DISTRIBUCIÓN DE LA INFECCIÓN POR Streptococcus iniae EN DIFERENTES ÓRGANOS DE TILAPIA ROJA...
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DISTRIBUCIÓN DE LA INFECCIÓN POR Streptococcus iniae EN
DIFERENTES ÓRGANOS DE TILAPIA ROJA (Oreochromis sp) Y TILAPIA
NILOTICA (Oreochromis niloticus) DIAGNOSTICADO POR PCR EN
TIEMPO REAL
FRANK BARREIRO SANCHEZ
CODIGO: 2005104481
DIRECTOR:
HENRY OSTOS ALFONSO, M.D. MSc. Genética
UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
PROGRAMA DE TECNOLOGIA EN ACUICULTURA CONTINENTAL
NEIVA – HUILA
2012
DISTRIBUCIÓN DE LA INFECCIÓN POR Streptococcus iniae EN
DIFERENTES ÓRGANOS DE TILAPIA ROJA (Oreochromis sp) Y TILAPIA
NILOTICA (Oreochromis niloticus) DIAGNOSTICADO POR PCR EN
TIEMPO REAL
TRABAJO DE GRADO REALIZADO COMO REQUISITO PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE TECNÓLOGO EN ACUICULTURA CONTINENTAL
FRANK BARREIRO SANCHEZ CODIGO: 2005104481
DIRECTOR:
HENRY OSTOS ALFONSO, M.D. M.Sc. Genética
UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
PROGRAMA DE TECNOLOGIA EN ACUICULTURA CONTINENTAL
NEIVA – HUILA
2012
NOTA DE ACEPTACIÓN
_______________________________________
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________________________________________
JURADO
________________________________________
JURADO
________________________________________
DIRECTOR
________________________________________
COORDINADOR
DEDICATORIA
A:
Dios, por darme la oportunidad de vivir y por estar conmigo en cada paso que doy, por fortalecer mi corazón e iluminar mi mente y por haber puesto en mi
camino a aquellas personas que han sido mi soporte y compañía durante todo el periodo de estudio
.
Mi madre María Gladys Sánchez, por darme la vida, quererme mucho, creer en mí y porque siempre me apoyaste. Mamá gracias por darme una carrera
para mi futuro, todo esto te lo debo a ti
.
Mi Padre Farith Barreiro, Por los ejemplos de perseverancia y constancia que lo caracterizan y que me ha infundado siempre, por el valor mostrado para
salir adelante y por su amor
.
Mis hermanos, Farith Alfredo y Albeiro, por estar conmigo y apoyarme siempre, los quiero mucho
.
Mi director de tesis, Henry Ostos Alfonso, por su gran apoyo, motivación y exigencia para la culminación de esta etapa de estudios.
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Surcolombiana por haberme admitido como un hijo más de su alma mater.
Agradecimiento especial:
A James Betancur López, Zootecnista, por sus asesorías, recomendaciones durante el desarrollo del presente trabajo.
A Juan Carlos Quintero, Médico Veterinario y Zootecnista, por sus recomendaciones
A Dolly Lucia Salgado,por su colaboración,apoyo administrativo y por su amistad.
A Andrea Garrido, Auxiliar del Laboratorio de Medicina genómica, por su colaboración y disponibilidad con los materiales del laboratorio.
INDICE DE CONTENIDO
Introducción………………………………………………………..…...….…9
1. Marco Teórico…………………………………………………….….….…..13 1.1. La estreptococosis en peces……………………………………........13 1.2. Características de cultivo de la bacteria.………………………...….16 1.3. Diagnostico……………………………………………………………..18 1.4. Salud pública……………………………………………………….…..19 1.5. Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR)………………………………………………………………....….20 1.6. PCR en tiempo real...…………………………………………….…….24
2. Formulación del Problema y Justificación………………………….……25 3. Objetivos……………………………………………………………….……..28
3.1. Objetivos general…………...………………………………….……….28 3.2. Objetivos específicos ……………………...…………………………...28
4. Metodología………………………………….…………………………….....29 4.1. Muestras y controles …..………………………………………..……...29 4.2. Extracción de DNA, a partir de tejidos…………………………….......29 4.3. Protocolo de PCR en tiempo real……………………………………...30 4.4. Examen de histopatología……...……………………………………....33 4.5. Análisis estadístico……………………………………………………...33
5. Resultados…………………………………………………………………....34 5.1. Extracción de DNA a partir de muestras congeladas ………….…...34 5.2. Resultados de la PCR en tiempo real…………………………...…....36 5.3. Sensibilidad de la PCR en tiempo real………………….…………....38 5.4. Especificidad de la PCR en tiempo real…………………………...…39 5.5. Histopatología…………………...……………………………………….40
6. Discusión …………………..…………………………………………………42
7. Conclusiones………………………………………………………………....43
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Pruebas de identificación de Streptococcus spp aislados en peces 18
Tabla 2. Primers utilizados para el diagnóstico de Streptococcus iniae por PCR en tiempo real 31
Tabla 3 Reactivos a utilizar y su cantidad de volumen para la PCR en tiempo real 31
Tabla 4. Cantidad de DNA obtenido a partir de la las muestras 34Tabla 5. Órganos positivos para la infección Streptococcus iniae 36Tabla 6. Hallazgos histopatológicos en diferentes órganos de
individuos diagnosticados positivos para Streptococcus iniae por PCR en tiempo real 40
Tabla 8. Cronograma 38
INDICE DE FIGURAS
Numeración Descripción de la figura Pagina Figura 1 Amplificación exponencial a partir de un fragmento
de ADN molde tras una serie de ciclos de PCR (Adaptado de Andy Vierstraete, 2001) 21
Figura 2 Esquema del procedimiento de la PCR 22Figura 3 Esquema de desarrollo PCR en tiempo real
(empleando sistema taqman). Tomado de: AbsoluteQuantificationstarted Guide. AplieddBiosystems. 25
Figura 4 Área de extracción de DNA 32Figura 5 Área de PCR 32Figura 6 NanoDrop 2000 35Figura 7 VortexMixer 36Figura 8 Resultado de la PCR tiempo real para el individuo
130 (izquierda), individuo 628 (derecha) 37Figura 9 Distribución de infección por órgano 37Figura 10 Sensibilidad de la PCR Tiempo Real. 38Figura 11 Especificidad de la PCR Tiempo Real. 39Figura 12 Moderados a severos focos de epicarditis
granulomatosa y leve presencia de bacterias tipo coco en miocardio y endocardio 2X (izquierda). Moderado foco de epicarditis necrótica 10X (derecha). 41
