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Diseño y caracterización de matrices 3D de alginato para la

encapsulación de células madre mesenquimales como un sistema

potencial de diferenciación celular.

Alejandra Suarez Arnedo

Directora:

Diana María Narváez Noguera

Co-Directora:

Helena Groot de Restrepo

Grupo de Investigación:

Laboratorio de Genética Humana

Universidad de los Andes

Facultad de Ciencias

Departamento de Ciencias Biológicas

2018

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Introducción Las células madre se han convertido en uno de los ejes centrales de la investigación en el campo

de la ingeniería de tejidos ya que poseen un potencial amplio para el tratamiento de múltiples

enfermedades y regeneración de órganos (1,2). Aunque existen diversos tipos de células madre,

como lo son las embrionarias (ESCs), las de pluripotencia inducida (iPSCs), las fetales y las

mesenquimales de tejido adulto (MSCs), estas últimas son la fuente autóloga más ampliamente

disponible para las aplicaciones prácticas y clínicas. Además, a diferencia de las células ESCs y las

iPSCs, las MSCs no se han reportado como inductoras de tumor (3). Debido a lo anterior y a la

habilidad de estas células para autorenovarse y diferenciarse en diversos linajes celulares como

los adipocitos, condrocitos, osteoblastos, entre otros (4,5), se han realizado múltiples estudios

con el fin de comprender los mecanismos celulares de su regulación (6,7).

Se ha determinado que las propiedades de las MSCs no sólo están influenciadas por las mismas

células, sino por el microambiente. Este microambiente compuesto por una matriz extracelular

provee las señales, moléculas e interacciones necesarias que promueven la expresión de una

cascada de genes reguladores y determinan el destino celular (8). No obstante, las señales

bioquímicas, como biomoléculas, factores de crecimiento y matrices extracelulares no son las

únicas variables que llevan a la diferenciación celular, ya que se ha establecido que propiedades

extrínsecas e intrínsecas del microambiente, como las físicas y mecánicas, tienen un papel

fundamental en los mecanismos de control (3,9,10). Entre estas señales se ha establecido que la

rigidez de la matriz extracelular normalmente determina el destino de diversos linajes celulares

dependiendo si ésta es comparable con la rigidez del tejido al que se quiere dirigir la célula, la

cual se mide mediante el módulo de Young en Pascales (Pa). Matrices extracelulares suaves entre

0.1 a 1 kPa promueven a tejido neural por tener módulos semejantes al del cerebro, de igual

manera, módulos entre 25 a 40 kPa al imitar más la rigidez del hueso tienden a la osteogénesis

(11). De esta manera, existe un proceso de mecanotransducción de la célula madre guiado por la

rigidez de la matriz. El cual modifica los sitios de adherencia al sustrato al permitir la interacción

con diferentes tipos de integrinas, receptores de membrana que participan principalmente en la

unión de las células con la matriz extracelular. Esto a su vez lleva a una cascada de señalización

que afecta la expresión de genes y que regula la conformación del citoesqueleto y la interacción

de la célula con el ambiente (3,11,12). Múltiples estudios sugieren que la diferenciación de las

células madre modulada por la rigidez está mediada principalmente por integrinas. Son las

integrinas las que trasmiten señales bidireccionales que afectan el ensamble de adhesiones

focales, la organización de citoesqueleto y la cascada posterior de mecanismos de transducción

(11).

Teniendo en cuenta que para analizar las dinámicas celulares en estudios in vitro es necesario

desarrollar ambientes que imiten la matriz extracelular, se han realizado técnicas de

descelularización (13–15) y se han utilizado biomateriales (3,16,17) que puedan promover a la

diferenciación de MSCs a diversos destinos celulares (3,18–20). Entre estos biomateriales se ha

utilizado principalmente hidrogeles (21) compuestos con biopolímeros tanto de origen natural

como de origen sintético que son biocompatibles, fácilmente manipulables y a los cuales se les

3

puede variar la rigidez, topografía, porosidad y demás características físicas (3,18–20). Uno de

estos biomateriales es el alginato de sodio, un polisacárido de origen natural compuesto de

unidades monoméricas de ácido αL-gulurónico (G) y ácido β-D-manurónico (M) en diversas

cantidades, cuya frecuencia depende de la fuente de la cual haya sido extraído. Estudios han

demostrado que la composición monomérica, su secuencia molecular y la cinética de formación

del gel tienen un impacto significativo sobre la estabilidad, la rigidez, la permeabilidad y la

biodegradabilidad (22). Gracias a su conformación estructural y a la dinámica entre sus

monómeros G y los iones de divalentes metálicos, principalmente iones de calcio (Ca 2+), posee la

habilidad de formar hidrogeles y esferificar (23,24). No obstante, el alginato carece de la

capacidad para generar adhesiones celulares, debido a su pobre unión con las proeínas del suero

(25,26), a menos que sea funcionalizado (25–27) para agregar sitios de unión entre los receptores

de la membrana celular con la matriz. Esta capacidad hace que el alginato sea ampliamente

utilizado para generar sistemas de cultivo de células en 3D, que promueven la diferenciación de

MSCs a condrocitos (4,28–31) y la inducción osteogénica a partir de scaffold funcionalizado con

compuestos como la hidroxipatita (32). Asimismo, aunque se sabe que la naturaleza

heteropolímerica y la proporción entre los monómeros G y M modifica las características

mecánicas y reológicas de los hidrogeles, no se ha analizado cómo este factor altera el

comportamiento de células madre mesenquimales en este biomaterial.

De acuerdo con lo anterior, en este proyecto se determinó cuál es el efecto de la rigidez y del

porcentaje de monómeros G y M en el comportamiento y la viabilidad de las células madre

mesenquimales de tejido adiposo humano (hAdMSCs) encapsuladas en hidrogeles de alginato de

sodio; con el fin de determinar su uso potencial como matrices inductoras de diferenciación

osteogénica y condrogénica. Para lograr esto, el trabajo se dividió en 3 secciones. En una primera

parte, se diseñó y caracterizó los hidrogeles de alginato sodio mediante la medición de

propiedades mecánicas relacionadas con la rigidez del material como el módulo elástico, viscoso,

y módulo de Young. Posteriormente, se evaluó la viabilidad de las células hAdMSCs encapsuladas

en los hidrogeles y su potencial de diferenciación en monocapa. Finalmente, se analizó la

producción de filamentos de actina de las células madre encapsuladas en distintas formulaciones

de alginato utilizando microscopia confocal. De acuerdo con los resultados obtenidos los

hidrogeles realizados a partir de un alginato con mayor proporción de monómeros G son más

rígidos. Asimismo, se probó que la rigidez de la matriz promueve cambios en el comportamiento

de las células madre en función del tiempo, aún sin generarse uniones entre la célula y la matriz

tridimensional.

Materiales y Métodos

Materiales Alginato con bajo contenido de monómeros G [entre 20% y 30%] (Bajo G) fue adquirido de Sigma

Aldrich®, mientras que el alginato con alto porcentaje de monómeros G [entre 65y 75%] (Alto G)

fue adquirido de Protanal LFR 5/60 (FMC BioPolymer). Cristales de Cloruro de sodio (J.T. Baker),

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CaCl2 (Carlo Erba), Agarosa (Sigma Aldrich), Medio Dubelco´s Modified Eagle´s medium low-

glucose, DMEM (Gibco), penicilina/ estreptomicina p/s (Gicbco), Suero bovino fetal SBF (Gibco),

PBS (1X), pH 7.4 sin calcio ni magnesio (Gibco), tripsina-EDTA (Gibco), Thiazolyl Blue Tetrazolium

Bromide MTT (Sigma Aldrich®), Fosfato Naphtol (Sigma Aldrich®), Fast Blue (Sigma Aldrich®),

Alexa Fluor 488 phalloidin (Termofisher Scientific), hMSC Osteogenic BulletKit (Lonza), hMSC

Chondro BulletKit (Lonza), Hoechst 33342 (Termofisher Scientific), Triton X-100 Surfact-Amps

Detergent solution (Termofisher Scientific)y 16 % formaldehido solución (w/v) libre de metanol

(Termofisher Scientific).

Realización y caracterización de los hidrogeles de alginato.

Preparación de las soluciones de alginato de sodio

Se preparó una solución fisiológica de 0.9% NaCl en agua destilada desionizada (33). Se pesó la

masa apropiada de alginato de sodio (Bajo G o Alto G) y se mezcló con la solución fisiológica para

formar las soluciones de alginato a una concentración stock de 4% (p/v). Se agitó en un shaker a

200 rpm durante toda la noche. Finalmente, las soluciones se autoclavaron durante 30 min para

esterilizarlas (34) y se almacenaron a 4°C hasta su uso (23,35–37). Para validar el efecto de la

esterilización del alginato en las propiedades de los hidrogeles se comparó la viscosidad previa y

posterior al autoclavado de las soluciones stock de cada alginato. Se realizó una prueba de flujo

en un rango de tasas de cizalla de 0 s-1 a 100 s-1 a 25°C en el reómetro AR-G2 (TA Instruments).

Formación de los hidrogeles

Para la formación de los hidrogeles se adaptó el procedimiento descrito por Cavo y colabores en

el 2016 (38). En primer lugar, se preparó una solución al 1% de agarosa, 0.9% de NaCl y 0.5 M de

CaCl2 se mezcló, calentó a una temperatura aproximada de 80°C y vertió en una caja de Petri o

recipiente de plástico hasta que estuvo completamente polimerizado. Posteriormente, se cortó

la agarosa con moldes específicos para las diferentes pruebas realizadas en el trabajo. Se

determinó, mediante varios ensayos que el tamaño ideal para encapsular las células fue de 4.90

± 0.46 mm y para las pruebas reológicas de 20 ± 1.37 mm. Teniendo en cuenta lo anterior, se

realizaron cortes circulares de 4.90 ± 0.46 mm con una pipeta Pasteur de vidrio y cortes circulares

en la agarosa de 20 ± 1.37mm, utilizando una capa base adicional de agarosa al 2%., 0.9% de NaCl

y 0.5 M de CaCl2. Las soluciones de alginato se vertieron en los moldes y se dejaron gelificar

durante 45 min a 37°C como mínimo, para asegurar la completa difusión de Ca 2+ de la agarosa al

hidrogel (38). En la Figura 1 se presenta tanto fotografías como el diagrama de la fabricación de

los hidrogeles de alginato de 20 mm según el método previamente mencionado.

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Figura 1. Proceso de fabricación de los hidrogeles y descripción esquemática de los moldes de 20 mm. A) Moldes de agarosa con 2 capas. B). Moldes con diferentes concentraciones de alginato. C) Hidrogeles de alginato después de la incubación por 1 hora. D) Diagrama de la fabricación de los hidrogeles y mecanismo de difusión de los Ca 2+ desde la capa de agarosa al alginato para promover su gelificación.

Pruebas reológicas

Para medir el módulo elástico de los distintos hidrogeles de alginato se utilizó el reómetro

Discovery Hybrid Rheometer (DHR1) (TA Instruments). Primero se colocaron los geles de 20 ± 1.37

mm diámetro cuando el gap entre platos no era mayor a 5 cm. Se utilizó una geometría de platos

paralelos, un “gap” de 700 μm y una temperatura constante de 37°C para todos los ensayos. Se

realizó un barrido de tiempo a cada uno de los geles de alginato, dejando fijos el porcentaje de

deformación σ (1%) y la frecuencia de oscilación ω (1 Hz), durante 3 minutos.

Esta prueba se realizó en tres tipos de hidrogeles debido a que es importante determinar cómo

las propiedades reológicas de los hidrogeles cambian en función de la presencia de las células y

medio de cultivo DMEM suplementado con 10% SBF, 1% P/S. El primero se preparó con una

solución inicial de cada uno de los alginatos al 1%, 2% y 4% (p/v) en solución fisiológica de 0.9%

NaCl. El segundo, se realizó con las mismas concentraciones de alginato, pero disuelto en DMEM

suplementado. Por último, el módulo elástico se midió en hidrogeles preparados con una

densidad inicial de 1x106 células/mL. Los resultados se presentan en una gráfica del módulo

elástico G’ en Pa en función del tiempo, el cual es una variable con la cual se puede representar

la rigidez del hidrogel (39) y se relaciona con la energía almacenada en un material viscoelástico.

