ENCAPSULACIÓN MICROBIANA EN ALGINATO-ALMIDÓN YUCA 1 ...

ENCAPSULACIÓN MICROBIANA EN ALGINATO-ALMIDÓN YUCA 1

Encapsulación de un Consorcio Microbiano con Actividad Promotora de Crecimiento

Vegetal (PGPM) en una Matriz de Almidón de Yuca y Alginato

Amador Lamus Ingrid Sofia

Universidad de Santander

Facultad de Ciencias Exactas, Naturales y Agropecuarias

Microbiología Industrial

Bucaramanga

2021


Encapsulación de un Consorcio Microbiano con Actividad Promotora de Crecimiento

Vegetal (PGPM) en una Matriz de Almidón de Yuca y Alginato


Trabajo de Grado Para Optar por el Título de Microbióloga Industrial

Director

Acevedo Agusto Carlos Isidro

M.Sc

Codirector

Agualimpia Valderrama Bayron Enrique

M.Sc

Asesores

Ropero Vega José Luis

Ph.D

Osorio Márquez Jorge Daniel

BSc.

Universidad de Santander

Facultad de Ciencias Exactas, Naturales y Agropecuarias

Microbiología Industrial

Bucaramanga

2021


Dedicatoria

A mis papás, por darme el mejor ejemplo de vida, por sacarme a delante y luchar

conmigo hasta el final a pesar de tantos tropiezos por el camino. Gracias a ellos y a mi hermana

Nathalie que siempre creyeron en mí, aceptaron mis errores y ayudarme a ser mejor cada día.

¡Por mateo, para ser su mejor ejemplo de vida y lograr que llegue a ser mejor que nosotras! Lo

son todo para mí, gracias por confiar en mí.

A Julián, quien con sus regaños, consejos y compresión me ayudaron a nunca parar o

desistir a culminar mis prácticas y este proyecto. ¡Gracias por tanto amor!


Agradecimientos

Especialmente agradezco a mi profesor Carlos Acevedo quien me guio durante mis dos

últimos años de carrera en mi trabajo de grado y mi año de prácticas formativas, sin duda alguna

cada consejo, regaño y conocimiento de él me ayudo a ser mejor y a formarme como una gran

profesional. Al profesor Bayrón Agualimpia quien me acompaño en mis últimos días de

laboratorio colaborándome para poder acabar de la mejor manera posible todos los ensayos. Y a

mis asesores por su apoyo y aporte en desarrollo del trabajo, sin ustedes no hubiese podido

culminar esta gran etapa.

Al personal del laboratorio de Agroecología y biotecnología, por su valiosa colaboración

al realizar este proyecto.

A mis compañeros de la universidad, en especial a Paula, por brindarme sus

conocimientos y su amistad durante toda la carrera. Por estar siempre presente a pesar de las

diferencias. Gracias a Tatiana y Laura por ser mis compañeras de lucha durante estos últimos 3

años, con su compañerismo, amistad y apoyo moral para culminar juntas esta etapa.


Contenido

Pág.

Introducción .................................................................................................................................. 18

1. Planteamiento del Problema ..................................................................................................... 20

2. Justificación .............................................................................................................................. 22

3. Marco Teórico ........................................................................................................................... 24

3.1 Microorganismos Promotores de Crecimiento Vegetal (PGPM) ........................................ 24

3.1.1 Mecanismos para la Promoción de Crecimiento Vegetal Mediada por PGPM ........... 24

3.1.1.1 Bacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal. ..................................................... 25

3.1.1.2 Rizobacterias Solubilizadores de Fosfato. ............................................................. 26

3.1.1.3 Rizobacterias Fijadoras de Nitrógeno. ................................................................... 27

3.1.1.4 Rizobacterias Productoras de Fitorreguladores. .................................................... 27

3.2 Producción de Inoculantes Microbianos ............................................................................. 28

3.2.1 Técnicas de Inmovilización .......................................................................................... 29

3.2.2 Encapsulación de Microorganismos ............................................................................. 29

3.2.3 Método de Extrusión o Goteo ....................................................................................... 30

3.3 Matrices Poliméricas Orgánicas .......................................................................................... 31

3.3.1 Alginato ........................................................................................................................ 31

3.3.2 Almidón ........................................................................................................................ 32

3.3.2.1 Almidón de Yuca. .................................................................................................. 33

3.3.2.1.1 Gelatinización. ................................................................................................ 34

3.3.2.1.2 Polímeros Biodegradables. .............................................................................. 34

4. Marco Referencial ..................................................................................................................... 36


5. Marco Legal .............................................................................................................................. 39

6. Hipótesis ................................................................................................................................... 40

7. Objetivos ................................................................................................................................... 41

7.1 Objetivo General ................................................................................................................. 41

7.2 Objetivos Específicos .......................................................................................................... 41

8. Metodología .............................................................................................................................. 42

8.1 Ubicación ............................................................................................................................ 42

8.2 Manipulación de Microorganismos de Referencia ............................................................. 42

8.3 Preparación del Inóculo ....................................................................................................... 43

8.3.1 Preparación de las Soluciones de los Polímeros Almidón Yuca - Alginato ................. 43

8.3.2 Encapsulación de Microorganismos en la Matriz de Alg-Almidón .. ¡Error! Marcador

no definido.

8.4 Pruebas de Viabilidad de las Matrices de Alginato-Almidón de Yuca Encapsuladas ........ 45

8.4.1 Prueba de la Forma y Tamaño ...................................................................................... 45

8.4.2 Determinación de la Concentración Microbiana Obtenida Después de la

Encapsulación ........................................................................................................................ 46

8.4.3 Evaluación de Viabilidad Mediante Exposición Luz Ultravioleta ............................... 46

8.4.3.1 Concentración Microbiana Viable Después de Exposición UV. ........................... 46

8.4.3.2 Evaluación de la Capacidad Promotora de Crecimiento Vegetal. ......................... 47

8.4.3.3 Prueba de Fijación de Nitrógeno. .......................................................................... 48

8.4.3.4. Prueba de Solubilizadores de Fosfato. .................................................................. 48

9. Resultados y Discusión ............................................................................................................. 49

9.1 Pruebas de Viabilidad de las Matrices de Alginato-Almidón de Yuca Encapsuladas ........ 49


9.1.1 Pruebas de la Forma y Peso de las Matrices ................................................................. 49

9.1.2 Recuento de la Concentracion Microbiana Obtenida por Perla Despues de la

Encapulación ......................................................................................................................... 57

9.2 Concentración Microbiana Viable Después de Exposición UV ......................................... 59

9.2.1 Crecimiento Microbiano Viable Después de Exposición UV ...................................... 59

9.3 Verificación de Forma Cualitativa la Capacidad Promotora del Crecimiento Vegetal ...... 62

9.3.1 Capacidad Fijadora de Nitrógeno ................................................................................. 62

9.3.2 Solubilizadores de Fosfato............................................................................................ 65

10. Conclusiones ........................................................................................................................... 68

11. Recomendaciones ................................................................................................................... 69

Referencias Bibliográficas ............................................................................................................ 70

Apéndices ...................................................................................................................................... 81


Lista de Figuras

Pág.