Figura 13 Severa acumulación de bacterias tipo coco focalizada en encéfalo y meningitis extensa multifocal. 40X (izquierda). Moderado a severo foco de meningitis fibrinohemorrágica con leve presencia de bacterias tipo coco en el citoplasma de macrófagos 10X (derecha). 41
Figura 14 Moderado foco de hepatitis con presencia de bacterias tipo coco intracelulares. Moderados focos de activación de CMM en hepatopáncreas 40X (izquierda). Severo foco de necrosis e inflamación en hepatopáncreas con presencia de bacterias tipo coco intra y extracitoplasmáticas en células tipo macrófagos, leve a moderados focos de infiltrado mononuclear perivascular, leve presencia de vacuolas que desplazan el núcleo de los hepatocitos 10X (derecha) 41
9
INTRODUCCIÓN
La acuicultura sigue siendo un sector productivo de alimentos ricos en
proteínas creciente, vigoroso e importante, según la información
proporcionada por la FAO, la producción acuícola mundial de pescado
comestible, incluidos los peces de aleta, los crustáceos, los moluscos y otros
animales acuáticos destinados al consumo, alcanzó los 52,5 millones de
toneladas en el año 2008. (FAO 2010). La contribución de la acuicultura a la
producción total de la pesca de captura continuó aumentando y pasó del 34,5
% en 2006 al 36,9 % en 2008. En el período 1970-2008 la producción
acuícola de pescado comestible aumentó a un ritmo anual medio del 8,3 %,
mientras que la población mundial aumentó en promedio un 1,6 % anual.
(FAO 2010). El resultado combinado del desarrollo de la acuicultura en todo
el mundo y la expansión de la población mundial es que el suministro per
cápita medio anual de pescado comestible procedente de la acuicultura para
el consumo se multiplicó por diez y pasó de 0,7 kg en 1970 a 7,8 kg en 2008,
lo que supone un incremento medio del 6,6 % anual. (FAO, 2010)
La producción acuícola se destina principalmente al consumo. En 2008 la
acuicultura generó el 45,7 % de la producción mundial de pescado
comestible destinado al consumo, cifra superior al 42,6 % correspondiente a
2006. (FAO, 2010). En China, el mayor productor acuícola del mundo, el 80,2
% del pescado comestible consumido en 2008 procedió de la acuicultura,
cifra superior al 23,6 % correspondiente a 1970. La producción acuícola
suministró al resto del mundo el 26,7 % de su pescado comestible, cifra
superior al 4,8 % correspondiente a 1970. (FAO, 2010)
10
La acuicultura Colombiana en mayor parte es la piscicultura; lo primero que
hay que resaltar sobre el desarrollo de la piscicultura nacional es que, si bien
es cierto que se trabaja con varias especies nativas, la mayor parte de su
producción está concentrada en dos especies exóticas que son la tilapia y la
trucha, siendo la primera la que muestra una mayor dinámica en producción
y participación en el mercado. La especie nativa con mayor participación es
la cachama, seguida muy de lejos por el bocachico. (FAO – INCODER,
2011).
En primer lugar, a pesar de la gran participación del sistema productivo de
estanques en la superficie total, sólo genera el 65.48 % en el volumen total
de producción, mientras que el sistema de jaulas, con menos del 2 % del
espejo de agua genera el 34.52 % de la producción, en segundo lugar, la
tilapia representa el 73.72 % del total de la producción, mientras que la
cachama, que es el segundo nivel llega al 11.5 %, la trucha el 2.86 % y las
otras especies sólo el 3.4 %. La participación del Huila en el total de la
producción es del 44.47 %, seguido por el Meta con el 15.11 %; todos los
demás departamentos tienen producciones muy inferiores al Huila y Meta.
(FAO – INCODER, 2011).
La estreptococosis es una enfermedad originada por un grupo de cocos
Gram (+) que inducen una signología clínica bastante característica que
involucra muchos órganos del pez. Hasta el momento los cocos Gram (+)
que se han publicado como agentes patógenos para los peces incluyen:
Streptococcus sp., Streptococcus agalactiae, Streptococcus iniae,
Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus milleri, Streptococcus ictaluri,
Streptococcus parauberis, Enterococcus sp., Enterococcus seriolicida,
Lactococcus sp., Lactococcus garviae, Lactococcus piscium, Vagococcus
sp., Vagococcus salmoninarum, Carnobacterium piscícola. (Prieta et al.,
11
1993; Eldar et al., 1994; Toranzo et al., 1994; Domenech., 1996; Michel et al.,
1997, Mata et al., 2004, Yang and Li, 2009, Jimenez A. P. 2010).
Streptococcus iniae y otras especies de estreptococos se han descrito en
numerosos brotes de la enfermedad en varias especies de peces como la
tilapia. (Hernández E, Figueroa J, and Iregui C. 2009.) Streptococcus iniae es
el principal agente causal de la estreptococosis en todo el mundo de peces
silvestres y de granja. Originalmente aislado de abscesos subcutáneos sobre
delfines de agua dulce del Amazonas (Pier y Madin, 1976), este patógeno se
ha asociado a brotes de enfermedades en diferentes especies de peces de
agua dulce y salada comerciales, tales como la trucha arco iris, la tilapia, el
bagre rayado, la dorada o la lubina (Zlotkin et al., 1998; Shoemaker et al.,
2001; Colorni et al., 2002), con tasas de mortalidad entre el 30 y el 50% de
los peces afectados (Eldar et al, 1995b).
Las técnicas de biología molecular, tales como la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), son más precisas y exactas para la identificación de
bacterias a nivel de especie. Estas técnicas se han utilizado cada vez más
para detectar e identificar muchos patógenos bacterianos. Varias técnicas
moleculares han sido desarrollados para complementar los protocolos de
diagnóstico y taxonómicos del Streptococcusiniae, haciéndolo más rápido,
sensible, exacto y específico. Los ensayos de PCR se han utilizado con éxito
para identificar Streptococcus iniae por la amplificación de los genes 16S
rRNA (Zlotkin et al., 1998), la chaperonina HSP60 (Goh et al., 1998), el 16S-
23S rRNA gen de la región espaciadora intergénica (Berridge et al., 1998), y
el gen de la lactato oxidasa (LCTO) (Mata et al., 2004).