Determinación de la rigidez

Para calcular el módulo de Young se utilizó el microscopio de fuerza atómica (AFM) Asylum

Research, modelo MFP-3D-BIO equipado con un escáner de bucle cerrado, el cual siempre opera

en closed loop (38). Se utilizó cantiléver con punta de silicio esférica de 6 µm de radio. La

constante elástica (40.19 pN/mm) se calculó monitoreando la oscilación del cantiléver tanto en

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aire como en buffer debido al ruido térmico. Hidrogeles con el mismo tamaño de los utilizados en

las pruebas reológicas se colocaron en láminas de vidrio y se mantuvieron con una recubierta de

buffer que contiene 5 mM de CaCl2 (38).

Las medidas de indentación se realizaron con una velocidad de 2.4 µm/s, una fuerza de 8 nN y

distancia de fuerza de 8 µm. Para tener en cuenta la heterogeneidad de la muestra se hicieron

mapas de 20 µm con dos líneas y 16 puntos en tres regiones diferentes del hidrogel para tener un

total de 96 puntos. Se calculó el módulo de Young a partir de cada curva de fuerza utilizando la

siguiente ecuación (Ecuación 1):

(−1 − 𝜈𝑡𝑖𝑝

2

𝐸𝑡𝑖𝑝+

1

𝐸𝑐)

−1

=𝐸𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒

1 − 𝜈𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒2 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 1.

Donde 𝜈𝑡𝑖𝑝 es la razón de Poisson de la punta de 0.17, 𝐸𝑡𝑖𝑝 es el módulo de la punta de 150 GPa,

𝜈𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 es la razón de Poisson de la punta de 0.5 y 𝐸𝑐 representa el módulo reducido.

Cultivo y viabilidad de las células hAdMSCs encapsuladas.

Cultivo de las hAdMSCs

Las hAdMSCs fueron suministradas por el grupo de Ingeniería de Tejidos y Terapia Celular de la

Universidad de Antioquía, a cargo de la Dra. Luz Marina Restrepo. Las células se cultivaron en

DMEM suplementado con 10% SBF, 1% P/S en un ambiente húmedo de 5% de CO2 y a 37°C. Se

realizó cambio de medio 2 veces por semana hasta que alcanzaran confluencia. Hay que tener en

cuenta que el potencial de diferenciación de las hAdMSCs se va perdiendo en función del pase

(máximo Pase 10) (40).

Encapsulación de las células

Cuando las células hAdMSCs llegaron a un 80% de confluencia se contaron en cámara de

Neubauer y se suspendieron a una concentración de 1 x 106 células /mL (36,41) en la solución de

alginato para asegurar que las células estén completamente disociadas entre sí y mantener la

viabilidad celular (41–43). Se prepararon los hidrogeles en moldes de 4.90 ±0.46 mm como se

mencionó anteriormente. Se pasaron 5 hidrogeles por pozo a una microplaca de 24 pozos y se

lavó tres veces con PBS 1X libre de calcio y magnesio. Los hidrogeles se cubrieron con DMEM

bajo en glucosa, 2% SBF, 1% P/S y se incubaron en un ambiente húmedo de 5% de CO2 y a 37°C.

Se cambió el medio 2 veces por semana durante 14 días (44–46). Se monitoreó en microscopio

invertido la proliferación y el mantenimiento de las células en los hidrogeles.

Evaluación de la viabilidad

Se evaluó la viabilidad de las células encapsuladas luego de 1, 4, 7 y 14 días mediante la prueba

colorimétrica de MTT (47). Brevemente, los hidrogeles se incubaron en placas de 24 pozos con

800 µL de medio (48) y 80 µL de MTT (5mg/mL) a 37°C y 5% de CO2 durante 16 horas (47).

Posteriormente, se retiró el medio y los hidrogeles individuales se pasaron a pozos de una placa

de 96 pozos. Para disolver los cristales de formazan se debió romper los hidrogeles

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mecánicamente con un pellet pestles y se agregaron 100 µL de isopropanol (49) dejando en

agitación durante 30 min (48). Se leyó la densidad óptica en un Lector de microplacas Model 680

(BioRad) a una absorbancia de 590 nm con un filtro de referencia de 620 nm (47).

Medición de cambios en los filamentos de actina de las hAdMSCs encapsuladas

Tinción fluorescente

Se realizó una tinción fluorescente para determinar el efecto de la rigidez en la conformación del

citoesqueleto de las células encapsuladas mediante la detección de filamentos de actina. Primero,

se fijaron las células encapsuladas con 4% de paraformaldehído por 10 min y se permeabilizó con

0.1% de Tritón-X durante 5 minutos. Se lavó con PBS y se adicionó Hoechst 33342 para la tinción

del núcleo durante 5 minutos. Se lavó nuevamente con PBS y se tiñeron los filamentos de actina

con una solución de Alexa Fluor 488 Phalloidin y 1% de BSA durante 30 min (50). Las células se

visualizaron utilizando un microscopio Confocal de barrido Olympus FV1000.

Análisis de imagen

Se midieron las diferencias en la producción de filamentos de actina de las hAdMSCs encapsuladas

a los 7 y 14 días, en los hidrogeles de 4% (p/v) tanto del alginato alto como el bajo en G mediante

el programa Fiji (https://fiji.sc/#download)(51). Para cuantificar la formación de filamentos de

actina, se tomaron imágenes de células individuales y se midió la intensidad de fluorescencia

utilizando una modificación de la ecuación de Gavet y Pines (52) (Ecuación 2).

𝐼𝐹𝐶𝑐 =𝑃𝐼𝑐 − (𝐴𝑐 ∗ 𝑀𝐼𝑓)

𝐴𝑐 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 2.

Donde 𝐼𝐹𝐶𝑐 es la intensidad de fluorescencia corregida por célula, 𝑃𝐼𝑐 es el promedio de la

intensidad de fluorescencia de la célula, 𝐴𝑐 es el promedio del área de la célula y 𝑀𝐼𝑓 es la

intensidad de fluorescencia media del fondo. Asimismo, para determinar la distribución de los

filamentos de actina en la célula, se realizaron perfiles de intensidad en escala de grises a lo largo

del diámetro celular. Finalmente, para determinar los bordes de la célula y resaltar la forma se

encontró los bordes y se aplicó un filtro de convolución con normalización de Kernel (53,54).

Medición del potencial de diferenciación condrogénico y osteogénico

Diferenciación de las hAdMSCs

Para validar el potencial de diferenciación de las células se sembraron las células hAdMSCs (Pase

6-7) en monocapa con medio específico de diferenciación tanto para condrocitos como para

osteoblastos. Para la inducción osteogénica se utilizó el medio suplementado con 1% P/S,

dexametasona, β glicerofosfato, ascorbato, 10% SBF y 2% L-Glutamina, y para la inducción

condrogénica se utilizó el medio suplementado con 1% P/S, piruvato de sodio, L-prolina,

dexametasona, ascorbato, 2% L-glutamina y mix de insulina-transferrina-selenio (ITS) (55,56). Se

cambió el medio 2 veces por semana durante 14 días.

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Análisis histológico

Para medir la diferenciación osteogénica en las células sembradas en laminilla, se examinó la

actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) usando (500 µg/mL) Fast Blue BB y (500 µg/mL) fosfato de

Napthol. Los hidrogeles se fijaron con paraformaldehído al 10% en PBS 1X durante 30 min a

temperatura ambiente. Posteriormente, se lavaron con PBS 1X y se equilibraron con un buffer

alcalino (Tris-HCl 100 mM, 100 mM de NaCl, 0.1% de Tween 20, 50 mM de MgCl, pH 8.2) durante

15 min. Los hidrogeles se tiñeron con una solución del colorante durante 60 min a temperatura

ambiente, se lavaron con el buffer y se neutralizaron con PBS 1X (26,57). La condrogénesis se

midió mediante la producción de proteoglicanos secretados que se tiñen con azul de Alcian o

Safranina. Primero, las muestras se lavaron por 5 min en PBS 1X y se equilibraron en agua

destilada durante 2 min. Luego, se tiñeron durante 2 horas en solución de azul de Alcian (azul

alcalino al 1%, en ácido acético al 3%, pH 2.5). Por último, se lavaron con una mezcla de ácido

acético al 3% y etanol. Las muestras se analizaron en un microscopio óptico (26). Además, para

comprobar la producción de proteoglicanos secretados las muestras se tiñeron con Safranina 1%

durante 30 min y posterior se lavaron las muestras con abundante agua (58).

Análisis estadístico

Se utilizó la prueba Ryan Joiner de normalidad para todos los datos obtenidos. Se realizó la prueba

t de dos colas para los resultados de las pruebas reológicas y la determinación de la rigidez. Por

otro lado, se utilizó la Prueba de Kruskal Wallis para validar el efecto del alginato y del tiempo en

la viabilidad e intensidad de la fluorescencia de las hAdMSCs encapsuladas. Los valores de p

menores a 0.05 fueron considerados como significativos. Los resultados fueron analizados y

graficados con Minitad versión 18.1 (59) y GraphPad Prism software 7 (GraphPah Software, San

Diego, California, EE.UU., www.graphpad.com).

Resultados y discusión

Realización y caracterización de los hidrogeles de alginato.

Efecto del método de esterilización sobre las características del alginato

Se seleccionó el autoclavado como método de esterilización debido a que protocolos como la

liofilización, irradiación gamma y tratamiento con óxido de etileno han demostrado tener un

efecto deletéreo en aplicaciones clínicas (60). Asimismo, se descartó la filtración ya que aunque

se ha utilizado ampliamente en la literatura (23,61–65), al filtrar el alginato Alto G con una

membrana de 0.2 µm se recuperaba sólo el 16.7% de la solución inicial lo que resultó muy poco

para las cantidades y concentraciones que se manejaron en el proyecto. Igualmente, la viscosidad

de la solución Stock al 4% (p/v) del alginato Alto G era tan alta, que al ejercer presión sobre el

filtro se tapaba y se rebozaba parte de la solución, lo que genera riesgo de contaminación. Para

validar el efecto del autoclavado en la integridad de las propiedades físicas de los alginatos

utilizados, se evaluó la viscosidad de las soluciones de alginato antes y después del uso de este

tratamiento de esterilización (Figura S 1). Según los resultados de esta figura el autoclavado

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disminuye la viscosidad de los dos alginatos utilizados. De igual manera, esta disminución no sólo

depende del proceso sino de la viscosidad inicial que presentaba la solución, ya que el alginato

Alto G posee una viscosidad de cerca de un orden de magnitud mayor en comparación con Bajo

G, por lo que la disminución de la viscosidad del primer alginato es mayor que la del alginato con

baja proporción de mónomeros G. La reducción de la viscosidad se debe a la escisión de la cadena

de alginato, unida por los enlaces glicosídicos y su despolimerización (23,34,66,67). De acuerdo

con los resultados obtenidos se puede suponer que las diferencias en las soluciones antes y

después de autoclavadas se deben a características en la estructura molecular y la secuencia de

monómeros de los alginatos. Hay que tener en cuenta que el proceso de autoclavado no afecto

la propiedad de las soluciones de alginato de gelificarse en presencia de los iones de calcio, aún

en concentraciones de 1% (p/v).