Figura 1. Estructura Química de la Amilosa y Amilopectina del Almidón .................................. 33

Figura 2. Recuperación de Microorganismos PGPM en Medio NBY Durante 6 Semanas en

Agitación Constante a 28°C. A) TSEBT 05-01 B) TSPHP 04-01 C). TSEBT 01-01 .................. 42

Figura 3. Encapsulación de Consorcio Microbiano PGPM Mediante la Técnica de Goteo en

Matriz Alginato-Almidón de Yuca. .............................................................................................. 45

Figura 4. Representación del Proceso para el Crecimiento de Microorganismos Viables

Encapsulados en la Matriz Alg-Almidón de Yuca ....................................................................... 47

Figura 5. Control positivo de Perlas Alginato-Almidón Comercial Almacenada a 4°C. ............. 50

Figura 6. Perlas de Alginato-Almidón de Yuca Almacenadas a 4°C. A) Alginato 1%-Almidón

5% B) Alginato 1%- Almidón 15% .............................................................................................. 50

Figura 7. Perlas de Alginato-Almidón de Yuca Almacenadas a 4°C. A) Perlas Alginato 1% -

Almidón 15% TSEBT 05-01. B) Perlas Alginato 1% -Almidón 5% TSEBT 05-0. C). Perlas Alg

1% -Almidón 15% TSEBT 01-01. D) ). Perlas Alginato 1% -Almidón 5% TSEBT 01-01 E).

Perlas Alginato 1% -Almidón 15% TSPHT 04-01. F) Perlas Alginato 1% -Almidón 5% TSPHT

04-01 ............................................................................................................................................. 51

Figura 8. Control Positivo del Medio Ashby. El Medio Presentó un Viraje a Color Azul Luego de

Agregar Dos Gotas de Azul de Bromotimol. ................................................................................ 62

Figura 9. Prueba de Viabilidad de las Bacterias PGPM Encapsuladas. A) Bacteria TSEBT 01-01

Encapsulada en Alginato 1%- Almidón 5% Almacenada a 4°C e Inoculada en Medio Ashby.

Trascurrido este Tiempo, se Agregaron Azul de Bromotimol, Realizando un Viraje a Color Azul.

B) Bacteria TSEBT 01-01 Encapsuladas en Matriz Alginato 1% -Almidón 15% Almacenadas a


4°C e Inoculadas en Medio Ashby Durante 48 horas. Trascurrido este Tiempo, se Agregaron

Gotas de Azul de Bromotimol. ..................................................................................................... 63

Figura 10. Prueba de Viabilidad de las Bacterias PGPM Encapsuladas. A) Bacteria TSEBT 05-

01 Encapsulada en Alginato 1%- Almidón 5% Almacenada a 4°C e Inoculada en Medio Ashby.

Trascurrido este Tiempo, se Agregaron Azul de Bromotimol Mostrando que no Hubo Cambio de

Color. B) TSEBT 05-01 05-01 Encapsuladas en Matriz Alginato 1% -Almidón 15%

Almacenadas a 4°C e Inoculadas en Medio Ashby Durante 48 Horas. Trascurrido este Tiempo,

se Agregaron Gotas de Azul de Bromotimol y no Mostro Ningún Cambio. ................................ 64

Figura 11. Prueba de Viabilidad del Hongo PGPM Encapsuladas. A) Hongo TSPHP 04-01

Encapsulada en Alginato 1%- Almidón 5% Almacenada a 4°C e Inoculada en Medio NBRIP.

Trascurrido este Tiempo. B) Hongo TSPHP 04-01 Encapsuladas en Matriz Alginato 1% -

Almidón 15% Almacenadas a 4°C e Inoculadas en Medio NBRIP Durante 48 Horas. Trascurrido

Este Tiempo, se Observó una Sedimentación en el Medio. .......................................................... 66


Lista de Tablas

Pág.

Tabla 1. Soluciones para la Preparación de la Matriz de Almidón- Alginato .............................. 44

Tabla 2. Contingencia de Frecuencias Absolutas de Perlas de TSEBT 01-01 en matriz Alginato-

Almidón Yuca Respecto a su Forma ............................................................................................ 52

Tabla 3. Contingencia de Frecuencias Absolutas de Perlas de TSEBT 01-01 en Matriz Alginato-

Almidón Yuca Respecto a su Tamaño .......................................................................................... 53





Tabla 6. Contingencia de Frecuencias Absolutas de Perlas de TSPHP 04-01 en Matriz Alginato-


Tabla 7. Contingencia de Frecuencias Absolutas de Perlas de TSPHP 04-01 en Matriz Alginato-


Tabla 8. Promedio del Recuento del Microorganismo Encapsulados en Matriz de Alginato-

Almidón Yuca ............................................................................................................................... 58

Tabla 9. Características Morfológicas de Microorganismos PGPM en Agar NBY Antes de Ser

Expuestos a UV y Características Morfológicas Después a Exposición UV ............................... 59

Tabla 10. Composición del medio NBY líquido .......................................................................... 81

Tabla 11. Composición del medio NBY sólido ............................................................................ 81

Tabla 12. Composición del medio Ashby líquido ........................................................................ 81

Tabla 13. Composición del medio NBRIP líquido. ...................................................................... 82


Tabla 14. Recuento del microorganismo encapsulados en matriz de alginato-Almidón yuca ..... 84


Lista de Apéndices

Pág.

