la

mezcla de macroelementos, N y K, los microelementos MS y las concentraciones en

mg/1 de sacarosa (30,000), mioinositol (100), tiamina HCI (0.4), BA (1) y bacto-agar

(8,000). La capacidad de enraizamiento se determinó con el uso de una secuencia

39

de dos etapas que incluye tres días de cultivo en medio basa) con macroelementos

MS diluido a 0.3 X y 1 mg/1 de AIB y la subsiguiente transferencia a medio similar de

AIB pero con 1 mg/1 de carbón activado; todos los cultivos fueron incubados a 25°C,

1500 lux y 8:16 h de obscuridad y luz.

Solórzano-Vega (1989) utilizó plantas de aguacate del cultivar Colin V-33 y

una selección adaptable a suelos salinos, mismas que ubicó en una cámara de

etiolación por un período de 30 días. Una vez etioladas fueron establecidas in vitro

en tubos con medio MS, metasulfato de potasio fue añadido para reforzar las

condiciones nutritivas del sustrato. Un control total de la oxidación fue logrado con la

aplicación de metasulfato de potasio, en tanto que el radio óptimo de reguladores fue

de 2 mg/1 de BA y GA3 en iguales cantidades, 25% de los explantes de Colín V-33

murieron debido a la presencia de bacterias.

Con base en los resultados obtenidos por Pliego Alfaro y col. (1987), sobretodo

en el medio de doble fase para la etapa de proliferación, Zirari y Lionakis

(1994) en Grecia tomaron explantes (puntas de brotes y segmentos nodales solos,

ambos cerca de 1.5 cm de longitud) de brotes de aguacate que crecieron

activamente después de la poda del tronco principal, en árboles de 19 años de edad

de los cultivares Topa-Topa, Hass y Fuerte. Dos clases de este material fueron

usados (brotes del año en curso después de la poda y brotes de 2 años de edad), el

material adulto de Duke (13 años de edad) fue también usado y éste obtenido de

brotes nuevos de varetas incubadas bajo luz continua a 25°C. El material etiolado fue

obtenido de nuevos brotes de varetas que crecieron bajo total oscuridad a 25°C. Los

resultados que obtuvieron señalan que los explantes puntas de brotes produjeron más

proliferación de brotes que los segmentos nodales; el cultivar Topa-Topa

produjo el más alto número de brotes axilares, seguido por Fuerte y Hass; el

tratamiento de etiolación mejoró significativamente la producción de brotes axilares,

la elongación y el número de hojas, especialmente de material del portainjerto Duke.

Las pruebas para enraizar microbrotes de aguacate no fueron exitosas, debido a la

severa necrosis del brote después de la transferencia a medio de enraizamiento.

40

Mohamed-Yasseen (1995b) describe un método para propagar in vitro

aguacate a partir de ejes embrionarios de semillas maduras de seis cultivares de

Florida (Dade, Maxima, Cataloina, Tower 2, Waldin y Choquette), los cuales cultivó

en medio MS suplementado con 100 mg/1 de mioinositol, 30 g/I de sacarosa, 8 g/I de

agar sin reguladores de crecimiento o con diferentes combinaciones de BA (1, 2, 3

mg/I) o TDZ (0.2, 1, 2 mg/I) y 0.1 mg/1 de ANA. Los explantes fueron incubados en la

oscuridad por 7 - 10 días para reducir la necrosis-oxidación y transferidos a un

fotoperiodo de 18 horas. Los ejes embrionarios respondieron a la adición de BA al

incrementar a 8 brotes por explante, cuando el medio MS fue usado solo (sin

reguladores de crecimiento) se formó un brote y pequeñas yemas laterales pero

abatidas por la dominancia apical del brote principal. Los brotes múltiples fueron

subcultivados para su multiplicación en medio MS fresco con BA, los brotes fueron

enraizados en MS con 2 mg/1 de AIB.

Embriones maduros de semillas de aguacate (P. americana cv. americana,

raza mexicana) fueron cultivados en medio MS suplementado con K y/o AIB a

25±2°C por 21, días en obscuridad seguido por 14 días de luz continua. La

germinación del embrión, producción de un brote y raíz de 0.5 cm de longitud

mínima, fue en el 100% de los embriones cultivados con 0.3 mg/1 de AIB y 0.1 a 0.3

mg/1 de K; concentraciones mayores a 0.3 mg/1 de AIB redujeron la germinación. El

mayor número de brotes adventicios fue obtenido con 3.0 mg/1 de AIB y 0.1 mg/1 de

K. La máxima longitud del brote (12.5 cm) fue alcanzada con la combinación de 1

mg/1 de AIB y 1 mg/1 de K. La máxima longitud de raíz (4.9 a 6.6 cm) fue obtenida con

AIB entre 0.3 y 1 mg/1 combinado con 0.1 a 1 mg/1 de K (Llano-Agudelo et al., 1995).

Entre los últimos reportes se encuentran los de Barceló-Muñoz y col. (1999)

quienes en España, desarrollaron un procedimiento para micropropagar la selección

IV-8, un portainjerto de aguacate adulto; el cultivo fue iniciado de brotes básales

obtenidos después de podar un árbol a nivel del suelo; las yemas brotaron en medio

sólido MS con los macroelementos a la mitad de la concentración de las sales (MS

41

0.5X) y 1.3 µM de BA; para inducir proliferación, los brotes fueron cultivados por 2

semanas en medio líquido en un agitador giratorio con la formulación de sales de

Gamborg (Gamborg, 1966) y 1.3 µM de BA, seguido por 6 semanas en condiciones

de doble fase (medio sólido con una capa de medio líquido arriba) al usar la misma

formulación de sales y dos diferentes dosis de BA, 2.8 µM en la fase sólida y 0.4 µM

en la fase líquida; el 90% de los brotes enraizaron después de 3 días de cultivo en

medio líquido en un agitador giratorio con macroelementos MS 0.3X y 4.9 µM de AIB,

seguido por la transferencia a medio sólido en ausencia de auxina pero con 1 g/l de

carbón activado; el promedio de supervivencia durante la aclimatación en el

invernadero fue del 70%.

En resumen, los esfuerzos para micropropagar el aguacate vía organogénesis

han sido enormes, se han estudiado con diferentes explantes (Mohamed-Yasseen,

1995a) y con tres especies de Persea y con varios portainjertos e injertos

sobresalientes. Sin embargo, falta el establecimiento de un sistema que garantice en

un 100% la propagación clonal, ésto porque al tomar como explantes ejes

embrionarios y embriones cigóticos no se tendría la certeza de estar propagando

idénticamente desde el punto de vista genético, el material de origen del explante.

Por otra parte se requiere que este sistema permita la micropropagación con material

de árboles adultos para la conservación in vitro de germoplasma, o sea evitar la

aplicación de podas del tallo principal y trabajar con rebrotes, o bien, con plántulas de

vivero propagadas por semilla; además que sea práctico y económico, es decir que

se manejen los componentes y dosis mínimas en los medios de cultivo, que su

preparación no implique complicación alguna y se evite la dependencia de equipo y

procedimientos sofisticados, que lo único que ocasionan es el incremento en los

costos de producción por planta.

Así, se demanda un sistema de micropropagación de aguacate vía

organogénesis que apoye una serie de aplicaciones futuras del cultivo de tejidos,

principalmente en la conservación in vitro, la regeneración de plantas a partir de

tejidos tratados con agentes mutagénicos, bien sean físicos o químicos, para la

42

producción de variantes y mutantes a evaluar ante factores biótícos y abióticos que

afectan al cultivo del aguacate, entre otros aspectos.

2.3.2. Embriogénesis somática

La embriogénesis somática es el proceso de iniciación y desarrollo de

embriones desde células que no son el producto directo de la fusión de gametos, es

un fenómeno natural en muchas especies in vivo (Janick, 1993). Los embriones

somáticos tienen, al igual que los cigóticos, la capacidad de formar una nueva planta

después de un proceso de germinación, con la diferencia de que la embriogénesis

somática es un proceso asexual por lo que la nueva planta será exactamente igual a

la donadora de la célula inicial. Aún no se conoce con exactitud el proceso de

inducción de ésta, pero se sabe que implica un cambio drástico en los patrones de

expresión genética mediante el cual las células pasan del patrón normal a uno

embriogénico. Existen dos tipos de embriogénesis somática in vitro, la directa y la

indirecta, en la primera los embriones aparecen directamente sobre el explante

original, en tanto que en la segunda es indispensable obtener un tejido calloso o bien

una suspensión celular embriogénica a partir de la cual se obtendrá la diferenciación

de los embriones somáticos (Tisserat, 1991; Pérez et al., 1999).

Debido a la totipotencia de las células vegetales, la embriogénesis somática

puede ser inducida de tejidos diferenciados y órganos de muchas especies, se

incluye polen, mesófilo, tallo, raíz y protoplastos aislados (Carman,1990).

La embriogénesis somática es un sistema ideal para investigar los procesos

completos de diferenciación de plantas, así como los mecanismos de expresión de

totipotencia en células vegetales, tiene muchas ventajas comparado con la

embriogénesis cigótica; por ejemplo, a) el proceso de embriogénesis es fácilmente

monitoreado, b) el ambiente del embrión puede ser controlado, y c) un gran número

de embriones puede fácilmente ser obtenido (Nomura y Komamine, 1999).

43

Los embriones somáticos son estructuras bipolares con un eje radical-apical y

carecen de conexión vascular con el tejido materno; estas estructuras bipolares son

capaces de crecer y formar plantas; este método es considerado el más eficiente

para la producción masiva de plantas “in vitro”, ya que se puede regenerar un gran

número de plantas por unidad de tiempo (Villalobos y Thorpe, 1991; Gómez, 1998);

Adicionalmente, al cultivar en medio líquido embriones somáticos con ayuda de un

biorreactor, se disminuye el costo de producción de una planta de laboratorio de

cultivo de tejidos, ya que en algunas especies, como por ejemplo en café (Coffea

arabica var. Catimor) se han alcanzado producciones de hasta 72,000 embriones

somáticos/1 de medio con más de un 80% de conversión (Jiménez y de Feria, 1998).

Se entiende por conversión como la supervivencia y desarrollo en fase de propágulo

en condiciones ambientales ex vitro o sea en suelo (Stuart y Strickland, 1984).

Parrot (1993) y Gómez (1998) mencionan que el desarrollo de un sistema

experimental para la regeneración de plantas vía embriogénesis somática incluye los

siguientes pasos: inducción de los embriones somáticos, desarrollo de los embriones

somáticos, proliferación, maduración, germinación y conversión en plantas. Pérez y

col. (1999) indican que consta de las etapas de:

a) Inducción. Proceso de conversión de una célula somática a una célula

proembriogénica, para que éste se presente son factores determinantes el genotipo, el

grado de diferenciación de las células del explante, las auxinas y el aislamiento

celular.

b) Histodiferenciación. Las masas de células proembriogénicas se diferencian

al formar embriones somáticos, mediante una división y diferenciación celular

simultáneas; se requiere la eliminación de las auxinas exógenas para que se detenga

la multiplicación y ocurra la diferenciación; en esta etapa los embriones somáticos

pasan por una serie de estadios intermedios muy similares a los que ocurren en la

embriogénesis cigótica; en las dicotiledóneas estos son: globular, de corazón y de

torpedo, mientras que en las monocoltiledóneas son: globular, coleoptilar y escutelar.

c) Maduración. Durante esta etapa ocurre una elongación celular sin división;

Bewley y Black (1985) mencionan que la maduración es el periodo en el desarrollo

44

del embrión somático en el cual ocurre la expansión de la célula y la acumulación de

sustancias de reserva, para la mayoría de las especies se sabe que los estímulos

que hacen posible la maduración de los embriones son la desecación y el ABA.

d) Germinación. Proceso de elongación y reactivación metabólica de un

embrión somático maduro para convertirse en una plántula; los estímulos requeridos

son tratamientos con frío, incubación en presencia de luz o aplicaciones de ácido

giberélico o citocininas.

De acuerdo con Lozoya (1990) los principales factores que intervienen en la

embriogénesis somática son:

a). Medios de cultivo. Se indica la adición de substancias al medio para

favorecer la embriogénesis, entre ellas se incluyen la tiamina, ácido nicotínico,

piridoxina, glicina, mio-inositol, adenina y auxinas.

b). Luz y temperatura. En zanahoria y cítricos, especies en donde los estudios

de embriogénesis han sido más profundos, se reporta que luz y temperatura son

determinantes para que ésta se presente; en general una intensidad lumínica de

1,000 a 3,000 lux y una temperatura de 25-28°C son adecuadas.

Aunado a lo anterior, la embriogénesis somática es también afectada por el

genotipo de la planta, el tipo y estado fisiológico del explante, los reguladores de

crecimiento y las condiciones de cultivo (Gómez, 1998). Aunque cambios en el pH

inducen la embriogénesis somática en zanahoria (Krikorian y Smith, 1992), en cultivo

de Picea abies, la inducción promedio fue más alta entre pH de 6.5 a 7.5 que entre

pH 5 a 6 (Von Arnold, 1987). En tanto que Rugkhla y Jones (1998) en Santalum

album y S. spicatum obtuvieron una alta frecuencia de inducción de embriogénesis

somática (100%) en medio MS con TDZ (1 o 2 µM) y pH ajustado a 5.8, para el

desarrollo, mantenimiento y multiplicación de los embriones somáticos emplearon

AlA (6 µM) y cinetina (1 µM), y en la germinación AG3 (6 µM).

Además de la multiplicación in vitro de los tejidos vía embriogénesis somática,

también puede aplicarse al callo embriogénico tratamientos mutagénicos y

45

recuperarse los embriones somáticos desarrollados de una sola célula mutada;

dichos embriones serían de mucho mayor valor puesto que no serían quimeras

(Zimmerman, 1988). Los usos de la embriogénesis somática pueden resumirse como

a continuación se anota: propagación clonal (micropropagación o producción de

semilla sintética), mejoramiento del cultivo (selección de células, rescate de

embriones, transformación, hibridación somática y producción de líneas

homocigóticas), producción de metabolitos, eliminación de enfermedades y

conservación de germoplasma (Janick, 1993).

En la actualidad existen varios reportes de estudios realizados en frutales

perennes y otras especies de cultivo para producir embriogénesis somática (Cuadro

1) entre los que se observa que el explante más frecuentemente utilizado es la

nucela y los embriones cigóticos inmaduros, cultivados sobre el medio de cultivo MS

con la auxina 2,4-D en combinación con citocininas como BA, KIN y 2iP. Sin

embargo, es señalado el papel del 2,4-D en la incidencia de la variación genética y

los cambios epigenéticos que aparecen en plantas obtenidas de embriones

somáticos, no obstante que en muy pocas especies de plantas se han realizado

estudios en campo durante varios años de poblaciones regeneradas vía

embriogénesis somática, uno de los ejemplos es en palma de aceite por más de 10

años (Merkle et al., 1996), quienes reportan 11 % más de productividad en las plantas

obtenidas mediante embriones somáticos en relación a las de semilla; además

mencionan que la variabilidad somaclonal es rara y que no existe relación entre el

tiempo de multiplicación in vitro de los embriones y el porcentaje de anormalidades.

2.3.2.1. Embriogénesis somática en aguacate

Mooney y Staden (1987) utilizaron embriones inmaduros obtenidos de frutos de

3 a 4 mm de longitud de los cultivares Fuerte y Duke-7 de P. americana, que fueron

establecidos sobre medio de inducción de callo, MS modificado de acuerdo con

Pliego-Alfaro (1981) y suplementado con sacarosa 30,000 mg/I, tiamina-HCI 0.4 mgll,

mioinositol 100 mg/I, picloram 0.1 mg/l y carbón activado 1,000;mg/l; obtuvieron

46

Cuadro 1. Embriogénesis somática en frutales perennes y otras especies de cultivos.

Reguladores de

crecimientod

Familia Especie Explanteb Medioc Auxina Citocinina Citado por

Anacardiaceae Mangifera indica N,E MS 2,4-D ----- Litz et al. (1984)

Caricaceae Carica papaya S MS AlA KIN Yie y Liaw (1977)

Juglandaceae Juglans regia C * AIB BA, KIN Tulecke y McGranahan (1985)

Lauraceae Persea americana E MS PIC Pliego-Alfaro y Murashige (1988)

Musaceae Musa (AAA, ABB) L,R MS Dicamba ZEA Novak et al. (1989)

Myrtaceae Feijoa sellowiana E MS 2,4-D KIN Cruz et al. (1990)

Myrciaria cauliflora N MS 2,4-D ----- Litz (1984)

Oleaceae Olea europaea E MS 2,4-D BA Rugini (1988)

Palmae Cocos nucifera Inf MS 2,4-D BA,2iP Branton y Blake (1983)

Phoenix dactylifera E MS 2,4-D 21P Reynolds y Murashige (1979)

P. dactylifera ST MS 2,4-D 2iP Tisserat (1979)

Rosaceae Eriobotrya japonica N MS 2,4-D BA Litz (1985)

E. japonica ST MS 2,4-D BA Ho et al. (1986)

E. japonica E MS 2,4-D BA Ho et al. (1986)

Malus x domestica

M. x domestica

Prunus persica

N

C,L

E

MS

N

MS

ANA

ANA

2,4-D

BA

BA

BA, KIN

Eicholtz et al. (1980)

Mehra y Sachdeva (1984)

Raj Bhansali et al. (1990)

Rubiaceae Coffea arabica L MS 2,4-D KIN Sondahi y Sharp (1977)

Coffea canephora S MS 2,4-D KIN Staritsky (1970)

47

Cuadro 1. (Continuación).

Reguladores de

crecimiento

Familia Especie Explanteb Medioc Auxina Citocinina Citado por

Rutaceae

Sterculiaceae

Vitaceae

Citrus liman

Citrus nobilis

Citrus paradisi

Citlus sinensis

Theobroma cacao

Vitis longii

Vitis vinifera

Vitis vinifera

Vitís sp.

N

N

N

N

E

O

N

E

S,L,P

MS

MT

MT

MS

MS

MS

N,MS

N

MS

-----

-----

-----

-----

ANA

2,4-D

NOA

NOA

2,4-D

-----

-----

-----

-----

-----

KIN

BA

BA

BA

Rangan et al. (1968)

Kochba et al. (1982)

Kochba et al. (1982)

Rangan et al. (1968)

Pence et al. (1979)

Gray y Mortensen (1987)

Mullins y Srinivasan (1976)

Stamp y Meredith (1988)

Krul y Worley (1977)

a Medio de inducción.

b C = cotiledón; E = embrión cigótico; Inf = inflorecencia; L = hoja; N = nucela; O = ovario; P = peciolo; R = raíz; S = tallo; ST =

meristemo.

c MS = Murashige y Skoog (1962); MT = Murashige y Tucker (1969); N = Nitsch (1969); * = formación específica.

d KIN = cinetina; PIC = picloram; ZEA = zeatina; AlA = ácido indol-3-acético; AIB = ácido indolbutírico; ANA = ácido

naftalenacético; NOA = ácido naftoxiacético; 2,4-D = ácido diclorofenoxiácetico; 2iP= 2, isopenteniladenina.

48

callo embriogénico el cual lo subcultivaron a intervalos de 2 a 3 semanas en medio

de Dixon y Fuller (1976) suplementado con 3 mg/1 de isopentiladenosina (IPA) y

ácido benzotiazol-2-oxiacético (BTOA); la regeneración de plantas fue lograda a

través del subcultivo de los proembriones globulares en las sales y vitaminas del

medio anterior, sin reguladores de crecimiento. En los estudios histológicos,

observaron que el callo se formó arriba del tejido normal parenquimatoso hacia el

centro de un grupo de células y numerosas células proembrionales en la periferia de

la masa de los callos; la embriogénesis inició en células individuales en la periferia de

los callos y desde células en la superficie de proembriones existentes; los embriones

iniciales pudieron ser reconocidos por su manifiesto contenido de almidón y por sus

paredes gruesas, las cuales carecen de plasmodesmo; las divisiones celulares

ocurren en células con paredes gruesas para dar origen a proembriones globulares;

los proembriones desarrollaron forma acorazonada, de torpedo y en embriones

cotiledonarios y finalmente hacia plantas completas.

Un procedimiento de cultivo de tejidos fue desarrollado para la regeneración de

embriones somáticos de callos cultivados de aguacate; embriones cigóticos

inmaduros de P. americana de 0.6 a 0.8 mm de longitud fueron utilizados como

explante original; el medio basa) contenía sales MS con sacarosa 30,000 mg/I,

tiamina-HCI 0.4 mg/l, mioinositol 100 mg/l y fue solidificado con 8% de agar, el pH fue

fijado a 5.7; la adición de 0.1 mg/1 de picloram al medio de cultivo parece ser crítica

para la iniciación de callos, concentraciones bajas (0.001 - 0.01 mg/I) o altas (1 mg/I)

fracasaron para inducir callos, el desarrollo de embriones fue establecido en las

concentraciones de 0.01 a 0.1 mI/I de picloram; unos pocos embriones bien

desarrollados produjeron brotes verdes; los ensayos para inducir una alta incidencia

de germinación fue desafortunada (Pliego Alfaro y Murashige, 1988).