Propiedades reológicas de los hidrogeles de alginato

Para comparar las propiedades reológicas de cada una de las formulaciones evaluadas, en la Figura

2 se presenta tanto el módulo elástico como el viscoso promedio del barrido de tiempo de los

diferentes hidrogeles en una solución base de 0.9% de NaCl. Según la Figura 2A al aumentar la

concentración del alginato aumenta la magnitud del módulo elástico. No obstante, esta relación

es contraria con respecto al porcentaje de monómeros G. Según las tres formulaciones estudiadas

se evidencia una clara tendencia a que el módulo elástico sea mayor en el alginato con Bajo G con

respecto al Alto G. Siendo esta diferencia significativa en los hidrogeles a una concentración del

4% (p/v) de alginato. Por el contrario, en la Figura 2B el módulo viscoso de los hidrogeles varía sólo

por la concentración del alginato en el hidrogel más no por la proporción monomérica.

Siguiendo con el análisis reológico, en la figura suplementaria (Figura S 2) se presenta el barrido

de tiempo de 3 min tanto del módulo elástico, como del módulo viscoso de cada una de las

formulaciones evaluadas. Según esta figura se puede ver una leve tendencia de los hidrogeles

Alto G en disminuir el valor de su módulo elástico transcurrido el tiempo. Asimismo, los hidrogeles

obtenidos a partir del alginato Bajo G mantienen estable en el tiempo tanto el módulo elástico

como el viscoso, lo que asegura la completa gelificación de todos los hidrogeles. Hay que tener

en cuenta que esta disminución en el módulo elástico o viscoso en el tiempo cuando un esfuerzo

constante es aplicado se conoce como stress relaxation. El stress relaxation representa la

capacidad del hidrogel de remodelarse, lo cual es una variable de las matrices extracelulares que

se presenta sobre las células bajo condiciones fisiológicas (57).

Los resultados obtenidos en las pruebas reológicas sugieren que sin importar que el alginato Alto

G forme más enlaces con los Ca 2+ debido a su mayor proporción de monómeros G, el alginato

Bajo G rico en monómeros M puede almacenar más energía Figura 2. De acuerdo con lo anterior

y teniendo en cuenta que el valor del módulo elástico de alginato Alto G va disminuyendo en

función del tiempo, se puede suponer que este comportamiento se debe a la distribución del

agente de gelificación durante el proceso rápido de difusión. Como resultado, los hidrogeles Alto

G pueden presentar una superficie más dura y un centro más suave (68). Sin embargo, los

hidrogeles Alto G presentan una ventaja debido a que se ha determinado mayor estabilidad y la

10

porosidad de los hidrogeles en proporción de los monómeros G y a la presencia de bloques G

mucho más largos (24). La magnitud de los módulos es similar a la reportada previamente para

el alginato (69).

Figura 2 Análisis reológico de hidrogeles Bajo G y Alto G A) módulo elástico (G’) promedio de un barrido de tiempo de 3 min para todas las formulaciones analizadas (hidrogeles con Bajo G en color verde, hidrogeles con Alto G en color morado). B) módulo viscoso (G”) promedio de un barrido de tiempo de 3 min para todas las formulaciones analizadas (hidrogeles con Bajo G en color verde, hidrogeles con Alto G en color morado). α de 0,05; las comparaciones entre alginatos sin barra de error no son significativas (ns) p value<0.0001 (***) n=3 barridos de flujo con 30 puntos.

Finalmente, se evaluó el efecto de la presencia de medio de cultivo DMEM suplementado y las

células (Figura S 4 y Figura S 5, respectivamente). De acuerdo con la Figura S 4 la formación de los

hidrogeles de alginato con medio DMEM suplementado genera un aumento del valor promedio

de los módulos de almacenamiento para todas las formulaciones, tanto del alginato Bajo G como

el Alto G. En este sentido, la presencia de suplementos y nutrientes en el medio altera el

componente elástico de los hidrogeles. En paralelo, en la Figura S 5 se demuestra que la presencia

de células a la concentración establecida mantiene la magnitud de los módulos elásticos

obtenidos en los hidrogeles con solución fisiológica. Por consiguiente, las propiedades reológicas

medidas para los dos alginatos permanecen similares aún con la presencia de células para todas

las formulaciones, exceptuando al alginato Alto G al 4%. Las diferencias en las propiedades

reológicas de los hidrogeles en función de la solución base se puede deber a la presencia de todos

los suplementos y nutrientes que va a contener el medio de cultivo como el suero bovino. En el

medio suplementado con el suero no sólo está contribuyendo a alterar la composición química,

sino también las características mecánicas al aumentar la viscosidad (70). Por otro lado, se ha

evaluado que la presencia de células no afecta las propiedades reológicas de las soluciones de

alginato (71), ni las propiedades mecánicas de los hidrogeles (72) lo que concuerda con los

resultados de este trabajo.

Determinación de la rigidez

En la Figura 3 y en la Tabla S 1 se comparan los módulos de Young de los hidrogeles de alginato para las tres concentraciones evaluadas. La rigidez de los hidrogeles Alto G, en comparación con Bajo G, es más alta para todas las concentraciones evaluadas 1%, 2% y 4% (p/v). Esta diferencia se ve fuertemente exacerbada, en aproximadamente un orden de magnitud, a medida que

11

aumenta la concentración. Al comparar cada uno de los módulos obtenidos utilizando la prueba t de student se obtuvo que la rigidez de cada hidrogel es significativamente diferente con respecto a la de las otras cinco formulaciones (Figura 3).

1 2 4

1

1 0

1 0 0

1 0 0 0

A lg in a to (% p /v )

Mó

du

lo d

e Y

ou

ng

(k

Pa

)B a jo G

A lto G

* * * *

* * * *

* * * *

Figura 3. Módulo de Young (kPa) de dos tipos diferentes de alginato (Bajo G y Alto G) a 1%, 2% y 4% (p/v). La significancia fue calculada utilizando la prueba t pareada. p-value <0.00001 (****). n=3 mapas de fuerza con 32 puntos por formulación.

Estos resultados corroboran la hipótesis de que los hidrogeles con una mayor razón de

monómeros G son más rígidos que aquellos que presentan una baja proporción de estos

monómeros (73). Lo anterior sugiere que un mayor contenido de monómeros G puede contribuir

al proceso de gelificación debido a la interacción con los iones divalentes de calcio. Aunque, los

valores obtenidos de rigidez son mayores a los reportados generalmente para el alginato

(3,72,74,75), son coherentes con los presentados por Cavo y colaboradores (38), donde la

concentración de CaCl2 juega un papel significativo en la rigidez del hidrogel. Por lo que se puede

afirmar que una rigidez más alta se puede obtener al aumentar la concentración del

entrecruzante (38,76,77). Del mismo modo, estos resultados son consistentes con los

encontrados por Kaklamani y colaboradores (76) donde se demostró que los Ca2+ promueven un

mayor grado de gelificación, debido a que la carga superficial de este catión soporta un

entrecruzamiento físico más fuerte en el hidrogel.

La razón principal por la cual se caracterizó tanto el módulo de Young como el módulo de

almacenamiento y el módulo viscoso en los hidrogeles es que la deformación que sufren estas

matrices presenta un componente tanto viscoso, como elástico. Es por esto que las fuerzas

ejercidas por las células a la matriz, aunque sean constantes, no van a tender a almacenar o a

perder la energía en el hidrogel, sino que por el contrario se va a generar un remodelamiento y

disipación de energía (57). Esto permite afirmar que las matrices del alginato Alto G, aunque van

a presentar consistentemente mayor rigidez que la de los hidrogeles del alginato Bajo G, también

van a tener una mayor disipación de energía. La cual está representada en la leve disminución del

12

módulo elástico lo que les da a los hidrogeles con Alto G la capacidad de remodelarse en una

mayor proporción en función de las fuerzas generadas a partir de las células. De esta manera, se

espera observar variaciones en el comportamiento celular no sólo en función de la rigidez del

hidrogel, sino en el tiempo de incubación de las células en la matriz.

Revisión: Diferenciación en función de la rigidez

Se sabe que la rigidez del material influye en la capacidad de diferenciación de las células madre

mesenquimales (3). Si se tienen en cuenta los valores de rigidez para las formulaciones de alginato

analizadas (Tabla S 1) y se comparan con los rangos reportados en la literatura para inducir

diferenciación, en este trabajo se obtuvo una rigidez media y alta (Figura 4). Este tipo de rigidez

promueve principalmente la diferenciación a linaje muscular, endotelial, condrogénico y óseo

(11,78).

Figura 4 Diferenciación de las MSCs en función de la rigidez del sustrato. De arriba abajo el diagrama está organizado en nivel rigidez media (1kPa a 20kPa) y alta (>20kPa). Se muestran la diferenciación a 6 linajes celulares.: Azul Oscuro (Osteogénesis), Verde (Condrogénesis), Rosa oscuro (Adipogénesis), Azul claro (Neurogénesis), Rosado (Diferenciación muscular) y Morado

13

(Diferenciación endotelial). Los números representan la referencia a los artículos en los que se obtuvo está información. Los cuadros verdes representan la rigidez de los hidrogeles Bajo G (BG) y los cuadros morados representan la rigidez de los hidrogeles de alginato Alto G (AG). El opaco de estos colores representa la concentración de alginato.

Según la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. los hidrogeles de alginato Bajo G al 1% y al 2%

(p/v) se encuentran en un rango de densidad medio (78,79). En la Tabla 1 se presenta una revisión de

los diferentes biopolímeros usados para moldear matrices extracelulares, así como los distintos

destinos celulares, origen de las MSCs utilizadas y demás variables evaluadas en la literatura.

Según la Tabla 1 En la rigidez del alginato Bajo G al 1% (aproximadamente 3.1 kPa) la diferenciación a

tejido adiposo se realizó en matrices 3D de agarosa, pero en este caso si se presentó la funcionalización

del biopolímero utilizado con RGD para la promoción de la adhesión celular con la matriz (80). Asimismo,

en el trabajo de Kuroda y colaboradores este valor de rigidez llevo al destino adiposo, pero en hMSCs de

médula ósea en matrices 2D de poliacrilamida (PAM) - (81,82). Del mismo modo, valores cercanos

a la rigidez del alginato Bajo G al 2% (aproximadamente 7.65 kPa) se han relacionado con un

proceso de adipogénesis, no sólo teniendo en cuenta la rigidez del sustrato, sino la geometría a

través de micropatrones circulares 2D en láminas de polietilenglicol diacrilato (19). En valores

mayores a 10 kPa, cercanos a la rigidez obtenida con el alginato Alto G al 1% (p/v)

(aproximadamente 12,08 kPa), los destinos celulares a los que mayormente se reporta

diferenciación son tejido muscular (78,83,84) y en menor medida a osteogénesis (80) y

condrogénesis (85). Hay que tener en cuenta que la diferenciación a tejido muscular se da

principalmente en sustratos 2D donde las fuerzas focales van a estar ubicadas en una sola

dirección (78,83). La diferenciación reportada a otros linajes se da generalmente en hidrogeles

3D donde no sólo varía la rigidez de la matriz sino otras variables como los receptores de adhesión

celular a la membrana y - el tipo de colágeno utilizado (80,85).