Apéndice A. Preparación del medio NBY Liquido y sólido para los microorganismos

PGPM ............................................................................................................................................ 81

Apéndice B. Cálculos de la concentración de almidón de yuca y alginato para la

encapsulación de microorganismos .............................................................................................. 83

Apéndice C. Recuento de microorganismos viables después de la encapsulación en

Alginato-Almidón de yuca por cámara de neubauer .................................................................... 84


Resumen

Título

Encapsulación de un consorcio microbiano con actividad promotora de crecimiento

vegetal (PGPM) en una matriz de almidón de yuca y alginato.

Autor


Palabras Clave

Almidón de Yuca, alginato, Encapsulación, Actividad PGPM

Descripción

El uso de microorganismos promotores de crecimiento vegetal (PGPM) son la alternativa

actual para mejorar la producción agrícola. De esta manera, El objetivo de este trabajo de

investigación fue evaluar la encapsulación de un consorcio microbiano con actividad PGPM a

partir de alginato y almidón de yuca. Para tal fin, se realizó la encapsulación de las bacterias

TSEBT 01-01, TSEBT 05-01 y el hongo TSPHP 04-01 utilizando como material de soporte el

alginato a una concentración de 1% y el almidón de yuca variando su concentración ente 5 y

15%. Posteriormente, se realizaron pruebas de forma, tamaño y peso para establecer qué relación

de alginato y almidón de yuca les confería uniformidad a las perlas. Para establecer la cantidad

de microorganismos viables dentro de las perlas se realizó un conteo directo en cámara de

Neubauer. Finalmente, se sometieron los microorganismos encapsulados a luz UV durante 60

segundos para establecer si su morfología macroscópica y su actividad PGPM se veía afectada

por la radiación. Se encontró que la bacteria TSEBT 01-01 mantenía su actividad fijadora de

nitrógeno y el hongo TSPHP 04-01 su actividad solubilizadora de fosfato. De acuerdo con lo

anterior, se concluye que, el almidón de yuca a cualquier concentración permite la formación de


estructuras con el alginato, donde a una concentración de almidón de 15% no se evidencian

cambios de forma o tamaño mostrándose como una alternativa de protección para los

microorganismos evaluados.


Abstract

Title

Encapsulation of a microbial consortium with plant growth promoting activity (pgpm) in

a yucca and alginate starch matrix.

Author

Ingrid Sofia Amador Lamus

Key words

Yucca starch, Alginate, Encapsulation, PGPM Activity

Description

The use of microorganisms that promote plant growth are the current alternative for

optimization in crops with the potential to positively affect plant growth. In this way, the

objective of this research was to evaluate the encapsulation of a microbial consortium with plant

growth promoting activity from alginate and yucca starch. For this purpose, the encapsulation of

the bacteria TSEBT 01-01, TSEBT 05-01 and the fungus TSPHP 04-01 was carried out using

alginate at a concentration of 1% as support material and yucca starch varying its concentration

between 5 and 15%. Subsequently, shape, size and weight tests were carried out to establish

which ratio of alginate and yucca starch conferred uniformity to the pearls. To establish the

quantity of viable microorganisms within the beads, a count was performed using the neubauer

technique. Finally, the previously encapsulated microorganisms were subjected to UV light for

60 seconds to establish if their macroscopic morphology and their enzymatic capacities were

affected by radiation. The bacterium TSEBT 01-01 was found to maintain its nitrogen fixing

activity and the fungus TSPHP 04-01 its phosphate solubilizing activity. In accordance with the

above, it is concluded that yucca starch at any concentration allows the formation of structures


with alginate, where at a starch concentration of 15% no changes in its shape or size are

expected, conferring it to be a protective barrier. to microorganisms.


Introducción

Los bioinsumos de uso agrícola, se han convertido en una alternativa de producción para

el control de plagas, enfermedades y la mejora de fertilidad de los suelos generando una

agricultura sana y sostenible (Somoza, 2011, p.10-40). En Colombia para el año 2020 se

encontraron registradas 146 empresas de bioinsumos, el 75,5% son productoras y el 45,5% son

importadoras (Agropecuario, 2020, p.5). Se conoce que estas empresas se encuentran ubicadas

en Cundinamarca, Valle del cauca y Antioquia. De acuerdo con el ICA, el 46,7% de las empresas

ofrecen agentes biológicos para control de placas, el 26,7% es de inoculantes biológicos y el

26,6% de productos bioquímicos (Zambrano et ál, 2015, p.15). Los bioinsumos presentan un

potencial en la disminución de las moléculas del suelo afectadas (hierro, cobre, zinc, manganeso

y boro), limitando el efecto invernadero para el mejoramiento de la calidad del cultivo,

promoviendo el bajo costo (Asobiocol, 2019, p.9).

Actualmente, los bioinsumos presentan un potencial para la disminución en el impacto de

las moléculas químicas, produciendo una limitación en el efecto invernadero y el mejoramiento

de la calidad del producto, promoviendo la disminución de costos y acelerando el crecimiento de

los cultivos.

Los biofertilizantes de microorganismos PGPM minimizan notablemente el impacto

ambiental generado por los fertilizantes químicos, mejorando el rendimiento de los cultivos

(Almanza, et ál, 2018, p.52). Por medio de estas actividades de solubilización de fosfato,

fijadoras de nitrógeno y mecanismos indirectos PGPR han desarrollado inoculantes microbianos

que mejoran fisiológicamente los cultivos aumentando la biomasa y la resistencia a fitopatógenos

y el crecimiento rápido de los cultivos (Ahemand y Kibret, 2013, p.15).


Estudios han demostrado que la conservación microbiana se realiza mediante la

encapsulación con matrices poliméricas, las cuales ofrece protección contra el estrés ambiental,

aumenta la supervivencia y liberación de microorganismos en el suelo o semillas (Hernández, et

ál, 2011, p.6). Las características de un recubrimiento ideal para la encapsulación son: baja

viscosidad a altas concentraciones, máxima protección a condiciones adversas (luz, pH, oxígeno

y humedad) (Martin, y Gallardo, 2010, p.50). El alginato es un polisacárido aniónico, en la

encapsulación se usa en concentraciones de 0,5 a 4% para mayor seguridad a la capsula. El

almidón contiene alto contenido de amilosa formando películas fuertes, resistentes y con

gelificación rápida (Kailasapathy, 2003, p.48).