Litz (1997) explica que el principal objetivo de las investigaciones que realiza en

Florida, USA, es una nueva generación de portainjertos de aguacate con alto nivel

de resistencia a Phytophthora pudrición de la raíz (PRR); en sus estudios tiene 3

objetivos: 1) la hibridación somática de aguacate con especies de Persea resistentes

49

a PRR por medio de la fusión de protoplastos, 2) la transformación genética de

portainjertos de aguacate con genes relacionados a la patogénesis y 3) el desarrollo

de un protocolo eficiente in vitro para micropropagación de los portainjertos actuales

y los futuros. También indica que muchos frutos tropicales y subtropicales pueden

reproducirse vegetativamente por la formación de nucelas, éste es un tejido ovular de

origen materno; así se debe tener la habilidad para demostrar la facilidad de regenerar

las selecciones de aguacate elite por inducción de embriogénesis somática

de nucelas, después de removerse de semillas jóvenes; los embriones nucelares de

aguacate pueden ser utilizados para propagar las selecciones de portainjertos

actuales, pero pueden también ser utilizadas en estudios de transformación genética

en orden para alterar un cultivar importante por un tratamiento, tales como el control

de la madurez de la fruta o PRR.

Se indujo el desarrollo de cultivo de callos a partir de peciolos de hojas, yemas

axilares y embriones cigóticos de nueve variedades de cinco especies de Persea (P.

cinerascens, P. borbonia, P. schiedeana var. G755, P. indica, P. americana cv. Topa

topa y cv. RCF Púrpura, y tres clones vegetativos de P. americana : VC6, VC51 y

VC66), con variación en su resistencia a la pudrición de la raíz del aguacate,

enfermedad causada por el hongo Phytophthora cinnamomi; fueron establecidos

procedimientos de desinfección de explantes y cultivos de callos y suspensiones;

fueron determinados parámetros de crecimiento comparativos para varios callos; la

yema axilar y el peciolo de hoja fueron los mejores explantes para la inducción de

callo en todas las variedades excepto para P. borbonia, la cual fue mejor inducida de

semillas maduras; un alto promedio de supervivencia (70%) de embriones somáticos

fue logrado de callo de aguacate (P. americana) en un medio con ácido abscísico 10

mg/I; brotes o brotes y raíces desarrollaron de embriones somáticos en un 12% y 1 %,

respectivamente, en un medio que contenía 0.1 mg/l de thidiazurón + 0.5 mg/I de

ácido giberélico; los cultivos de Persea se utilizaron para estudiar su respuesta a la

inoculación de P. cinnamomi y para una posible selección in vitro de nuevos clones

resistentes (Raviv et al., 1998).

50

Cruz (1998) a partir de embriones cigóticos inmaduros de aguacate induce la

formación de callo embriogénico en medio de cultivo basado en los

macronutrimentos minerales B5 (Gamborg et al., 1968) y micronutrimentos MS,

tiamina 4 mg/I, mioinositol 100 mg/I, picloram 0.1 mg/l, sacarosa 30 g/I y agar 8 g/I; el

mantenimiento de las masas proembriogénicas fue logrado en el mismo medio de

inducción con excepción de los macronutrimentos, en esta etapa y en las siguientes

usó MS; en la recuperación de embriones somáticos no utilizó reguladores de

crecimiento, en el desarrollo y maduración de embriones utilizó BA (0.1 mg/l) y

solamente en la última etapa empleó AG3 (0.1 M9/0

Un grupo de investigadores de Malaga, España (Perán-Quesada et al., 1999)

estudiaron el efecto del regulador de crecimiento ácido abscísico, la sacarosa y un

agente gelificante (gelrite), sobre la producción y maduración de embriones

somáticos de aguacate; partieron de callo embriogénico del cv. Anaheim, iniciaron

suspensiones en medio basa) MS suplementado con picloram 0.1 mg/l; filtraron las

suspensiones a través de una malla de 2 mm de diámetro y cultivaron la fracción más

pequeña en medio basa) B5 solidificado con 1.7 g/I de gelrite y suplementado

con: 88, 175, 263 mM de sacarosa o 1, 10 y 100 µM de ABA; en el experimento con

gelrite se utilizó medio basa) B5 solidificado con 1.7, 3.4 y 6.8 g/I de gelrite;

encontraron que la concentración del agente gelificante tuvo un efecto significativo

sobre la producción de embriones somáticos observándose que tanto el número de

embriones blanco-opacos, mayores y menores de 5 mm, como el porcentaje de

regeneración, fueron mayores en la concentración más alta de gelrite, 6.8 g/l; la

ytilizapión de elevadas concentraciones de sacarosa también tuvo un efecto positivo

sobre la formación de embriones somáticos blanco-opacos, en dosis de 175 mM de

sacarosa se obtuvo el mayor número de embriones, así como el mayor porcentaje de

regeneración a lo largo de tres subcultivos; los resultados obtenidos con el ABA no

fueron concluyentes.

En Florida, USA, Witjaksono y Litz (1999a) indujeron cultivo embriogénico de

embriones cigóticos inmaduros de aguacate (colectados entre las 3 semanas a 2

51

meses después de la polinización) representado por diferentes razas botánicas e

híbridos complejos; el medio de inducción óptimo consistió de macronutrimentos B5,

micronutrimentos MS, tiamina-HCI 0.4 mg/I, mioinositol 100 mg/l, sacarosa 30 g/I,

picloram 0.41 µM y agar TC 8 g/I; la embriogénesis somática se presentó directamente

de los explantes en medio de inducción, y proliferaron embriones secundarios y

masas proembriogénicas en medio de mantenimiento líquido y en sólido; el

mantenimiento del cultivo embriogénico fue optimizado en líquido, el medio MS

filtrado-esterilizado, se suplementó con sacarosa 30-50 mg/I, tiamina-HCI 4 mg/I y

picloram 0.41 µM; dos tipos de cultivo embriogénico se reconocieron: genotipos que

proliferaron como masas proembriogénicas (tipo-PEM) en presencia de auxina y

genotipos en los cuales la etapa de corazón y las etapas posteriores de embriones

somáticos (tipo-SE) desarrollaron en presencia de auxina; los cultivos embriogénicos

en suspensión llegaron a ser cada vez más desorganizados con el tiempo, y esto fue

asociado con una perdida progresiva del potencial embriogénico.

En otro estudio (Witjaksono y Litz, 199%) utilizaron masas proembriogénicas

de aguacate de cultivos en suspensión para establecer un protocolo en el desarrollo

y maduración de embriones somáticos; los embriones somáticos desarrollaron de

masas proembriogénicas tanto en medio líquido como en semisólido pero sólo los

últimos pudieron desarrollarse para maduración; el tamaño y el número de los

embriones somáticos opacos se afectó por la concentración del agente gelificante

(gel-gro gellan gum), con una óptima respuesta en medio suplementado con 6-7 g/l de

gel-gro; la concentración óptima de sacarosa para la recuperación de embriones

somáticos opacos fue 90 g/I; sin embargo, el desarrollo de los embriones fue

suprimido en esta concentración; consecuentemente, la recuperación de los

cotiledonarios, embriones somáticos opacos fue lograda en medio con 30 g/I de

sacarosa; los embriones somáticos desarrollaron de las masas proembriogénicas

desdiferenciadas requiriendo para ello de medio con un alto promedio de NO-3:NH+

4

(1:0 y 3:1) en comparación con la proporción estándar (2:1) de medio MS; la

germinación de los embriones somáticos fue esporádica.

52

Las investigaciones realizadas indican que el sistema de embriogénesis

somática resulta más rentable en comparación a la organogénesis, esto porque en

poco espacio es posible producir una gran cantidad de embriones somáticos para su

maduración y encapsulación, y así tener semillas sintéticas; además el sistema como

tal, tiene también otras aplicaciones de enorme importancia en el mejoramiento del

aguacate, no obstante que para recuperar los tejidos transformados, seleccionados o

aquellos que se conservaron in vitro se requiere el tener previamente la metodología

de multiplicación de brotes, el enraizamiento y la aclimatación de las plántulas

(organogénesís).

Específicamente en aguacate son pocos los estudios realizados para

determinar un sistema óptimo de embriogénesis somática, máximo cuando la mayor

parte de estos utilizaron embriones cigóticos inmaduros como explante en la

generación de callo embriogénico, situación en la cual no se garantiza la propagación

clonal, y establecen procedimientos imprácticos o compuestos de los medios de

cultivo en muchos casos demasiado costosos; además de que las investigaciones

reportan una germinación esporádica de los embriones maduros o con porcentajes

demasiado bajos. De ahí que se requiere un sistema vía embriogénesis somática

que garantice en primera instancia la propagación clonal, que sea práctico y

altamente eficiente.

2.4. Factores que intervienen en la morfogénesis in vitro

Abdelnour y Vicent (1993) destacan algunos de los factores importantes que

influyen en la inducción de la organogénesis y embriogénesis somática, estos son el

genotipo, edad de la planta, estado fisiológico de la planta al momento de tomar el

explante y condiciones del ambiente in vitro (factores físicos y químicos).

En un estudio en mora (Morus alba L. vars. Chinese white y Kokuso-27) se

encontró que la callogénesis fue dependiente de la naturaleza del explante usado, el

genotipo y los reguladores de crecimiento suplementados en el medio de cultivo; las

53

hojas fueron el mejor tipo de explante usado para inducción de callos (Bhau y Wakhlu,

2001).

2.4.1. Inóculo o explante

La elección del explante (órgano, tejido o fragmento de tejido, células, etc.

cortado u obtenido del material parental para iniciar el cultivo in vitro) adecuado,

constituye el primer paso para el establecimiento de los cultivos, éste variará de

acuerdo con el objetivo perseguido. Se ha demostrado que la edad fisiológica del

mácula es un factor importante en la formación de órganos, entre más joven y menos

diferenciado sea un tejido, más fácil será su adaptación y respuesta al cultivo in vitro

(Halperin, 1996). Esto por el transporte basipétalo de auxinas, al ocurrir una

acumulación en la base del explante, lo cual permite la formación de callo,

producción de raíces y/o inhibición del desarrollo de brotes en las yemas axilares

más cercanas (Lomax et al., 1995; Jensen et al., 1998).

2.4.2. Factores físicos

Entre éstos destacan el pH del medio de cultivo, intercambio gaseoso,

humedad, luz y temperatura.

pH. El grado de acidez o alcalinidad (pH) del medio de cultivo es importante y

específico para cada tipo de planta, al igual que ocurre en el suelo las especies

vegetales responden de manera diferente, por lo que se hace necesario ajustarlo a

los requerimientos de la especie en estudio. Sin embargo, el pH adecuado en medio

de cultivo se encuentra en un rango de 4.5 a 7 para las plantas, es el pH 5.7 el más

generalizado (Abdelnour y Vicent, 1993).

Intercambio gaseoso. Los gases más comunes son O2 (oxígeno), CO2

(dióxido de carbono) y C2H4 (etileno). En recipientes de cultivo cerrados

herméticamente se ha detectado una acumulación de gases (dióxido de carbono

54

CO2, etileno C2H4 y etano) y otras sustancias como etanol y acetaldehído que,

además de influir o controlar el crecimiento, también pueden afectar los procesos de

diferenciación y morfogénesis (Righetti et al., 1990).

En un estudio sobre dosificación de CO2 en nueve especies vegetales, se

observó que el crecimiento en dosis alta de este gas incrementó el número de

mitocondrias por unidad de área celular de 1.3-2.4 veces el número en plantas

control que crecieron en más bajo CO2 y produjeron un incremento significativo

estadísticamente en la cantidad de estroma del cloroplasto (sin presión), membranas

tilacoides, comparado con estos en tratamientos más bajos de CO2; no se

observaron cambios en el tamaño de la mitocondria; sin embargo, en contraste al

efecto del CO2 en el número de mitocondrias, altas dosis de CO2 promueve una

disminución en el promedio de masa basado en la respiración obscura; estos cambios

pueden reflejar un mayor cambio en el metabolismo vegetal y el balance de

energía que puede ayudar a explicar el incremento de la productividad de la planta

en respuesta a elevadas concentraciones de CO2 (Griffin et a/., 2001).

Humedad. En condiciones in vitro la humedad dentro de los recipientes es de

casi 100 %. Por eso la planta in vitro en general no desarrolla sistemas de regulación

hídrica tales como cera, estomas, cutícula, etc (Abdelnour y Vicent, 1993), de ahí que

se dificulte la aclimatación de las plantas micropropagadas.

Luz. Es conocido que la luz es una señal importante para el desarrollo de la

planta, influye en casi todos los aspectos del ciclo de la vida desde germinación

hasta floración (Campbell y Liscum, 2001).

En condiciones in vitro clásicas, la intensidad y calidad de la luz es muy baja

(10 W/m2 en comparación con las condiciones naturales donde la luz puede

presentar una intensidad hasta de 900 W/m2). La calidad de la luz también es muy

baja y se recomienda mezclar diferentes tipos de luz en una misma sala para tener

diferentes longitudes de onda. El espectro útil para los vegetales es de 400 a 700

55

nm. Dos fenómenos importantes dependientes de la luz son: fotosíntesis y

fotomorfogénesis (Abdelnour y Vicent, 1993).

La morfogénesis funciona con la presencia de pigmentos susceptibles a

radiación azul y roja. Las funciones más conocidas son las del pigmento susceptible al

rojo: fitocromo (rojo 660 nm y rojo lejano 730 nm); expansión foliar, elongación de

entrenudos, diferenciación de estomas, síntesis de clorofila, etc. La falta de CO2

disminuye los requerimientos lumínicos de los cultivos, es más importante su papel en

fotomorfogénesis que en fotosíntesis (Cañal et al., 1999).

Las respuestas diversas de las plantas requieren sofisticada sensibilidad de

intensidad, dirección, duración y longitud de onda de la luz; el espectro de acción de

respuesta de la luz tiene previsto pruebas para identificar tres fotorreceptores

absorbentes en el ultravioleta, azul/cercano a ultravioleta y rojo/rojo-lejano (R/FR); el

mejor grupo caracterizado de esos fotorreceptores es R/RF fitocromos absorbentes.

Los fitocromos controlan el desarrollo hasta el final del ciclo de vida de la planta, al

iniciar con la germinación de la semilla y de-etiolación de la plántula (la transición del

crecimiento en la oscuridad a luz), ellos sólo controlan la expansión de la hoja del

cotiledón y elongación del tallo por la regulación de la división celular y expansión;

los fitocromos permiten la percepción de plantas vecinas o la sombra, e influyen la

transición a floración (Neff et al., 2000).

2.4.3. Factores químicos

El medio de cultivo. Consiste en una mezcla de determinadas sustancias

sobre o dentro del cual crecen los explantes. Son combinaciones de sustancias

químicas que los investigadores han descrito después de numerosos experimentos y

que permiten que las plantas crezcan y se multipliquen in vitro. López (1990) indica

que en general los medios de cultivo se encuentran constituidos por los siguientes

compuestos:

56

1. Sales inorgánicas.

A) Macronutrimentos. Además del carbono, hidrógeno y oxígeno, los

elementos más demandados por las plantas son: nitrógeno, fósforo, potasio, calcio,

magnesio y azufre.

El nitrógeno tiene importancia porque forma parte de la estructura de las

moléculas proteicas, ácidos nucleicos, porfirinas que intervienen en la fotosíntesis, en

general es un elemento esencial porque determina en gran medida la tasa de

crecimiento del tejido; al comparar con el ion nitrato NO3- (es la forma más oxidada

del nitrógeno), el ión amonio, NH4+ es la forma más reducida; las plantas utilizan

nitrógeno reducido para su metabolismo, y dentro de la planta el nitrógeno existe casi

en su mayor parte en la forma reducida. El fósforo interviene en la estructura de

moléculas nucleicas y en la síntesis de compuestos de alta energía, además de que

participa en la activación de diversas enzimas; el fósforo es adsorbido por la planta en

forma de iones de fosfato por un proceso que requiere transporte activo con gasto

de energía. El potasio es necesario para la división celular normal, síntesis de

carbohidratos y clorofila y asimilación de nitrógeno, importante en la apertura y

cerrado de estomas, es un activador de enzimas en la síntesis de ciertos péptidos, de

proteínas y de CHOs; los iones de potasio son rápidamente transportados a

través de las membranas y dos de sus funciones más importantes son regular el pH

y el ambiente osmótico dentro de las células (George, 1993; Salgado, 1998).

El calcio es un constituyente de la pared celular en forma de pectato de calcio

y esta involucrado en la plasticidad de las células, ya que la remoción del calcio

incrementa la permeabilidad y la plasticidad de la membrana, entre otras funciones

también está la organización de cromatina en la mitosis, activador de enzimas

(fosfolipasa, arginina-cinasa, ADP fosfatasa y adonil cinasa), número de mitocondrias

y en la translocación de CHOs. El magnesio es importante en los procesos de

fotosíntesis y metabolismo de carbohidratos, es un constituyente de la clorofila,

activador de enzimas (biosíntesis de CHOs, síntesis de ADN y ARN, fijación de CO2 –

RUBISCO y PEP carboxilasa) y agente de unión de ribosomas (síntesis de

57

proteínas). El azufre está presente en algunas proteínas en forma de aminoácidos

azufrados y constituyente de vitaminas (tiamina y biotina), coenzima A, enzimas

(grupos sulfidrilos), síntesis de esteroles y lignina, importante en la fotosíntesis

(síntesis de ferrodoxina); el azufre es absorbido por la planta como S04-2 (George,

1993; Salgado-Garciglia et al., 1997; Pérez et al., 1999).

b) Micronutrimentos. Los más importantes son fierro, manganeso, zinc, boro,

cobre, cobalto y molibdeno, estos últimos cinco son fundamentales para la síntesis

de clorofila y la función de los cloroplastos (López, 1990). El fierro es requerido para

la formación de los precursores de la clorofila, tiene incorporación en citocromos y

ferrodoxina, y es componente de varias flavoproteínas (peroxidasas y catalasas). El

manganeso es necesario para el mantenimiento de la ultraestructura y el proceso

fotosintético (la actividad del fotosistema II es proporcional al contenido de

manganeso), esencial en los pasos de transferencia de electrones, activador de

enzimas en: ciclo de Krebs, reducción de nitratos y oxidación del ácido indolacético

(AIA). Cobre y zinc se requieren en la oxidación e hidroxilación de compuestos

fenólicos, el zinc además participa en la síntesis de AlA, a través de la síntesis de

triptofano (triptofano sintetasa). Molibdeno y fierro forman parte de las enzimas

nitrato reductasa y nitrogenasa. Cobalto es el metal componente de la vitamina B12,

la cual se involucra en la síntesis de ácidos nucleicos. Boro es necesario para el

mantenimiento de la actividad meristemática, está involucrado en la síntesis de

bases nitrogenadas, en particular uracilo, interviene en el transporte de CHOs dentro

de la planta y facilita transporte a través de membranas (George, 1993; Salgado,

1998).

2. Agentes quelatos. Son compuestos orgánicos que son capaces de formar

complejos con cationes metálicos, en los cuales el metal es sostenido por medio de

enlaces. Son moléculas que retienen un ión de metal con varias uniones químicas al

formar un complejo en forma linear o de anillo (EDTA= ácido etilendinitrotetra-

acético) (López, 1990; George, 1993).

58

3. Vitaminas. Se requieren en la realización de una serie de reacciones

catalíticas en los sistemas enzimáticos y se emplean en pequeñas cantidades. Las

más utilizadas son: tiamina (vitamina B1) es la única realmente esencial en casi todos

los tejidos vegetales, ácido nicotínico (niacina), piridoxina (vitamina B6), ácido

pantoténico ayuda en el crecimiento de ciertos tejidos, ácido fálico disminuye la

proliferación de tejido en la oscuridad, mientras que en la luz la aumenta, riboflavina

inhibidor del crecimiento de raíces, vitamina E ayuda a la formación de callos y en

cultivos en suspensión ayuda la viabilidad de las células y mioinositol no es

propiamente una vitamina sino un azúcar-alcohol que tiene efecto estimulante en la

morfogénesis y ayuda a la formación de varios constituyentes celulares como el

ácido ascórbico y la pectina, además de otros compuestos que intervienen en la

división celular (López, 1990; Salgado-Garciglia et al., 1997).

4. Aminoácidos. Se utilizan como fuente de nitrógeno; glicina es el único

aminoácido usado en medios de cultivo para células vegetales; caseína hidrolizada

se emplea para enriquecer en nitrógeno el medio de cultivo; otros arginina, L-

metionina, glutamina y asparagína (Salgado-Garciglia et al., 1997).

5. Reguladores decrecimiento. (Véase apartado 2.1.).

6. Carbohidratos. Se utilizan como fuente de energía y como reguladores

osmóticos. La sacarosa es la mejor fuente de carbono (George, 1993), y es el azúcar

más empleada, le siguen la glucosa, maltosa, rafinosa, fructosa y galactosa, manosa

y lactosa (López, 1990). Se adiciona usualmente en cantidades de 20 a 45 g/l; al

esterilizar el medio se obtiene la combinación de sacarosa, D-glucosa y D-fructosa

(Salgado-Garciglia et al., 1997).

7. Agentes gelificantes. El agar se ha empleado como soporte en los medios

sólidos y semisólidos, es un derivado de una alga marina; es un polisacárido con una

elevada masa molecular que tiene capacidad de gelificar los medios (Pierik, 1990).

Generalmente se emplea agar-agar a una concentración de 0.5 a 0.6%. Se ha

59

estudiado el efecto de la concentración y marca comercial de agar, los resultados

indican que no existe una correlación entre las características y el crecimiento de las

plantas (Cañal et al., 1999).

8. Agua. Es el compuesto más abundante (95%) del medio de cultivo, por lo

tanto la purificación es necesaria, misma que se lleva a cabo por destilación, por

intercambio de iones y por ósmosis inversa (George, 1993). Se utiliza agua

destilada, bidestilada y desionizada.