Tabla 1.Polímeros utilizados para la diferenciación de MSCs en un rango de rigidez de 1-1000 kPa(2-20 kPa), especificando tipo de cultivo y origen de las células. Entre las variables adicionales se puede observar factores de crecimiento, propiedades químicas y características mecánicas de la matriz. (--: Sólo se estudió la rigidez de la matriz, LC: Línea celular)

Polímeros Rango (kPa)

Origen de MSCs tipo de cultivo Diferenciación Variables

adicionales Referencias

Colágeno/ Glicosoamiglicanos

(CG) 1.5 Médula ósea Scaffold (2D) Osteogénesis -- (86)

Polietilenglicol dimetimetacrilato

(PEGDM) 2.0-15 LC Lonza Corp Scaffold (3D)

Diferenciación endotelial y

muscular -- (3,84)

Policrilamida (PAM) 5.5-17 LC TCS cellworks

Ltd Hidrogel (2D)

Diferenciación neuronal y muscular

Motivos químicos

(3,87)

Policrilamida (PAM) 3.0-15 LC Lonza Corp Hidrogel (2D) Diferenciación

muscular TGF-β (83)

Policrilamida (PAM) 8.0-17 LC Osiris

Therapeutics Hidrogel (2D)

Diferenciación muscular

-- (88)

Alginato-RGD, Agarosa-RGD, PEG-

RGD 2.5-20 LC Lonza Corp Hidrogel (3D)

Osteogénesis y adipogénesis

RGD (80)

14

Polietilenglicol dimetimetacrilato (PEGDM)+ VEGF

2

LC Lonza Corp Hidrogel (3D)

Diferenciación

endotelial VEGF

(89)

Policrilamida (PAM) 1-11 LC Lonza Corp Hidrogel (2D) Diferenciación

muscular durotaxis (90)

Policrilamida (PAM) 2.5,8.7 Médula ósea Hidrogel (2D) Adipogénesis Vinculina (81)

Polietilenglicol diacrilato (PEG-DA)

>7 LC Lonza Corp Micropatrones

(2D) Adipogénesis Geometría

(19)

Policrilamida (PAM) 41 LC TCS cellworks Ltd

Hidrogel (2D) Osteogénica Motivos químicos

(3,87)

Policrilamida (PAM) 25.0-40 LC Osiris Therapeutics

Hidrogel (2D) Osteogénica -- (88)

Alginato-RGD, Agarosa-RGD, PEG-

RGD

20-30 LC Lonza Corp Hidrogel (3D) Osteogénesis RGD (80)

Alcohol polivinilico y Gelatina (PVA-G),

politeilenglicol (PEG)

10-100 LC Lonza Corp Hidrogel (3D) Condrogénesis Tipo de II de

colágeno

(85)

Policrilamida (PAM) 10.0-40 Médula ósea Micropatrones (2D)

Osteogénesis Geometría (91)

Policrilamida (PAM) 23 Médula ósea Hidrogel (2D) Osteogénesis Vinculina (81)

Metil acrilato/ metil metacrilato (MA/MMA)

1000 LC Lonza Corp Sustrato (2D) Osteogénesis y condrogénesis

ITGB1 (94)

Colágeno recubierto de policrilamida (C-

PAM)

10-300 Médula ósea Hidrogel (2D) Osteogénesis y angiogénesis

JNK3, edad de las células

(93)

Fibroína de seda 6-64 LC Lonza Corp Hidrogel (3D) Diferenciación muscular

TGF-b1 (92)

Polietilenglicol diacrilato (PEG-DA)

25 LC Lonza Corp Micropatrones (2)

Osteogénesis Geometría (19)

Si se tienen en cuenta la rigidez de las otras formulaciones (> 20 kPa), los hidrogeles Alto G al 2%

y al 4% (p/v) y el hidrogel Bajo G al 4% (p/v) se clasifican como matrices con rigidez alta. De

acuerdo con lo anterior, el hidrogel Alto G al 2% (p/v) de alginato, con una rigidez aproximada de

30.78 kPa, promueve mayoritariamente la diferenciación osteogénica tanto en sustratos 2D (88)

donde se varía la geometría (91), la concentración de factores de crecimiento (81), como en

matrices 3D funcionalizadas con receptores de adhesión celular (80). Hay que tener en cuenta

que en el valor de rigidez de esta formulación al 2% (p/v) del hidrogel con el alginato Alto G

también se ha reportado diferenciación condrogénica en matrices 3D (85), y a linaje muscular en

matrices 3D de Fibroína de seda (92). Asimismo, para valores cercanos a la rigidez del hidrogel

Bajo G 4% (p/v), aproximadamente 60 kPa, se ha reportado diferenciación osteogénica en

sustratos 2D (88) y condrogénica (85). Para el valor de rigidez del hidrogel Alto G con 4% (p/v),

aproximadamente 300 kPa, se reporta que sustratos 2D de poliacrilamida recubiertos con

colágeno inducen tanto osteogénesis como angiogénesis- (93).

15

Teniendo en cuenta lo descrito y otros trabajos complementarios (Tabla 1) se puede observar que

uno de los mayores inconvenientes para establecer un intervalo óptimo de rigidez para la

diferenciación a un linaje celular específico es que la rigidez in vitro no sólo es modelada en

matrices 3D sino en sustratos 2D. De esta manera, en sustratos 2D las células sólo van a presentar

adhesiones focales y fibras de estrés en la superficie basal, por lo que las células se anclan a la

superficie e impide que se genere un gradiente de concentración de factores secretados que

pueda simular la difusión in vivo. Por el contrario, en microambientes 3D, se van a generar

adhesiones celulares distribuidas tanto en dirección planar como en dirección perpendicular. En

cuanto a los factores secretados, estos van a estar altamente concentrados en su sitio de

producción y van a poder dispersarse de acuerdo a la rigidez e índice de difusión de la matriz

(11,95). Asimismo, en cuanto a la agrupación de las células y las uniones célula a célula, sólo se

pueden generar en sistemas 3D cuando estos son poco rígidos, con módulo elástico menor a 120

kPa (96). Finalmente, con la revisión realizada se puede concluir que los hidrogeles que tienen un

potencial de diferenciación más definido según su rigidez y en los cuales se les van a encapsular

las células para posteriores análisis son Alto G al 4%(p/v) (Diferenciación osteogénica) y Bajo G al

4% (p/v) (Diferenciación condrogénica).

Evaluación de la viabilidad de las hAdMSCs encapsuladas. La Figura 5 presenta la viabilidad relativa utilizando la prueba de MTT para la formulación de 4%

(p/v) de los dos alginatos. De acuerdo con lo obtenido, la viabilidad de las células se mantiene

durante los 14 días de incubación sin presentarse diferencia significativa entre el alginato Bajo G

y el Alto G. Se observa una leve tendencia de disminución en el alginato Alto G en comparación

con el Bajo G que se mantiene más estable en el tiempo. Del mismo modo, se puede apreciar

que la densidad óptica medida para el día 4 es levemente menor para los dos alginatos en

comparación con los días 1, 7 y 14.

Hay que tener en cuenta que sólo se analizó la viabilidad de dos de las seis formulaciones

inicialmente planteadas debido a los rangos de rigidez presentados en la literatura que

promueven la diferenciación osteogénica (78,79) y condrogénica (85). Asimismo, la estabilidad

de las formulaciones decrece al disminuir la concentración de alginato en el tiempo, por lo que al

final de los 14 días el porcentaje de hidrogeles de estas formulaciones es menor al de los

hidrogeles de 4% (p/v) donde la estabilidad se conserva hasta el final de la prueba. Una de las

variables que se tuvo en cuenta para la siembra y mantenimiento de las células en el hidrogel fue

la concentración inicial de células en alginato y la concentración de SBF al 2% utilizada para este

ensayo. para mantener las células individuales, prevenir la formación de esferoides y la

proliferación celular (97). Del mismo modo, como el objetivo era verificar si las células

permanecían viables en los hidrogeles durante 2 semanas de incubación el control de crecimiento

fue la densidad óptica de cada una de las formulaciones en el día 1.

16

Figura 5. Viabilidad Celular de hAdMSCs en hidrogeles de alginato, medida mediante la prueba de MTT, a una concentración de 4% (p/v) para el alginato Bajo G (verde) y alto G (morado) Tiempo de incubación 14 días. Densidad inicial de células 4,25 x105

células/mL. A). Densidad óptica absorbancia a 595 nm. B). Porcentaje de viabilidad normalizado con respecto a la densidad óptica inicial (día 1 de cada una de las formulaciones). La significancia entre los alginatos y del tiempo fue calculada utilizando la prueba de Kruskal Wallis (ns) Significancia nula para todas las comparaciones realizadas. n=2 repeticiones= 4.

De acuerdo con los resultados obtenidos y lo descrito en la literatura la encapsulación en

hidrogeles de alginato mantiene la viabilidad y la función de las células encapsuladas (24). Sin

embargo, se ha reportado que posterior a 21 días de cultivo las células disminuyen su viabilidad

(cerca al 80%) en comparación con la viabilidad del día 1 (63). Adicionalmente, en ese trabajo se

comparó la viabilidad de hidrogeles con alta y baja proporción de monómeros G. Según los

resultados no hay diferencia significativa entre esta razón monomérica y la viabilidad de las

células, y sólo se observa una pequeña disminución de la viabilidad (cercana al 60%) para los

hidrogeles cultivados durante 21 días en matrices de alginato de grado molecular con viscosidad

baja y alta proporción de monómeros M (63). En contraste al estudiar el efecto de la rigidez de

los hidrogeles de alginato en la viabilidad celular se ha establecido que existe una estricta relación

entre la viabilidad y la rigidez de la matriz (38), lo que explicaría el por qué el hidrogel Alto G

presenta una menor viabilidad celular en la mayoría de los días en comparación con el hidrogel

Bajo G.

Finalmente, la viabilidad en los hidrogeles de alginato depende de muchos factores como la

concentración de Ca 2+ utilizada para la gelificación (47), la concentración inicial de células

encapsuladas (97), la concentración de alginato (47), el peso molecular del alginato utilizado (98)

y si el alginato está funcionalizado con otras moléculas (99,100) o proteínas que inducen la

adhesión celular(26).

Medición de cambios en los filamentos de actina de las hAdMSCs encapsuladas Se comprobó que la encapsulación en las diferentes formulaciones indujera un cambio en la

conformación del citoesqueleto mediante tinción fluorescente sobre los filamentos de actina y el

núcleo. Como se ha nombrado previamente el alginato por sí sólo no promueve la adhesión

celular a menos de que esté funcionalizado con moléculas que permitan la unión con receptores

de membrana como lo es el péptido RGD (26,101). Se decidió mirar los filamentos de actina pues

17

es una proteína importante en la conformación del citoesqueleto y permite delimitar si hay

presencia de adhesiones focales por la formación de fibras de estrés (102,103). Al observar la

Figura 6 se pudo comprobar que todas las células encapsuladas conservan principalmente una

geometría circular semejante a células en suspensión. Asimismo, también se puede observar que

el tamaño promedio de las células (aproximadamente 20 µm) y la razón entre el núcleo y el

citoplasma no presentó variaciones por el hidrogel en el que estuvieran encapsuladas.

De esta manera, al comparar la morfología de las células en cultivos 2D y 3D se puede afirmar que

ésta depende de las interacciones y las direcciones de las fuerzas en la matriz. Mientras que las

MSCs se cultiven sobre sustratos, van a variar su morfología de redondeada a alargada

dependiendo de la rigidez y la topografía del sustrato. Sin embargo, las células encapsuladas en

hidrogeles mantienen su morfología esférica, por lo que el destino de estas células depende de

la rigidez de la matriz. En este sentido, hidrogeles más elásticos inducirán la adipogénesis y los

más rígidos la osteogénesis (104,105). Del mismo modo, se conoce que cultivos 3D, como los

realizados en este trabajo, promueven el aumento del potencial paracrino inmunomodulatorio

de las MSCs al ser comparados con sustratos 2D, ya que en estos últimos se da una baja expresión

de algunos marcadores mesenquimales (106). Es así como en sistemas 3D se presentan múltiples

señales extracelulares como la rigidez, gradientes de gas, mediadores paracrinos, entre otros, que

no siempre se pueden dar en sistemas 2D (106).

Según la Figura 6 y Figura 7 se puede observar una acumulación significativa de filamentos de

actina en las células con respecto al tiempo, siendo mayor a los 14 días que a los 7 días. Del mismo

modo, aún con la variación de la intensidad de fluorescencia entre las células hay una pequeña

tendencia a aumentar el promedio de intensidad en función del alginato utilizado, siendo el Alto

G, que es el más rígido, en el que se aprecia una mayor intensidad promedio tanto en el día 7

como en el día 14.