Por ello, este trabajo se enmarca en la encapsulación de un consorcio microbiano con

actividad promotora de crecimiento vegetal en una matriz de almidón de yuca y alginato. De esta

manera, se podrán aplicar futuras investigaciones en el ámbito de la biotecnología mejorando los

bioinsumos para cultivos agro-sostenibles.


1. Planteamiento del Problema

La producción agrícola tradicional se ha conocido por su poca tecnificación y uso de agro

insumos, fertilizantes y demás, por ello, se ha empezado a incorporar la agricultura moderna

donde la ciencia y tecnología es más eficiente ahorrando recursos y logrando una mejor

producción (Aristizabal, 2014, p.66). Los bioinsumos son una estrategia para esta agricultura

sostenible y sustentable, sin embargo, la diversidad de ellos es escasa debido a que la producción

o el desarrollo de estos productos pueden tardar entre cinco y diez años estudiando la diversidad

microbiana asociada a cada tipo de suelo garantizando su calidad (García, 2009, p.44).

El uso de insumos de síntesis química ha generado problemas globales, causando

agotamiento de la nutrición en el suelo; estos efectos adversos han generado la reducción en la

producción de cultivos y esto es causado por la baja diversidad de bioinsumos biológicos. La

amplia diversidad de microorganismos benéficos ha minimizado factores de riesgos y pérdidas

en cultivos de interés económico, aplicándose directamente a las semillas (Ballester, et ál, 2014).

Los consorcios microbianos tienen gran impacto ya que, pueden resistir mejor los

periodos de limitación de nutrientes debido a la diversidad metabólica disponible entre especies

(Lincheng, et ál, 2008, p.35). Además, se caracterizan por la utilización del recurso y la

adaptación a diferentes cambios ambientales. Por esta razón, para minimizar estos limitantes, se

han utilizado técnica de encapsulación en matrices poliméricas naturales (Birch, et ál, 2017,

p.40).

Un consorcio microbiano PGPM debe superar temperaturas, humedad, salinidad,

radiación UV y estrés hídrico del suelo. Un aspecto importante por destacar es que el inoculante

microbiano no pierda la actividad al ser transportado a campo. La encapsulación con polímeros


muestra efectos positivos y generan efectos como la protección de los microorganismos

aumentando la supervivencia y liberación de ellos en cultivos o suelos (Bashan, et ál, 2008).

Actualmente, el laboratorio de Agroecología de la UDES cuenta con un consorcio

microbiano con actividad PGPM (promotora de crecimiento vegetal) evaluado a nivel de

laboratorio, vivero y campo; mostrando efectos benéficos sobre los índices de desarrollo vegetal

en sacha inchi. Pese a lo anterior, no se cuenta con un soporte que permita la encapsulación de

estos microorganismos para ser utilizado como un bioinsumo. Por ello, debido a las cualidades

que presenta el almidón de yuca en su potencial de formación de películas biodegradables se

evaluó como un candidato para conformar una matriz con alginato, de tal forma que permitan la

formación de perlas las cuales mantengan la conservación, viabilidad y almacenamiento de dicho

consorcio con actividad PGPM.

Pregunta de Investigación: ¿Cómo se ve afectada la estabilidad y viabilidad de un

consorcio microbiano con actividad PGPM encapsulado en almidón de yuca y alginato?


2. Justificación

El impacto positivo generado por los biofertilizantes en la agricultura los últimos años es

ampliamente reconocido, ya que contiene microorganismos con actividad PGPM

(solubilizadores de fosfato, fijadores de nitrógeno y productores de sustancias indolicas

promotoras de crecimiento vegetal), los cuales reducen el uso de fertilizantes sintéticos, de tal

forma que mitigan el impacto ambiental, como la eutrofización, lluvia ácida, entre otros (Zhang,

2003, p.9). En Sinaloa, México en el 2010 fue el principal productor nacional de leguminosas en

el país, debido al uso de biofertilizantes, que mostraron la capacidad de sustituir la fertilización

convencional, pues este bioinsumo contaba con microorganismos capaces de fijar nitrógeno,

solubilizar fosfato y sintetizar sustancias reguladoras de fitohormonas (Basahan, et ál, 2014,

p.33).

La encapsulación de microorganismos como forma de inmovilización celular provee de

una protección frente a condiciones adversas del medio ambiente, el cual permite una alta

concentración celular permitiéndole estabilidad a los microorganismos. Uno de los métodos de

encapsulación de células más empleados, consiste en la utilización de medios poliméricos,

inorgánicos o una combinación de ambos, con el fin de lograr un sistema que sea asequible,

viable, estable y económico. (Wasi, et ál, 2013, p.185). Por ejemplo, en la India, se utilizan

microorganismos promotores de crecimiento (PGPM) promoviendo una agricultura sostenible,

sus estudios empezaron midiendo el impacto negativo que han ocasionado los agro insumos

sobre sus recursos naturales (Hernández, et ál, 2011, p.6). Estudios de Debasis et ál., (2019)

demostraron contribuciones en el desarrollo de bioinsumos a base de microorganismos PGPM

para diferentes cultivos agrícolas (Soya, maíz, tomate, fresa, trigo), obteniendo como resultado

un producto enfocado en la agrobiotecnología o nanotecnología en la formulación de bioinsumos


para la productividad de los cultivos agrícolas (p.45). Por otro lado, el almidón de yuca genera

gran interés al obtener características que permitan el desarrollo de materiales biodegradables

(plásticos) por su capacidad de gelificación, la cual permite moldearlo y así formar películas. Los

polisacáridos como el alginato y el almidón han mostrado beneficios en la obtención de matrices

de encapsulación de microorganismos. Normalmente, las matrices empleadas son perlas de

alginato de sodio, maltodextrinas y arroz; siendo el alginato uno de los principales polímeros

utilizados como soportes de inmovilización por su estabilidad, formación de biopelículas y de

gel, facilitando el almacenamiento y conservación de microorganismos (Chicaiza y Florez, 2016,

p.20). Por esto, es necesario que los microorganismos obtengan un soporte que evite su

exposición a condiciones adversas y se puedan vehiculizar de manera eficiente. Para ello, se

utilizaron técnicas de encapsulación mediante matrices poliméricas como lo es el almidón de

yuca y el alginato, los cuales, dado sus nutrientes pueden ser una fuente de energía para los

microorganismos manteniendo su viabilidad a través del tiempo. El desarrollo de este trabajo

contribuirá a fortalecer y enriquecer la línea de investigación en el área de la biotecnología.