Por otra parte las tasas de crecimiento, desarrollo y muchas de las

características fisiológicas y morfológicas de las plantas formadas in vitro están

influenciadas por el ambiente físico, químico y gaseoso de los recipientes (Kozai et

al., 1992; Buddenford-Joosten y Woltering, 1994). Este mismo grupo de

investigadores hacen una clasificación de los factores que pueden afectar al

crecimiento y morfogénesis de las plantas ín vitro (Figura 1), mencionan que los

fenómenos que controlan los cambios ambientales en el interior de un recipiente de

cultivo son similares a los que ocurren en el interior de un invernadero, ya que de

hecho un recipiente de cultivo es, hasta cierto punto, un invernadero en miniatura

mantenido en condiciones asépticas. De manera concreta Cañal y col. (1999)

resumen algunas de las respuestas más habituales de los explantes introducidos en

cultivo, como resultado de la interacción que se produce entre los explantes y las

características ambientales descritas (Cuadro 2).

60

61

Cuadro 2. Respuesta al ambiente en la micropropagación convencional.

Tejidos Planta

1. Disminución o alteración del contenido

de ceras epicuticulares

1. Menor tasa de crecimiento

2. Funcionamiento estomático anormal 2. Crecimiento suculento

3. Disminución del contenido de clorofila 3. Desordenes fisiológicos y morfológicos

4. Menor peso seco final 4. Formación de pocas raíces secundarias

5. Disminución del área foliar 5. Elevada variabilidad en tamaño, forma

y estado de desarrollo

6. Disminución del número estomático 6. Mayor frecuencia de mutaciones

7. Menor desarrollo anatómico 7. Presencia de contaminaciones

Lo anterior explica las dificultades para aclimatar plantas cuando existen

problemas en la regulación estomática que provoca estrés hídrico y la existencia de

menor cantidad de ceras epicuticulares; de ahí que debido a las condiciones

anatómicas y fisiológicas de las plántulas que se desarrollaron in vitro, se requiere

mantener una alta humedad los primeros días después del transplante; para este

propósito un significativo número de laboratorios comerciales tienen sistemas de

nebulización o bien recurren al uso de antitranspirantes como Folicote (Preece y

Sutter, 1991).

62

III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Localización del sitio de investigación

La presente investigación se desarrolló en los laboratorios de Biotecnología -

Cultivo de Tejidos Vegetales e invernadero del Campo Experimental Forestal y

Agropecuario Uruapan, perteneciente al Instituto Nacional de Investigaciones

Forestales, Agrícolas y Pecuarias, ubicado en la ciudad de Uruapan, Michoacán, en

el Instituto de Investigaciones Químico-Biológicas de la Universidad Michoacana de

San Nicólas de Hidalgo, Ciudad Universitaria Morelia, Michoacán y en el Centro de

Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional Unidad

Irapuato, Guanajuato.

3.2. Material biológico

Los explantes empleados en el sistema de organogénesis fueron yemas

axilares que se encontraban en el último crecimiento de las ramas laterales de un

árbol de aguacate criollo raza mexicana, Persea americana Mill. var. drymifolia, de 32

años de edad. En tanto que para el sistema de embriogénesis somática se utilizaron

nucelas obtenidas de frutos de 10 a 12 mm de diámetro, también de un solo árbol de

aguacate, P. americana cv. Hass, de 12 años de edad; ambos fueron seleccionados

en el área del Campo Experimental Uruapan.

3.3. Reactivos utilizados

Los diferentes medios de cultivo o soluciones que se emplearon en el estudio,

se prepararon con los reactivos que se anotan en el Anexo 1.

63

3.4. Organogénesis de aguacate criollo

3.4.1. Definición de las condiciones asépticas del explante

Las pruebas en desinfección del explante se llevaron a cabo en dos formas:

superficial o externa e interna. En la desinfección externa se realizaron 6 pruebas

con diferentes combinaciones en dosis del fungicida Benlate (benomilo, 1 y 2 g/I),

fungicida-bactericida Agrimicin 500 (sulfato de estreptomicina + clorhidrato de

oxitetraciclina + oxicloruro de cobre, 1 y 2 g/I) e hipoclorito de sodio comercial (20, 40

y 60%), además de probar diferentes tiempos de permanencia (10, 15 y 20 minutos)

del explante en el producto y realizar la desinfección en diferentes épocas del año.

Desinfección interna. Para eliminar los patógenos endógenos en el explante,

se llevaron a cabo cuatro pruebas: en la primera se probó la dosis de Benlate (0, 0.5,

1.0 y 2.0 g/l de medio de cultivo); además se evaluó si este producto se inactiva con

la esterilización. En cada tratamiento se utilizaron 6 frascos tipo Gerber® con 3

explantes por frasco en 20 ml de medio, preparado con las sales minerales

completas y vitaminas del medio MS (Murashige y Skoog, 1962) con BA 1 a 2 mg/l,

AIB 0.5 y 0.66 mg/I, azúcar 30 g/I, agar 7 g/I, pH 5.7 y ácido ascórbico 25 mg/l;

se midió el porcentaje de contaminación a los 4, 6 y 12 días después del

establecimiento y el porcentaje de necrosis únicamente a los 12 días.

En la segunda prueba se probaron dos factores, la interacción Benlate con

Agrimicin 500 (0 - 0, 1 - 0, 1 - 0.5, 1 - 1, 0.5 - 1 y 0 - 1 gll de medio de cultivo) y

tiempo de permanencia del explante en el medio con los productos anteriores

(permanencia continua, 7, 14 y 21 días), el medio empleado fue MS con la mitad de

sus sales minerales, suplementado con vitaminas MS, BA 1.0 mgll, AIB 0.5 mg/l,

azúcar 30 g/I, agar 7 g/I, pH 5.7 y ácido ascórbico 50 mg/I; en este medio se

incorporó el fungicida y el fungicida - bactericida en las dosis indicadas, se prepararon

54 tubos de ensaye con 10 ml de medio y se emplearon 3 tubos por

tiempo de permanencia en cada tratamiento, con una microestaca o yema axilar

64

establecida por tubo; la variable tomada fue solamente porcentaje de contaminación

a diferentes tiempos en cada tratamiento.

La tercera prueba contempló nuevamente la evaluación de dos factores, la

interacción Benlate con el bactericida Agrimicin 100 (1 -1, 1 - 0, 0 -1, 0.5 - 0.5 y 0 - 0

g/I de medio de cultivo) y tiempo de permanencia del explante en el medio con el

fungicida y bactericida (8, 16, 31 y 50 días), en cada tratamiento del primer factor se

emplearon 25 tubos de ensaye con 10 ml de medio de cultivo cada uno y en el

segundo factor se recultivaron 5 yemas axilares una por tubo después del período

de permanencia, el medio de cultivo fue preparado con sales MS a 1/5 parte de sus

macroelementos y microelementos, vitaminas MS, mioinositol 100 mg/I, BA 2 mg/I,

AIB 0.2 mg/l, azúcar 30 g/I, agar 6 g/l, pH 5.7 y ácido ascórbico 25 mg/I; se registró el

porcentaje de contaminación y el de necrosis a 8, 17, 24, 31, 41 y 53 días del

establecimiento o del recultivo a medio sin los pesticidas para determinar el mejor

tratamiento.

Por último y con la finalidad de observar la posibilidad de eliminar los

pesticidas del medio de cultivo y evitar la contaminación, se realizó la prueba de

tiempos de permanencia del explante en solución con Benlate y Agrimicin 100 en

dosis de 1 g/I de cada producto, los tratamientos evaluados fueron: 0, 24, 48 y 73

horas y posteriormente siembra en medio sin pesticidas, en contraste con siembra en

medio con Benlate 1 g/I; se establecieron 20 explantes por tratamiento en tubo de

ensaye y se obtuvo el porcentaje de contaminación.

3.4.2. Prevención de necrosis del explante

Se realizaron dos tipos de tratamientos para evitar la necrosis del tejido de las

microestacas de aguacate utilizadas como explante. Para lo anterior se dio un lavado

continuo al explante a chorro de agua; se probó tiempo de permanencia del explante

a chorro de agua (15, 30, 60 y 90 minutos). Posteriormente, de la desinfección de las

microestacas y previo a su establecimiento en el medio de cultivo se probaron en

65

solución acuosa, las dosis siguientes del antioxidante ácido ascórbico: 0, 100, 200,

300 y 400 mg/I, con una permanencia del explante en la solución de 30 y 60 minutos,

para su posterior establecimiento en el medio sin el antioxidante, en contraste con el

tratado a 100 mg/1 de ácido ascórbico durante 30 minutos y colocado en medio con

antioxidante. El medio de cultivo empleado fue MS a 1/5 parte de su concentración

complementado con vitaminas MS, mioinositol 100 mg/l, BA 2 mg/l, AIB 0.2 mg/I,

azúcar 30 g/I, agar 6 g/I y Benlate 1 g/I, a los 13 días se recultivaron todos los

explantes de los tratamientos al mismo medio, pero sin Benlate; se utilizaron 10

tubos de ensaye por tratamiento con un explante por tubo; las variables evaluadas

fueron: porcentaje de oxidación a los 30 días, y porcentaje de brotación a los 70 días.

3.4.3. Tipos y dosis de reguladores de crecimiento y otros compuestos del

medio de cultivo para lograr la organogénesis in vitro de aguacate criollo

3.4.3.1. Inducción de brotes

Se realizaron 8 pruebas preliminares con la finalidad de inducir la brotación in

vitro de las yemas axilares contenidas en microestacas de aguacate; en la primera se

evaluaron los medios de cultivo con los reguladores de crecimiento reportados por

Neel y col. (1982) en Persea indica, González y Salazar (1984) en P. americana raza

antillana, González y col. (1985) en P. schiedeana, Shall (1987) en P. americana cv.

Fuerte y el de Solórzano-Vega (1989) en P. americana cv. Colin V-33. Sin embargo,

las pruebas que aportaron resultados concluyentes fueron dos: a) concentración de

sales minerales MS, WPM y Mc Cown's, los tratamientos evaluados se presentan en

el Cuadro 3, y b) barrido de reguladores de crecimiento citocinina - auxina en sales

minerales MS, BA (0, 1, 2 y 3 mg/l) - AIB (0, 0.2, 0.5 y 1 mg/l), se formaron 16

tratamientos.

El medio de cultivo se complementó con vitaminas MS, mioinositol 100 mg/l,

BA 2 mg/I, AIB 0.2 mgll, azúcar 30 g/l, agar 6 g/I, pH 5.7, Benlate 1 g/I y ácido

ascórbico 50 mg/l, excepto el tratamiento 6 en el cual la dosis de reguladores fue de

66

2 mg/1 de BA y AIB. Se establecieron 25 yemas axilares por tratamiento y a los 16

días se recultivaron en medio sin fungicida. Se registró el porcentaje de brotación y

establecimiento a los 55, 100 y 127 días y el crecimiento del brote principal, para

obtener esta última variable se obtuvo la longitud promedio de los brotes en mm a los

72, 96, 100, 117 y 127 días.

En el barrido de reguladores de crecimiento BA - AIB el establecimiento

fue en 5 frascos por tratamiento con 4 yemas axilares por frasco, en medio base

MS al 40% de sales, vitaminas MS, mioinositol 100 mg/I, azúcar 30 g/l, pH 5.7, agar 5

g/l, Benlate 1 g/I y ácido ascórbico 50 mg/I; se recultivaron en medio sin Benlate a los

22 días. Se obtuvo el porcentaje de brotación y establecimiento a los 60, 96 y 110

días, así como la longitud del brote principal a los 96 y 110 días.

67

3.4.3.2. Multiplicación de brotes obtenidos in vitro

Con la finalidad de multiplicar in vitro los brotes de aguacate obtenidos de la

fase de iniciación se establecieron dos experimentos, en el primero se evaluó la

interacción BA - AIB (0 - 0, 0.5 - 0.05, 1 - 0.1, 1.5 - 0.15 y 2 - 0.2 mg/I) en sales

minerales modificadas completas (Cuadro 4) y a 1/2 de su concentración con

adenina 40 mg/I, se establecieron 10 frascos por tratamiento con tres explantes por

frasco; las variables obtenidas fueron: número y longitud de brotes a los 40 y 70 días.

En tanto que el segundo estudio y más concluyente, con sales MS completas y sin

adenina, se realizó un barrido de reguladores de crecimiento BA (0, 0.3, 0.6 y 0.9

mg/I) y AIB (0, 0.05, 0.1 mg/I), así se formaron 12 tratamientos con 10 frascos y tres

explantes por frasco en cada tratamiento; se consideraron las variables de: días a

brotación, color del brote, formación de callo y de brote, número de brotes laterales

por explante - frasco y longitud de los brotes.

3.4.3.3. Enraizamiento de brotes obtenidos in vitro

En dos experimentos se determinó el medio de cultivo óptimo para el

enraizamiento in vitro de brotes de aguacate; en el primero se probaron dos tipos de

sales minerales (MS y modificadas, Cuadro 4) y las auxinas: AIB (0, 0.5, 0.8, 1.1 y

1.4 mg/I), ANA (0, 0.3, 0.6, 0.9 y 1.2 mg/I) y la interacción AIB 0.5 mg/1 - ANA 0.3

mg/I. En el segundo experimento con sales minerales MS completas se estudiaron

dosis de AIB (0, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 y 1.2 mg/I) y la interacción AIB - AG3 en dosis de

0.6 - 0.125, 0.8 - 0.125, 1.0 - 0.125 y 1.0 - 0.25 mg/I; en los dos estudios la unidad

experimental fue el frasco con tres explantes y 10 frascos por tratamiento. Las

variables evaluadas fueron: inicio de emisión de raíces, número de raíces por frasco

- brote, porcentaje de brotes con raíz, promedio de raíces por brote y longitud de

raíz.

68

Cuadro 4. Composición de sales minerales MS y modificadas en macroelementos,utilizadas en las pruebas de multiplicación y enraizamiento in vitro debrotes de aguacate.

Cantidad (mg/1)

Compuesto MS Modificadas

NH4NO3 1,650 1,000

KNO3 1,900 800

CaCl2 2H2O 440 0

Ca(NO3)2 4H2O 0 1,250

MgSO4 7H2O 370 1,250

KH2PO4 170 382

3.4.4. Aclimatación de plántulas de aguacate obtenidas in vitro

Se probaron diferentes sustratos y procedimientos para aclimatar en el menor

tiempo y con alta supervivencia las plántulas de aguacate obtenidas in vítro, en total

se realizaron 9 pruebas (Cuadro 5) en donde las variables medidas fueron porcentaje

de supervivencia y altura de planta.

Debido a que en las primeras pruebas se obtuvieron resultados negativos, fue

necesaria la realización de estudios citológicos, esto para determinar con precisión el

estado de desarrollo de las células compañeras o estomáticas; se llevaron a cabo

observaciones de estomas y cutícula de hojas de plántulas obtenidas en laboratorio

por cultivo de tejidos en comparación con hojas de plantas de vivero y árbol adulto,

este estudio proporcionó información que sirvió en gran medida para dirigir los

tratamientos a las plántulas; los datos se obtuvieron al utilizar un microscopio de

fases con un ocular 10X, objetivo 40X y un micrómetro ocular en rejilla de 1 mm2, se

midió la frecuencia de estomas (FE), frecuencia de células no estomáticas (FCNE) e

índice estomático (IE) que se determinó con base en la siguiente formula

(Barrientos y Sánchez, 1987)

69

Cuadro 5. Tratamientos evaluados en las nueve pruebas de aclimatación de brotesde aguacate criollo obtenidos in vitro.

No. Descripción de prueba Tratamientos1 Protección de pérdida de humedad. 1. Entrada de aire.

Sustrato de turba tratado con benlate 1g/I y fertilizado con 2. Cierre total con bolsa de polietileno.30-10-101 g/1. 4 repeticiones por tratamiento.

2 Evaluación de sustratos. 1. Sustrato de turba 100%Sustratos tratados con benlate 1 g/I y fertilizados con 30- 2. Sustrato de turba 50% + arena 50%.10-10 1 gll.16 repeticiones por tratamiento.

3 Evaluación de sustratos. 1. Sustrato de turba 100%Sustratos tratados con captan 15 g/l + benlate 1 g/I yfertilizados con 30-10-101 g/l + raizal 5 g/I + ácido húmico 0.5 cc/I.2 repeticiones por tratamiento.

2. Tierra "topuri" 50% + arena 50%

4. Evaluación de sustratos. 1. Agrolita 100%Sustratos tratados con: a) captan 7.5 g/l + benlate 1 g/I y 2. Arena de "tezontle" 100%fertilizados con 30-10-10 3. Sustrato de turba 100%1 g/l + raizal 5 g/I + ácido húmico 0.5 cc/I + bayfolan 1 g/I; 4. Tierra "topuri" 100%al momento del trasplante se aplico radix 1500 (1500 ppm 5. Arena + Sustrato de turba 50% c/ude AIB). 6. Arena + tierra 50% c/ub) captan 7.5 g/I + benlate 1 g/l y fertilizado con raizal 5 g/I 7. Corteza de pino 100%+ medio liquido MS 100% complementado con vitaminas 8. Arena + corteza 50% c/uMS, mioinositol, AIB 0.5 mg/l, AG3 0.25 mg/I, azúcar 3%, 9. Sustrato de turba+corteza 50% c/upH 5.7. Se establecieron 5 repeticiones por tratamiento 10. Tierra + corteza 50% c/u.

11. Sust. de turba 70% + agrolita 30%.5 Evaluación de intensidades de luz. 1. Intensidad de luz ±250 luxes

Sustrato de turba 70% + agrolita 30%, se trato con ridomilcobre 8 g/1 + agrimicin 1005 g/l y se fertilizo con 30-10-10 1 g/l + 0.5 cc/l de ácidohúmico. 5 repeticiones por tratamiento.

2. Intensidad de luz ±4000 luxes

6 Evaluación de fertilización líquida y reguladores de 1. Fertilización MS 100% con vitaminascrecimiento. MS, mioinositol, BA 0.5, AIB 0.25Sustrato de turba 70% + agrolita 30%, esterilizado en mg/I, AG3 0.25 mgll, azúcar 3%, pHautoclave y tratado con benlate 1 g/l. 15 repeticiones por 5.7. A 5 plantas se les aplicó ac.tratamiento. Acetilsalisilico (ASA) 500 mg/I y a 5

2. ac. Absicico (ABA) 4.4 mg/l.Fert. 30-10-10 1 g/I + ácido húmico0.5 cc/I + bayfolan 1 g/I + raizal 2 g/I.

7 Evaluación de ASA y Folicote. 1. Aplicación de ASA 250 mgllSustrato arena 50% + turba 50%, tratado con benlate + 2. “ “ Folicote (49.46% agua,agrimicin 100 + ridomil 1 g/I de c/u y fertilizado con 30-10- 41.6% parafina y cera refinada, 4.5%10 1 g/I + raizal 5 g/l. 20 repeticiones por tratamiento. aceite mineral, 4.3% emulsificante y

0.14% preservativos), en dosis de 1parte en 20 de agua.

3. Control.8 Evaluación de Folicote. Dosis de Folicote

Sustrato de turba 70% + agrolita 30%, se trato con 1. 1 parte en 20 de agua.benlate + agrimicin 100 + ridomil 1 g/l de c/u y se 2. 1.5 " " " "humedeció con medio líquido'/2 de MS con vitaminas MS 3. 2 " " " "y mioinositol, se ajustó el pH a 5.7. Con 10 repeticionespor tratamiento y 20 en el control.

4. Control.

9 Evaluación de tratamiento de preaclimatación. 1. Folicote 1 parte en 20 de agua.Sustrato de turba 70% + agrolita 30%, se trato con 2. Tratamiento de preaclimatación 25benlate + agrimicin 100 + ridomil 1 g/I de c/u y se días antes del trasplante, en mediohumedeció con medio líquido'/2 de MS con vitaminas MS de enraizamiento con tapa y filtroy mioinositol, se ajustó el pH a 5.7. Adicionalmente se uso bacteriológico.un promotor de enraizamiento Tri-raíz en dosis de 12.5 3. Control.cc/1. Con 10 repeticiones por tratamiento.

70

3.5. Embriogénesis somática de aguacate cv. Hass

3.5.1. Desinfección de frutos y procedimiento de extracción de la nucela

Los frutos fueron primeramente lavados con detergente y cepillo, se llevaron a

campana de flujo laminar, se enjuagaron con agua destilada - estéril y asperjados

con etanol, posteriormente se realizó un corte del fruto por la parte media, de cada

mitad se extrajo el tejido nucelar con pinzas, se eliminó con ayuda del bisturí el tejido

adyacente.

3.5.2. Productos y procedimientos para evitar la necrosis-oxidación de la

nucela

Basado en los resultados obtenidos en trabajos para evitar la necrosis in vitro

de yemas axilares de árbol adulto, en donde se realizaron tratamientos con ácido

ascórbico, se utilizó en este estudio con nucelas los productos y procedimientos que

a continuación se describen: 1) cisteína 0 (control) y 10 mg/l adicionada al medio de

cultivo, 2) inmersión antes de su establecimiento in vitro, en solución con 0 (control) y

400 mg/i de ácido ascórbico durante 5 segundos y 3) incubación bajo luz con

intensidad de 9.4 µEm-2s-1, con 16 horas de luz por 8 de oscuridad y oscuridad

completa (control) hasta la generación de callo embriogénico; en este experimento se

aplicaron ocho tratamientos en total, al interaccionar los dos niveles de cada factor

2 x 2 x 2 = 8. Se utilizaron 25 nucelas por tratamiento en dos repeticiones,

establecidas en tubos de ensaye de fondo plano de 95 x 25 mm, con medio de

generación de callo embriogénico, formado con: sales minerales MS a 1/2 de su

concentración, mioinositol 100 mg/l, ácido nicotínico 1 mg/I, píridoxina 1 mg/l, glicina

1 mg/l, tiamina 10 mg/l, caseína hidrolizada 200 mg/I, picloram 2 mg/I, sacarosa 30

g/I y agar-agar 4.4 g/l, se ajustó el pH a 5.7. La variable medida fue solamente

porcentaje de necrosis.