18

Figura 6 Imagen de confocal de células hAdMSCs cultivadas en hidrogeles de alginato tanto Bajo G como Alto G al 4% (p/v) durante 7 y 14 días. A) Bajo G 7 días, B) Alto G 7 días, C) Alto G 14 días y D) Bajo G 14 días. Las células fueron teñidas con DAPI (núcleo: azul) y Alexa fluor 488 phalloidin (Filamentos de actina: verdes) [Barra de escala: 20 µm].

19

Figura 7. Promedio de la intensidad corregida por célula de los filamentos de actina de hAdMSCs cultivadas en cada hidrogel de alginato tanto Bajo G (verde) como Alto G (morado) al 4% (p/v) durante 7 y 14 días. La significancia entre los alginatos en los diferentes días fue calculada utilizando la prueba de Kruskal-Wallis Significancia nula (ns). La significancia del tiempo fue calculada utilizando una prueba Kruskal Wallis. p-value <0.05 (*) n=3.

Para determinar si además del aumento de la producción en los filamentos de actina se observa un cambio en la forma de la célula se realizó un análisis de la convolución y normalización de Kernel de las imágenes obtenidas con el filtro de Alexa 488 phalloidin. Las células cultivadas hasta el día 7 presentan un borde más regular y redondeado tanto en el alginato Alto G como Bajo G (flechas blancas) (Figura 8). Sin embargo, estos bordes son mucho más irregulares en las células cultivadas hasta el día 14, donde no sólo se observan claramente bordes irregulares con alta acumulación de actina (flechas negras), sino que además se ven pequeñas irregularidades menos acentuadas orientadas hacia la periferia de la célula (flechas azules) (Figura 8). También se observa una mayor acumulación de filamentos actina al interior de las células luego de un mayor tiempo de incubación, lo que se puede apreciar de igual manera en la Figura 9 en donde se presentan los perfiles de distribución de filamentos de actina a lo largo del diámetro de las células. Al día 7 los filamentos de actina están ubicados principalmente en la periferia; no obstante, al pasar el tiempo está distribución cambia en el alginato Bajo G donde los filamentos se ven indistintamente a lo largo de la célula. Por el contrario, el alginato Alto G no sólo conserva la ubicación preferencial de los filamentos de actina en los bordes de la célula, sino que el valor medio del perfil a lo largo de la célula aumenta. Según estos resultados, el valor de gris al interior de la célula aumenta en el día 14, lo cual explica porque la cuantificación de la intensidad de las células es mayor a mayor tiempo de incubación. La acumulación en los bordes de los filamentos de actina concuerda con la literatura. Las agrupaciones de filamentos de actina se encuentran debajo de la corteza celular, la cual constituye la red de proteínas asociadas a membrana que soporta y le da fuerza a la membrana plasmática (103).

20

Figura 8. Imagen del borde resaltado de hAdMSCs encapsuladas en hidrogeles de alginato al 4% (p/v) durante 7 y 14 días con filtro de convolución y normalización de Kernel. A) Alto G 7 días, , D) Bajo G 7 días, C) -) Alto G 14 días y D) Bajo G 14 días. Las imágenes se obtienen a partir del filtro fluorescente Alexa fluor 488 phalloidin . Las flechas blancas indican bordes más lisos y circulares, las flechas negras y azules indican bordes irregulares [Barra de escala: 20 µm] .

Según la literatura la conexión entre las señales mecánicas de la matriz extracelular y el

citoesqueleto son el ensamblaje de proteínas complejo conocido como adhesiones focales, las

cuales utilizan a las integrinas como los principales receptores de adhesión. Son las integrinas los

receptores que median la organización del citoesqueleto y permiten activar la cascada de

señalización a través de eventos de transducción durante el procesamiento de señales mecánicas.

Por tal razón, se dice que son esenciales para la percepción de la señal que orienta e inicia el

proceso de mecanotransducción inducido por la rigidez de la matriz que finalmente desencadena

el proceso de diferenciación celular (11,107). No obstante, según los resultados obtenidos al

analizar las imágenes de las células encapsuladas en el alginato se demuestra que los receptores

de membrana no sólo son los únicos que pivotean la transducción a partir de señales mecánicas.

Las células en sistemas 3D pueden censar los cambios de rigidez en la matriz y generar

modificaciones en su estructura en función del tiempo. Con lo descrito previamente y teniendo

en cuenta el proceso de tensegridad de las células, en el cual la forma de la célula se rige por un

principio de tensión y compresión de los microfilamentos de actina y los microtúbulos (102),; se

supone que los cambios observados en las Figura 6, Figura 7, Figura 8 y Figura 9 se deben a que

las células se adaptan a los cambios de rigidez de la matriz al alcanzar valores cercanos a ésta

mediante el agrupamiento y construcción de filamentos de actina (11).

21

Figura 9. Perfiles de distribución de filamentos de actina a lo largo del diámetro de las células encapsuladas en hidrogeles de alginato. A) Alto G 7 días, B) Bajo G 7 días, C) Alto G 14 días y D) Bajo G 14 días. Las imágenes en negro representan la fluorescencia en escala de grises de los filamentos de actina, las líneas blancas demuestran los cortes que fueron realizados en la imagen para realizar las medidas del perfil. n=3 con tres cortes transversales por célula

Las diferencias entre la agrupación de filamentos de actina de las células encapsuladas a los 14

días entre los hidrogeles Alto G y Bajo G se pueden deber a las diferencias y relación entre sus

módulos elásticos y viscosos. De esta manera, se puede afirmar que el hidrogel Alto G al tener un

módulo elástico menor y presentar una disminución en el tiempo a la aplicación de un esfuerzo

constante permite, -, que en el tiempo las fuerzas de tracción aplicadas desde la célula puedan

disipar la energía y generar una reorganización de la matriz (10). Es por esta misma razón que se

supone que el Bajo G a los 14 días presenta una distribución diferente de las agrupaciones de

filamentos de actina. Al tener un mayor componente elástico y no percibir pérdida apreciable en

el tiempo, las fuerzas se mantienen en la matriz y se impide tanto el remodelamiento de ésta

como el de las células encapsuladas.

Teniendo en cuenta lo descrito y que uno de los objetivos de este trabajo era el diseñar hidrogeles

de alginato con potencial para ser utilizado como matrices extracelulares que promovieran la

diferenciación principalmente osteogénica y condrogénica se puede afirmar que la matriz al 4%

(p/v) de alginato Alto G es la más adecuada para la diferenciación a tejido condrogénico. El

hidrogel Alto G al 4% (p/v) presenta un valor de rigidez en el cual se ha reportado la diferenciación

a este linaje. Del mismo modo al tener un componente elástico menor se da la reorganización de

la matriz para poder soportar las fuerzas de compresión a las cuales está sometido el cartílago

(108) . No obstante, también se ha descrito que estas dos variables en hidrogeles 3D promueven

la osteogénesis (10). Por tal razón se espera evaluar la diferenciación a estos dos linajes en las

22

células encapsuladas en el alginato al 4% (p/v) posterior a 14 días de cultivo. Finalmente, estos

hidrogeles pueden ser utilizados como soporte para estudios de comportamiento celular en el los

cuales se pueden variar las tasas de difusión de diversas moléculas gracias al control de la

formulación del hidrogel (109) controlando tanto la proporción de monómeros como de

concentración del alginato.

Medición del potencial de diferenciación condrogénico y osteogénico Teniendo en cuenta el análisis posterior de diferenciación de las hAdMSCs en los hidrogeles de

alginato, se validó el potencial de diferenciación de las células (Pase 6-7) mediante la realización

de controles de diferenciación con células cultivadas en monocapa en medios inductivos durante

14 días. Se seleccionó la tinción de glicosoaminoglicanos como marcador de diferenciación

condrogénica debido a que estas proteínas presentan una función importante en el cartílago, ya

que provee hidratación y presión de hinchamiento a tejidos que están bajo fuerzas de compresión

(108). Se observó una acumulación y producción de glicosoaminoglicanos en todas las células

hAdMSCs cultivadas en el medio de diferenciación (Figura 10A, C, E y G), mientras que en las

células cultivadas en medio de mantenimiento solo se observó una tinción basal con Azul Alcian

y Safranina sin acumulación de glicosoaminoglicanos (Figura 10B, D, F y H).

Además, se seleccionó la medición de la actividad de la fosfatasa alcalina sobre la observación de

depósitos de calcio (10), para comprobar la diferenciación osteogénica de las células hAdMSCs.

La actividad de la fosfatasa alcalina ha sido ampliamente utilizada como una medida para la

cuantificación de la ostegénesis ya que actúa tanto para aumentar la concentración local de

fosfato inorgánico, un promotor de la mineralización, como para disminuir la concentración de

pirofosfato extracelular, un inhibidor de formación de minerales (110). Según lo observado se

presenta una acumulación de la actividad de la fosfatasa en todas las células cultivadas en el

medio de diferenciación (Figura 11A, y C), mientras que en las células cultivadas en medio de

mantenimiento no se observa una tinción aparente (Figura 11B y D).

Figura 10 Tinción de la producción de glicosoaminoglicanos con Azul Alcian o Safranina de células control crecidas en monocapa después de 14 días de incubación. A) incubación en medio condrogénico (línea=200 µm, tinción con Safranina). B) Incubación en medio de mantenimiento (línea=200 µm, tinción con Safranina).C) incubación en medio condrogénico (línea=200 µm, tinción con Azul Alcian). D) Incubación en medio de mantenimiento (línea=50 µm, tinción con Azul Alcian). E) incubación en medio condrogénico (línea=50 µm, tinción con Safranina). F) Incubación en medio de mantenimiento (línea=50 µm, tinción con Safranina). G) incubación en medio condrogénico (línea=50 µm, tinción con Azul Alcian) ). D) Incubación en medio de mantenimiento (línea=50

23

µm, tinción con Azul Alcian)..Las fechas indican la acumulación de glucosoaminoglicanos identificados con una mayor acumulación del color ya que los dos colorantes tiñen preferencialmente ácidos polisacáridos.

De acuerdo con lo presentado en estas dos figuras se comprueba que las células utilizadas tienen

el potencial de diferenciación a linaje tanto osteogénico como condrogénico. Se debe tener en

consideración que el potencial osteogénico de las hMSCs depende de múltiples factores como la

edad del paciente del que se extrajo el tejido (111,112), el pase o subcultivo en el que se

encuentren las células y el tipo de tejido de donde se extraigan (113) ya sea médula ósea, tejido

dental, tejido adiposo, entre otros.

Figura 11 Tinción de la actividad de la fosfatasa alcalina con fosfato naphthol de células control crecidas en monocapa después de 14 días de incubación. A) incubación en medio osteogénico (línea=200 µm). B) Incubación en medio de mantenimiento (línea=200 µm). C) incubación en medio osteogénico (línea=50µm). D) Incubación en medio de mantenimiento (línea=50 µm).

Conclusiones Se diseño y caracterizó hidrogeles de alginato con potencial para ser utilizado como matrices

extracelulares que promuevan cambios en el comportamiento de células madre mesenquimales

encapsuladas. Asimismo, con este trabajo se demostró que la mecanotransducción en matrices

extracelulares 3D no sólo está mediada por receptores de membrana, sino que la célula censa la

rigidez y genera cambio en la agrupación de filamentos de actina. No obstante, se requiere más

investigación para dilucidar los detalles intrincados del mecanismo. Al diseñar hidrogeles de

alginato con la concentración de células utilizadas se generó un sistema en el cual se puede

analizar la estructura de una célula individual por lo tienen el potencial de ser utilizadas como

soporte para estudios de comportamiento celular. Finalmente, este trabajo representa un intento

para correlacionar los cambios en la composición de los hidrogeles a base de alginato y sus

propiedades reológicas y mecánicas con el comportamiento celular de hAdMSCs. Este enfoque

parece atractivo para el diseño de hidrogeles con la capacidad de imitar de cerca el

microambiente extracelular con potencial uso en la Ingeniería de tejidos.