3. Marco Teórico

3.1 Microorganismos Promotores de Crecimiento Vegetal (PGPM)

Los microorganismos promotores de crecimiento vegetal (PGPM), son bacterias, hongos,

levaduras y/o virus, que se encuentran en el suelo y que pueden incrementar el crecimiento y

productividad vegetal de forma directa o indirecta mediante una serie de mecanismos complejos

que interactúan entre sí para establecer relaciones benéficas entre estos y las raíces de las plantas

objetivo. Entre los microorganismos más conocidos están las especies pertenecientes a los

géneros Rhizobium, Pseudomonas, y Azospirillum. (de-Bashan et al., 2007; Birch, et ál, 2017

p.40).

3.1.1 Mecanismos para la Promoción de Crecimiento Vegetal Mediada por PGPM

Los mecanismos directos se relacionan con la producción de fitohormonas de tipo auxinas

y giberelinas o la regulación de la producción de hormonas por parte de la planta (Puente, et ál,

2010, p.116). Entre los microorganismos más utilizados se encuentra Pseudomonas fluorescens,

que estimula el crecimiento de la plata mediante la producción de antibióticos, evitando

enfermedades en cultivos por otras bacterias y hongos, a su vez acelera la germinación de las

semillas y el crecimiento de las plantas por la síntesis de hormonas, como auxinas y citoquininas

(Jime, et ál, 2012, p.13). En los hongos generalmente se encuentran diferentes especies de

Trichoderma spp, para el control de hongos fitopatógenos del suelo, principalmente de

Colletotrichum spp, Pythium y Fusarium entre otros., además tienen efecto promotor de

crecimiento por la producción de fitohormonas y solubilización del fosfato (Almanza, et ál,

2018, p.52).


Otro tipo de mecanismos directos de los PGPM permiten la supresión de hormonas de

estrés como el etileno, la mejora de consumo de agua, nutrientes mediante la fijación de

nitrógeno y la solubilización de fosfato (Perez, et ál, 2017, p.10).

Por otra parte, los PGPM también protegen las plantas de patógenos mediante

mecanismos de acción indirecta, tales como: la inducción de la resistencia sistémica a

fitopatógenos, el control biológico de enfermedades, la producción de antibióticos y de

sideróforos (Voinnet, 2005; rao et al., (2000); Ahemand y Kibret, 2013, p.15).

Según Weert et al, (2003) los PGPM son de importancia, previniendo la marchitez y aumentando

el contenido mineral de los productos agrícolas (Fe, Zn, y Se). El beneficio fundamental es que

el uso de este tipo de microorganismos influye en la biodisponibilidad de nutrientes para los

cultivos mediante la solubilización, quelación, fijación y reacción óxido- reducción en el suelo,

así mismo, aliviar los efectos negativos del CO2 elevado, estrés por calor y salinidad (Abhilash,

et ál, 2016, p.11).

Los microorganismos que colonizan la rizosfera pueden clasificarse según sus efectos

sobre las plantas y la forma en que interactúan con las raíces. Teniendo en cuenta que las

bacterias son el grupo más abundante en el suelo y que su facilidad para adquirir recursos son

importantes para favorecer el crecimiento y desarrollo de la planta objetivo (Timmusk, et ál,

2011, p.6)., se realizará una revisión de forma específica en el campo de las bacterias promotoras

de crecimiento vegetal (PGPB).

3.1.1.1 Bacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal. Las bacterias que pueden

promover el crecimiento de las plantas, es decir, (PGPB) incluyen aquellas que son de vida libre,

aquellas que forman relaciones simbióticas específicas con las plantas (por

ejemplo, Rhizobia spp. Y Frankia spp.), Endófitos bacterianos que pueden colonizar una parte o


una porción de los tejidos del interior de una planta y cianobacterias (antes llamadas algas verde

azuladas) (Galaviz, 2015, p.44). Las PGPB pueden promover el crecimiento de las plantas

directamente, ya sea facilitando la adquisición de recursos o modulando los niveles de hormonas

vegetales, o indirectamente disminuyendo los efectos inhibidores de varios agentes patógenos

sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas, es decir, actuando como bacterias de control

biológico (Peñin, 2017,p.5-30).

En los últimos años, el número de PGPR que se han identificado ha experimentado un

gran aumento, principalmente porque el papel de la rizosfera como ecosistema ha ganado

importancia en el funcionamiento de la biosfera. Se ha informado que varias especies de

bacterias como Pseudomonas, Azospirillum, Azotobacter, Klebsiella, Enterobacter, Alcaligenes,

Arthrobacter, Burkholderia, Bacillus y Serratia mejoran el crecimiento de las plantas (Kloeper et

al., 2008; Patra et al., 2007). Hay varios inoculantes de PGPR comercializados actualmente que

parecen promover el crecimiento a través de al menos un mecanismo; supresión de enfermedades

de las plantas (denominadas bioprotectores), mejora de la adquisición de nutrientes

(biofertilizantes) o producción de fitohormonas (bioestimulantes) (Sánchez, 2008, p.66-70).

3.1.1.2 Rizobacterias Solubilizadores de Fosfato. A pesar de que la cantidad de fósforo

en el suelo es generalmente bastante alta (a menudo entre 400 y 1200 mg kg -1 de suelo), la

mayor parte de este fósforo es insoluble y, por lo tanto, no está disponible para apoyar el

crecimiento de las plantas (Podile y Kshore, 2010, p.8-11). La limitada biodisponibilidad del

fósforo del suelo, combinada con el hecho de que este elemento es esencial para el crecimiento

de las plantas, significa que la incapacidad de obtener suficiente fósforo a menudo limita el

crecimiento de las plantas (Perez, et ál, 2017, p.10). Por lo tanto, la solubilización y

mineralización del fósforo por bacterias solubilizadores de fosfato es un rasgo importante en


PGPB y dentro de este grupo destacan especies de los géneros Bacillus spp, enterobacter spp y

pseudomonas spp (Sharma, et ál, 2013, p.18).