71

3.5.3. Tipo y dosis de reguladores de crecimiento, para lograr la embriogénesis

somática de aguacate cv. Hass

3.5.3.1. Generación de callo embriogénico

En esta fase del sistema se establecieron dos experimentos, en el primero se

utilizó la concentración completa de sales minerales MS y a 1/2, y dosis de las

auxinas 2,4-D (0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 y 1 mg/l) o picloram (0, 0.05, 0.1, 0.5 y 1 mg/I).

El medio basa) tenía vitaminas MS, mioinositol 100 mg/I, tiamina 0.5 mgll, azúcar

comercial 30 g/l y phytagel 2 g/l, se ajustó el pH del medio a 5.7. En el segundo

experimento también se utilizaron sales MS completas y a 1/2, se aumento el

nitrógeno en forma orgánica en el tratamiento MS a 1/2, al adicionar 200 mg/l de

caseína hidrolizada y se incremento en la concentración completa de MS la dosis de

KN03 en un 25%; en cada uno de estos tratamientos se probaron diversas

combinaciones de picloram - AIB (0 - 0, 1 - 0.1, 2 - 0.2, 4 - 0.4 y 2 - 0 mg/l) y 2,4-

D - BA (0 - 0, 1 - 0, 2 - 2 y 4 - 2 mg/I), suplementados los medios de cultivo con

mioinositol 100 mgll, tiamina 10 mg/l, sacarosa 30 g/l y agar-agar 4.4 g/I.

Adicionalmente, en los medios con sales minerales MS a 1/2 se utilizó ácido

nicotínico, piridoxina y glicina en dosis de 1 mg/1 de cada compuesto y cisteína 10

mg/l; en tanto que en los medios con sales MS completas la dosis de cisteína

utilizada fue 7.5 mg/l. En el primer estudio se utilizaron de 7 a 12 nucelas por

tratamiento y en el segundo de 10 a 20, inoculadas en tubo de ensaye de 150 x 24

mm y en caja de petri de vidrio de 90 mm de diámetro. Las variables fueron:

porcentaje de formación de callo, diámetro en mm y color de callo.

3.5.3.2. Multiplicación y desarrollo de embriones somáticos

En el proceso de multiplicación y desarrollo de embriones somáticos se evaluó

medio sólido y líquido en nueve pruebas, al utilizar medio base MS suplementado

con tiamina 4 mg/l, mioinositol 100 mg/I, sacarosa 30 g/l, agar-agar en medio sólido 5

g/l y se ajustó el pH a 5.7, se probaron los reguladores BA (0.11 mg/l), AG3

(0.11mg/l) y picloram (0.1, 0.3, 0.6, 0.9 y 1 mg/I), así como el compuesto nitrogenado

72

orgánico caseína hidrolizada (0, 200, 400, 600, 800 y 1,000 mg/l) y el efecto de la luz

indirecta (9.4 µEm-2s-1) y de la oscuridad sobre la multiplicación y desarrollo de los

embriones; la siembra del inóculo en medio sólido se llevó a cabo en cajas de petri

de 90 mm de diámetro y en líquido en matraces Erlenmeyer de 125 ml, se utilizaron 2

g de inóculo en 12.5 y 25 ml de medio, mismos que después del establecimiento se

colocaron en un agitador orbital a 100 rpm, también para la multiplicación en medio

líquido se empleó un biorreactor de 2 litros de capacidad, aunque se preparó

solamente 1 litro de medio de cultivo y se establecieron 5.0363 mg/ml de masas

proembriogénicas y embriones somáticos globulares. Se contaron masas y

embriones, se determinó viabilidad por observación directa en microscopio de

epifluorescencia previa tinción con diacetato de fluoresceína (Widholm, 1972),

además se obtuvo la ganancia de peso del inóculo.

3.5.3.3. Maduración de embriones somáticos

Con base en los resultados de Cruz (1998) y de Witjaksono y Litz (1999b), al

tomar como medio base el empleo de sales MS complementadas con tiamina 4 mg/l,

mioinositol 100 mg/l, sacarosa 30 g/l, agar-agar 5 g/I y se ajustó el pH a 5.7, se

evaluó el efecto del ABA (0, 1, 2, 4 y 8 mg/l), sacarosa (30, 40, 50, 60, 70 y 90 g/I),

agar-agar (5, 6, 7, 8, 10, 11, 14, 20 y 30 g/I) y manitol (70, 90, 110 y 130 g/l) sobre la

maduración de los embriones somáticos, las pruebas realizadas (8) se establecieron

en caja de petri de 90 mm de diámetro con medio sólido y de 5 a 10 cajas por

tratamiento; se utilizó como explante embriones somáticos en fase globular, corazón y

torpedo; las variables evaluadas fueron: número promedio de embriones maduros

por caja y tamaño del embrión (ancho x largo en mm).

3.5.3.3.1. Análisis de almidón y glucosa de embriones somáticos maduros

Adicionalmente a los embriones somáticos maduros se les realizó un análisis

de almidón y glucosa; para determinar almidón se utilizó el método semicuantitativo

que consiste en: hacer cortes muy finos del tejido vegetal, colocar dichos cortes en

73

un portaobjetos, agregar de una a dos gotas de lugol (2 g de yoduro de potasio + 1 g

de yodo en 250 ml de agua) y esperar 5 minutos, después de ese tiempo observar

los cortes al microscopio de fases. En la determinación de glucosa se utilizó el

reactivo Glucosa (oxidasa) que es un método enzimático, colorimétrico, de punto final

(Hycel No. 70408 con Reg. No. 0930R87 S.S.A.); el procedimiento consistió en:

obtener el peso de 5 embriones somáticos maduros, disolver 2.142 g del reactivo

Glucosa (oxidasa) en 100 ml de agua destilada y de ahí se tomaron 2.5 ml a cada

tubo de ensaye (6), un blanco y cinco de problema; moler los embriones somáticos

en mortero, colocado este en hielo y agregar 1 ml de agua destilada; obtener el

embrión del mortero y colocar en un tubo Eppendorf y centrifugar a 3,000 rpm por 20

minutos; adicionar 0.02 ml de la solución superficial de cada tubo Eppendorf a los 2.5

ml de la solución con el reactivo que contenía por tubo de ensaye y se calentaron a

37°C por 30 minutos; se observó el cambio de color al dejar en reposo por 10

minutos; se tomó el porcentaje de transmitancia en espectrofotómetro a 520 nm; se

sacó el valor en curva de calibración (Glucosa mg/100 ml) y por último se obtuvo la

cantidad final de glucosa por mg de peso de cada embrión somático, basado en el

valor obtenido en la curva de calibración que es al peso inicial de cada embrión.

3.5.3.4. Germinación de embriones somáticos

Se probaron diferentes dosis de reguladores de crecimiento y procedimientos

para germinar embriones somáticos maduros; la interacción BA - AG3 (0.11 - 0.11,

0.11 - 0.24 y 0.11 - 0.36 mg/I en primera evaluación y 0 - 0, 0.5 - 0, 1.25 - 0, 0.2 - 0.1 y

0.1 - 0.1 mg/1 en la segunda ), el barrido de reguladores BA (0, 0.3, 0.6 y 0.9

mgll) - AIB (0, 0.03 y 0.06 mg/I), todo ésto en medio de cultivo sólido; siembra de los

embriones en sustrato de turba previamente esterilizado y humedecido con medio

líquido MS 1/2 de concentración, complementado con mioinositol 100 mg/l, vitaminas

MS, BA 2 mg/I y se ajustó el pH a 5.7; prueba de germinación en caja de petri con

papel filtro humedecido con medio líquido MS suplementado con mioinositol 100

mg/I, tiamina 4 mg/I, BA 0, 3 y 6 mg/I en primera evaluación bajo este sistema y en la

segunda BA 0, 0.5, 1 y 2 mg/l, TDZ 0.1, 0.5 y 1 mg/l, BA - AIB (2 - 0.2 mg/l),

74

sacarosa 30 g/I y pH 5.7; en caja de petri con medio sólido se evaluó

brasinoesteroides (0.1 mg/I) en interacción con BA (0.05 mg/I) - AG3 (0.1 mg/l) y con

agua de coco (200 ml/l) - carbón activado (50 mg/I) - glutamina (400 mg/l); en tubo

de ensaye con medio sólido se probó una dosis baja de carbón activado (5 mg/l) en

interacción con BA (0.1 mg/I) - AG3 (0.1 mg/I) y con BA - 2,4-D (0 - 0, 0.1 - 0.05, 0.1

- 0.1, 0.2 - 0.05 y 0.3 - 0.05 mg/l); en magenta con medio líquido MS 50%

complementado con vitaminas MS, BA 1 mg/l, sacarosa 30 g/I y pH 5.7, se estudió la

frecuencia de la inmersión temporal (12, 24, 48 horas e inmersión continua en

primera prueba y 24, 48 y 72 horas en segunda prueba); en magenta y basado en el

mismo medio anterior pero sin BA, se evaluaron las dosis de adenina 0, 25, 50 y 100

mg/l, con una frecuencia de inmersión de cada 24 horas; también se probaron las

mismas dosis pero en medio sólido en frasco. La última prueba fue el establecimiento

de los embriones somáticos maduros en medio de Anderson (1975) modificado en

nitratos (+ 25%) y su recultivo a los 90 días en medio MS con 0.3 mg/l de BA. En

relación a los datos tomados en esta fase, solamente se realizaron observaciones

sobre el tipo de crecimiento del tejido obtenido, el porcentaje de brotación, número y

longitud de brotes.

3.6. Condiciones de incubación de los explantes

En el estudio de organogénesis los diferentes explantes (yemas axilares en

mícroestacas procedentes de árbol adulto y yemas axilares de brotes obtenidos in

vitro), después de su establecimiento en el medio de cultivo se incubaron en un

cuarto de crecimiento a una temperatura de 25±2°C, fotoperiodo de 16 horas de luz,

con una intensidad de 110.58 µEm-2s-1; para los de embriogénesis somática, una vez

establecidas las nucelas in vitro se pusieron en oscuridad por 45 a 50 días, período

después del cual se colocaron a luz con una intensidad de 9.4 µEm-2 s-1, con 16

horas de luz y a la misma temperatura que en organogénesis.

75

3.7. Análisis estadístico

Los porcentajes se analizaron por comparación directa entre tratamientos;

generalmente la unidad experimental fue el frasco, el tubo de ensaye o la caja de

petri. Con los datos de las variables cuantitativas en organogénesis, tales como:

número de brotes laterales, longitud del brote y de raíz en mm, índice estomático,

frecuencia de estomas y frecuencia de células no estomáticas, se hizo un análisis

de varianza (ANDEVA) bajo el diseño experimental completamente al azar, tal como

lo sugiere Vera (1987).

En aquellos casos donde se encontró significancia en el análisis de varianza,

se corrió una prueba de comparación de medias Tukey, de acuerdo con el

procedimiento de Gómez (1996).

En embriogénesís somática, los datos de la variable porcentaje de oxidación

se transformaron a valores de arco seno √x se realizó análisis de varianza bajo

un diseño de bloques al azar con arreglo factorial A x B x C, al encontrar significancia

se aplicó la prueba de diferencia mínima significativa (DMS) para determinar el mejor

tratamiento.

En las fases de multiplicación y maduración de embriones somáticos, con las

variables número de: masas proembriogénicas, globulares, acorazonados, torpedos

y maduros se realizó ANDEVA con un diseño completamente al azar y pruebas de

comparación de medias DMS y Tukey.

76

IV. RESULTADOS

4.1. Organogénesis de aguacate criollo

El establecimiento in vitro de aguacate criollo (P. americana var. drymifolia),

se obtuvo por diversos procedimientos de asepsia, tratamientos con desinfección

externa e interna. En base de prueba y error se observaron aquellos con los menores

porcentajes tanto de contaminación como de necrosis, esta última debida al método

de desinfección.

4.1.1. Desinfección externa

El mejor método de desinfección externa se obtuvo al lavar los explantes con

detergente biológico y cepillo; cortar en segmentos de 2 a 4 cm con 1 a 2 yemas

axilares; tratar con Benlate (2 g/I, durante 15 a 20 minutos), con Agrimicin 500 (2 g/l,

también durante 15 a 20 minutos); enjuagar con agua destilada estéril; tratamiento

con hipoclorito de sodio 40-60% + tween 20 (2 gotas/I) de 15 a 20 minutos; y por

último, practicar tres enjuagues con agua destilada estéril en campana de flujo

laminar. El tiempo y la concentración varió de acuerdo a la madurez del tejido y a la

temporada en que se obtuvo el explante, para tejido muy maduro colectado en los

meses de junio - octubre, se utilizó la máxima concentración de hipoclorito y 20

minutos de permanencia en las soluciones.

4.1.2. Desinfección interna

En la primer prueba con dosis de Benlate, adicionado al medio de cultivo y

esterilizado e incorporado después de la esterilización en campana de flujo laminar,

se observó que la aplicación de Benlate sin esterilizar en autoclave, su acción fue

más efectiva (0% de contaminación a los 12 días), aunque se presentó un alto

porcentaje de necrosis en los dos medios de cultivo probados (88.8 y 66.7%), ésto

77

como consecuencia de la aplicación al explante de una desinfección superficial

severa. Al usar Benlate esterilizado en autoclave, la mejor dosis fue de 2 g/I de medio

de cultivo (Cuadro 6), se encontró de 0-22.2% de contaminación según el medio de

cultivo, con tan solo de un 50 a un 55.5% de necrosis.

Con estos resultados, es conveniente resaltar que la desinfección debe ser

ligera (40% de hipoclorito de sodio y 15 minutos de tiempo de permanencia del

explante en cada desinfectante) y cultivar los explantes en medio con Benlate

esterilizado (2 g/I), para evitar menor daño al tejido vegetal.

Cuadro 6. Porcentaje de contaminación y necrosis de yemas axilares de aguacatecriollo a los 12 días del establecimiento en dos medios de cultivo (A y B),en la prueba de dosis de Benlate.

Contaminación/Necrosis (%) a 12 díasTratamientos(Benlate g/I y tipo de

incorporación)A B

0 44.4/27.7 33.4/72.2

0.5 esterilizado 55.5/33.3 66.7/0

1.0 esterilizado 50/22.2 0/38.9

2.0 esterilizado 0/50 22.2/55.5

1.0 no esterilizado 0/88.8 0/66.7

A = BA 1 mg/I +AIB 0.5 mg/IB = BA 2 mg/I + AIB 0.66 mg/I

En la segunda y tercer prueba los plaguicidas se incorporaron en campana de

flujo laminar después de esterilizar el medio de cultivo; en el Cuadro 7 se observa

hasta un 100% de contaminación en el tratamiento control a los 7 días después de

su establecimiento, no así con el tratamiento con Benlate 1 g/I que en permanencia

continua hasta los 40 días no mostró contaminación, este mismo tratamiento en

permanencia de 7 días en medio con el producto y recultivo posterior a medio sin

Benlate hasta los 33 días presentó contaminación en 1/3 (33.33%) de los explantes.

78

Cuadro 7. Porcentaje de contaminación de yemas axilares de aguacate criollo adiferentes días después del establecimiento por tratamiento parapermanencia continua y en etapas de recultivo a medio sin plaguicidas.

Tratamiento Contaminación (%)Benlate - Agrimicin Permanencia continua con plaguicidas a los:

500(g/1) 7 14 21 30 40 días48.6h14.3b

000

14.3h62.9h

---

025h0

39.3h---

---

0---0------

---

0---0------

Permanencia 7 días con plaguicidas14-0

33.3h33.3b100h33.3h

---

23-0

33.3h33.3b

---66.7h

---

33---

33.3h33.3h33.3b

---------

Permanencia 14 días con plaguicidas

50 días---

33.3h33.3h66.6b

---------

20h

0000

20h

7100h

00

66.7h0

100h

7100h

033.3h33.3b100h100h100h

16-

33.3h66.6h33.3b

---------

26días---

33.3h---

---------

Permanencia 21 días con plaguicidas

0-0

1-01-0.51-1

0.5-10 – 1

0-01-0

1-0.5

1 –10.5-10-1

0-01-0

1-0.5

1 - 10.5-10-1

1-01-0.51 -10.5-1

90

33.3h66.6h33.3h

190

66.6h100h33.3h

36 días0

66.6h---

66.6hh = hongo, b = bacteria, --- sin explantes, desechados por contaminación, necrosiso recultivados.

Cuando los explantes permanecieron 14 días en Benlate, a los 16 días del

recultivo se presentó la contaminación también en 1/3 y en permanencia de 21 días

no hubo contaminación alguna. La contaminación en algunos tratamientos de

79

permanencia, cuando se utilizó Benlate a 1 g/I, obedeció en gran medida a errores

en la manipulación del explante al realizar el recultivo (Cuadro 7).

También se observó que al aplicar Benlate en combinación con Agrimicin 500,

no se evitó la contaminación, ésto fue más evidente cuando permanecieron por 14

días, al obtener datos hasta del 100% en casi la totalidad de los tratamientos donde

interaccionan estos dos plaguicidas, lo que resulta en un marcado antagonismo de

los productos. Además, de manera general se apreció una dominancia de

contaminación por hongos, sobre los cuales no se observó la eficiencia del oxicloruro

de cobre del Agrimicin 500.

Al utilizar Benlate con Agrimicin 100 en dosis de 1 g/l de cada producto, se

logró un buen control de la contaminación del explante por hongos y bacterias,

presentándose 0% de contaminación, aunque la necrosis fue menor (20%) cuando

se utilizó solamente Benlate, éste fue el mejor tratamiento (Cuadro 8).

Cuadro 8. Porcentaje de contaminación y necrosis de yemas axilares de aguacatecriollo a diferentes días después del establecimiento por tratamiento parapermanencia continua con dos severidades de desinfección superficial yen etapas de recultivo a medio sin plaguicidas.

Contaminación/ Necrosis (%)Permanencia continua con plaguicidas

8 15 31 48 días

TratamientoBenlate -

Agrimicin100(g/l) DSL DSS DSL DSS DSL DSS DSL DSS1 - 1 0/0 0/0 010 0/0 0/40 0/50 0/40 0/601 - 0 010 0/0 0/0 0/0 0/0 0/40 0/0 0/400 - 0 26.7h 0/0 46.7h 0/0 46.7h 0/60 46.7h 0/60

6.7b/0 6.7b/0 6.7b/20 6.7b/40Permanencia 8 días con plaguicidas

8 24 41 53 días1 - 1 010 0/0 20b/20 20b/801 - 0 20b/0 40b/0 40b/0 40b/60

Permanencia 31 días con plaguicidas17 31 días

1 - 1 0/40 0/401 - 0 0/20 0/40

DSL = Desinfección superficial ligera, DSS = Desinfección superficial severa,b = bacteria, h = hongo.

80

En el estudio de pretratamiento de explantes en solución con Benlate y

Agrimicin 100, 1 g/I de cada uno (Cuadro 9), la contaminación se presentó a los 14

días de su establecimiento con un 93.3% en los tratamientos de 0, 24 y 48 horas, y del

100% en el de 73 horas; en tanto que en el testigo de siembra en medio de

cultivo con Benlate solamente se observó un 13.3% de contaminación, éste fue

nuevamente el mejor tratamiento.

Cuadro 9. Porcentaje de contaminación de yemas axilares de aguacate criollo a 7 y14 días del establecimiento, en estudio de pretratamiento de explantes ensolución con Benlate más Agrimicin 100 a diferentes tiempos depermanencia.

Contaminación (%)Tratamiento

Tiempo (horas) de permanenciaen solución (Benlate+Agrimicin100, 1 g/I de c/u)

Establecimiento en mediode cultivo

7 14 días

24 horas Sin Benlate 80 93.348 horas ” “ 80 93.373 horas ” “ 46.7 1000 horas ” “ 86.7 93.3

0 horas Con Benlate 1 g/I 0 13.3

4.1.3. Prevención de necrosis del explante

Se determinó que 30 minutos a chorro de agua era tiempo suficiente para que,

en combinación con el uso de antioxidante en la asepsia y en el medio de cultivo, se

evitara que el tejido expulsara fenoles al medio y por consecuencia se deteriorara el

explante.

Con la finalidad de eliminar el antioxidante del medio de cultivo y reducir la

necrosis, se estableció un estudio sobre el tratamiento previo al establecimiento del

explante con ácido ascórbico, se encontró que al emplear 400 mg/l durante 30

minutos, se redujo a los 30 días la necrosis al 10% y se obtuvo a los 70 días una

brotación del 90%, en tanto que cuando se realizó un tratamiento previo con ácido

81

ascórbico (100 mg/I) y el establecimiento en medio con 50 mg/l de este mismo

antioxidante, la necrosis fue del 70% y la brotación de 0%; también se encontró que

en dosis alta de ácido ascórbico (400 mg/l) combinado con un tiempo de permanencia

del explante de 60 minutos, el porcentaje de necrosis se incrementó hasta un 70% con

una brotación de 0%; igual comportamiento se tuvo al dejar el explante 30 minutos en

100 mg/l de ascórbico y establecerlo posteriormente en medio con 50 mg/l de

ascórbico, ésto nos indica que en exposición en alta concentración o continua del

explante en ácido ascórbico se origina necrosis o apardamiento al tejido vegetal

(Cuadro 10).