24

Perspectivas Con el fin de validar el potencial de diferenciación el siguiente paso en esta investigación es el evaluar la diferenciación a estos dos linajes en las células encapsuladas en el alginato posterior a 14 días de cultivo. Del mismo modo para profundizar en el estudio del comportamiento celular adicional al análisis microscópico con las demás formulaciones utilizadas en este trabajo se espera realizar un análisis de expresión de genes mediante RT-PCR. Finalmente, para conocer si las células individuales están comenzando a sintetizar su propia matriz extracelular después de varios días de cultivo en los hidrogeles se pretende funcionalizar los alginatos con marcadores fluorescentes y analizar utilizando microscopia confocal.

Agradecimientos Agradecimientos a la Facultad de Ciencias por la financiación de este proyecto, Convocatoria

2017-2 para la financiación de proyectos de investigación y presentación de resultados en eventos

académicos. Al centro de microscopia de la Universidad de los Andes, principalmente a Humberto

Ibarra, Juan Camilo Orozco, César Augusto Quintana por su ayuda técnica en el protocolo de

medición de la rigidez de los hidrogeles. A Felipe Salcedo y Paula Sarmiento por su colaboración

en la caracterización reológica de los hidrogeles. Al grupo de Ingeniería de Tejidos y Terapia

Celular de la Universidad de Antioquía, a cargo de la Dra. Luz Marina Restrepo por envío de las

células hAdMSCs utilizadas en este proyetco. Finalmente, Juan Carlos Cruz, Carolina Muñoz y

Fernando Pastrana que fueron mis asesores y guiaron junto a Diana Narváez y Helena Groot en la

realización de este trabajo.

Referencias 1. Khademhosseini A, Langer R. A decade of progress in tissue engineering. Nat Protoc [Internet].

2016;11(10):1775–81. Available from: http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nprot.2016.123

2. Fernández Vallone VB, Romaniuk MA, Choi H, Labovsky V, Otaegui J, Chasseing NA. Mesenchymal stem cells and their use in therapy: What has been achieved? Differentiation. 2013;85(1–2):1–10.

3. Higuchi A, Ling Q, Chang Y, Hsu S, Umezawa A. Physical Cues of Biomaterials Guide Stem Cell Di ff erentiation Fate. 2013;

4. Mo X tao, Guo S chun, Xie H qi, Deng L, Zhi W, Xiang Z, et al. Variations in the ratios of co-cultured mesenchymal stem cells and chondrocytes regulate the expression of cartilaginous and osseous phenotype in alginate constructs. Bone [Internet]. 2009;45(1):42–51. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.bone.2008.07.240

5. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, et al. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science (80- ). 2008;143(1999).

6. Ashton RS, Keung AJ, Peltier J, Schaffer D V. Progress and Prospects for Stem Cell Engineering. Annu Rev Chem Biomol Eng [Internet]. 2011;2(1):479–502. Available from: http://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev-chembioeng-061010-114105

7. Anastasia L, Pelissero G, Venerando B, Tettamanti G. Cell reprogramming: expectations and challenges for chemistry in stem cell biology and regenerative medicine. Cell Death Differ [Internet]. 2010;17(8):1230–7. Available from: http://www.nature.com/cdd/journal/v17/n8/full/cdd201014a.html

8. Watt FM, Hogan BL. Out of Eden: stem cells and their niches. Science. 2000;287(5457):1427–30.

25

9. Guilak F, Cohen DM, Estes BT, Gimble JM, Liedtke W, Chen CS. Control of Stem Cell Fate by Physical Interactions with the Extracellular Matrix. Cell Stem Cell [Internet]. 2009;5(1):17–26. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.stem.2009.06.016

10. Chaudhuri O, Gu L, Klumpers D, Darnell M, Bencherif SA, Weaver JC, et al. Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity. Nat Mater [Internet]. 2015;15(November):326–33. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nmat4489

11. Lv H, Li L, Sun M, Zhang Y, Chen L, Rong Y, et al. Mechanism of regulation of stem cell differentiation by matrix stiffness. 2015;1–11.

12. Discher DE, Mooney DJ, Zandstra PW. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science (80- ). 2009;324(June):1673–8.

13. Benders KEM, Weeren PR van, Badylak SF, Saris DBF, Dhert WJA, Malda J. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends Biotechnol. 2013;31(3):169–76.

14. Cheung HK, Han TTY, Marecak DM, Watkins JF, Amsden BG, Flynn LE. Composite hydrogel scaffolds incorporating decellularized adipose tissue for soft tissue engineering with adipose-derived stem cells. Biomaterials [Internet]. 2014;35(6):1914–23. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2013.11.067

15. Sayyar B, Dodd M, Wen J, Ma S, Marquez-Curtis L, Janowska-Wieczorek a., et al. Encapsulation of factor IX-engineered mesenchymal stem cells in fibrinogen-alginate microcapsules enhances their viability and transgene secretion. J Tissue Eng [Internet]. 2012;3(1):2041731412462018. Available from: http://tej.sagepub.com/lookup/doi/10.1177/2041731412462018

16. Lutolf MP, Hubbell J a. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol [Internet]. 2005;23(1):47–55. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15637621

17. Ma PX. Biomimetic materials for tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 2008;60(2):184–98.

18. Lee J, Abdeen AA, Kilian KA. Rewiring mesenchymal stem cell lineage specification by switching the biophysical microenvironment. Sci Rep [Internet]. 2014;4:5188. Available from: http://www.nature.com/srep/2014/140605/srep05188/full/srep05188.html

19. Harris G, Piroli M, Jabbarzadeh E. Deconstructing the Effects of Matrix Elasticity and Geometry in Mesenchymal Stem Cell Lineage Commitment. Adv funct Mater. 2014;24(16):2396–403.

20. Lee J, Abdeen AA, Zhang D, Kilian KA. Directing stem cell fate on hydrogel substrates by controlling cell geometry, matrix mechanics and adhesion ligand composition. Biomaterials [Internet]. 2013;34(33):8140–8. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2013.07.074

21. Hoffman AS. Hydrogels for biomedical applications. Adv Drug Deliv Rev [Internet]. 2012;64(SUPPL.):18–23. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.addr.2012.09.010

22. Wong M. Alginates in tissue engineering. Methods Mol Biol [Internet]. 2004;238:77–86. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14970440

23. BL Strand, YA Morch GS-B. Alginate as immobilization matrix for cells. Minerva Biotecnol. 2000;12(4):223–33.

24. Andersen T, Auk-Emblem P, Dornish M. 3D Cell Culture in Alginate Hydrogels. Microarrays [Internet]. 2015;4(2):133–61. Available from: http://www.mdpi.com/2076-3905/4/2/133/htm

25. Alsberg E, Anderson KW, Albeiruti A, Franceschi RT, Mooney DJ. Cell-interactive Alginate Hydrogels for Bone Tissue Engineering. J Dent Res [Internet]. 2001;80(11):2025–9. Available from:

26

http://jdr.sagepub.com/cgi/doi/10.1177/00220345010800111501

26. Lee JW, Kim H, Lee KY. Effect of spacer arm length between adhesion ligand and alginate hydrogel on stem cell differentiation. Carbohydr Polym [Internet]. 2016;139:82–9. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.carbpol.2015.12.024

27. K. Y. Lee DJM. Alginate : properties and biomedical applications. Prog Polym Sci. 2012;37(1):106–26.

28. Awad HA, Wickham MQ, Leddy HA, Gimble JM, Guilak F. Chondrogenic differentiation of adipose-derived adult stem cells in agarose, alginate, and gelatin scaffolds. Biomaterials. 2004;25(16):3211–22.

29. Kelly DJ, Jacobs CR. The role of mechanical signals in regulating chondrogenesis and osteogenesis of mesenchymal stem cells. Birth Defects Res Part C - Embryo Today Rev. 2010;90(1):75–85.

30. Barry F, Boynton RE, Liu B, Murphy JM. Chondrogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow: Differentiation-Dependent Gene Expression of Matrix Components. Exp Cell Res [Internet]. 2001;268(2):189–200. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014482701952784

31. De Ceuninck F, Lesur C, Pastoureau P, Caliez A, Sabatini M. Culture of chondrocytes in alginate beads. Methods Mol Med. 2004;100:15–22.

32. Lu L, Zhang X, Wang Y, Ortiz L, Mao X, Jiang Z, et al. E ff ects of Hydroxyapatite-Containing Composite Nano fi bers on Osteogenesis of Mesenchymal Stem Cells In vitro and Bone Regeneration In vivo. Appl Mater Interfaces. 2013;5:319–30.

33. Fan C, Wang D-A. Potential use of alginate beads as a chondrocyte delivery vehicle and stepwise dissolving porogen in a hydrogel scaffold for cartilage tissue engineering. RSC Adv [Internet]. 2015;5(98):80688–97. Available from: http://xlink.rsc.org/?DOI=C5RA15376J

34. Yu H, Cauchois G, Schmitt J, Louvet N, Six J. Is there a cause-and-effect relationship between physicochemical properties and cell behavior of alginate-based hydrogel obtained after sterilization ? J Mech Behav Biomed Mater [Internet]. 2017;68(January):134–43. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.jmbbm.2017.01.038

35. International A. F2315-11 Standard Guide for Immobilization or Encapsulation of Living Cells or Tissue in Alginate Gels. Annu B ASTM Stand. 2011;1–8.

36. Gothard D, Smith EL, Kanczler JM, Black CR, Wells JA, Roberts CA, et al. In vivo assessment of bone regeneration in alginate/bone ECM hydrogels with incorporated skeletal stem cells and single growth factors. PLoS One. 2015;10(12):1–23.

37. Kavalkovich KW, Boynton RE, Murphy JM, Barry F. Chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells within an alginate layer culture system. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2002;38(8):457–66.

38. Cavo M, Fato M, Peñuela L, Beltrame F, Raiteri R, Scaglione S, et al. Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D in vitro model. Sci Rep [Internet]. 2016;6(October):35367. Available from: http://www.nature.com/articles/srep35367

39. Wang L, Chung JE, Chan PP, Kurisawa M. Biomaterials Injectable biodegradable hydrogels with tunable mechanical properties for the stimulation of neurogenesic differentiation of human mesenchymal stem cells in 3D culture OH. Biomaterials [Internet]. 2010;31(6):1148–57. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2009.10.042

40. Di Battista JA, Shebaby W, Kizilay O, Hamade E, Abou Merhi R, Mebarek S, et al. Proliferation and differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cells (ASCs) into osteoblastic lineage are passage dependent. Inflamm Res. 2014;63(11):907–17.

41. Xu J, Wang W, Ludeman M, Cheng K, Hayami T, Lotz JC, et al. Chondrogenic differentiation of human

27

mesenchymal stem cells in three-dimensional alginate gels. Tissue Eng Part A. 2008;14(5):667–80.

42. Ma H-L, Hung S-C, Lin S-Y, Chen Y-L, Lo W-H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J Biomed Mater Res A [Internet]. 2003;64(2):273–81. Available from: http://eutils.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/eutils/elink.fcgi?dbfrom=pubmed&id=12522814&retmode=ref&cmd=prlinks%5Cnpapers2://publication/doi/10.1002/jbm.a.10370

43. Zhou H, Xu HHK. The fast release of stem cells from alginate-fibrin microbeads in injectable scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials [Internet]. 2011;32(30):7503–13. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2011.06.045

44. Jaiswal N, Haynesworth SE, Caplan a I, Bruder SP. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem. 1997;64(2):295–312.

45. Cai X, Lin Y, Ou G, Luo E, Man Y, Yuan Q, et al. Ectopic osteogenesis and chondrogenesis of bone marrow stromal stem cells in alginate system. Cell Biol Int. 2007;31(8):776–83.