12
En la realización de este trabajo se empleó la PCR en tiempo real, para
identificar la distribución de la infección por Streptococcus iniae en cerebro,
corazón e hígado de tilapia roja (Oreochromissp) y tilapia nilotica
(Oreochromisniloticus) además se observó el daño histopatológico por
órgano.
13
1. MARCO TEÓRICO
1.1. LA ESTREPTOCOCOSIS EN PECES
El patógeno Streptococcusi niae en peces (Pier, G.B., Madin, S.H., 1976) es
endémica en varias partes del mundo, incluido Israel (Eldar, A., S. Lawhon,
P. F. Frelier, L. Assenta, B. R. Simpson, P. W. Varner, and H. Bercovier.
1997.) y América del Norte (Perera, R. P., S. K. Johnson, M. D. Collins, and
D. H. Lewis. 1995.) la infección por Streptococcus iniae en la trucha arco iris
(Oncorhynchusmykiss) produce una enfermedad que afecta sustancialmente
el cerebro, con sólo pequeñas alteraciones patológicas en otros órganos
(Eldar A y Ghittino C. 1999). Recientemente el Streptococcus iniae se ha
aislado de los seres humanos enfermos que sufren de celulitis, meningitis o
bacteriemia lo que indica una amenaza para la salud pública.
(GiladBachrach, Amir Zlotkin, AvshalomHurvitz, Donald L.Evans and
AviEldar. 2001).
El Streptococcusiniae fue inicialmente aislado en 1976 en delfines
amazónicos de agua dulce (Iniaegeoffrensis) que habitaban en el acuario de
San Francisco y Nueva York (Pier y Madin, 1976 y 1978). Estos animales
presentaban lesiones cutáneas superficiales. En los años ochenta, se aisló
una nueva especie del estreptococo, considerado el agente etiológico de
meningoencefalitis agudas que afectaban a tilapias de cultivo en Israel,
Taiwán y los Estados Unidos (Eldaret al, 1994 y 1995a), causando una alta
tasa de mortalidad entre los animales. (Romano. LA., Mejía J. 2003.).
14
En principio a este patógeno se lo denominó Streptococcus shiloi,
posteriormente, las características fenotípicas y genotípicas demostraron que
se trataba del Streptococcus iniae (Eldar y et al, 1995b).
La primera infección por Streptococcus en el híbrido de tilapia
(Oreochromisniloticus x O. aureus) fue en Arabia Saudita y se reporta en
1994 (Al-Harbi, 1994). Desde entonces, la infección se ha propagado
rápidamente por todo el país, causando una mortalidad considerable en las
poblaciones de tilapia, con efecto económico significativo. (Al-Harbi, Ahmed
H., 2010).
Un estudio demuestra que la prevalencia de Streptococcus iniae en
establecimientos productores de tilapias en Estados Unidos de Norteamérica
es realmente preocupante. El Streptococcus iniae se aisló en 3,81 % de las
tilapias nilóticas estudiadas y en el 7,23 % de su híbrido denominado
vulgarmente tilapia roja. En cuanto a los establecimientos evaluados entre el
21,6 % y el 27,4 % presentaban algún animal infectado por Streptococcus
iniae. Se observaron variaciones entre animales de diferentes edades tanto
en tilapia nilótica como en tilapia roja. En tilapia nilótica se halló una menor
prevalencia bacteriana en animales de peso comercial y alevinos con el 1,67
% y 0,88 % respectivamente y la mayor incidencia se observó en peces en
fase de engorde (7,96 %). Algo similar sucedió con la tilapia roja, donde se
encontró una menor prevalencia bacteriana en animales de peso comercial y
alevinos con el 3,12 % y 2,12 % respectivamente y la mayor incidencia se
observó también en peces en fase de engorde (9,56 %) (Shoemaker y cols,
2001).
Clínicamente se evidencia que los animales infectados dejan de alimentarse,
se observan letárgicos y adelgazados. Macroscópicamente se encuentran
frecuentemente con endoftalmos, aunque ocasionalmente, puede observarse
15
exoftalmos cuando la septicemia genera una panoftalmitis aguda. (Romano.
LA., Mejía J. 2003.). Las hemorragias cutáneas difusas o petequiales son
frecuentes y si bien se observan en todo el cuerpo, prevalecen en la región
cefálica y caudal. En el abdomen se suele observar una ascitis con líquido
que varía entre cetrino y hemorrágico. Con cierta frecuencia se observa una
esplenomegalia y el hígado se observa friable. En la cavidad craneal se
puede ver la congestión difusa cerebral con líquido cefalorraquídeo
hemorrágico (Romano. LA., Mejía J. 2003).
El análisis histológico muestra un característico cuadro septicémico con una
marcada infiltración celular inflamatoria y numerosos cocos en la mayoría de
los tejidos examinados. Predomina un cuadro menigoencefálico con
dilatación de capilares meníngeos, extravasación de eritrocitos y densos
infiltrados inflamatorios con predominio de granulocitos y macrófagos aunque
también se observan linfocitos. Con técnicas de impregnación argéntica se
pueden ver abundantes cocos en el parénquima encefálico. En el hígado se
observa una hepatitis focal intraséptica con focos de necrosis hepatocelular e
infiltrados inflamatorios. En algunos casos se puede observar una periarteritis
hepática. En el bazo se observa disgregación de melanomacrófagos y
presencia de cocos en los sinusoides esplénicos. La miocarditis y la
pericarditis suele ser un hallazgo frecuente. Algunos autores describen
oftalmitis, presencia de granulomas meníngeos y focos inflamatorios renales
(Perera et al, 1998).