Cuadro 10. Porcentaje de necrosis y brotación de yemas axílares de aguacate criollopor tratamiento en el estudio de pretratamiento del explante con ácidoascórbico.

Tratamiento

Dosis deAc. ascórbico

(mg/1)

Tiempo depermanencia

(min.)

Tipo de establecimientoen medio de cultivo

Necrosis (%)a los 30 días

Brotación(%)

a los 70 días

100 30 Sin ascórbico 30 40

200 30 “ “ 40 50

300 30 “ “ 50 30

400 30 “ “ 10 90

100 60 “ “ 50 50

200 60 “ “ 60 60

300 60 “ “ 40 60

400 60 “ “ 70 0

100 30 Con “ 70 0

Por lo tanto, es recomendable para establecer yemas axilares de aguacate

criollo con bajo porcentaje de necrosis y evidentemente mejor índice de brotación,

tratar los explantes, previó a su establecimiento in vitro, con 400 mg/l de ácido

ascórbico durante 30 minutos.

82

4.1.4. Efecto de los reguladores de crecimiento y otros compuestos del medio

de cultivo en la organogénesis in vitro de aguacate criollo

4.1.4.1. Iniciación o establecimiento in vitro de yemas axilares

De las 8 pruebas que se llevaron a cabo en esta fase, solamente se presentan

los resultados de 3, por considerar irrelevante la respuesta del explante en el resto

de éstas. Al evaluar los diferentes medios, tipos y dosis de reguladores de

crecimiento que reportaron Neel y col. (1982), González y Salazar (1984), González

y col. (1985), Shall (1987) y Solórzano-Vega (1989), no se observó brotación de las

yemas, solamente la formación de callo en un 10% en el medio de los últimos

investigadores anteriormente señalados.

En el estudio sobre concentración de tres sales minerales, la brotación de las

yemas axilares inició a los 35 días después del establecimiento in vitro, fue en el

tratamiento MS 20% donde se alcanzó el mayor porcentaje de brotación, con 76% a

los 55 días, se observó una disminución de este porcentaje a los 100 días y 127 días

de cultivo, debido a la contaminación de los explantes que ya habían brotado. En el

tratamiento McCown's 100%, se mostró el porcentaje más bajo de brotación, con

12% a los 55 días y un 20% a los 100 días (Cuadro 11).

La formación de brotes laterales pudo observarse en las yemas axilares

cultivadas en el tratamiento MS 20%, único tratamiento donde se formaron. Los

resultados mostraron que en un 50% de los explantes se encontraron entre 3 y 4

brotes laterales, en un 34% 1 y 2, en un 8% con 6 y en el otro 8% con 8 (Figura 2).

En cuanto al crecimiento en mm del brote principal se encontró la mayor longitud con

36.17 mm a los 127 días en el tratamiento MS 100%*; los que menos crecieron (5 y

11 mm, a los 117 días) fueron los de los tratamientos MS 80% y 20%,

respectivamente (Figura 3).

83

Cuadro 11. Porcentaje de brotación de yemas axilares de aguacate criollo adiferentes días por tratamiento en estudio sobre concentración de tressales minerales.

Brotacíón (%)

Tratamiento 55 días 100 días 127 días

1. MS 20% 76 72 64

2. MS 40% 24 36 36

3. MS 60% 48 40 28

4. MS 80% 16 4 0

5. MS 100% 63 12 8

6. MS 100%* 32 40 24

7. WPM 100% 16 12 8

8. WPM 50% 40 36 32

9. Me Cown's 100% 12 20 0

10. Me Cown's 50% 36 12

* Tratamiento con 2 mg/1 de BA y AIB.

84

Al observar los datos de crecimiento del brote principal en la Figura 3, el

tratamiento donde mayor crecimiento, promedio por día se logró (0.24 mm) fue el MS

100%*, mientras que en el MS 80% no se sobrepasó los 0.06 mm/día. Al realizar el

análisis de varianza, en longitud del brote principal, resultó altamente significativo en

127 días, la comparación de medias entre tratamientos indicó que no existen

diferencias estadísticas entre el MS 100%, WPM 100% y MS 100%*, y que éstos son

los mejores en relación a la variable longitud del brote (Cuadro 12).

Con la aplicación de las diferentes dosis de los reguladores de crecimiento en

la combinación BA AIB, la formación de brotes inició solamente en algunos

tratamientos a los 45 días, en tanto que otros ya presentaban brotes con 1 a 2 hojas

pequeñas, este es el caso de los tratamientos (1-0, 1-0.2, 2-0, 2-0.2, 3-0 y 3-0.2 mg/l

de BA AIB) con porcentaje de brotación entre 15 y 53%.

85

A los 96 días, se estabilizó la respuesta del tejido con los resultados

siguientes: en el tratamiento sin reguladores (0-0) y en los tratamientos sin BA y con 1

mg/l, combinados con 0.2, 0.5 y 1.0 mg/1 de AIB (0-0.2, 0-0.5, 0-1 y 1-0.5 mg/I de BA-

AIB), las yemas axilares no formaron brotes. Las yemas axilares que presentaron los

porcentajes más altos de brotación (50-65%) fueron las incubadas en los medios de

cultivo con diferentes dosis de BA-AIB, preferentemente con dosis altas de BA sin AIB

o con 1 mg/l de esta auxina (1 -0, 2-0, 3-0 y 3-1 mg/l de BA-AIB).

Los datos de la variable longitud del brote se procesaron en un análisis de

varíanza para un diseño completamente al azar, se encontró significancia a los 96 y

110 días, sin embargo, , al realizar la prueba de comparación de medias Tukey

(α=0.05), no se encontraron diferencias estadísticas significativas (Anexos 2 y 3).

4.1.4.2. Multiplicación de brotes

Con base en la respuesta de. las yemas exilares en la fase de iniciación, las

cuales mostraron una mayor longitud dei brote al cultivarlas en el medio MS al 100%,

en este mismo medio se probaron dos concentraciones de sales minerales

86

modificadas (completas y a 1 /2 de su concentración) con la interacción BA - AIB y

adenina 40 mg/l. Después de 70 días de su cultivo, el número de brotes por explante

más alto alcanzado fue de 1.93 para el tratamiento con 1 mg/1 de BA más 0.1 mg/1 de

AIB en MS a un 1/2 de la concentración de sales; y para el parametro de longitud del

brote, el valor mayor (17.6 mm) se obtuvo en el mismo tratamiento anterior de

reguladores de crecimiento, pero con la concentración completa de sales (MS 100%)

(Cuadro 13).

Cuadro 13. Número de brotes por explante y longitud del brote de aguacate criolloen los tratamientos de la interacción BA - AIB en sales modificadascompletas (MS 100%) y MS 112 de su concentración.

Tratamiento Número de brotes Longitud (mm)BA - AIB mg/1 Conc. sales

2-0.2 112 1.81 16.06

1.5-0.15 112 1.54 14.40

1-0.1 112 1.93 14.95

0.5-0.05 112 1.37 16.33

0-0 112 1.20 10.47

2-0.2 Completas 1.63 15.96

1.5-0.15 “ 1.85 14.54

1-0.1 “ 1.44 17.60

0.5-0.05 “ 1.92 14.72

0-0 “ 1.78 11.86

En este mismo cuadro se observa que en los tratamientos sin reguladores se

muestra la menor longitud del brote, esto indica qué la interacción de la citocinina con

la auxina (BA-AIB) promueve en gran medida el crecimiento promedio de los brotes.

No se detectó significancia en el análisis de varianza para el factor concentración de

sales respecto a la variable número de brotes promedio por frasco, situación similar

se presentó en la variable longitud de brote por explante.

87

En los tratamientos probados con la combinación BA AIB pero en el medio

de cultivo MS 100% sin adenina, las yemas respondieron entre los 12 y 15 días

después del establecimiento en la formación de brotes, sin que se notaran

diferencias entre un tratamiento y otro. Sin embargo, se observaron diferencias

claras en brotación según la posición del brote formado, en las yemas axilares y

apicales del explante se formaron los primeros brotes, en tanto que las de la base

fueron más retardadas en su brotación.

Al realizar el análisis de varianza con los datos de la variable número de

brotes por explante frasco a los 25 y 85 días (Anexos 4 y 5), se observó significancia

entre los tratamientos, no obstante que los coeficientes de variación resultaron altos,

43.3 y 49%, debido en gran medida a la variación del inóculo; es decir no fue posible

uniformizar la sección del brote empleado en los tratamientos, para ello se utilizaron

yemas apicales y axilares de los brotes obtenidos in vitro y se eligió al azar el

tratamiento.

La prueba de comparación de medias Tukey (α= 0.05) (Cuadro 14) a los 85

días reportó que el tratamiento 4 (BA 0.9 mg/l y 0 de AIB, Figura 4), se encuentra en

el primer grupo de significancia estadística, sin que existan diferencias con los

tratamientos 10, 3, 8, 6, 11, 12, 7 y 2; del análisis de los niveles de los reguladores

que componen los tratamientos anteriores se deduce que aparentemente no existió

efecto del AIB, puesto que no hay diferencia entre 0.0, 0.05 y 0.1 mg/l. Así como

tampoco hubo efecto del BA en dosis de 0.3, 0.6 y 0.9 mgll, pero sí son notables con

el testigo (0.0 - 0.0 mg/I de BA - AIB).

En esta misma prueba se realizó un análisis de varianza con el promedio de la

longitud en mm de los brotes producidos por tres explantes por frasco, a los 25 y 85

días de su establecimiento (Anexos 6 y 7); se detectó solamente significancia al nivel

de 0.05 e igualmente que en la variable anterior los coeficientes de variación fueron

altos, 41.66 y 43.19, esto debido a la heterogeneidad del inóculo utilizado.

88

Cuadro 14. Comparación de medias Tukey (α=0.05) en la variable número debrotes promedio por frasco de aguacate criollo a los 25 y 85 días, entratamiento con reguladores BA-AIB.

Tratamientos Número de brotes por frasco

No. BA - AIB (mg/l) 25 días 85 días4 0.9-0.0 9.5 A 10.9 A

10 0.3-0.1 8.2 AB 8.4 AB

3 0.6-0.0 8.0 AB 9.0 AB

8 0.9-0,05 7.1 AB 8.3 AB

6 0.3-0.05 6.3 AB 6.4 AB

5 0.0-0.05 6.1 AB 4.9 B

11 0.6-0.1 6.0 AB 7.1 AB

12 0.9-0.1 5.8 AB 9.0 AB

7 0.6-0.05 5.6 AB 5.8 AB

9 0.0-0.1 5.1 B 4.8 B

2 0.3-0.0 4.8 B 6.9 AB

1 0.0-0.0 4.2 4.7 B

89

En la prueba de comparación de medias Tukey (α= 0.05) (Cuadro 15), a los 85

días se detectó dentro del primer grupo de significancia al tratamiento testigo (0 - 0

mg/l de BA - AIB, Figura 5), sin que existieran diferencias con el resto de los

tratamientos, excepto con el tratamiento 9 (0.0 - 0.1 mg/1 de BA - AIB) que se ubicó

en el grupo B con un promedio de 16.2 mm.

Cuadro 15. Comparación de medias Tukey (α=0.05) en la variable longitud promediode brote de yemas axilares in vitro de aguacate criollo a los 85 días, entratamientos con reguladores de crecimiento (BA-AIB).

Tratamientos Significancia estadística Tukey

No. BA - AIB (mg/l) Media (mm)

2 0.3-0.0 28.5 AB

8 0.9-0.05 22.2 AB

7 0.6-0.05 26.1 AB

4 0.9-0.0 22.5 AB

1 0.0-0.0 31.9 A

3 0.6-0.0 24.2 AB

12 0.9-0.1 18.2 AB

6 03-0.05 23.2 AB

10 03-0.1 20.8 AB

11 0.6-0.1 18.5 AB

5 0.0-0.05 18.9 AB

9 0.0-0,1 16.2 B

Es indudable que no únicamente las características cuantitativas son

determinantes para decidir cuál es el mejor tratamiento, ya que para esto se requiere

el análisis de las características cualitativas de los brotes, respecto a lo cual se

encontró que a los 85 días de su establecimiento (Cuadro 16) solamente los

tratamientos 1 y 2 presentaron una coloración verde oscuro, en tanto que el resto

verde claro, cuando se indujo a la brotación con dosis altas de BA - AIB

90

Cuadro 16. Características cualitativas de los brotes in vitro de aguacate criolloen los diferentes tratamientos a tos 85 días del establecimiento, entratamientos con reguladores de crecimiento (BA-AIB).

TratamientoNo. BA - A)B (mgll)

Características de los brotes

Color % de necrosis % de callo Formación brote

1 0.0-0.0 Verde oscuro 0 10 Bien formados

2 0.3-0.0 Verde oscuro 0 10 Bien formados

3 0.6-0,0 Verde claro 0 55.56 Deformes

4 0.9-0.0 Verde claro 0 70 Deformes

5 0.0-0.05 Verde claro 0 3,7 Bien formados

6 0.3-0.05 Verde claro 0 36.67 Bien formados

7 0.6-0.05 Verde claro 0 73.3 Deformes

8 0.9-0.05 Verde claro 0 40 Deformes

9 0.0-0.1 Verde claro 0 0 Bien formados

10 0.3-0.1 Verde claro 6.7 40 Deformes

11 0.6-0.1 Verde amarillo 30 36,67 Deformes

12 0.9-0-1 Verde amarillo 50 40 Deformes

(tratamientos 10, 11 y 12) se observó un porcentaje alto de necrosis de los explantes,

91

50% el tratamiento 12; también en las dosis altas de reguladores de crecimiento se

presentó formación de callo en la base de los explantes; se obtuvieron brotes bien

formados y poca formación de callo en los tratamientos 1, 2, 5, 6 y 9, esto fue en los

tratamientos con dosis bajas o bien con 0 - 0 mg/1 de BA - AIB.

Al realizar una revisión de los resultados en las diferentes variables en esta

prueba, se obtuvo la mejor respuesta en las yemas axilares cultivadas en el medio

MS con 0.3 mg/l de BA (Tratamiento 2, Figura 6), debido a que se observó un

número de 2.3 brotes laterales por explante (6.9 promedio por frasco), una longitud

promedio de brote de 28.5 mm (a los 85 días del establecimiento), un color óptimo de

brote (verde oscuro), un bajo porcentaje de formación de callo en la base de los

explantes (10%) y una buena formación de brote. Aunque en el tratamiento sin

reguladores de crecimiento (Testigo), las yemas formaron brotes con la mayor

longitud promedio, bien formados y poca formación de callo, no es mejor que el resto

de los tratamientos debido a que resultó con el valor más bajo en número de brotes

promedio.

92

4.1.4.3. Enraizamiento de brotes

En la primer prueba se observó que la respuesta al enraizamiento se obtuvo

con AIB incorporado al medio de cultivo con sales modificadas, lográndose hasta un

25% de enraizamiento y un promedio de 2.3 raíces por brote, en el tratamiento con 0.8

mg/1 de AIB. Por otra parte, cuando se utilizó ANA generalmente no se obtuvo

formación de raíces, excepto en sales MS con 0.3 mg/I de ANA con un 16.67% de

enraizamiento y en sales modificadas en la interacción AIB 0.5 mg/l - ANA 0.3 mg/I,

con 8.33% de enraizamiento; el hecho de que en los brotes del tratamiento control se

formaran raíces es normal, ya que cuando no se utilizan reguladores en el medio de

cultivo se presenta enraizamiento, pero en una baja proporción, 1 de cada 10 brotes

(Anexo 8).

En la segunda prueba, el análisis de varianza para la longitud de raíz indicó

alta significancia a los 54 y 88 días de establecida (Anexos 9 y 10), al realizar la

prueba de comparación de medias Tukey (α=0.05) a los 54 días se obtuvo con la

mayor longitud y en el primer grupo de significancia al tratamiento control, sin que

existan diferencias estadísticas significativas con AIB 0.4 mg/l; a los 88 días

permaneció dentro del primer grupo de significancia el tratamiento control pero no

hay diferencias estadísticas significativas con los tratamientos 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 y 1.2

mg/l de AIB (Cuadro 17).

En el Cuadro 18 se observa en forma más precisa; que la mayor cantidad de

raíces por brote se obtuvieron en los brotes incubados en MS con 0.6 mg/l de AIB más

0.125 mg/l de AG3 con 4.69 y 4.08 raíces en el. Medio MS con 0.8 mg/l de AIB más

0.125 mg/l de AG3. Cabe mencionar ,.que en estos tratamientos, los brotes

mostraron alta formación de callo en la base.

93

Cuadro 17. Comparación de medias Tukey (α=0.05) en la variable longitud de raíz porbrote de aguacate criollo a los 54 y 88 días, en prueba de enraizamiento debrotes in vitro con AIB e interacción AIB-AG3.

Tratamientos (mg/l) Longitud de raíz (mm)AIB AG3 54 días 88 días

0.8 0.125 7.5 11.81

0.6 0.125 6.9 B 10.78 B

0.4 0.0 16.8 AB 22.97 AB

1.0 0.25 10.1 B 13.85 B

1.2 0.0 12.0 B 16.77 AB

1.0 0.125 7.7 B 15.88 B

1.0 0.0 11.8 B 19.43 AB

0.0 0.0 26.2 A ' 31.83 A

0.8 0.0 6.8 B 20.78 AB

0.6 0.0 10.8 B 20.42 AB

Cuadro 18. Respuesta al enraizamiento de los brotes de aguacate criollo obtenidos in vitroa los 88 días del establecimiento, en prueba de dosis de AIB einteracción AIB-AG3,

Tratamiento(mg/l)

AIB AG3

Número deraíces totales por

brotes

Número de raícespromedio por brote

Enraizamiento(%)

Longitud deraíz (mm)

0.0 0.0 12 en 9 1.33 29.03 31.83

0.4 0.0 27 en 12 2.25 44.44 22.97

0.6 0.0 13 en 7 1.86 29.17 20.42

0.8 0.0 17 en 6 2.83 20.00 20.78

1.0 0.0 4 en 3 1.33 9.68 19.43

1.2 0.0 29 en 11 2.64 36.67 16.77

0.6 0.125 61 en 13 4.69 43.33 10.78

0.8 0.125 49 en 12 4.08 40.00 11.81

1.0 0.125 10 en 5 2 19.23 15.88

1.0 0.25 18 en 8 2.25 32.00 13.85

94

En el medio nutritivo con 0.4 mg/l de AIB a los 88 días, los brotes presentaron

un 44.4% de enraizamiento (Cuadro 18 y Figura 7), un número aceptable de raíces

por brote (2.25), sin formación de callo en la base del tallo y una longitud de raíz de

22.97 mm. Lo anterior presenta a este tratamiento como el óptimo para lograr el

desarrollo de plántulas aptas para el transplante. Es importante señalar que al

trasplantar para su aclimatación brotes con raíz y con callo, la supervivencia resultó

nula.

4.1.5. Aclimatación de plántulas de aguacate criollo obtenidas in vitro

En las tres primeras pruebas realizadas, aproximadamente a los 12 días de su

establecimiento, se observó muerte prematura de las plántulas. En la cuarta prueba

con sustratos y procedimientos de fertilización, a los 10 días la mezcla donde las

plántulas mostraron el mejor comportamiento, con un 100% de supervivencia y mejor

color de plántulas, fue el sustrato de turba 70% + agrolita 30% con fertilización de

95

medio líquido MS 100%, sin embargo las plántulas murieron antes de 20 días. En la

prueba sobre intensidades de luz las plántulas mostraron 0% de supervivencia a los

16 días. - En la prueba sobre sistemas de fertilización, el comportamiento de las

plántulas fue del 60% de supervivencia a los 18 días del establecimiento con

fertilización MS 100% y de 0% en el segundo tratamiento (fertilización con 30-10-10,

N-P-K 1 g/I + ácido húmico 0.5 cc/I + bayfolan 1 g/I + raizal 2 g/I), por otra parte, en

esta misma prueba no se observó respuesta al aplicar los tratamientos con ASA y

ABA en las plántulas del tratamiento 1, ya que a los 10 días de la aplicación todas

tomaron una coloración café clara por efecto de la pérdida de agua o deshidratación

de los tejidos y posteriormente cambiaron a café oscura con muerte de las plántulas.

En la prueba 7 sobre aplicación de 250 mg/1 de ASA en comparación con el

uso de Folicote en dosis de 1 parte en 20 de agua, a los 20 días se obtuvieron los

siguientes resultados: 20% de supervivencia en Folicote, 0% en ASA y 25% en el

control, pero a los 42 días el porcentaje de supervivencia disminuyó al 5% en el

control y el mismo valor en Folicote; a los 100 días sobrevivió solamente un 5% de

las plántulas con Folícote y presentaron éstas una altura promedio de 5 cm.

La prueba 8 sobre dosis de Folicote reportó el siguiente comportamiento de las

plántulas: a los 20 días una supervivencia de 90% en la dosis de 1 parte en 20 y

0% en el control (Figura 8), a los 30 días se quitó la tapa transparente a la charola

96

y se observó una disminución en la supervivencia, muerte de las plántulas por

deshidratación, el tratamiento 1.5 partes en 20 muestra el porcentaje más alto con

30% (Cuadro 19); la altura promedio de las plántulas del tratamiento 1 fue de 3.5 cm a

los 60 días y de 4.2 cm a, los 75 días.