Típicamente, la solubilización del fósforo inorgánico ocurre como consecuencia de la

acción de ácidos orgánicos de bajo peso molecular como el ácido glucónico y cítrico, ambos

sintetizados por diversas bacterias del suelo (Rodríguez et al., (2009); González et al., (2004).

Por otro lado, la mineralización del fósforo orgánico ocurre a través de la síntesis de una

variedad de fosfatasas diferentes, catalizando la hidrólisis de ésteres fosfóricos (Rodríguez et al.,

2009). Es importante destacar que la solubilización de fosfato y la mineralización pueden

coexistir en la misma cepa bacteriana (Tao et al., 2008).

3.1.1.3 Rizobacterias Fijadoras de Nitrógeno. La fijación biológica de nitrógeno (N2)

es esencial para las moléculas presentes en los organismos. El nitrógeno atmosférico es

convertido en formas asimilables para que las plantas mediante el proceso de fijación biológica

de nitrógeno donde las bacterias transforman el nitrógeno en amonio y se fijan por un complejo

enzimático llamado nitrogenasas (Hoffman, et ál, 2014, p.40-41). La fijación biológica del

nitrógeno es llevada a cabo por bacterias diazotroficas, un 80% de la fijación es llevada a cabo

por asociaciones simbióticas específicas con leguminosas. Los principales géneros de

rizobacterias fijadoras de N2 son: Klebsiella, Paenibacillus, Pantoe, Pseudomonas, Rhodobacter

y Stenotrophomonas (Perez, et ál, 2017, p.10).

3.1.1.4 Rizobacterias Productoras de Fitorreguladores. Las hormonas vegetales

juegan un papel clave en el crecimiento y desarrollo de las plantas y en la respuesta de las

plantas a su entorno (Bautista y Gallardo, 2008, p. 60). Además, durante su vida, una planta a

menudo se somete a una serie de tensiones no letales que pueden limitar su crecimiento hasta

que se elimine el estrés o la planta pueda ajustar su metabolismo para superar los efectos del


estrés (Glick, 2012, p. 4-10). Cuando las plantas encuentran condiciones ambientales que limitan

el crecimiento, a menudo intentan ajustar los niveles de sus fitohormonas endógenas para

disminuir los efectos negativos de los factores ambientales estresantes (Glick, 2012, p. 4-10). Si

bien esta estrategia a veces tiene éxito, los microorganismos de la rizosfera también pueden

producir o modular fitohormonas en condiciones in vitro (Maheswari, 2011, p.7) de modo que

muchas PGPB pueden alterar los niveles de fitohormonas y, por lo tanto, afectar el equilibrio

hormonal de la planta y su respuesta al estrés.

Varios estudios han demostrado que muchas bacterias del suelo en general, y PGPB en

particular, pueden producir citoquininas, giberelinas o ácido indolacético (Maheswari, 2011,

p.7). Así, por ejemplo, se han detectado alguna de estas hormonas en el medio libre de células

de algunas cepas de Azotobacter spp., Rhizobium spp., Pantoea agglomerans , Rhodospirillum

rubrum , Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis y Paenibacillus polymyxa (Ramírez, et ál,

2009, p.1).

3.2 Producción de Inoculantes Microbianos

La formulación microbiana contiene una o más cepas bacterianas benéficas en una matriz

de transporte la cual puede ser orgánica, inorgánica o sintética a partir de moléculas definidas

(Pandey y Maheshwari, 2007, p.53). Estas matrices deben garantizar un alto número de células

presentes, asegurando su viabilidad y estabilidad fisiológica microbiana en el medio ambiente y

en el inoculo presente (Ramirez, et ál, 2014, p.3). En este contexto, se debe garantizar que la

formulación y producción comercial de bioinoculante cumplan con la integración de parámetros

físicos, químicos y biológicos que permitan la supervivencia de los microorganismos a través del

tiempo en diferentes condiciones medioambientales (Vanegas, et ál, 2012, p.55-67).


Estos inoculantes presentan ventajas, pueden almacenarse a temperatura ambiente por

periodos prolongados, ofreciendo una calidad constante y un mejor ambiente para la

sobrevivencia de los microorganismos donde pueden ser fácilmente manipulados (Bashan, et ál,

2008, p.23).

3.2.1 Técnicas de Inmovilización

Existe gran variedad de metodologías de encapsulación de microorganismos aplicables a

diversos campos (medicina, industria alimentaria, industria farmacéutica, agricultura, cosmética,

entre otros) con diferentes materiales como soportes de inmovilización. Los métodos más

utilizados para estos microorganismos son: i) emulsión, ii) desecación por atomización, iii)

liofilización, y iv) extrusión o goteo (Aguilera, et ál, 2011, p.84).

3.2.2 Encapsulación de Microorganismos

La encapsulación se define como el proceso fisicoquímico en el cual los

microorganismos quedan atrapados en una membrana semipermeable, produciendo una cápsula

con un diámetro pequeño, donde los mismos flotan libremente sin afectar su actividad biológica

(Medina y Huertas, 2012, p.90-95). Así mismo, la encapsulación en un proceso aplicado para

proteger, mediante un material de recubrimiento o material pared la estabilidad,

biodisponibilidad y conservación de los componentes bioactivos y la viabilidad de

microorganismos (Lupo, et al, 2012, p.130). Para la selección de una adecuada matriz polimérica

se debe tener en cuenta aspectos como costos, propiedades fisicoquímicas como la solubilidad,

peso molecular, difusividad, formación de películas, propiedades emulsionantes y capacidad para

formar una barrera entre el interior de la capsula y sus alrededores (Rodríguez y Rojas, 2016,

p.15).


Los materiales de recubrimiento más empleados en la encapsulación de microorganismos

son los lípidos, polisacáridos (almidón y sus derivados amilosa, celulosa y dextrinas

maltodextrinas), extractos de plantas, proteínas como el suero lácteo y alginatos. Se conoce, que

los polisacáridos presentan una alta facilidad para formar macropartículas esféricas (Da Silva, et

al, 2015, p.67).