El Streptococcus iniae en pez oscar (Astronotusocellatus), seriola
(Seriolaquinqueradiata), anguila (Anguilla japonica) y corvinón ocelado
(Sciaenopsocellatus) provoca septicemia hemorrágica, con ascitis y
trombosis difusa en vasos sanguíneos (Kusuda y cols., 1993; Eldar y cols.,
1999; Tukmechi y cols., 2009). En tilapia provoca un cuadro septicémico con
una marcada infiltración celular inflamatoria, de predominio
meningoencefálico con dilatación de capilares meníngeos, extravasación de
16
eritrocitos y densos infiltrados inflamatorios con predominio de granulocitos,
macrófagos y linfocitos (Romano y Mejía, 2003). En la trucha arcoíris
(Oncorhynchusmykiss), el Streptococcus iniae provoca formación de
abscesos en el interior de los músculos abdominales con necrosis por
coagulación, así como proliferación de células mucosas y espongiosis en
piel, tejido ocular con hiperemia, hemorragias retinianas, inflamación en el
vítreo y hemorragias en la cámara posterior del ojo, así como
glomerulonefritis, edema y descamación de la mucosa intestinal, y necrosis
focal hepática con hiperemia e infiltración linfocitaria (Akhlaghil y Mahjor,
2004).
En otro estudio con trucha arcoíris, Eldar y Ghittino (1999) describen
meningitis aguda, panoftalmitis con destrucción de la cámara anterior del
globo ocular y afectación del nervio óptico, pero en cambio, describen un
tejido renal sin lesiones, que sí se describe en el estudio de Akhlaghil y
Mahjor (2004) también con trucha arcoíris. (Aamri F. 2010.)
1.2. CARACTERÍSTICAS DE CULTIVO DE LA BACTERIA
Los medios de cultivo usualmente empleados para el aislamiento de estas
bacterias deben ser suplementados con sangre ovina desfibrinada al 5%;
dentro de estos se pueden mencionar: agar tripticasa soya (TSA) (Perera et
al., 1995; Baya et al., 1996; Cheng and Chen, 1998), agar triptona sangre
(BTA) (Bragg and Broere, 1986; Ceschia et al., 1992), y agar infusión cerebro
corazón (BHI) (Prieta et al., 1993; Nieto et al., 1995; Yuasa et al., 1999).
En general, se obtiene el crecimiento de colonias pequeñas (0.5-1.5 mm),
blancas opacas, viscosas, redondeadas y con un borde liso (Plumb et al.,
17
1974; Boomker et al., 1979; Bragg and Broere, 1986; Ceschia et al., 1992;
Prieta et al., 1993; Perera et al., 1995; Yuasa et al., 1999). La alta viscosidad
comúnmente observada de estas colonias ha sido asociada a la presencia de
una cápsula muy prominente (Yoshida et al., 1996).
Adicionalmente, se han desarrollado medios de cultivo selectivos para estas
bacterias. (Kitao et al., 1993) usaron caldo tioglicolato suplementado con
azida de sodio (0.025%) para el aislamiento de Enterococcus seriolicida de
agua marina y fangos alrededor de las explotaciones de ¨yellowtail¨. (Jimenez
A. P. 2010).
Por medio de la coloración de Gram suelen observarse como cocos de 0.6-
0.8 μm solos o en cadenas cortas como en el caso de los Streptococcus iniae
y Streptococcus agalactiae (Kitao, 1993; Perera et al., 1994), como
cocobacilos, especialmente el L. garviae y S. parauberis (Boomker et al.,
1979; Bragg and Breore, 1986; Prieta et al., 1993; Doménech et al., 1996) o
como células ovoides (1.4 x 0.7μm) en el caso de los Enterococcus sp. Y
Vagococcus sp. (Carson et al., 1993; Michel et al., 1997).
En general no son motiles, no esporulados, anaerobios facultativos, no
producen catalasa, ácido sulfhídrico, indol, ornitina ni oxidasa, producen
ácido láctico a partir de carbohidratos y no suelen reaccionar con los grupos
de antígenos Lancefield (Austin and Austin, 1985; Hardie, 1986).
La tabla 1 muestra las principales características de identificación de algunas
de las especies de estreptococos aislados de peces.
18
1.3. DIAGNOSTICO
El diagnóstico presuntivo de la estreptococosis se basa
fundamentalmente en la presencia de los signos clínicos y el aislamiento
de cocos Gram(+) de órganos internos. Una vez se obtiene el crecimiento
de colonias puras en los diferentes medios de cultivo, es necesaria una
confirmación más precisa mediante pruebas fisiológicas y bioquímicas
(Kitao, 1993; Shoemaker and Klesius, 1997).
Técnicas de inmunohistoquímica han sido utilizadas exitosamente para la
identificación de Streptococcus sp. en trucha arco iris, Tilapia y Yellowtail
es una especie de pez de agua salada, la inmunohistoquímica como la
inmunoperoxidasa indirecta ha mostrado una mayor sensibilidad en
19
comparación con el aislamiento microbiológico (Bragg, 1988; Hernández,
2009). Recientemente, se ha empleado inmunofluorescencia para la
detección de Streptococcus iniae en tilapia (Klesius et al., 2006).
En Colombia, el diagnóstico de la estreptococcosis se viene realizando
mediante el uso simultáneo de la histopatología, inmunoperoxidasa
indirecta (IPI), microbiología y PCR (a partir de colonias bacterianas); bien
sea en casos de mortalidad o en programas de monitoreo sanitario que se
han realizado periódicamente con propósitos preventivos (Iregui et al.,
2004).
1.4. SALUD PÚBLICA
El primer caso de enfermedad humana fue reportado en Texas en 1991,
un segundo caso apareció en Ottawa en 1994, y nueve casos más entre
1995 y 1996 (Weinstein et al., 1997). Todos los pacientes tuvieron historia
de manipulación de tilapias vivas o sus filetes y desarrollaron celulitis
aguda, osteomielitis o endocarditis. Por el momento solo se ha implicado
el Streptococcus iniae, pero se sospecha que otras bacterias relacionadas
con la entidad en peces, puedan como esta, causar infección y
enfermedad en humanos (Weinstein et al., 1997; Lau et al., 2003).