Cuadro 19. Porcentaje de supervivencia de plántulas de aguacate en el estudio dedosis de Folicote.

Tratamiento Supervivencia (%)20d 30d 40d 60d 75 días

1. Folicote 1 parte en 20 de agua. 90 10 10 10 102. “ 1.5 “ “ “ “ “ 60 50 30 0 03. “ 2 “ “ “ “ “ 60 0 0 0 04. Control 0 0 0 0 0

En la última prueba (9), a los 45 días se obtuvo una supervivencia del 10% en

el tratamiento tapa con filtro bacteriológico y del 40% con Folicote, a los 110 días se

estabilizó el. porcentaje de supervivencia superando la aplicación de Folicote,

producto que cumple satisfactoriamente en la protección de la plántula contra la

pérdida de agua. La disminución del porcentaje de supervivencia se debió en gran

medida a la eliminación prematura de la bolsa de plástico, al exponer drásticamente

a las plántulas a muerte. por deshidratación (Cuadro 20); a los 110 días se tuvieron

plantas con un promedio de 6 cm de altura.

Cuadro 20. Porcentaje de supervivencia de plántulas de aguacate en el estudio depreaclímatación con filtro bacteriológico en comparación a Folicote.

Tratamiento Porcentaje de supervivencia

15d 30d 45 d 100 d 110 días

1. Folicote 1 parte en 20 de agua. 100 90 40 20 20

2. Preaclimatación tapa con filtro. 90 40 10 10 10

3. Control 100 70 30 5 5

En la validación del tratamiento con Folicote en dosis de 1 parte en 20 de

agua, con 60 plántulas de aguacate criollo obtenidas in vitro , se obtuvieron

97

porcentajes de supervivencia hasta del 100% a los 100 días del trasplante, al evitar

eliminar la bolsa de plástico o la cubierta de las plántulas durante los 80 primeros

días, o sea hasta que ésta forme sus primeras dos hojas en la fase de aclimatación.

En los estudios citológicos al realizar el análisis de varianza, se obtuvo

significancia únicamente en la variable frecuencia de estomas, con un coeficiente de

variación aceptable (Anexo 11). En el Cuadro 21 se presenta la prueba de

comparación de medias Tukey (α= 0.05), en éste se detecta que el número de

células estomáticas en hojas de plántulas ín vitro fue menor y significativamente

diferente a las hojas de plantas de vivero, no así con el árbol adulto (Figura 9).

Cuadro 21. Prueba de comparación de medias Tukey (α=0.05) en la variablefrecuencia de estomas en hojas de aguacate criollo.

Tratamiento Media Signif. Tukey (a=0.05)

Arbol adulto 5.96 AB

Invernadero 6.46 A

Plántulas in vitro 4.56 B

98

En relación a los valores de las variables FCNE e IE, se tiene que el mayor

valor.con 17.82 de FCNE y el menor IE (5.83) se presentó en el tratamiento de

plántulas in vitro e inverso con 13.96 de FCNE y 7.39 en lE en las hojas de árbol

adulto (Anexo 12). Adicionalmente se presentó malformación de las células

estomáticas en las hojas de las plántulas in vitro; con relación a la cutícula los tejidos

de árbol adulto, éstos mostraron una cutícula gruesa cerosa, en tanto que en las

plántulas in vitro se observó muy delgada y con ausencia de ceras.

4.2. Embriogénesis somática de aguacate cv. Hass

4.2.1. Efecto del ácido ascórbico, cisteína y luz en la necrosis del tejido nucelar

Únicamente se observó efecto positivo dei ácido ascórbico en la reducción de

la necrosis del tejido nucelar, en donde este antioxidante en una concentración de

400 mg/l evitó la presencia de necrosis en todos los explantes (Figura 10). Los

porcentajes de necrosis promedio por factor de variación para cada tratamiento se

presentan en el Cuadro 22, con los cuales es notable que tanto en luz como en

oscuridad, el ácido ascórbico reduce a 0% la necrosis del tejido; sin antioxidantes, el

porcentaje de necrosis es de 87.5% en oscuridad y del 100% en la luz; además de

que la cisteína prácticamente no tiene efecto en impedir este fenómeno de oxidación.

Con el análisis estadístico realizado, se encontró que la significancia estadística fue

alta solamente en el factor de variación B (ácido ascórbico, Anexo 13); ésto se

corroboró al aplicar una DMS al promedio de valores de arco seno √x de los

tratamientos.

Estos resultados sugieren que para evitar la necrosis de las nucelas de

aguacate, antes de su establecimiento in vitro deben de sumergirse en una solución

de ácido ascórbico en dosis de 400 mg/1 por 5 segundos, y posteriormente incubarlas

en oscuridad o bien a intensidades de luz de 9.4 µEm-2s-1, con un fotoperiodo de 16

horas de luz por 8 de oscuridad y a una temperatura de 25±2°C.

99

Cuadro 22. Porcentaje de necrosis en tejido nucelar de aguacate cv. Hass endiferentes tratamientos de antioxidantes e intensidad de luz.

Necrosis (%)Tratamientos Oscuridad Luz

Sin antioxidantes 87.5 100Cisteína 91.5 79.16

Acido ascórbico 0 0Cisteína - Ac. ascórbico 4.15 3.84

100

4.2.2. Efecto de los; reguladores de crecimientó y otros Componentes del medio

de cultivo en la embriogénesis somática

4.2.2.1. Inducción de callo embrigénico

En el medio de cultivo in vitro, las sales minerales y;. otros componentes del

medio de cultivo así los reguladores de crecimiento, son también

fundamentales en la. indo -Ion de formación de callo embr1 gén ico. El tejido nucelar

respondió de diferente manera al incubarse en los diferentes tratamientos de la

primera prueba, donde se varió la concentración de nutrimentos del medio nutritivo

MS y el tipo y dosis de auxinas. La mejor formación de callo se indujo en el medio

MS con la mitad de sus componentes (MS 1/2) suplementado con 0.01 mg/l de 2,4-

D, en un 28.57% de los explantes. Un valor de tan solo un 8.3% de las nucelas con

callo embriogénico se obtuvo en el mismo medio MS 1/2 pero con 0.5 mg/l de

picloram.

Con el propósito de aumentar estos porcentajes de explantes con formación

de callo embriogénico, el tejido nucelar de aguacate fue incubado bajo otras dosis de

auxinas, observado un inicio de crecimiento de callo entre los 25 a 40 días después

del establecimiento de las nucelas en el medio de cultivo, aunque los porcentajes de

nucelas con callo no aumentó considerablemente, si fue posible lograrlo en varios

tratamientos; se logró un 20% de formación de callo embriogénico en el medio MS 1/2

con 1 mg/1 de 2,4-D; un 17.8% en el tratamiento MS 1/2 con 4 mg/l de picloram más

0.4 mg/1 de AIB; y un 10% al adicionar al medio de cultivo 2 mg/1 de picloram en

concentración completa de MS (Figura 11), igual porcentaje se obtuvo con la dosis

de 2 mg/l de picloram más 0.2 mg/l de AIB (Cuadro 23).

Generalmente los callos presentaron un color blanco crema, amarillento o

cristalino, mismos que con el transcurrir del tiempo cambiaron de color a café claro y

oscuro (Figura 12); el diámetro que alcanzaron entre los 60 y 70 días fue de 8 a 13

mm (Cuadro 23).

101

Cuadro 23. Porcentaje de formación de callo embriogénico en tejido nucelar deaguacate cv. Hass, color y diámetro en los tratamientos donde seformaron las estructuras embriogénicas.

Concentraciónde MS

Tipo y dosis dereguladores de

crecimiento (mg/1)

Porcentajede formación

callo

Color deCallo

Diámetro deCallo (mm)

1/2

1/2

Completas

"

Picioram-AIB 4 - 0.4

2,4-D 1

Picioram-AIB 2 - 0.2

Picioram 2

17.8

20

10

10

Blanco crema

“

Café claro

“

13

Irregular

13

8

102

4.2.2.2. Multiplicación y desarrollo de embriones somáticos

En la prueba del efecto de reguladores de crecimiento sobre el desarrollo de

los embriones somáticos de aguacate, pudo observarse que en la totalidad de los

tratamientos se presentó un mejor crecimiento del callo embriogénico cuando se

mantenía el explante a luz indirecta, a los 30 días de su cultivo; sin embargo, al

comparar de manera preliminar el número de embriones, cuando se utilizó BA (0.11

mg/I), la combinación BA-AG3 (0.11 mg/I de cada uno) y sin reguladores, no se

observó significancia estadística en el ANDEVA. Situación similar a la anterior se

presentó al evaluar otros tratamientos con reguladores de crecimiento, ya que con

picloram (0.1 mg/l) y sin reguladores, no existen diferencias estadísticas en el

número de: masas proembríogénicas (MPE), estructuras globulares (EG),

acorazonados (EA), torpedos (ET) y embriones somáticos maduros (ESM).

103

Al utilizar dosis mayores de picloram (0.3, 0.6, 0.9 y 1 mg/I) y el testigo (0

mg/I), también no se detectaron diferencias estadísticas significativas en las

diferentes fases de los embriones somáticos. La ausencia de acción alguna de los

reguladores de crecimiento BA (0.2 mg/I) y picloram (0.3 mg/l), sobre la multiplicación

de masas proembriogénicas en medio sólido se confirmó en la cuarta y quinta

prueba; sin embargo quedaba la duda del tipo de tejido más adecuado para propagar

las diferentes fases de embriones somáticos, para lo cual se establecieron en los tres

diferentes medios (BA, picloram y sin reguladores), dos tipos de tejidos a utilizar:

masas proembriogénicas y globulares (Figura 13).

Lo anterior dio como resultado que a los 14 días se observara una

multiplicación óptima en el número de estructuras embrionarias, a partir del tejido con

masas proembriogénicas (Anexo 14), pero no así en los otros tejidos, donde no se

observaron diferencias.

104

Al utilizar diferentes dosis de caseína hidrolizada, en otro de los experimentos,

se encontraron diferencias entre los tratamientos solamente en embriones globulares

y acorazonados a los 20 días del cultivo (Cuadro 24), no así en masas

proembriogénicas, embriones en fase de torpedo (Figura 14) y maduros. En una

concentración de 400 mg/l, el efecto fue positivo en el aumento del número de

estructuras globulares y acorazonados. En el cuadro 24 se observa la relación

directa entre la concentración de la caseína hidrolizada adicionada al' medio de

cultivo y el número de estructuras de estos tipos: sin este compuesto y en

concentraciones altas (1,000 mg/l), no se induce el desarrollo de los embriones

somáticos de aguacate.

Al evaluar otras dosis más bajas de caseína hidrolizada (100, 200 y 300 mg/l),

a los 19 días no se reportó significancia en el ANDEVA en las diferentes fases de

crecimiento y desarrollo de los embriones somáticos.

Cuadro 24. Número de estructuras embrionarias (globulares y acorazonados) encallos de aguacate cv. Hass a los 20 días del establecimiento.Significancia estadística (Tukey α= 0.01).

Tratamientos Número de estructuras embrionarias

(Dosis caseína, mg/1) Globulares Acorazonados

400 5.68 A 2.54 A

800 5.02 A 2.08 AB

600 4.58 AB 1.04 BC

0 4.20 AB 1.36 B

200 3.44 AB 1.72 AB

1,000 0.88 B 0.2 C

105

Al cultivar las estructuras embrionarias en medio líquido, en donde se

evaluaron diferentes dosis de picloram (0, 0.1, 0.3, 0.5, 0.7 y 1 mg/I), incubándolas

en agitación orbital (100 rpm), se observó la presencia de necrosis en el tejido entre

los 15 y 20 días, situación que no se presentó al cultivarse en medio sólido, en donde

después de los 25 a 30 días se empieza a deteriorar el tejido; sin embargo, pudo

constatarse que hubo un mayor número de estructuras embrionarias con altos

porcentajes de viabilidad (85%) en el medio sin picloram, a los 20 días del cultivo:

se encontraron 29.5 masas proembriogénicas, 12.5 estructuras globulares, 4

estructuras en forma de corazón y 4.5 estructuras torpedo, por cada 10 mi de medio

(Cuadro 25).

Además, en este último tratamiento se observó la formación de embriones

somáticos maduros completos, disgregados y de color amarillo claro, en tanto que en

el tratamiento con la dosis más alta de picloram, lo embriones se presentaron en

agregados, de color café claro a oscuro y sin llegar a la maduración.

106

Cuadro 25. Número y porcentajes de viabilidad de estructuras embrionarias deaguacate cv. Hass en sus diferentes fases, por cada 10 ml demedio, a los 20 días de cultivo.

Número de estructuras embrionariasTratamientoDosis de picloram

(m9/1)MPE EG EA. ET

Viabilidad(%)

0 29.5 12.5 4 4.5' 85

0.1 13.5 12 2 1.5 80

0.3 6.5 6 1.5 0.5 35

0.5 13 10 4 0 45

0.7 8.5 8.5 2 > 0:5 55

1.0 6.5 10 2.5 0.5 17.5

Asimismo, al evaluar la ganancia de peso del cultivo de masas

proembriogénicas en medio líquido, se encontró la mayor ganancia (0.85 g) en el

tratamiento sin picloram y la menor (0.63 g) en el tratamiento con 0.7 mgll de

picloram, a los 20 días por cada 12.5 ml de muestra.

Con el fin de obtener un cultivo masivo de masas proembriogénicas o de

embriones somáticos de aguacate, se establecieron cultivos de masas

proembriogénicas y embriones somáticos en fase globular en un biorreactor.

Previamente se verificó que la viabilidad de estas estructuras fuera del 100%. Se

inoculó con 5.0363 mg/ml de masas proembriogénicas, se encontró .a los 25 días .un

incremento en el peso de la muestra por ml del 200%, al obtener 15.5 mg/ml; cabe

señalar que el medio de cultivo se preparó con 0.3 mg/l de picloram.

4.2.2.3. Maduración de embriones somáticos

Con la adición al medio de cultivo de los diferentes reguladores de crecimiento

en varias dosis para inducir la maduración de los embriones y conseguir un número

óptimo de embriones somáticos maduros (ESM), fue posible observar el efecto de

estas sustancias.

107

En los medios de cultivo con BA (0.11 mg/l) y ABA (1 y 2 mg/I), a los 22 días

del establecimiento se generaron ESM con un promedio por caja de petri (con 5

explantes) de 0.48, 0.66 y 0.76 respectivamente, es decir a mayor cantidad de ABA

el promedio fue, mayor, no obstante no se encontró significancia en el ANDEVA

(Anexo 15). Al aumentar los niveles de BA (1 mg/l) y ABA (2, 4 y 8 mg/l), en dosis de

sacarosa de 30 y 60 g/l, también se obtuvieron ESM, se aumentó el promedio de

éstos al incubarse en MS con 8 mg/l de ABA (0.64 ESM), con un valor promedio

máximo de 0.88 en MS con 60 g/I de sacarosa, aunque no se encontró significancia

estadística en el ANDEVA (Anexo 16).

Con base en los resultados anteriores y de acuerdo a los trabajos de

Witjaksono y Litz (1999b), se decidió probar en el medio de cultivo diferentes dosis de

agar (5, 6, 7, 8 y 10 g/I), sin encontrar valores más altos de ESM que en el

experimento anterior, y sin diferencias significativas entre los tratamientos. En el

medio de cultivo utilizado como control (MS con 5 g/l de agar), no se. observaron

ESM. El promedio máximo de ESM por caja de petri (con 5 explantes) fue de 0.6 en

MS con 7 g/I de agar y el mínimo de 0.13 al incubarlos en medio nutritivo con 6 g/l.

Debido a esto, se incrementaron las dosis de altar hasta una concentración máxima

de 20 g/l (8, 11, 14 y 20 g/l), observándose la formación de ESM a los 36 días en

todos los tratamientos, con valores máximos de 0.9750 en presencia de 20 g/I de

agar, seguido de los valores promedio de EM de 0.5429 y 0.4889 en los tratamientos

con 14 y 11 g/I de agar, respectivamente (Cuadro 26).

Se obtuvo una alta significancia en los valores del factor de variación

tratamientos (Anexo 17), al realizar el ANDEVA con el promedio de embriones por

caja de petri (con 7 explantes), por consiguiente se aplicó la prueba de comparación

de medias Tukey (α=0.01), se eliminó el tratamiento testigo que presentó 0

embriones maduros. En el último grupo de significancia se ubicó el tratamiento de 8

g/l de agar (Cuadro 26).

108

Cuadro 26. Promedio de embriones somáticos maduros de aguacate cv. Hass porcaja de petri, a los 36 días. Significancia estadística Tukey (a=0.01).

Tratamientos Media Significancia estadística

Dosis de agar (g/I) Tukey

20 0.9750 A

14 . 0.5429 B

11 0.4889 B

8 0.0857 C

En otro experimento, donde se probaron 10, 20 y 30 g/I de agar, con la

finalidad de confirmar el efecto del agar sobre la maduración de los embriones

somáticos de aguacate, a los 23 días del cultivo se detectó un promedio de ESM por

caja de petri hasta de 1.96 en 20 g/I de agar (Figura 15A), 1.88 en 30 g/I y 0.24 en 10

g/l. No hubo diferencias estadísticas entre los tratamientos de 20 y 30 g/I, pero sí con

el de 10 g/I (Tukey, α= 0.01) (Cuadro 27).

Cuadro 27. Promedio de embriones somáticos maduros de aguacate cv. Hass porcaja de petri a los 23 días. Significancia estadística Tukey (a= 0.01).

TratamientosDosis de agar (g/l)

Media

20 1.96 A

30 1.88 A

10 0.24 B

Además, para conseguir la maduración de embriones somáticos de aguacate,

se estudió el efecto de diferentes dosis de sacarosa (30, 50, 70 y 90 g/I) y manitol (7,

9, 11 y 13%) para observar la consecuencia del aumento de la presión osmótica del

medio de cultivo. En los medios de cultivo con la variación en la concentración de

sacarosa, se generaron ESM en un promedio máximo por caja de petri de 0.37 con

50 g/l, pero no existieron diferencias entre los tratamientos probados (Anexo 18); se

repitió la prueba anterior, se encontró solamente formación de ESM en el tratamiento

90 g/I de sacarosa con un promedio de 0.22. Al cultivar las estructuras embrionarias

109

en medios con manitol, no se presentó la maduración de embriones somáticos y se

detectó un alto porcentaje de necrosis en los tejidos incubados (90%).

La maduración de los embriones somáticos de aguacate se percibe por los

cambios de coloración, formación de nuevo tejido y por el tamaño de éstos. Ya se ha

indicado que el color de los ESM cambia de amarillo cremoso a blanco, al observar

la formación de un tejido envolvente rígido (Figura 15A). El tamaño de los ESM llega

a alcanzar los 5 x 3 mm (Figura 15B), aunque esto depende del medio y condiciones

de cultivo. Generalmente los resultados confirman que el tamaño de los ESM se

comporta inversamente proporcional al número de éstos por caja de petri, con la

110

dosis más alta de agar se encontraron los embriones más pequeños con un

promedio de 2 x 1 mm, la siguiente de 2 x 2, 4 x 3 y en la dosis más baja, ESM de 5 x

3 mm.

4.2.2.3.1. Análisis de almidón y glucosa de embriones somáticos maduros

Se analizó la presencia de almidón y glucosa en los ESM de aguacate

obtenidos en esta investigación para verificar la integridad de éstos y relacionar el

contenido con la respuesta de germinación. Cortes de tejido de los ESM fueron

sometidos a tinción con una solución de fugo¡ (2 g de yoduro de potasio + 1 g de

yodo en 250 ml de agua), y fueron observados en el microscopio de fases. Las

células no mostraron el color azul característico de la presencia de gránulos de

almidón, se concluye que no había almidón en los ESM. En la cuantificación de

glucosa, los ESM presentaron un contenido de 6.026 x 10-4 mg a 13.779 x 10-4 mg

por cada mg de ESM.

4.2.2.4. Germinación de embriones somáticos maduros

Con las diferentes pruebas realizadas sobre reguladores de crecimiento,

interacción BA-AG3 BA-AIB, BA-2,4-D y brasinoesteroides- BA-AG3 en medio sólido,

dosis de BA, TDZ e interacción, BA-AIB en medio líquido con papel filtro o en

magenta en diferentes tiempos de inmersión o con diferentes dosis de adenina

(Figura 16), no se obtuvieron porcentajes aceptables de germinación, ya que

solamente en algunos tratamientos se observaron indicios de emisión de brotes o

formación de raíces (Figura 17).

De manera general, con niveles altos de reguladores se generó nuevamente

callo embriogénico, es decir que los tejidos sufrieron de nuevo desdiferenciación

celular. No obstante a lo anterior, al establecer los embriones somáticos en medio de

cultivo con sales de Anderson (1975) modificada en nitratos (+25%), sin reguladores

de crecimiento y recultivar éstos a los 90 días a medio MS con BA 0.3 mg/l, se

111

obtuvo un porcentaje del 10% de germinación a los 118 días de su establecimiento

(Figura 18).