El método de encapsulación se realiza para inmovilizar microorganismos, los polímeros

han sido uno de los experimentos de laboratorio más utilizados en la industria farmacéutica,

química, cosmética y alimentaria (Jiménez L, et al, 2014, p.1-28). Dentro de los polímeros

empleados, se destaca el uso de alginato, ya que ha sido objeto de diversos estudios, debido a

que, el alginato proporciona un entorno amigable para las células inmovilizadas (Jen, et al,

1998). La matriz del alginato brinda protección ante los cambios físicos-químicos y la radiación

UV (Agustín, et al, 2002, p.53). Además, el almidón es un polímero de importancia, porque es

empleado en estas técnicas asegurando la viabilidad de la población de microorganismos

inmovilizados ofreciendo una superficie ideal para la adherencia de ellos durante la metodología

(Kumar y Harjinder, 2007, p.18).

3.2.3 Método de Extrusión o Goteo

La extrusión consiste en producir pequeñas gotas de material que se quiere encapsular

por medio de una jeringa o de una boquilla en los dispositivos generadores de goteo. Para ello,

los microorganismos son adicionados en una solución hidrocoloide y la mezcla se hace gotear

sobre una solución de endurecimiento. El tamaño de las perlas obtenidas suele ser de 2 a 4 mm y

este depende del diámetro de salida de la solución, entre menos sea el diámetro de la jeringa,

menor será su tamaño (Spasojevic, et ál, 2010, p.292). Esta técnica es apropiada para la

encapsulación de microorganismos ya que, no es agresiva y no se emplean disolventes


perjudiciales para las bacterias y hongos a inmovilizar, además, se puede llevar a cabo en

condiciones aerobias como anaerobias (Chandramouli, et ál, 2005. P.56).

3.3 Matrices Poliméricas Orgánicas

La inmovilización de microorganismos se realiza por medio de matrices poliméricas

orgánicas e inorgánicas. Los polímeros orgánicos se dividen en dos categorías: polímeros

naturales y sintéticos (Cohen, 2002, p.9). En este estudio, las matrices a utilizar son de polímeros

naturales agarosa y almidón. Se conoce que estos materiales tienen mayor adsorción, adhesión y

biodegradación en comparación a los materiales inorgánicos y esto se debe a la presencia de

diferentes grupos de reacción, como lo son el carboxilo, amonio, hidroxilo, entre otros., que se

encuentran en la superficie de los materiales orgánicos (Lincheng, et ál, 2008, p.28-35).

3.3.1 Alginato

El alginato es un polisacárido abundante presente en las algas marinas, comprenden hasta

un 40% de su peso seco y también pueden ser producidos por bacterias no patógenas y fijadoras

de nitrógeno como Azotobacter vineladii (Hernandez, et ál, 2012, p.6). Son macromoléculas

formadas por la unión de monómeros de tipo orgánico siendo derivados del ácido orgánico. Los

alginatos son una familia de polisacáridos lineales, contienen ácido β-D manurónico (1,4-enlace

ácido β-D-mano piranosilurónico) y ácido α-L-gulurónico (G: 1,4-nlace ácido α-L-

gulopiranosilurónico) (Lupo, et ál, 2012, p.130). Su composición (dada por la relación

característica manurónico/gulurónico M/G) y secuencias varían dependiendo de la fuente de la

cual proviene el polisacárido. Este polímero debe su carácter poli aniónico a los grupos

carboxilos que aparecen a lo largo de la cadena. La composición y extensión de las secuencias y

el peso molecular determinan las propiedades físicas de los alginatos (Lupo, et ál, 2012, p.130).


Entre las propiedades más importantes del alginato es la capacidad viscosa y gelificante,

siendo estas sus propiedades más atractivas en el mercado (Vos, et ál, 2014,p.20). El alginato al

utilizarlo como inmovilizante aumenta la velocidad de los procesos catalíticos en el interior de

las células, pero una de las desventajas, es que el sistema se vuelve vulnerable a diversos factores

tales como la agitación constante o las altas temperaturas (Rodrigo, et ál, 2012, p.1).

El proceso de microencapsulación con alginato se lleva a cabo a través de dos

mecanismos de gelificación iónica: la gelificación externa y la gelificación interna, dependiendo

de la concentración de cloruro de calcio (Rokka y Rantamaki, 2010, p.231). Para la preparación

de microcápsulas de alginato de calcio con aplicaciones alimentarias, se tienen las técnicas por

extrusión, en emulsión y secado por atomización. Aunque el secado por atomización ha sido para

la industria un proceso práctico y económico, su aplicación con alginato se ha visto limitada por

la viscosidad y velocidad de gelificación. Por el contrario, la técnica por extrusión ha sido la

técnica tradicional empleada en las últimas décadas, debido a la uniformidad de las

microcápsulas en su forma y tamaño (Oliveira, 2003, p.6-59).

3.3.2 Almidón

El almidón es un polisacárido que consiste en unidades de glucosa unidas por enlaces

glucosídicos. Principalmente se compone de amilosa, polímero lineal formado por moléculas de

D-glucopiranosa unidas por enlaces de α-1-4 y amilopectina, un polímero ramificado de glucosa

en el cual las moléculas se unen por medio de enlaces glucosídicos 1-4 en su porción rectas y

enlaces 1-6 en sus ramificaciones. La amilosa y la amilopectina permite determinar la absorción

y retención de agua y su capacidad de formación de geles (Amorós, 2013, p.20).

En la actualidad, los almidones se modifican con un fin específico, utilizándolo como

encapsulante de sabores volátiles, vitaminas, especias y aceites de alto peso molecular. Esta clase


de almidones modificados son resistentes a la oxidación evitando problemas de colores

indeseables, aromas y sabores inaceptables (Villacrez, 2013, p.25-85).

3.3.2.1 Almidón de Yuca. Es un polisacárido natural, obtenido de la raíz de la yuca.

Este almidón se clasifica como agrio y nativo (dulce). En los gránulos de almidón de yuca, su

tamaño puede variar entre 5 a 35 micrómetros, conteniendo un 17% de amilosa (Figura 1)

(Trujillo, 2014, p.5-16).

Una de las principales propiedades del almidón es su semi cristalinidad, donde la

amilopectina es el componente dominante de la cristalización en la mayoría de los almidones.