46. Klokkevold PR, Vandemark L, Kenney EB, Bernard GW. Osteogenesis enhanced by chitosan (poly-N-acetyl glucosaminoglycan) in vitro. J Periodontol [Internet]. 1996;67:1170–5. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8959566

47. Cao N, Chen XB, Schreyer DJ. Influence of Calcium Ions on Cell Survival and Proliferation in the Context of an Alginate Hydrogel. ISRN Chem Eng [Internet]. 2012 May 7 [cited 2017 Nov 21];2012:1–9. Available from: http://www.hindawi.com/journals/isrn/2012/516461/

48. Moshaverinia A, Chen C, Xu X, Akiyama K, Ansari S, Zadeh HH, et al. Bone regeneration potential of stem cells derived from periodontal ligament or gingival tissue sources encapsulated in RGD-modified alginate scaffold. Tissue Eng Part A [Internet]. 2014;20(3–4):611–21. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3926152&tool=pmcentrez&rendertype=abstract

49. Galateanu B, Dimonie D, Vasile E, Nae S, Cimpean A, Costache M. Layer-shaped alginate hydrogels enhance the biological performance of human adipose-derived stem cells. BMC Biotechnol [Internet]. 2012 Jun 29 [cited 2017 Nov 21];12(1):35. Available from: http://bmcbiotechnol.biomedcentral.com/articles/10.1186/1472-6750-12-35

50. Qazi TH, Mooney DJ, Duda GN, Geissler S. Biomaterials that promote cell-cell interactions enhance the paracrine function of MSCs. Biomaterials [Internet]. 2017;140:103–14. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2017.06.019

51. Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frise E, Kaynig V, Longair M, Pietzsch T, et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods [Internet]. 2012 Jun 28;9:676. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.2019

52. Gavet O, Pines J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Biol [Internet]. 2010 Apr 19 [cited 2018 Apr 17];189(2):247–59. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20404109

53. Palomares FG, Serrá JAM, Martínez EA. Modelling in Science Education and Learning MSEL. Model Sci Educ Learn [Internet]. 2016;9(1):97–108. Available from: https://polipapers.upv.es/index.php/MSEL/article/view/4524/4724

54. Bankhead P. Analyzing fluorescence microscopy images with ImageJ. ImageJ. 2014;(May):1–195.

55. Huang S, Fu R, Shyu W, Liu S, Jong G. Review Adipose-Derived Stem Cells : Isolation , Characterization , and Differentiation Potential. 2013;22:701–9.

56. Li W-J, Tuli R, Huang X, Laquerriere P, Tuan RS. Multilineage differentiation of human mesenchymal stem

28

cells in a three-dimensional nanofibrous scaffold. Biomaterials [Internet]. 2005 Sep [cited 2017 Apr 25];26(25):5158–66. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0142961205000037

57. Chaudhuri O, Gu L, Darnell M, Klumpers D, Bencherif SA, Weaver JC, et al. Substrate stress relaxation regulates cell spreading. Nat Commun [Internet]. 2015;6:6364. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=4518451&tool=pmcentrez&rendertype=abstract

58. Im G Il, Shin YW, Lee KB. Do adipose tissue-derived mesenchymal stem cells have the same osteogenic and chondrogenic potential as bone marrow-derived cells? Osteoarthr Cartil. 2005;13(10):845–53.

59. Minitab INC. MINITAB statistical software. Minitab Release. 2000;13.

60. Stoppel WL, White JC, Horava SD, Henry AC, Roberts SC, Bhatia SR. Terminal sterilization of alginate hydrogels: Efficacy and impact on mechanical properties. J Biomed Mater Res - Part B Appl Biomater. 2014;102(4):877–84.

61. Sánchez P, Hernández RM, Pedraz JL. Chapter 21 Encapsulation of Cells in Alginate Gels. 1051(6):313–25.

62. Fraser JE, Bickerstaff GF. Entrapment in Calcium Alginate. Immobil Enzym Cells. 1977;1:61–6.

63. Rey-Rico A, Klich A, Cucchiarini M, Madry H. Biomedical-grade, high mannuronic acid content (BioMVM) alginate enhances the proteoglycan production of primary human meniscal fibrochondrocytes in a 3-D microenvironment. Sci Rep [Internet]. 2016;6(October 2015):28170. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27302206%5Cnhttp://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=PMC4908386

64. Hwang YS, Cho J, Tay F, Heng JYY, Ho R, Kazarian SG, et al. The use of murine embryonic stem cells, alginate encapsulation, and rotary microgravity bioreactor in bone tissue engineering. Biomaterials [Internet]. 2009;30(4):499–507. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2008.07.028

65. Jeon O, Bouhadir KH, Mansour JM, Alsberg E. Photocrosslinked alginate hydrogels with tunable biodegradation rates and mechanical properties. Biomaterials [Internet]. 2009 May [cited 2017 Nov 26];30(14):2724–34. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19201462

66. Leo WJ, Mcloughlin AJ, Malone DM. Effects of Sterilization Treatments on Some Properties of Alginate Solutions and Gels. Biotechnol Prog. 1990;6(1):51–3.

67. Aida TM, Yamagata T, Watanabe M, Smith RL. Depolymerization of sodium alginate under hydrothermal conditions. Carbohydr Polym [Internet]. 2010;80(1):296–302. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0144861709006730

68. Rehm B. Alginates : biology and applications. 2009.

69. Khavari A, Nydén M, Weitz DA, Ehrlicher AJ. Composite alginate gels for tunable cellular microenvironment mechanics. Sci Rep [Internet]. 2016;6(August):30854. Available from: http://www.nature.com/articles/srep30854

70. Fröhlich E, Bonstingl G, Höfler A, Meindl C, Leitinger G, Pieber TR, et al. Comparison of two in vitro systems to assess cellular effects of nanoparticles-containing aerosols. Toxicol In Vitro [Internet]. 2013 Feb [cited 2017 Nov 26];27(1):409–17. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22906573

71. Manojlovic V, Djonlagic J, Obradovic B, Nedovic V, Bugarski B. Immobilization of cells by electrostatic droplet generation: A model system for potential application in medicine. Int J Nanomedicine. 2006;1(2):163–71.

72. Ahearne M, Yang Y, El Haj AJ, Then KY, Liu K-K. Characterizing the viscoelastic properties of thin hydrogel-based constructs for tissue engineering applications. J R Soc Interface [Internet]. 2005 Dec 22 [cited 2017 Nov 27];2(5):455–63. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16849205

29

73. Chan E, Lim T, Voo W, Pogaku R, Tey T, Zhang Z. Effect of formulation of alginate beads on their mechanical behavior and stiffness. Particuology [Internet]. 2011;9(3):228–34. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.partic.2010.12.002

74. Pebworth M, Cismas SA, Asuri P. A Novel 2 . 5D Culture Platform to Investigate the Role of Stiffness Gradients on Adhesion- Independent Cell Migration A Novel 2 . 5D Culture Platform to Investigate the Role of Stiffness Gradients on Adhesion-Independent Cell Migration. 2014;(October):1–6.

75. Bokkhim H, Bansal N, Grøndahl L, Bhandari B. Characterization of beads. Food Hydrocoll [Internet]. 2015; Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.foodhyd.2014.12.002

76. Kaklamani G, Cheneler D, Grover LM, Adams MJ, Bowen J. Mechanical properties of alginate hydrogels manufactured using external gelation. J Mech Behav Biomed Mater [Internet]. 2014;36:135–42. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.jmbbm.2014.04.013

77. Voo W, Ooi C, Islam A, Tey B, Chan E. Calcium alginate hydrogel beads with high stiffness and extended dissolution behaviour. Eur Polym J [Internet]. 2016;75:343–53. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.eurpolymj.2015.12.029

78. Engler AJ, Sen S, Sweeney LH, Discher DE. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification Supplementary Information. Cell [Internet]. 2006;126 VN-. Available from: http://scholar.google.com/scholar?q=Matric Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification&btnG=&hl=en&num=20&as_sdt=0,22

79. Lv H, Wang H, Zhang Z, Yang W, Liu W, Li Y, et al. Biomaterial stiffness determines stem cell fate. Life Sci [Internet]. 2017;178:42–8. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.lfs.2017.04.014

80. Huebsch N, Arany PR, Mao AS, Shvartsman D, Ali OA, Bencherif SA, et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat Mater [Internet]. 2010;9(6):518–26. Available from: http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nmat2732

81. Kuroda M, Wada H, Kimura Y, Ueda K, Kioka N. Vinculin promotes nuclear localization of TAZ to inhibit ECM stiffness-dependent differentiation into adipocytes. J Cell Sci [Internet]. 2017 [cited 2017 May 28];130(5). Available from: http://jcs.biologists.org/content/130/5/989

82. Dupont S, Morsut L, Aragona M, Enzo E, Giulitti S, Cordenonsi M, et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature [Internet]. 2011 Jun 9 [cited 2018 Apr 19];474(7350):179–83. Available from: http://www.nature.com/articles/nature10137

83. Park JS, Chu JS, Tsou AD, Diop R, Tang Z, Wang A, et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials [Internet]. 2011 [cited 2017 May 25];32(16):3921–30. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961211001712

84. Wingate K, Bonani W, Tan Y, Bryant SJ, Tan W. Compressive elasticity of three-dimensional nanofiber matrix directs mesenchymal stem cell differentiation to vascular cells with endothelial or smooth muscle cell markers. Acta Biomater [Internet]. 2012 [cited 2017 May 25];8(4):1440–9. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1742706112000037

85. Miao T, Miller EJ, McKenzie C, Oldinski RA, Luyten FP, Denti M, et al. Physically crosslinked polyvinyl alcohol and gelatin interpenetrating polymer network theta-gels for cartilage regeneration. J Mater Chem B [Internet]. 2015;3(48):9242–9. Available from: http://xlink.rsc.org/?DOI=C5TB00989H

86. Murphy CM, Matsiko A, Haugh MG, Gleeson JP, O’Brien FJ. Mesenchymal stem cell fate is regulated by the composition and mechanical properties of collagen–glycosaminoglycan scaffolds. J Mech Behav Biomed Mater [Internet]. 2012 Jul [cited 2017 May 25];11:53–62. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22658154

30

87. Lanniel M, Huq E, Allen S, Buttery L, Williams PM, Alexander MR, et al. Substrate induced differentiation of human mesenchymal stem cells on hydrogels with modified surface chemistry and controlled modulus. Soft Matter [Internet]. 2011 [cited 2017 May 25];7(14):6501. Available from: http://xlink.rsc.org/?DOI=c1sm05167a

88. Engler AJ, Sen S, Sweeney HL, Discher DE. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. 2006;677–89.

89. Wingate K, Floren M, Tan Y, Tseng PON, Tan W. Synergism of Matrix Stiffness and Vascular Endothelial Growth Factor on Mesenchymal Stem Cells for Vascular Endothelial Regeneration. Tissue Eng Part A [Internet]. 2014 Sep [cited 2017 May 25];20(17–18):2503–12. Available from: http://online.liebertpub.com/doi/abs/10.1089/ten.tea.2013.0249

90. Tse JR, Engler AJ, Radmacher M, Wang Y, Sheetz M. Stiffness Gradients Mimicking In Vivo Tissue Variation Regulate Mesenchymal Stem Cell Fate. Leipzig ND, editor. PLoS One [Internet]. 2011 Jan 5 [cited 2017 May 28];6(1):e15978. Available from: http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0015978

91. Lee J, Abdeen AA, Huang TH, Kilian KA. Controlling cell geometry on substrates of variable stiffness can tune the degree of osteogenesis in human mesenchymal stem cells. J Mech Behav Biomed Mater [Internet]. 2014 [cited 2017 May 25];38:209–18. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1751616114000101

92. Floren M, Bonani W, Dharmarajan A, Motta A, Migliaresi C, Tan W. Human mesenchymal stem cells cultured on silk hydrogels with variable stiffness and growth factor differentiate into mature smooth muscle cell phenotype. Acta Biomater [Internet]. 2016 Feb [cited 2017 May 29];31:156–66. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1742706115302270

93. Barreto S, Gonzalez-Vazquez A, Cameron AR, Cavanagh B, Murray DJ, O’Brien FJ. Identification of the mechanisms by which age alters the mechanosensitivity of mesenchymal stromal cells on substrates of differing stiffness: Implications for osteogenesis and angiogenesis. Acta Biomater [Internet]. 2017 Apr [cited 2017 May 29];53:59–69. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1742706117301368

94. Olivares-navarrete R, Lee EM, Smith K, Hyzy SL, Doroudi M, Williams JK, et al. Substrate Stiffness Controls Osteoblastic and Chondrocytic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Exogenous Stimuli. 2017;1:1–18.