112

113

V. DISCUSIÓN

5.1. Organogénesis de aguacate criollo

5.1.1. Condiciones óptimas de asepsia para el establecimiento in vitro de yemas

axilares de aguacate

En los cultivos in vitro encaminados a la obtención de procesos

morfogenéticos, como la organogénesis, uno de los principales problemas es la

enorme dificultad para establecer los explantes en condiciones asépticas y lograr

excelente brotación, debido a la alta incidencia de contaminación por hongos y a la

necrosis apical (Pliego-Alfaro et al., 1987). Para establecer óptimamente un sistema

in vitro, existen métodos rutinarios de asepsia que involucra el uso de compuestos

detergentes y tóxicos a microorganismos, así como el uso de plaguicidas y

antibióticos usados directamente sobre el explante o adicionados al medio de cultivo

(McClelland y Smith, 1993).

En las yemas de aguacate, el uso de plaguicidas para eliminar los patógenos

del explante fue más eficiente cuando se incorporaron al medio de cultivo, esto

probablemente porque su absorción es lenta y en determinada forma dosificada por

la misma entrada de los compuestos nutritivos a los tejidos del explante. Uno de los

mejores tratamientos para eliminar la presencia de hongos, fue la incorporación al

medio de cultivo de solamente 1 g/I de benomilo, con una permanencia del explante

que no excedió los 15 días, ya que con los resultados obtenidos, se observó que

estos explantes soportaron hasta los 48 días sin mostrar síntomas de necrosamiento

o fitotoxicidad.

114

5.1.2. Prevención de necrosis de yemas axilares de aguacate

Al preparar los explantes para su establecimiento in vitro se dañan los tejidos y

los compuestos fenólicos que están acumulados en grandes cantidades en las

vacuolas se mezclan con el contenido de los plastidios y otros orgánulos donde están

confinadas las polifenoloxidasas y aparece la coloración negra o marrón como

consecuencia del proceso de oxidación (Jiménez,1998). El tratamiento que resultó

más favorable para eliminar el necrosamiento de las yemas axilares de aguacate in

vitro, fue la inmersión del explante en ácido ascórbico (400 mg/I) durante 30 minutos

previo a su establecimiento en el medio de cultivo. Este resultado elimina el problema

de manera más práctica y económica que la obtenida por Pliego-Alfaro y col. (1987)

y Barceló-Muñoz y col. (1999), ya que el primer grupo de investigadores proponen la

técnica de cultivo de doble fase o recultivos múltiples a intervalos cortos, condiciones

que inducen hiperhidricidad e hinchamiento de las yemas las cuales mostraron un

lento crecimiento. El segundo grupo indica que para vencer el problema anterior se

deben cultivar las yemas apicales o laterales en medio líquido en un agitador

giratorio por un periodo de 2 semanas. Todo lo anterior incrementó los costos y

tiempo.

5.1.3. Reguladores de crecimiento y otros compuestos del medio de cultivo en

la organogénesis in vitro de aguacate

La composición de un medio de cultivo es determinante en el crecimiento y

desarrollo del explante, las sales minerales y los reguladores de crecimiento son

importantes. Los resultados obtenidos en la brotación in vitro de yemas axilares de

árbol adulto de aguacate criollo, indican que en las sales minerales MS 20% con BA

2 mg/l y AIB 0.2 mg/I, se produce el mayor porcentaje de brotación (76% a los 55

días del establecimiento del explante) y el mayor número de brotes laterales (3.41),

aunque la mayor longitud del brote principal (32.17 mm a los 127 días) se obtuvo con

MS 100% y 2 mg/I de BA y AIB; sin embargo, no se observaron diferencias

115

estadísticas significativas cuando se empleó MS o WPM al 100% con BA 2 mg/I y

AIB 0.2 mg/l. De manera general, la brotación fue mayor (43.16%) en los medios de

cultivo preparados con sales minerales MS, en tanto que en sales WPM fue de 28%

y en Mc Cown's del 24%.

En la fase de establecimiento de un explante in vitro se requiere obtener la

máxima brotación, brotes bien formados, de una longitud aceptable y con la mayor

cantidad de yemas axilares, situación que en parte se logró en aguacate criollo al

utilizar el medio de cultivo con sales MS 20%, en tanto que Pliego-Alfaro y col. (1987)

con el portainjerto IV-8 muestran que la reducción de macroelementos MS a la mitad

de su concentración fue benéfico para el desarrollo de brotes; una reducción del

porcentaje de sales conlleva a obtener una buena brotación, pero reducida longitud

de éstos y por consecuencia menor cantidad de yemas axilares potenciales a

recultivar en la fase de multiplicación. De estos resultados se observa que existe una

relación directa entre menos sales (MS 20%), mayor brotación y menor longitud de

los brotes, y más sales (MS al 100%), menor brotación y mayor longitud de los

brotes.

Con relación al barrido de reguladores de crecimiento realizado en la fase de

iniciación, resulta notable que la falta de la citocinina en el medio de cultivo es

determinante para lograr la brotación y que precisamente los tratamientos que

mostraron las mayores brotaciones fue con BA, situación que coincide con lo

señalado por Davies (1995), Cline (1996) y Brandstatter y Kieber (1998), en donde

para obtener morfogénesis, iniciación y crecimiento de brotes se requiere la

presencia de citocinina.

En resumen, el efecto de las sales minerales MS es mejor que las del WPM y

Mc Cown's para la brotación de yemas axilares de aguacate criollo (P. americana

var. drymifolia), varios investigadores reportan su uso (Nel et al, 1982; González y

Salazar, 1984; González et al., 1985; Shall, 1987; Pliego et al., 1987; Solórzano-

Vega, 1989; Mohamed-Yasseen, 1995b y Barceló-Muñoz et al., 1999), pero no

116

coinciden los resultados que se obtuvieron con los de estos investigadores, en

cuanto a la concentración de las sales minerales, y en el tipo y dosis de los

reguladores de crecimiento, ya que en sus estudios emplearon germoplasma

diferente de aguacate, como P. indica, P. americana raza antillana, P. schiedeana, P.

americana cv. Fuerte entre otros, y por el tipo de explante que utilizaron para

regenerar plántulas in vitro: brotes de 3-5 cm de plántulas de 1 año, segmentos de

tallo obtenidos a partir de semilla, ejes embrionarios de semillas maduras y brotes

básales obtenidos después de podar el árbol a nivel de suelo.

En la multiplicación de brotes in vitro se observó que las yemas axilares y

apicales brotaron primero (12 días), en tanto que las yemas de la base del explante

brotaron posteriormente. Lo anterior es una respuesta normal, debido a que los

tejidos jóvenes inician más rápido el crecimiento en condiciones in vitro, que coincide

con lo señalado por Halperin (1996) quien demostró que la edad fisiológica del inóculo

influye en la formación de órganos.

Por otra parte, resulta evidente que en la prueba de brotación múltiple o

multiplicación de brotes, los valores más altos en cuanto a número de brotes

promedio por frasco (10.9 y 9 a los 85 días) se obtuvieron con dosis altas de

citocinina (0.9 y 0.6 mg/l de BA, y 0.9-0.1 mg/l de BA-AIB), sin embargo estos

tratamientos formaron callo abundante en la base del explante (70, 55.56 y 40%

respectivamente); indudablemente que con sólo 0.3 mg/l de BA se observó poca

formación de callo, un número aceptable de brotes promedio por frasco (6.9), buena

longitud promedio de los brotes (28.48 mm) y de color verde oscuro, crecimiento

uniforme y vigoroso. Estos resultados no coinciden con la dosis de reguladores de

crecimiento reportada por Nel y col. (1982) quienes trabajaron con P. indica y que

en la fase de establecimiento así como en las subsecuentes multiplicaciones

agregaron al medio 2 mg/l de BA; tampoco coincide con lo obtenido por González y

Salazar (1984) quienes observaron crecimiento de yemas axilares en P. americana

raza antillana en un medio con mayor proporción de auxina que de citocinina (0.3

mg/I de AIB y 0.1 mg/l de K); también difieren con Shall (1987) que utilizó P.

117

americana cv. Fuerte, en donde fomentó la formación de brotes con 5 y 10 mg/I de

BA; probablemente esto sea un reflejo de la diferencia endógena de las citocininas

en estas especies de Persea, ya que en la especie y variedad de estudio se requiere

una cantidad mínima de citocinina (0.3 mg/I de BA) para la multiplicación de los

brotes.

En la prueba anterior también se observó que cuando no se utilizan

reguladores de crecimiento se obtiene una buena longitud del brote, pero sin que

éste multiplique, en algunas especies esta etapa es necesaria para desarrollar el

brote, antes de la inducción de raíces o de la aclimatación. Lo antes mencionado

coincide con Von Amold (1988) quien señala que frecuentemente es necesario

eliminar las citocininas para el alargamiento y el enraizamiento de los brotes.

En la fase de enraizamiento in vitro de brotes de aguacate criollo se reportan

porcentajes de formación de raíces hasta del 44.44%, con un promedio de raíces por

brote de 2.25, aceptable en plantas leñosas como el aguacate, aunque este valor es

menor al alcanzado por Barceló-Muñoz y col. (1999) con brotes del portainjerto

selección IV-8, no obstante que para lograr estos resultados usaron dos tipos de

medio, primero establecieron los brotes en medio líquido en un agitador giratorio con

macroelementos MS 0.3X y 4.9 µM de AIB y posteriormente los transfirieron a medio

sólido en ausencia de auxina pero con 1 g/I de carbón activado, procedimiento que es

impráctico y costoso. En cuanto a la dosis de la auxina que se encontró como

mejor respuesta, 0.4 mg/I de AIB, no coincide con el nivel obtenido por Nel y col.

(1982), González y Salazar (1984) y Mohamed-Yasseen (1995b) en germoplasma de

aguacate diferente, investigadores que sugieren dosis de 2 hasta 10 mg/1 de AIB.

La fase de aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro es fundamental y

crítica, por la deshidratación y la intensidad de luz a que se expone, porque en

general una plántula in vitro no desarrolla sistemas de regulación hídrica tales como

cera, estomas, cutícula, etc. (Preece y Sutter, 1991) y la intensidad de luz puede ser

hasta 9 veces más (900 W/m2) (Abdeinour y Vicent, 1993); de ahí que la protección

118

del tejido con Folicote (ceras y parafinas refinadas) en cámara húmeda resultó

favorable y coincide con la sugerencia de Preece y Sutter (1991). La aplicación de

Folicote en dosis de 1 parte en 20 de agua y la cubierta plástica durante 80 días o

hasta que la plántula forme dos hojas más, incrementó la supervivencia hasta el

100%, estos resultados difieren con los obtenidos por Nel y col. (1982) quienes

alcanzaron tan sólo un 50% de supervivencia, Schall (1987) un 80% y Barceló-

Muñoz y col. (1999) un 70%.

En los estudios citológicos de las hojas de las plántulas producidas in vitro se

observaron células estomáticas deformes, cutícula delgada y ausencia de ceras,

aspectos coincidentes con los señalamientos de Cañal y col. (1999) que en

respuesta al ambiente en micropropagación se presentan: a) En los tejidos.-

disminución del área foliar, en el contenido de clorofila y del número estomático,

menor desarrollo anatómico y peso seco, disminución o alteración del contenido de

ceras, funcionamiento estomático anormal y b) En la planta.- menor tasa de

crecimiento, crecimiento suculento, desórdenes fisiológicos y morfológicos, formación

de pocas raíces secundarias, elevada variabilidad en tamaño y forma, mayor

frecuencia de mutaciones y presencia de contaminaciones.

Al integrar de manera conjunta los mejores tratamientos, con base a los

resultados obtenidos, en cada una de las fases del sistema de micropropagación vía

organogénesis, se encontró que este sistema resulta práctico, rentable, confiable y

asegura la producción clonal de plantas libres de enfermedades, además que en

corto tiempo se puede producir una alta cantidad de plantas. De una yema axilar de

árbol adulto de aguacate criollo, establecida in vitro en la fase de iniciación, a los 100

días se obtienen 5 yemas axilares, mismas que se establecen en medio de cultivo en

la fase de multiplicación y que a los 70 días generan 11:5 brotes con 5 yemas cada

uno, o sea en multiplicación se logran 57.5 yemas que se cultivan en medio inductor

de raíces, se obtiene un 44% de brotes con raíz (25.5 brotes), los cuales a los 6

meses de cultivo en invernadero se encuentran listos para su establecimiento en

campo, o bien para recibir el injerto. En cada una de las fases de laboratorio se utilizó

119

solamente un tipo de medio de cultivo y una cámara de crecimiento con temperatura

constante de 25±2°C y fotoperiodo de 16 horas de luz, a diferencia de algunos

protocolos que requieren para brotación, subsecuentes multiplicaciones y

enraizamiento, equipo especial tal como un agitador giratorio o bien condiciones de

doble fase (medio líquido - sólido o sólido - líquido) para poder lograr el propósito.

5.2. Embriogénesis somática de aguacate cv. Hass

La embriogénesis somática es una vía ideal para investigar los procesos

completos de diferenciación de plantas, así como los mecanismos de expresión de

totipotencia en células vegetales (Nomura y Komamine, 1999), mejoramiento del

cultivo, eliminación de enfermedades, conservación de germoplasma y propagar

clonalmente plántulas sobresalientes (Janick, 1993), de manera más práctica y

económica en comparación a la organogénesis, siempre y cuando para esto último

se inicie el proceso con tejido somático (nucelas) y no con embriones cigóticos

inmaduros. Numerosas investigaciones en diferentes especies vegetales indican la

utilización de tejido nucelar en la generación de callo embriogénico (Rangan et al.,

1968; Lítz, 1984a; Litz, 1984b), específicamente en aguacate se ha generado la

embriogénesis somática, pero con embriones cigóticos inmaduros (Mooney y Van

Staden, 1987; Pliego-Alfaro y Murashige, 1988; Raviv et al., 1998; Witjaksono y Litz,

1999a).

5.2.1. Prevención de necrosis de tejido nucelar de aguacate

Una etapa importante en la embriogénesis es el establecimiento in vitro de

tejido nucelar que genere callo embriogénico, al evitar la contaminación y oxidación

del tejido; en este estudio se encontró una reducción total de la necrosis en las

nucelas de aguacate (P. americana cv. Hass) por efecto del ácido ascórbico (400

mgll durante 5 segundos), antes de su colocación en medio de cultivo. El factor

oscuridad (etiolación del tejido) y el compuesto cisteína que en algunos explantes

120

han reducido la necrosis-oxidación (Zirari y Lionakis, 1994; Mohamed-Yasseen,

1995b; Llano-Agudelo et a/., 1995; Jiménez, 1998), en tejido nucelar de aguacate no

mostraron un efecto positivo, probablemente por la gran cantidad de fenoles que

existen en esta especie.

5.2.2. Reguladores de crecimiento y otros compuestos del medio de cultivo en

la embriogénesis somática de aguacate

En las pruebas realizadas con tejido nucelar de aguacate cv. Hass se obtuvo

formación de callo en 28.57% de los explantes con sales MS a 1/2 de su

concentración más 0.01 mg/1 de 2,4-D y 17.8% con las mismas sales anteriores pero

con 4 mgll de pictoram más 0.4 mgfl de AIB; se corroboró así el papel esencial que

juegan las auxinas en la inducción de la embriogénesis (Hobbie et a/., 1994; Davis,

1995; Macdonald, 1997). En base a los resultados anteriores y a los señalamientos

de Gómez (1998), en relación al papel que desempeña el 2,4-D en la incidencia de la

variación genética y los cambios epigenéticos que aparecen en plantas obtenidas de

embriones somáticos para la generación de callo embriogénico, es más conveniente

la utilización de las auxinas picloram (4 mg/l) y AIB (0.4mg/I), esto indudablemente en

una concentración de sales minerales MS 1/2 suplementadas con vitaminas, caseína

hidrolizada, sacarosa, agar-agar (Sigma) y ajustar el pH a 5.7. Las dosis de

reguladores de crecimiento difieren en gran medida con las encontradas por Mooney

y Staden (1987), Pliego-Alfaro y Murashige (1988) y Witjaksono y Litz (1999a) con

embriones cigóticos inmaduros, quienes determinaron que en la generación de callo

embriogénico se utilice solamente 0.1 mg/1 de picloram, debido principalmente a lo

anteriormente descrito, por la concentración endógena diferente de los explantes.

En las pruebas sobre multiplicación de masas proembriogénicas y desarrollo

de embriones somáticos en medio sólido y líquido con uso del agitador, no se detectó

respuesta al picloram y fue claro que al incrementar la dosis de esta auxina en medio

líquido se disminuyó la viabilidad de los embriones hasta el 17.5% con 1 mg/l de

picloram, además de la disminución en un 80% de la formación de masas

proembriogénicas. Estos resultados no coinciden con lo reportado por Mooney y

121

Staden (1987) y Witjaksono y Litz (1999a) investigadores que subcultivaron el callo

embriogénico en medio con auxinas, utilizaron ácido benzotiazol-2-oxiacético (BTOA

o BOA) los primeros y picloram los segundos, aunque si coincide en los periodos

para recultivar el callo sin esperar a que se deteriore el tejido. El hecho de la falta de

respuesta del tejido vegetal a la auxina es debido a que la permanencia continua en

medio de cultivo con auxina, además de perderse la capacidad de morfogénesis,

también se pierde la formación de masas proembriogénicas (Halperin, 1996); por lo

anterior, es conveniente cultivar el callo embriogénico de aguacate cv. Hass en

medio sin auxinas.

Con relación al tipo y desarrollo de embriones somáticos que se multiplicaron

en medio de cultivo sólido o líquido, se encontró que no obstante que en medio

líquido la multiplicación es de 5 a 7 días más rápida que en medio sólido, los

embriones estuvieron mejor formados en medio sólido.

Los resultados obtenidos en la maduración de embriones somáticos son

coincidentes a los obtenidos por Perán-Quesada y col. (1999) en cuanto al efecto del

agente gelificante, ellos encontraron un efecto significativo de éste sobre el número

de embriones blanco-opacos, mayores y menores de 5 mm, fue mayor con la

concentración de 6.8 g/I de gelrite, mientras que en éste estudio el mayor promedio de

embriones somáticos maduros se obtuvo con 20 g/I de agar-agar (Sigma). Sin

embargo, no coinciden en cuanto a que elevadas concentraciones de sacarosa

tienen un efecto positivo en la formación de embriones maduros. Witjaksono y Litz

(1999b) también reportan el efecto de la concentración del agente gelificante en el

tamaño y número de embriones somáticos opacos, con una óptima respuesta a 6-7

g/I de gel-gro, cabe señalar que tanto el gelrite como gel-gro son agentes

gelificantes, de los cuales normalmente se utiliza entre 1.5 y 2 g/I de medio de

cultivo.

Al endurecer el medio de cultivo con agar-agar se provocó una reducción en la

humedad relativa dentro de la caja de petri, ambiente que propició una desecación

122

lenta de los embriones somáticos y una condición de estrés que aceleró la

maduración de éstos, no obstante que a mayor concentración del agente gelificante

el diámetro de los embriones somáticos fue menor, respuesta similar a la observado

por Witjaksono y Litz (1 999b).

En los análisis de los embriones somáticos maduros no se encontró la

presencia de almidón, solamente glucosa, aunque en cantidades muy pequeñas,

algunas de estas moléculas de glucosa se oxidan por completo en las células

embrionarias hasta la producción de H2O y CO2; otras moléculas de glucosa se

convierten en moléculas de sacarosa y son transportadas a las células que inician el

crecimiento de la raíz y tallo, donde algunas son consumidas por completo en la

respiración y otras se destinan a materiales de la pared celular, proteínas y otras

sustancias necesarias para el crecimiento del brote (Salisbury y Ross, 1994).

Se obtuvo hasta un 10% de germinación en los embriones somáticos de

aguacate cv. Hass, con el solo hecho de usar sales minerales de Anderson (1975)

modificadas en nitratos, sin reguladores y recultivar éstos en medio óptimo, para

multiplicar brotes de aguacate, cabe señalar que en este último medio de cultivo la

presencia de la citocinina (BA) fue determinante para inducir la germinación. Las

investigaciones realizadas al respecto con otro germoplasma, mencionan porcentajes

de 12% para emisión de brotes y de 1 % en formación de brotes-raíces en un medio

con 0.1 mg/l de la citocinina TDZ más 0.5 mg/l de AG3 (Raviv et al., 1998) o bien ésta

ha sido esporádica (Witjaksono y Litz, 1999b).

Al poner 90 días los embriones somáticos maduros de aguacate en un medio

de cultivo bajo en nitratos, como fueron las sales de Anderson modificadas, fue un

estimulo para que los embriones después de este período iniciaran la germinación al

encontrarse en un medio con alrededor de 3 veces más el contenido de NH4NO3 y de

6 veces el de KNO3 más el regulador de crecimiento BA.

123

El sistema de embriogénesis somática que con las diferentes pruebas se

determinó, permitió en primer lugar asegurar la propagación clonal del aguacate,

debido a que en principio se parte de tejido nucelar y no de embriones cigóticos

como hasta la fecha lo indican los reportes realizados por varios investigadores. De

manera práctica se encontró que para generar callo embriogénico de aguacate cv.