20
1.5. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Es una técnica para la síntesis “in vitro” de secuencias específicas de
ADN. Las siglas PCR significan “Polimerase Chain Reaction”: reacción en
cadena de la polimerasa. Desarrollada originalmente por Kary Mullis en la
década de los 80, por lo cual se le adjudicó el Premio Nobel de Química
en 1993, ha sido ampliamente utilizada en el campo de la biología
molecular como PCR simple y en sus diferentes variedades (PCR
multiplex, PCR anidado, RT-PCR, PCR-RFLP, etc.) (Hoorfar et al., 2004,
Hoffmann et al., 2009).
La técnica de PCR permite amplificar de manera selectiva fragmentos del
ADN, situados entre dos regiones cuyas secuencias son conocidas. Estas
dos regiones se utilizan como iniciadores en la reacción de síntesis del
ADN, que está catalizada por la enzima ADN polimerasa (Gibello et al.,
2001).
Brevemente, la reacción se basa en la repetición sucesiva de 30 a 40
ciclos, conformado cada uno por tres etapas o fases principales: Una
primera fase de desnaturalización, donde la doble hélice de ADN se
separa en sus dos hebras, una segunda etapa de hibridación, donde los
iniciadores específicos se unen a las zonas 3’ complementarias que
flanquean el fragmento que queremos amplificar, y un paso final de
elongación, donde se produce la síntesis de una cadena sencilla
complementaria a la original mediante la enzima ADN polimerasa, la cual
incorpora los desoxinucleótidos fosfato presentes en el medio,
complementarios a la cadena molde. Este ciclo se repite de tal manera
que se da una amplificación exponencial de la secuencia de interés,
21
generando al final del proceso billones de copias de ella (Figuras. 1 y 2).
Todo el proceso se lleva a cabo en un equipo, denominado termociclador,
que realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas programadas de
forma exacta. Los productos obtenidos se visualizan normalmente por
medio de electroforesis en gel de agarosa. La amplificación de un gen
específico del patógeno puede de este modo aumentar significativamente
la sensibilidad de la detección (Gibello et al., 2001, Cunningham, 2002,
Yang and Rothman, 2004).
Figura 1. Amplificación exponencial a partir de un fragmento de ADN molde tras una serie de ciclos de PCR (Adaptado de Andy Vierstraete, 2001).
Las ventajas de la PCR sobre otros métodos de diagnóstico genético
radican en su simplicidad y rapidez, especificidad y sensibilidad (Johnson,
2000; Gibello et al., 2001).
Las diferentes clases de PCR han sido empleadas ampliamente para el
diagnóstico e investigación de infecciones causadas por microorganismos
(bacterias, hongos, protozooarios) así como para el estudio de
22
enfermedades de tipo genético, análisis forenses, relaciones filogenéticas
entre especies, detección de cepas resistentes a antibióticos etc. a partir
de diferentes muestras como sangre, semen, cultivos bacterianos,
cultivos celulares, tejidos frescos, congelados o embebidos en parafina,
tanto en medicina humana como Veterinaria (Figura 2.) (Yang and
Rothman, 2004).
Figura 2. Esquema del procedimiento de la PCR
En las últimas dos décadas la PCR ha sido extensivamente modificada
para expandir su utilidad y versatilidad. Por ejemplo, el PCR múltiple
permite la detección simultánea de diferentes secuencias de ADN, por la
incorporación de diferentes grupos de iniciadores. El PCR anidado,
incrementa la sensibilidad y especificidad por medio de dos
amplificaciones sucesivas, el PCR-RFLP (Poliformismos en el tamaño de
los fragmentos de restricción) permite la amplificación de genes de interés
23
y la posterior digestión con enzimas de restricción permitiendo generar
fragmentos de ADN de distintos pesos moleculares, esta técnica es de
gran utilidad para la genotipificación de microorganismos y el RT-PCR,
permite la detección de RNA por la conversión de RNA en una copia
complementaria de ADNc por medio de la enzima transcriptasa reversa,
muy útil en la identificación de virus RNA como VIH y hepatitis C (Hoorfar
et al., 2004, Hoffmann et al., 2009)
Un avance significativo, fue el desarrollo de la PCR en tiempo real, la cual
permite la amplificación y detección de los productos en una única
reacción, eliminando la necesidad de electroforesis para la visualización
de los amplificados. El PCR en tiempo real permite la amplificación
simultánea y la cuantificación en tiempo real (al final de cada ciclo) de
secuencias específicas de ácidos nucléicos, además de aumentar la
sensibilidad, permite reducir el riesgo de contaminación cruzada
(Houghton and Cockerill, 1996; Hoffmann et al., 2009).
El diagnóstico de infecciones basado en PCR ha sido desarrollado
efectivamente para un gran rango de microorganismos, debido a la alta
sensibilidad y especificidad y el bajo consumo de tiempo. En el mundo ha
sido aplicada a la identificación por género y especie de microorganismos
que no crecen in vitro o que requieren un largo tiempo para crecer (Yang
and Rothman, 2004). Sin embargo, un limitado número de ensayos ha
sido aprobado por la FDA (Food and Drug Administration) y aceptados en
la práctica clínica (Yang and Rothman, 2004).
En medicina humana es un método de rutina para el diagnóstico y
clasificación de enfermedades hematolinfoides, bacterianas
24
(Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus, Neisseriagonorrhoeae),
fúngicas (Chlamydia spp, Aspergillus, Candida), parasitarias
(Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania, Giardia, Entamoeba histolytica
etc), virales (Herpes, cytomegalovirus, Poxvirus, adenovirus, influenza
etc) y de enfermedades neoplásicas (Weiss, 1995,Espy et al., 2006;
Hutchins and Grabsch; 2009, Mengoli et al., 2009; Olson et al., 2010).
En Medicina Veterinaria, se emplea en el diagnóstico de infecciones
virales, bacterianas y parasitarias, principalmente en aves (New castle,
Influenza aviar) Bovinos (Diarrea viral Bovina, Leucosis bovina) y Cerdos
(Síndrome Respiratorio Porcino-PRRS, Haemophilus parasuis,
Streptococcus suis, Influenza porcina, Circovirus porcino, Peste porcina
clásica, Neumonía enzoótica porcina) (Pulido et al., 2006; Hoffmann et al.,
2009).