95. Baker BM, Chen CS. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. 2012;

96. Maia FR, Barbosa M, Gomes DB, Vale N, Gomes P, Granja PL, et al. Hydrogel depots for local co-delivery of osteoinductive peptides and mesenchymal stem cells. J Control Release [Internet]. 2014;189:158–68. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.jconrel.2014.06.030

97. Bohari SPM, Hukins DWL, Grover LM. Effect of calcium alginate concentration on viability and proliferation of encapsulated fibroblasts. Biomed Mater Eng [Internet]. 2011 Jan 1 [cited 2017 Nov 21];21(3):159–70. Available from: https://content.iospress.com/articles/bio-medical-materials-and-engineering/bme665

98. Joon H, Smith MK, Mooney DJ. Designing alginate hydrogels to maintain viability of immobilized cells. 2003;24:4023–9.

99. Li X, Liu T, Song K, Yao L, Ge D, Bao C, et al. Culture of neural stem cells in calcium alginate beads. Biotechnol Prog. 2006;22(6):1683–9.

100. Westhrin M, Xie M, Olderøy M, Sikorski P, Strand BL, Standal T. Osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells in mineralized alginate matrices. PLoS One. 2015;10(3):1–16.

101. Venkatesan J, Bhatnagar I, Manivasagan P, Kang K-H, Kim S-K. Alginate composites for bone tissue engineering: A review. Int J Biol Macromol [Internet]. 2015;72:269–81. Available from:

31

http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0141813014004735

102. Davies J. Mechanisms of morphogenesis. Academic Press; 2013.

103. O’Connor CM, Adams JU, Fairman J. Essentials of cell biology. Cambridge, MA NPG Educ. 2010;1.

104. Steward AJ, Kelly DJ. Mechanical regulation of mesenchymal stem celldifferentiation. J Anat. 2015;(November 2014):717–31.

105. Raab M, Discher D, Rehfeldt F. Hyaluronic acid matrices show matrix stiffness in 2D and 3D dictates cytoskeletal order and myosin-II phosphorylation within ... Integrative Biology. 2012;(February).

106. Follin B, Juhl M, Cohen S, Perdersen AE, Kastrup J, Ekblond A. Increased Paracrine Immunomodulatory Potential of Mesenchymal Stromal Cells in Three-Dimensional Culture. Tissue Eng Part B Rev [Internet]. 2016 Aug [cited 2017 May 29];22(4):322–9. Available from: http://online.liebertpub.com/doi/10.1089/ten.teb.2015.0532

107. Dalby MJ, García AJ, Salmeron-Sanchez M. Receptor control in mesenchymal stem cell engineering. Nat Rev Mater [Internet]. 2018 Jan 31 [cited 2018 Apr 20];3(3):17091. Available from: http://www.nature.com/articles/natrevmats201791

108. Yanagishita M. Function of proteoglycans in the extracellular matrix. Acta Pathol Jpn [Internet]. 1993 Jun [cited 2018 Apr 19];43(6):283–93. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8346704

109. Li J, Mooney DJ. Designing hydrogels for controlled drug delivery. Nat Rev Mater [Internet]. 2016 Oct 18 [cited 2018 Jan 30];1(12):16071. Available from: http://www.nature.com/articles/natrevmats201671

110. Golub EE, Boesze-Battaglia K. The role of alkaline phosphatase in mineralization. Curr Opin Orthop Curr Opin Orthop [Internet]. 2007 [cited 2017 Sep 10];18(18). Available from: http://josorge.com/publications/Citations/Bio-bio/004.pdf

111. Shi Y-Y, Nacamuli RP, Salim A, Longaker MT. The osteogenic potential of adipose-derived mesenchymal cells is maintained with aging. Plast Reconstr Surg [Internet]. 2005 Nov [cited 2018 Apr 19];116(6):1686–96. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16267433

112. Schäffler A, Büchler C. Concise Review: Adipose Tissue-Derived Stromal Cells-Basic and Clinical Implications for Novel Cell-Based Therapies. Stem Cells [Internet]. 2007 Apr [cited 2018 Apr 19];25(4):818–27. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17420225

113. Grottkau BE, Lin Y. Osteogenesis of Adipose-Derived Stem Cells. Bone Res [Internet]. 2013 Jun [cited 2018 Apr 19];1(2):133–45. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26273498

32

Material suplementario

0 5 0 1 0 0

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1

T a s a d e c o rte (1 /s )

Vis

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B a jo G N o a u to c la va d o

B a jo G A u to c la va d o

A lto G N o A u to c la v a d o

A lto G A u to c la v a d o

Figura S 1 Barrido de flujo de las soluciones de alginato al 1% (p/v) en 0.9% NaCl previo y posterior al autoclavado. El color morado representa las soluciones del alginato con alta proporción de mónomeros G. El color verde representa las soluciones del alginato con baja proporción de monómeros G. Los puntos rellenos representan la viscosidad de las soluciones previas al autoclavado. Los puntos vacíos representan la viscosidad de las soluciones posterior al autoclavado. La barra de error representa la desviación de la prueba n=3.

Figura S 2. Análisis reológico de hidrogeles Bajo G y Alto G A) (módulo de almacenamiento, puntos rellenos y módulo de pérdida, puntos vacíos) de hidrogeles al 4% (p/v). B) (módulo de almacenamiento, puntos rellenos y módulo de pérdida, puntos vacíos) de hidrogeles al 2% (p/v). C) (módulo de almacenamiento, puntos rellenos y módulo de pérdida, puntos vacíos) de hidrogeles al 1% (p/v). Para algunos datos, las barras de error son más cortas que la altura del símbolo. La barra de error representa la desviación de la prueba n=3

33

Figura S 3. Análisis reológico de hidrogeles de alginato al 1% (triángulos de color azul), 2%(triángulos de color verde) y 4% (triángulos de color morado) (p/v) en solución fisiológica de 0.9% de NaCl. A) Módulo elástico hidrogel Bajo G. B). Módulo elástico hidrogel Alto G. Para algunos datos, las barras de error son más cortas que la altura del símbolo. La barra de error representa la desviación de la prueba n=3

Figura S 4. Análisis reológico de hidrogeles de alginato al 1% (círculos de color azul), 2%(círculos de color verde) y 4% (círculos de color morado) (p/v) en medio de cultivo DMEM con 10%SBF, 1%P/S. A) Módulo elástico hidrogel Bajo G. B). Módulo elástico hidrogel Alto G. Para algunos datos, las barras de error son más cortas que la altura del símbolo. La barra de error representa la desviación de la prueba n=3

Figura S 5 Análisis reológico de hidrogeles de alginato al 1% (cuadrados de color azul), 2%(cuadrados de color verde) y 4% (cuadrados de color morado) (p/v) en medio de cultivo y una concentración inicial de 1x106 células/mL . A) Módulo elástico hidrogel Bajo G. B). Módulo elástico hidrogel Alto G. Para algunos datos, las barras de error son más cortas que la altura del símbolo. La barra de error representa la desviación de la prueba n=3

34

Tabla S 1 Módulo de Young (kPa) con su intervalo de confianza de dos tipos diferentes de alginato (Bajo G y Alto G) a 1%, 2% y 4% (p/v).

Presentación a Congresos

1. Congreso: IX Seminario Internacional de Ingeniería Biomédica (Mayo 16, 17 y 18, Bogotá,

Colombia)

Título: 3D Alginate Hydrogels with Controlled Mechanical Properties for Mammalian Cell

Encapsulation

Autores: Alejandra Suarez-Arnedo, Paula Sarmiento, Juan C. Cruz, Carolina Muñoz-Camargo, Felipe

Salcedo, Helena Groot, Diana M. Narváez. Facultad de Ingeniería y Laboratorio de Genética Humana,

Universidad de los Andes.

Abstract: Alginate is one of the most attractive biomaterials for the design of hydrogels for biological

and biomedical applications. This biomaterial is composed of varying amounts of two monomers, αL-

guluronic acid (G) and β-D-mannuronic acid (M). Recent reports have suggested that depending on

the monomeric composition of the hydrogel, stability, mechanical resistance, biodegradability,

permeability and gelation might vary significantly. Even though different alginate-based hydrogels

have been explored for encapsulation of cells, a correlation between composition and mechanical

properties is still missing. Closing this important knowledge gap has been considered crucial for the

development of next generation 3D materials capable of resembling the features of extracellular

matrices. The purpose of this study was therefore to correlate rheological and mechanical properties

of two alginate-based hydrogel formulations. Alginate 1 (Low G 20%-30% of G) and alginate 2 (High G

65%-75% of G) hydrogels were prepared by the diffusion of Calcium ions from a two-layer agarose

matrix. The prepared hydrogels were characterized by determining the elastic and Loss moduli at a

time sweep of 1Hz. Also, stiffness was determined via AFM. The rheological tests suggest that Low G

hydrogels, , exhibit higher Storage moduli than High G hydrogels. In line with this result, stiffness is

significantly higher for High G hydrogels.

Tipo: Presentación oral

2. Congreso: World Congress on Advanced Biomaterials and Tissue Engineering (Octubre 17-18,

Roma Italia)

Título: 3D alginate hydrogels: impact of substrate stiffness on cellular response

Tipo de

alginato

Concentración

(%p/v)

1 3,173 ± 0,16

Bajo G 2 7,652 ± 0,83

4 61,758 ± 0,69

1 12,088 ± 5,48

Alto G 2 30,781 ± 4,08

4 300,647 ± 43,91

Módulo de Young (kPa)

35

Autores: Alejandra Suarez-Arnedo, Homero F. Pastrana, Juan C. Cruz, Carolina Muñoz-Camargo,

Helena Groot, Diana M. Narváez. Facultad de Ingeniería y Laboratorio de Genética Humana,

Universidad de los Andes.

Abstract: Currently, the design of extracellular matrices is directed towards mimicking the cellular

microenvironment. Additionally, these matrices allow the study of cell behavior in response to varying

physicochemical and mechanical properties. For instance, mechanical properties such as stiffness have

been reported to alter cell differentiation, adhesion, and viability. Thus far, the cellular response

studies have been conducted on two-dimensional (2D) substrates; nonetheless, three-dimensional

(3D) microenvironments appear most suitable to approach to native cellular behavior. Alginate

hydrogels provide an appealing 3D microenvironment; however, a full characterization of mechanical

property-function relationships is still elusive. This study is therefore dedicated to determine if

changes in the stiffness of alginate hydrogels might lead to significant cytoskeletal changes in cells

upon encapsulation. Methods and materials: Hydrogels with alginate contents of 2% and 4% (w/v)

were prepared by the diffusion method. Subsequently, hydrogels stiffness was determined via atomic

force microscopy (AFM). Finally, Vero cells were encapsulated in the hydrogels where actin fillaments

were stained and imaged using Confocal microscopy. Results and Discussion: Stiffness values of the

2% and the 4% hydrogels were significantly different (p-value <0.0001) and approached 30.5 kPa and

300.3 kPa, respectively. Additionally, a simple inspection revealed tha actin filament was most

abundant for the 4% hydrogel (Figure 1). Accordingly, it is possible to suggest that, as for the 2D

systems, a more rigid 3D microenvironment can lead to an increase of actin filaments. Furthermore,

the observed cell geometries suggest that not only focal adhesions with the extracellular matrix but

local changes in mechanical properties are responsible for important structural changes in cells.

Tipo: Poster