Hass se debe utilizar nucelas obtenidas de frutos pequeños 10 a 12 mm de diámetro y

previo tratamiento con ácido ascórbico, proceder a su establecimiento in vitro en

medio MS a 1/2 de su concentración de sales, complementado con vitaminas,

caseína hidrolizada, las auxinas picloram (4 mg/l) y AIB (0.4 mgll), sacarosa, agar-

agar y ajustar el pH a 5.7. En la multiplicación y desarrollo de los embriones

somáticos se empleó como explante masas proembriogénicas en un medio MS

suplementado con tiamina 4 mg/l, mioinositol 100 mg/l, caseína hidrolizada 400 mg/l,

sacarosa 3011 y agar-agar 5 g/l. Mientras que para madurar los embriones somáticos

se empleó el mismo medio anterior, solamente se incrementó la cantidad de agar-

agar a 20 g/I de medio y eliminar la caseína. El porcentaje de germinación obtenido

(10%) aunque es bajo, indica la tendencia para incrementarlo, al modificar la

concentración de las sales minerales y evitar el uso de reguladores de crecimiento en

el medio de cultivo durante los primeros meses.

En esta investigación, pudo determinarse el efecto de la aplicación exógena de

los reguladores de crecimiento, al corroborar en algunos casos la función de éstos

sobre el papel de la morfogénesis in vitro. La combinación de una citocinina con

auxina en una relación de 10:1 fue efectiva para la inducción de brotes a partir de

yemas axilares de aguacate criollo y su multiplicación fue contundente con la

supresión de auxina y una dosis baja de citocinina. La función de la auxina endógena

fue importante para provocar un enraizamiento óptimo, con sólo aplicar de manera

exógena una cantidad mínima de auxina.

Las auxinas durante el proceso de la embriogénesis somática, al implicar la

inducción, la multiplicación de masas proembriogénicas y la germinación de los

embriones somáticos de aguacate cv. Hass, fueron importantes ya que se requirieron

124

en dosis relativamente altas para la inducción, la eliminación de éstas en la

multiplicación de las masas proembriogénicas, desarrollo de las estructuras

embrionarias y en la germinación. Para este último proceso la adición de una

citocinina fue relevante.

Los sistemas de organogénesis y embriogénesis somática determinados en

esta investigación son de enorme utilidad, porque sientan las bases para futuros

estudios sobre la conservación de germoplasma in vitro, selección de variantes y

mutantes (variación somacional), rescate de embriones, transformación y la

hibridación somática; además de que con estos sistemas es posible propagar

clonalmente plantas libres de enfermedades y la producción de semilla sintética.

125

VI. CONCLUSIONES

Se establecieron cultivos in vitro de yemas axilares de árbol adulto de

aguacate criollo y tejido nucelar de aguacate cv. Hass, se logró evitar la

contaminación de los explantes mediante la desinfección superficial e interna con el

uso de plaguicidas como el Benlate y Agrimicin 500, y el desinfectante hipoclorito de

sodio. Así mismo, la necrosis tanto de las yemas axilares y de las nucelas se previno

con un tratamiento de inmersión en solución con ácido ascórbico.

Se determinaron las dosis y tipos de reguladores de crecimiento para

conseguir la organogénesis en yemas axilares de aguacate criollo, y la

embríogénesis somática por el cultivo de tejido nucelar de aguacate cv. Hass.

Con la aplicación de la citocinina BA o la auxína AIB en una relación

adecuada, se logró la inducción, multiplicación y enraizamiento de los brotes hasta la

formación de plantas completas.

La formación de masas proembriogénicas se obtuvo por el efecto principal de

las auxinas picloram y AIB, y después no fueron requeridas para la multiplicación y

desarrollo de las estructuras embrionarias (globulares, acorazonados, torpedos y

maduros). La germinación de los embriones somáticos de aguacate cv. Hass se

consiguió en porcentajes relativamente bajos, en un cultivo de dos fases: primero en

un medio con baja cantidad de nitratos y sin reguladores de crecimiento; y después

en presencia de la citocinina BA, en donde se obtuvieron plantas completas.

Las plantas regeneradas de aguacate pudieron ser óptimamente

transplantadas y aclimatadas, al evitar el estrés hídrico de la plántula y mantenerla

en un microambiente especial hasta la formación de nuevo tejido (2 hojas).

126

VII. LITERATURA CITADA

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141

ANEXOS

Anexo 1.

Reactivos empleados en los diferentes medios de cultivo o soluciones.

Reactivo Fórmula Marca

Macroelementos

Nitrato de amonio

Nitrato de potasio

Cloruro de calcio 2 hidratado

Nitrato de calcio 4 hidratado

Sulfato de magnesio 7 hidratado

Fosfato de potasio monobásico

Sulfato de potasio

Fosfato de sodio

Microelementos

Acido bórico

NH4NO3

KNO3

CaCI2.2H2O

Ca (NO3)2 4H2O

MgSO4.7H2O

KH2PO4

K2SO4

NaH2PO4

H3BO3

Sigma

"

Sigma ®

"

J.T. Baker®

"

Merck®

Sigma ®

Sigma ®

Sulfato de manganeso monohidratado MnSO4.H2O "

Sulfato de zinc 7 hidratado ZnSO4.7H2O J.T. Baker®

Yoduro de potasio KI Sigma ®

Molibdato de sodio 2 hidratado Na2Mo04.2H2O Aldrich ®

Sulfato cúprico 5 hidratado , CuSO4.5H2O Merck®

Cloruro de cobalto 6 hidratado CoCl2.6H2O Sigma ®

Solución de fierro

Acido etilendinitrilotetraacético C10H16N2O8 Sigma ®

Sulfato ferroso 7 hidratado FeSO4.7H2O "

Vitaminas MS

Biotina (Vitamina H) C10H16N2O3S Sigma ®

Piridoxina (Vitamina B6) C8H11NO3 HCI "

Tiamina (Vitamina B1) C12H17CIN4OS.HCL- “

Acido nicotínico (Niacina) C6H5NO2 "

142

Reactivo Fórmula Marca

Reguladores de crecimiento

Bencilaminopurina (BA) C12H11N5 Sigma

Cinetina (K) C10H9N5O "

Thidiazuron (TDZ) C9H8N4OS "

Acido indolbutírico (AIB) C12H13NO2 "

Acido Naftalenacétíco (ANA) C12H10O2 "

2,4-D C8H6C12O3 Sigma ®

Picloram C6H3C13N2O2 "

Acido giberélico (AG3) C19H22O6 "

Acido abscisico (ABA) C15H20O4 "

Otros compuestos

Yodo l2 Sigma ®

Pantotenato de calcio C18H32CaN2O10 "

Glicina C2H5NO2 "

Mioinositol C6H12O6 "

Glutamina C5H10N2O3 "

Hemisulfato de adenina C5H5N51/2 H2SO4 "

Azúcar refinada comercial

Sacarosa C12H22O11 "

Manitol C6H14O6 "

Glucosa (oxidasa) Hycel®

Agar-agar Sigma ®

Phytagel "

Acido ascórbico C6H6O6 "

Cisteína C3H7NO2S "

Carbón activado Merck

Caseína hidrolizada Sigma ®

Diacetato de fluoresceína C24H16O7 "

143

Reactivo Fórmula Marca

Acido clorhídrico HCI J.T. Baker®

Hidróxido de calcio NaOH "

Polioxietilensorbitan Monolaurado

(Tween 20)

Sigma®

Anexo 2.

Valores de F para la variable longitud del brote principal en barrido de reguladores de

crecimiento con BA-AIB fase de iniciación.

Valor de

Ft

Factor

de

variación

Días después

del

establecimiento

F calc.

0.05 0.01

Tratamientos 60 2.17 2.22 3.05

96 2.19 1.97 2.59

110 2.49 2.07 2.76

144

Anexo 3.

Prueba de comparación de medias Tukey (0.05) a los 96 y 110 días delestablecimiento en la variable longitud del brote principal (mm) del estudio barrido dereguladores de crecimiento con BA-AIB fase de iniciación.

Tratamiento

No. BA-AIB mg/I

Media (mm)

a 96 días Significancia

Media (mm) a

110 días Significancia

10 2-0.2 22.5 A 22.5 A

13 3-0.0 21.6 A 25.4 A

15 3-0.5 21.5 A 24.3 A

9 2-0.0 16.8 A 22.0 A

5 1-0.0 16.5 A 19.7 A

6 1-0.2 16.0 A 17.8 A

14 3-0.2 15.3 A

8 1-1.0 15.0 A 17.3 A

16 3-1.0 14.7 A 20.7 A

11 2-0.5 13.6 A 16.2 A

12 2-1.0 13.1 A 15.0 A

Anexo 4.

Análisis de varianza en la variable número de brotes por frasco, a 25 días delestablecimiento, en el barrido de reguladores de crecimiento BA - AIB con sales MScompletas y sin adenina.

Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F calculada F tabulada

variación libertad cuadrados medio 0.01 0.05

Tratamientos 11 260.257 23.659 3.093 2.44 1.89

Error 108 826.108 7.649

Total 119 1086.366

C.V. 43.3%

145

Anexo 5.

Análisis de varianza en la variable número de brotes por frasco, a 85 días delestablecimiento, en el barrido de reguladores de crecimiento BA - AIB con sales MScompletas y sin adenina.

Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F calculada F tabulada

variación libertad cuadrados medio 0.01 0.05

Tratamientos 11 399.311 36.301 2.9406 2.44 1.89

Error 100 1234.466 12.345

Total 111 1633.777

C.V. 49%

Anexo 6.

Análisis de varianza en la variable longitud promedio de brotes (mm), a los 25 días delestablecimiento, en el barrido de reguladores de crecimiento BA - AIB con sales MScompletas y sin adenina.

Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F calculada F tabulada

variación libertad cuadrados medio 0.01 0.05

Tratamientos 11 606.22 55.11 2.314 2.44 1.89

Error 107 2547.84 23.81

Total 118 3154.06

C.V. 41.66%

Anexo 7.

Análisis de varianza en la variable longitud promedio de brotes (mm), a los 85 días delestablecimiento, en el barrido de reguladores de crecimiento BA - AIB con sales MScompletas y sin adenina.

Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F calculada F tabulada

variación libertad cuadrados medio 0.01 0.05

Tratamientos 11 2173.88 197.63 2.0722 2.44 1.89

Error 100 9536.92 95.37

Total 111 11710.80

C.V. 43.19%

146

Anexo 8.

Respuesta al enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro de aguacate criollo a los71 días del establecimiento, en prueba de dosis de AIB, ANA e interacción AIB -ANA en dos tipos de sales minerales.

Tratamiento

Dosis de

reguladores (mg/I)

Tipo de sales

minerales

Número de

raíces

Enraizamiento

(%)

Longitud

de raíz

(mm)

AIB 0.5 MS 100% 11 en 2 brotes 16.67 10.3

AIB 0.8 “ 0 0 0

AIB 1.1 “ 4 en 2 brotes 16.67 9.0

AIB 1.4 “ 4 en 1 brote 8.33 17.3

AIB 0.5 + ANA 0.3 “ 0 0 0

ANA 0.3 “ 5 en 2 brotes 16.67 24.9

ANA 0.6 “ 0 0 0

ANA 0.9 “ 0 0 0

ANA 1.2 “ 0 0 0

0 “ 2 en 1 brote 8.33 16

AIB 0.5 Modificadas 7 en 2 brotes 16.67 25.3

AIB 0.8 “ 7 en 3 brotes 25 20.6

AIB 1.1 “ 8 en 2 brotes 16.67 22.1

AIB 1.4 “ 2 en 1 brote 8.33 25

AIB 0.5 + ANA 0.3 “ 5 en 1 brote 8.33 39.4

ANA 0.3 “ 0 0 0

ANA 0.6 “ 0 0 0

ANA 0.9 “ 0 0 0

ANA 1.2 “ 0 0 0

0 “ 1 en 1 brote 11.11 20

147

Anexo 9.

Análisis de varianza en la variable longitud de raíz por brote, a 54 días delestablecimiento, en prueba de dosis de AIB e interacción AIB -AG3.

Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F calculada F tabulada

variación libertad cuadrados medio 0.01 0.05

Tratamientos 9 1674.43 186.05 4.19 3.0 2.13

Error 40 1775.81 44.40

Total 49 3450.23

C.V.= 57.58%

Anexo 10.

Análisis de varianza en la variable longitud de raíz por brote, a 88 días delestablecimiento, en prueba de dosis de AIB e interacción AIB -AG3.

Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F calculada F tabulada

variación libertad cuadrados medio 0.01 0.05

Tratamientos 9 2290.20 254.47 3.85 2.76 2.07

Error 54 3568.99 66.09

Total 63 5859.20

C.V.= 44.92%

Anexo 11.

Valores de F y significancia estadística para cada una de las variables evaluadas enobservaciones citológicas de hojas de aguacate criollo.

FVariableCalc. Tab.(0.05)

Coeficiente devariación (%)

Indice estomático 2.235 3.35 25.54Frecuencia de estomas 5.201 3.35 24.13

Frecuencia de células no estomáticas

2.479 3.35 24.41

148

Anexo 12.

Frecuencia de células no estomáticas e índice estomático de los diferentestratamientos del estudio sobre observaciones citológicas de hojas de aguacatecriollo.

Tratamiento Frecuencia de células no Indice estomático (JE)

estomáticas (FCNE)

Hojas de árbol adulto 13.96 7.39

Hojas de plantas invernad. 16.38 7.02

Hojas de plántulas in vitro 17.82 5.83

Anexo 13.

Significancia estadística en el análisis de varianza de los datos de oxidación

transformados a arco seno √x, en prueba sobre antioxidantes e intensidad de luz.

Factor de Grados Suma de Cuadrado Valor de F Valor de

variación de cuadrados medio calculada P>F

libertad

Cisteína (A) 1 15.2480 15.2480 0.1315 0.726

Ac. ascórbico

(B)

1 20929.4121 20929.4121 180.5106 0.000

Intens. de luz

(C)

1 0.0097 0.0097 0.0001 0.989

A x B 1 413.3066 413.3066 3.5647 0.099

A x C 1 228.0097 228.0097 1.9665 0.202

B x C 1 0.0410 0.0410 0.0004 0.983

A x B x C 1 218.5996 218.5996 1.8854 0.211

Error 7 811.6191 115.9455

Total 15 22838.2558

C.V. = 26.73%

149

Anexo 14.

Significancia estadística DMS (0.01) en la variable tipo de explante (masasproembriogénicas y globulares) para la multiplicación de masas proembriogénicas alos 14 días.

Tratamientos Media

Masas proembriogénicas 2.95 A

Globulares 2.10 B

Anexo 15.

Análisis de varianza en la variable promedio de embriones maduros por caja de petri,a los 22 días del establecimiento, en la primer prueba de ABA.

F tabuladaFuente de

variación

Grados de

libertad

Suma de

cuadrados

Cuadrado

medio

F calculada

0.01 0.05

Tratamientos 2 0.201334 0.100667 0.2449 3.88 6.93

Error 12 4.9320 0.411000

Total 14 5.1333

Anexo 16.

Análisis de varianza en la variable promedio de embriones maduros por caja de petri,a los 44 días del establecimiento, en la segunda prueba de ABA y dosis de sacarosa.

F tabuladaFuente de

variación

Grados de

libertad

Suma de

cuadrados

Cuadrado

medio

F calculada

0.01 0.05

Tratamientos 6 13.896187 2.316031 1.5996 2.49 3.63

Error 25 36.195999 1.447840

Total 31 50.092186

150

Anexo 17.

Análisis de varianza en la variable promedio de embriones maduros por caja de petri,a los 36 días del establecimiento, en prueba de dosis de agar.

Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F calculada F tabulada

variación libertad cuadrados medio 0.01 0.05

Tratamientos 3 2.981367 0.993789 34.8651 2.96 4.60

Error 27 0.769603 0.028504

Total 30 3.750970

C.V. = 31.53%

Anexo 18.

Análisis de varianza en la variable promedio de embriones maduros por caja de petri,a los 30 días del establecimiento, en prueba de dosis de sacarosa.

F tabuladaFuente de

variación

Grados de

libertad

Suma de

cuadrados

Cuadrado

medio

F calculada

0.01 0.05

Tratamientos 3 0.375428 0.125143 0.8928 2.95 4.57

Error 28 3.924572 0.140163

Total 31 4.30000

UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SANUNIVERSIDAD MICHOACANA DE SANNICOLÁS DE HIDALGONICOLÁS DE HIDALGO

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES QUÍMICO-BIOLÓGICAS

Lab. De Biotecnología de Plantas Edificio B-3, Ciudad Universitariasalgaciglia@hotmail com 58030, Morelia, Mico. MEXICO.

Tel-Fax: (443) 3 265788

DR. ALFONSO PESCADOR RUBIOCOORDINADOR ACADÉMICOPICAF-UNIV. DE COLIMAPRESENTE.

La presente es con el fin de comunicarle que he revisado el documento final del trabajo detesis "Efecto de los reguladores de crecimiento en los procesos de organogénesis yembríogénesis somática de aguacate (Persea americana Mill.)" del Ing. Ignacio VidalesFernández, estudiante inscrito al programa de doctorado en ciencias del posgrado PICAFque usted coordina, el cual ha sido corregido después de la revisión de un servidor y de losdemás asesores externos (Dr. Miguel A. Gómez Lim y Dr. Joel E. López Meza) que integranel comité tutorial.

Por lo anterior, como tutor de esta tesis, autorizo para que el Ing. Vidales Fernández envíe eldocumento para su última revisión por parte de Ud. y el Dr. Roberto Lezama Gutiérrez, y deesta manera continúe con los trámites correspondiente al examen de grado.

Sin más por el momento y agradeciendo de antemano su atención, reciba un cordial saludo.

A t e n t a m e n t e

C.c.p. Ing. Ignacio Vidales Femández.

135

CENTRO DE INVESTIGACION Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL LPNUNIDAD IRAPUATO

KM. 9.6 LIBRAMIENTO NORTE CARRETERA IRAPUATO - LEONAPDO. POSTAL 629, C.P 36500, IRAPUATO, GTO. MEXICO

Tels. : Conmutador (4) 6 23 96 00, Dirección 6 24 59 09, Fax Administración 6 24 58 46Compras 6 24 56 57, Biotecnología 6 24 59 96, Ingeniería Genética 6 24 58 49, Coordinación Recursos Materiales 6 23 96 91

Dr. Alfonso Pescador Rubio

Coordinador del PICAF

PRESENTE 9 de Octubre de 2002

De mi mayor consideración:

Por este conducto me permito informar que he revisado el trabajo de tesis titulado del Ing.

IGNACIO VIDALES FERNANDEZ titulado "Efecto de los reguladores del crecimiento en

los procesos de organogénesis y embriogénesis somática de aguacate (Persea americana,

Mill.)" y lo he encontrado enteramente satisfactorio. Por ello, por este medio doy mi visto

bueno para que puedan continuar los trámites de titulación.

Atentamente

136

Morelia, Mich. 9 de octubre de 2002.

DR. ALFONSO PESCADOR RUBIOCOORDINADOR DEL PICAF ENLA UNIVERSIDAD DE COLIMAPRESENTE.

Por este conducto hago de su conocimiento que la tesis intitulada EFECTO

DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO EN LOS PROCESOS DE

ORGANOGENESIS Y EMBRIOGENESIS SOMATICA DE AGUACATE (Persea

americana MILL.) presentada por el C. IGNACIO VIDALES FERNANDEZ ha sido

revisada y aprobada por un servidor. Asimismo, aprovecho la oportunidad para

comentarle que no existe inconveniente de mi parte para que el C. Vidales siga

con los tramites correspondientes para la presentación de su examen de Grado.

Sin otro particular por el momento, me despido de Usted enviándole un

cordial saludo.

Km 9.5, Carretera Morelia-Zinapécuaro, La Palma, Tarímbaro, Mich.Tel. y Fax: (443) 295-80-29

137

UNIVERSIDAD DE COLIMACENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIÓN Y

DESARROLLO AGROPECUARIO

ING. RODOLFO MORENTIN DELGADO

DIRECTOR DE LA F. C. R. A.

PR E SENTE.

En atención a que. el M. C. IGNACIO VIDALES FERNÁNDEZ, alumno egresado

del Doctorado en Ciencias, área de ciencias agrícolas y forestales, ha realizado todas, las correcciones al

manuscrito de tesis que presentó para su revisión, me dirijo respetuosamente a usted para informarle

que el documento titulado "Efecto de los reguladores de crecimiento en los procesos de. organogénesis

y embriogénesis somática de aguacate (Pernea americana Mi1I.)", reúne todas las características

necesarias para obtener el grado de Doctor en Ciencias.

Sin otro particular aprovecho la oportunidad para enviarle un cordial saludo.

C.C.P. DR. ROBERTO GOMEZ AGUILAR, SECRETARIO TÉCNICO DEL PICAF,UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NAYARIT.C.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE.C.C.P. ARCHIVO.

A PR/Angélica*

138

UNIVERSIDAD DF COLIMACENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTICACION Y

DESARROLLO AGROPECUARIO

Oficio No. 072/02

ING. RODOLFO MORENTIN DELGADO

DIRECTOR DE LA F- C. B. A.

PRESENTE.

En atención a que el M. C. IGNACIO VIDALES FERNÁNDEZ, alumno egresado

del Doctorado en Ciencias, área de ciencias agrícolas y forestales, ha realizado todas las correcciones al

manuscrito de tesis que presentó para su revisión, me dirijo respetuosamente a usted para informarle

que el documento titulado "Efecto de los reguladores de crecí lento en tos procesos de organogénesís

y embriogénesis somática de aguacate (Persia americana Mill.)", reúne todas las características

necesarias para obtener el grado de Doctor en Ciencias.

Sin otro particular aprovecho la oportunidad para enviarle un cordial saludo.

C.C.P. DR. ROBERTO GOMEZ AGUILAR, SECRETARIO TÉCNICO DEL PICAF,UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NAYARITC.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE.C.C.P. ARCHIVO.

APR/Angélica*