1.6. PCR EN TIEMPO REAL
La PCR cuantitativa detecta en tiempo real la amplificación del genoma
de interés. Para llevar a cabo esta detección existen varios métodos,
pero casi todos basados en la utilización de otro fragmento de ADN
(sonda) complementario a una parte intermedia del ADN que queremos
amplificar. Esta sonda lleva adherida una molécula fluorescente y otra
molécula que inhibe esta fluorescencia ("quencher"), de tal forma que sólo
cuando la sonda es desplazada de su sitio por acción de la ADN
polimerasa la molécula fluorescente se libera de la acción del "quencher"
y emite fluorescencia al ser iluminada con un láser (figura 3). La
cuantificación de la fluorescencia emitida durante cada ciclo de la PCR
será proporcional a la cantidad de ADN que se está amplificando. En
2
q
c
d
general
curva p
ADN qu
Figura 3Tomado d
2. FORMU
La acuicult
que tiene u
con la pro
desarrollo d
para que s
atrón en la
ue se está a
3. Esquema dde: AbsoluteQ
ULACIÓN D
tura de pec
un crecimie
ducción ga
de la acuic
sea válida e
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amplificand
de desarrolloQuantification
DEL PROB
ces es uno
ento anual d
anadera (3
cultura ha l
25
esta técnica
condiciones
o.(M. Tevfi
o PCR en tienstarted Guide
LEMA Y JU
de los sec
de casi el 1
3%) y la pe
levado a la
a requiere
s para cono
kDorak (Ed
empo real (ee. AplieddBio
USTIFICAC
ctores de p
10% desde
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d.) 2007).
mpleando sisosystems.
CIÓN
producción
e 1984, en
activa (1,6%
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paralelo u
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de aliment
comparaci
%). El rápi
n número
na
de
an).
tos
ón
do
de
26
enfermedades infectocontagiosas de muy diverso origen, ya que el régimen
intensivo del cultivo, unido en muchas ocasiones a unas condiciones
higiénico-sanitarias deficitarias, junto al estrés de los animales, favorece la
penetración y desarrollo de agentes patógenos, y como secuencia, la
aparición de enfermedades infectocontagiosas, que son un freno muy
significativo en la producción acuícola, afectando en muchos países al
desarrollo económico del sector.(Aamri F. 2010).
Streptococcus iniae es un importante patógeno de peces en muchas
regiones del mundo. Esta bacteria es también zoonótica con infecciones en
humanos asociados con la manipulación y preparación de los peces
infectados. El Streptococcus iniae se fue señalado como una enfermedad
emergente zoonótica transmitida por animales destinados al consumo en la
Conferencia Internacional sobre Enfermedades Infecciosas Emergentes en
2000 (Hansen et al 2001, Justice et al 2009)
En cuanto a la clínica producida en la infección por Streptococcus iniae, los
peces afectados pueden presentar uno o más de los siguientes signos
clínicos, dependiendo de la especie afectada: natación errática, pérdida de
orientación, letargia, pérdida de control de la flotabilidad, melanosis,
exoftalmia unilateral o bilateral, opacidad de la córnea, hemorragias en o
alrededor de los ojos, base de las aletas, ano, o en cualquier otro lugar en el
cuerpo, fluido ascítico en la cavidad abdominal y ulceraciones (Eldaret al.,
1994 y 1995-a). Esta sintomatología es muy similar a la producida por las
bacterias Streptococcus parauberis, Streptococcus agalactiae o Lactococcus
garvieae (Doménechet al., 1993 y 1996; Eldaret al., 1994 y 1995-a y b;
Bercovieret al., 1997; Eldar y Ghittino, 1999). En algunos casos, los peces no
muestran signos evidentes antes de la muerte. La necropsia puede
evidenciar la presencia de líquido hemorrágico en cavidad abdominal,
27
esplenomegalia, palidez hepática, así como la inflamación alrededor del
corazón y el riñón. Muchos estreptococos infectan el sistema nervioso de los
peces, lo que explica la natación errática frecuentemente observada en
peces infectados (Yanong y Francis-Floyd, 2006).
Su diagnóstico se basa en los signos clínicos, las lesiones histopatológicas y
el aislamiento microbiológico; sin embargo, se requiere de técnicas más
sensibles que confirmen o descarten la presencia de la bacteria en animales.
La técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en tiempo real
permite identificar con una alta sensibilidad y especificidad un gen de interés
de un microorganismo que posiblemente se encuentre en bajas
concentraciones en una muestra. (Jiménez A. P. 2010).
Además de su importancia en la acuicultura, Streptococcus iniae ha surgido
recientemente como una amenaza para la salud pública debido a su agente
zoonótico, al haber sido aislado de humanos infectados como consecuencia
de lesiones accidentales durante la manipulación de pescado fresco
infectado (Weinstein et al, 1997;.Lau .et al, 2003;. Facklam et al, 2005).
28
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVOS GENERAL
Identificar la distribución de la infección por Streptococcus iniae en
diferentes órganos de tilapia roja (Oreochromis sp) y tilapia nilotica
(Oreochromis niloticus) diagnosticado por PCR en tiempo real.
3.2. OBJETIVO ESPECÍFICOS
Determinar e identificar la distribución de la infección en Cerebro,
Hígado y Corazón.
Describir hallazgos histopatológicos en cerebro, hígado y corazón
de individuos infectados con Streptococcus iniae
29
4. METODOLOGÍA
4.1. MUESTRAS Y CONTROLES
El grupo de investigación del Laboratorio de Medicina Genómica en un
estudio realizado en el 2011, identificó 10 individuos positivos a la
enfermedad Streptococcus iniae, el análisis se realizó en una mezcla de
cerebro, corazón e hígado con la técnica de PCR en tiempo real, las
muestras están congeladas a -20° C y se emplearon en el presente estudio.
Para los controles se realizó la extracción de ADN de los cultivos puros de la
cepa de Streptococcus iniae, la cual fue adquirida de ATTC (No. 29178) con
el Kit comercial QIAamp ADN Mini Kit, QIAGEN, siguiendo las
recomendaciones del fabricante.
4.2. EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE TEJIDOS
La extracción de ADN se realizó con el kit comercial de Quigen según el
protocolo para bacterias de la misma marca comercial, las muestras de
cerebro, hígado, corazón que estaban a -20 °C se descongelaron. Estas
muestras de tejido se pesaron (10-20mg), se suspendieron en 180 µl de una
solución de enzimas (20 mg/ml lysozyme; 20 mM Tris-HCl, pH 8,0; 2 mM
EDTA; 1,2% Triton) este paso es para bacterias Gram-positivas y se
maceraron utilizando el mortero con Biovortex marca VortexMixer, (figura 7)
30
siempre dentro del tubo vial (eppendorf). Se incubaron por 30 minutos a
37°C. después se añadió 20µl de proteinasa K y 200 µl del Buffer AL. y se
mezclaron con VortexMixer e incubaron a 56°C por 30 minutos. Luego se
centrifugaron brevemente el tubo para precipitar las gotas que puedan estar
adheridas a la tapa del vial (eppendorf), después se añadieron 200µl de
etanol (96-100%) se centrifugo brevemente el tubo para precipitar las gotas
que puedan estar adheridas a la tapa del vial (eppendorf), luego se adiciono
el lisado en una columna purelink spin column y se centrifugó a 10000 rpm
por un minuto a temperatura ambiente. Se descartó todo lo que quedo en el
tubo colector, luego se adiciono 500µl del Buffer AW1, se centrifugó a 10000
rpm por un minuto, se descartó todo lo que quedo en el tubo colector, se
adiciono 500µl del buffer AW2 se centrifugo a 14000 rpm por tres minutos, se
descartó todo lo que quedo en el tubo colector, luego se introdujo el tubo en
un vial nuevo de 1,5 ml en la columna, a continuación se adiciono 200 µl del
Buffer AE y se incubo por 1 minuto temperatura ambiente y luego se
centrifugo a 14000 rpm por un minuto y se descartó la columna y se guardó
lo que queda en el vial de 1,5 ml.
4.3. PROTOCOLO DE PCR EN TIEMPO REAL
La estandarización de la prueba diagnóstica molecular por PCR en tiempo
real para las especies Streptococcus iniae, la realizó el grupo Laboratorio de
Medicina Genómica de la Universidad Surcolombiana, Se diseñaron los
primers para generar las secuencias de la accesión No. Y07622.1 proteína
Lactato oxigenasa (lctO) (S. iniae). En esta región se diseñaron los primers
específicos de especie, utilizando el Software Primer Express 3.0 Applied
Byosistems, para el equipo utilizado Applied Biosystems 7300 Real-Time
PCR System.
31
Tabla 2. Primers utilizados para el diagnóstico de Streptococcusiniae por PCR en tiempo real
Forward GTT TTC TTG AAG CTA TTG CAG GTT T Reversed CGC GCA AGG GTT TCA TG Sonda VIC-CTGCGGTTGCCATACCAGCAAGTATTCTA- TAMRA
Tabla 3. Reactivos a utilizar y su cantidad de volumen para la PCR en tiempo real.
Reactivo Cantidad
Taqman Universal PCR master mix (2X) 12.5 ul
Taqman (sonda) 0.5 ul
Primer F (10 uM) 1.25 ul
Primer R (10 um) 1.25 ul
DNA 1 ul
Agua 8.5 ul
TOTAL 25 ul
Protocolo de perfiles de temperatura para PCR en tiempo real.
50 ºC por 2 minutos 95 ºC por 10 minutos 40 ciclos 95ºC por 15 segundos 60 ºC por 1 minutos
Figura 4. Á
Figura 5. Á
Área de extr
Área de PC
racción de
R
32
DNA
33
4.4. EXAMEN DE HISTOPATOLOGÍA
Se tomaron muestras de 10 animales del cerebro, hígado y corazón, estos
fueron retirados del animal durante la necropsia y una parte esta conservada
en formol tamponado al 4% en PBS (phosphate buffer saline) como método
de rutina para fijar y conservar los tejidos sin afectar la citoarquitectura.
Luego en el laboratorio de Histopatología animal de la Universidad Nacional
de Colombia, se tomó una pequeña porción representativa de la muestra y se
llevó al procesador automático de tejidos, en esta fase se dio la inclusión del
tejido con parafina que consiste en: deshidratación, aclaración, infiltración y
colado de bloques donde el tejido queda incluido, se seccionaron los bloques
con ayuda de un micrótomo (6 - 8μ espesor) y se colocaron en baño de
flotación para la selección de las muestras, se montaron en placas de vidrio
para coloración general de rutina con hematoxilina- eosina (H&E) o tinción de
gram, para el análisis de las secciones histológicas. Posteriormente, se
llevaron las muestras para observación en microscopía (10x y 40x).
4.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los resultados se analizaron con estadística descriptiva y análisis de
frecuencias con el paquete estadístico INFOSTAT
34
5. RESULTADOS
5.1. EXTRACCIÓN DE DNA A PARTIR DE MUESTRAS CONGELADAS
La cantidad de DNA obtenido con el kit comercial de Quigen según el
protocolo para bacterias de la misma marca comercial se encuentra en la
tabla 4, la medición se realizó con el equipo NanoDrop 2000 (figura 6.)
Tabla 4. Cantidad de DNA obtenido a partir de la las muestras
Muestra
Cantidad (ng/µl) Identificación del
Individuo
Órgano
1
Corazón 46,3
Hígado 402
Cerebro 54,8
2
Corazón 32,4
Hígado 23,6
Cerebro 133,8
3
Corazón 36,2
Hígado 10,7
Cerebro 25
4
Corazón 29,8
Hígado 13,1
Cerebro 3,7
5
Corazón 37,5
Hígado 43,2
Cerebro 28,6
6
Corazón 34,6
Hígado 79,2
Cerebro 39,8
7 Corazón 22,3
Control p
8
9
10
ositivo de Str
Híga
Cere
Cora
Híga
Cere
Cora
Híga
Cere
Cora
Híga
Cere
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ado
ebro
azón
ado
ebro
azón
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ebro
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21,5
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34
14,2
23
11,7
12,5
8,7
l
T
23456789
5.2. RES
Los resulta
la tabla 5.
Tabla 5. Ór
Individuo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
SULTADOS
ados positiv
rganos pos
F
S DE LA P
vos para inf
sitivos para
36
Figura 7.Vorte
CR EN TIE
fección Str
la infección
ÓrganCorazCerebCorazCorazCorazHígadCorazHígadHígadHígad
exMixer
EMPO REA
reptococcus
n por Strep
nos infectazón - Hígadbro zón zón zón do zón - Cerebdo - Cerebrdo do - Cerebr
AL
s iniae se r
ptococcus in
dos do
bro ro
ro
relacionan
niae.
en
37
Ningún individuo presento infección en los tres órganos al mismo tiempo, el
40% presento infección en dos órganos, el 30% de la infección se presentó
en corazón, el 20% se presentó en Hígado y cerebro al mismo tiempo, 20%
en hígado, el 10% se presentó en cerebro igualmente en corazón - hígado y
corazón – cerebro
Figura 8. Resultado de la PCR tiempo real para el individuo 1 (izquierda), individuo 8 (derecha)
Figura 9. Distribución de infección por órgano.
F
A
y
u
d
5.3. SEN
Figura 10. Se
El limite má
ADN en ag
y 1:10000.
una dilució
diagnóstico
NSIBILIDA
ensibilidad de
ás bajo de
ua destilad
En la figura
ón tan alta
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38
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mpo Real.
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ó diluyendo
1:100, 1:10
gnóstico, c
ue permite
el
00
on
el
39
5.4. ESPECIFICIDAD DE LA PCR TIEMPO REAL
Figura 11. Especificidad de la PCR Tiempo Real.
La especificidad del ensayo de PCR Tiempo Real se probó utilizando ADN
extraído de las cepas de tres especies de Streptococcus; S. pyogenes, S.
pneumoniae y S. agalactiae, en la figura 10 se muestra la alta especificidad
que tiene la prueba para la familias S. iniae.
40
5.5. HISTOPATOLOGÍA
A nivel microscópico se hallaron diferentes daños o injurias en los tejidos
colectados (corazón, hígado, cerebro), en la Tabla 7 se muestran las
principales lesiones histopatológicas halladas en los diferentes órganos
analizados y que se relacionan con infecciones por streptococcocis.
Tabla 6. Hallazgos histopatológicos en diferentes órganos de individuos diagnosticados positivos para Streptococcus iniae por PCR en tiempo real
Corazón
Epicarditis multifocal con formación de granulomas o granulomatoso con presencia de bacterias tipo cocos.
Moderada miocarditis generalizada. Bacterias tipo coco en miocardio y endocardio. Granuloma en miocardio. Miocarditis generalizada.
Cerebro
Meningitis multifocal Hemorragias e inflamación granulomatosa en meninges. Leve a moderado foco de meningoencefalitis necrótica con presencia de
bacterias tipo cocos Congestión en encéfalo y meninges generalizada Granuloma de meninges Meningitis Fibrinohemorrágica con presencia de bacterias tipo cocos en
el citoplasma de macrófagos
Hígado
Focos de congestión hepática. Hepatopáncreas con presencia de bacterias tipo coco intra y
extracitoplasmaticas en celulas tipo macrófagos. Focos de hepatitis con presencia de bacterias tipo coco intracelulares. Activación de centros melanomacrófagos en hepatopáncreas. Granuloma en hígado. Vacuolización hepática.
41
Figura 12.Moderados a severos focos de epicarditis granulomatosa y leve presencia de bacterias tipo coco en miocardio y endocardio 2X (izquierda). Moderado foco de epicarditis necrótica 10X (derecha).
Figura 13.Severa acumulación de bacterias tipo coco focalizada en encéfalo y meningitis extensa multifocal. 40X (izquierda). Moderado a severo foco de meningitis fibrinohemorrágica con leve presencia de bacterias tipo coco en el citoplasma de macrófagos 10X (derecha).
Figura 14. Moderado foco de hepatitis con presencia de bacterias tipo coco intracelulares. Moderados focos de activación de CMM en hepatopáncreas 40X (izquierda). Severo foco de necrosis e inflamación en hepatopáncreas con presencia de bacterias tipo coco intra y extracitoplasmáticas en células tipo macrófagos, leve a moderados focos de infiltrado mononuclear perivascular, leve presencia de vacuolas que desplazan el núcleo de los hepatocitos 10X (derecha) .
42
6. DISCUSIÓN
Este trabajo corrobora los estudios previos de nuestro grupo de investigación
respecto que todos los casos positivos obtuvieron por los menos un órgano
infectado, el 40% reporto coinfección. La técnica de PCR Tiempo Real,
como una herramienta de diagnóstico molecular, ha facilitado la detección y
la identificación de un número creciente de bacterias de importancia clínica
en medicina veterinaria y humana. A veces, entre los microorganismos
filogenéticamente relacionadas, es difícil diseñar un conjunto específico de
cebadores para la identificación de especies bacterianas.
El examen histopatológico reveló agudo a subagudo meningoencefalitis que
consiste de un exudado que cubre la superficie del cerebro que contiene
colonias de bacterias y la infiltración multifocal de células de macrófagos en
el hígado y corazón como las lesiones principales, Estos resultados se
pueden correlacionar con los hallazgos clínicos de letargo y pérdida de la
orientación, (Eldar&Ghittino 1999) que pueden ser confundidos con otras
clases de infección.
La infección por Streptococcus iniae se presenta con morbilidades agudas y
crónicas en muchas especies de peces, tanto de pesca extractiva como de
acuicultura, y así, al menos, 27 especies de peces han sido descritas como
sensibles a la infección (Agnew y cols., 2007). Sin embargo, es la primera
vez que se realizan estudios sobre este tipo de patología en Colombia, las
investigaciones se han realizado en el laboratorio de medicina genómica de
la Universidad Surcolombia desde el año 2011.
43
7. CONCLUSIONES
La PCR en tiempo real es un método rápido, sensible y específico
para la detección de Streptococcus iniae en peces comerciales, útil en
investigación, estudios epidemiológicos y diagnóstico.
El Streptococcus iniae causa una infección muy grave y puede
generar graves problemas sobre la actividad acuícola del Huila y sobre
los recursos icticos nativos.
La importancia de seguir con monitoreos continuos, por las
implicaciones que tiene el Streptococcus iniae en la salud de los peces
y como agente zoonótico.
Se necesita más investigación para entender completamente este
patógeno, en particular, su diversidad serológica y epidemiológica,
antes de que los programas de vacunación puedan tener éxito a
escala mundial.
44
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