La proporción cristalina está compuesta por estructuras de doble hélice formadas por puentes de

hidrogeno entre los grupos hidroxilo en las cadenas lineales de la molécula de amilopectina

unidas con proporciones de amilosa (Aristizabal y Sánchez, 2013, p.50-62).

Figura 1.

Estructura Química de la Amilosa y Amilopectina del Almidón

Nota. Ramificaciones químicas del almidón comercial determinando la estructura de la amilosa y amilopectina

presente. Adaptado de Universitat de les Illes Balears, Modulo 6. Por Cortes y colaboradores, 2010


Los gránulos de almidón son insolubles en agua fría, se rompe sus membranas al ser

molidos, estos gránulos cambian su forma en agua y forman un gel. El almidón tiene un 20% de

solubilidad en el agua, la cual es la amilosa y un 80% de insolubilidad, conocida como

amilopectina. Ellas están constituidas por unidades de D- (+)-glucosa (Bertolini, 2010, p.21-53).

3.3.2.1.1 Gelatinización. Los polímeros del almidón forman gránulos gelatinizados

donde se incrementan la rigidez entre y dentro de los gránulos hinchados. La amilosa

normalmente gelifica fuera del granulo después de la gelatinización, la amilopectina permanece

dentro del gránulo hinchado donde se cristaliza y forman una matriz (Draget, 2000, p.279-395).

El almidón varía en su textura y viscosidad partir de las temperaturas a las cuales están

sometidas. El gel se forma en función del contenido de amilosa ya que, está presente en un 80%

en el almidón (Martínez, 2007, p.6-69).

3.3.2.1.2 Polímeros Biodegradables. Un polímero biodegradable se define como aquel

que puede ser degradado completamente por el medio ambiente, reduciendo así el impacto

ambiental que estos materiales producen. Por lo tanto, de acuerdo con esta definición, lo que

procura este tipo de material es que cuando se deseche al final de su vida útil, se genere una

transformación en su estructura molecular y por lo tanto sus propiedades físicas y químicas,

debido a la influencia de agentes ambientales. Así, el polímero es transformado en sustancias

simples o en componentes menores como agua, dióxido de carbono y biomasa que finalmente se

asimilan al medio ambiente (Armellín, 2002. p.9-11).

El almidón ha sido mezclado con polímeros sintéticos biodegradables como el ácido poli

láctico y la polica-prolactona donde el almidón incrementa la biodegradabilidad de la mezcla,

pero disminuye las propiedades mecánicas (Ruiz, 2005, p.1-25). Las mezclas obtenidas son

también heterogéneas (Seppala, et ál, 2001, p.6). Los polímeros biodegradables están expuestos


fácilmente a la acción de microorganismos, para contener sus funciones corporales en cadenas

alifáticas, carbonilos, esteres y demás. Estas acciones dependen de las condiciones del medio

(Franchetti y Marconato, 2006, p.811-816).


4. Marco Referencial

La formulación de nuevas matrices para la encapsulación de microorganismos ha

permitido desarrollar metodologías encaminadas a mejorar los procesos en industriales, así que

Singh y Anar, 2007 a partir de galeno al 0,75% jamilano y xantano al 1% desarrollaron un

soporte que confirió protección a microorganismos probióticos en condiciones extremas como

las gastrointestinales; bajo esas concentraciones se observó protección a los microorganismos

frente a acondiciones gastrointestinales. Las propiedades probióticas analizadas no se afectaron,

protegiendo la producción de peróxido de hidrogeno de la bacteria Lactobacillus rhamnosus.

(Jiménez L. , 2014, p.1-28).

Amorós (2013) evaluó el efecto del almidón en la viabilidad gastrointestinal de

lactobacillus acidophilus, en una matriz de alginato al 1% y almidón al 1,25% y 4,5% utilizando

la técnica de extrusión, donde observaron eficacia de las microcápsulas obtenidas y la viabilidad

de las células al ser sometidas a condiciones gástricas e intestinales (p.20). El efecto positivo de

la matriz polimérica de almidón en concentración mayores a 2% porque a medida que aumenta la

proporción las esferas se vuelven más regulares y rígidas y el microorganismo no pierde su

potencial como un probiótico.

Mollaei et al., (2010) Inmovilizó Pseudomona spp. Aislada de un sitio de contaminación

farmacéutica, en matrices orgánicas individuales y compuestas para mejorar la degradación del

fenol con este microorganismo. La inmovilización en matrices orgánicas individuales consistió

en variar concentraciones de alginato (2-4%) y pectina (3-5%), mientras en las matrices

orgánicas compuestas fue de polivinil alcohol (PVA-alginato) y alginato, alginato y glicerol y

alginato-quitosano-alginato (ACA). Los resultados obtenidos encontraron que la degradación por

células libres para las primeras concentraciones fue de 500 y 700 mg. L-1 al trascurrir 20 y 30


horas de incubación, sin embargo, cuando la concentración inicial aumento a 1000 mg. L-1 la

degradación completa duró 84 horas. Por otro lado, la inmovilización redujo un 65% del tiempo

por la degradación por células inmovilizadas en perlas de alginato (3%), en perlas compuestas de

PVA-alginato y en perlas de ACA comparadas a las células encapsuladas libremente. Para

evaluar la estabilidad y viabilidad de la cepa encapsulada, se realizaron ensayos utilizando las

perlas en cultivos discontinuos, encontrando que para una mejor concentración inicial de 1000

mg. L-1, donde en la biodegradación las perlas de PVA-alginato se pueden utilizar hasta 15 ciclos

de inmovilización.

El estudio realizado por Jiménez C., (2011), evaluó la encapsulación y viabilidad de

Lactobacillus paracasei en una matriz de alginato-almidón usando como método de

encapsulación aspersión y encapsulación por coacervación con el fin de comparar los métodos;

las perlas se sometieron a un secado por medio de lecho fluidizado durante 30 minutos para la

encapsulación por aspersión. Trascurrido cada 5 minutos se tomaban muestras para medir la

pérdida de su viabilidad, los cambios fisicoquímicos, físicos y la textura que presentaron las

capsulas durante el secado, posteriormente, se realizó la misma metodología por la encapsulación

por coacervación, donde se sometieron a una digestión gástrica in vitro y se evaluaron durante 6

semanas. Transcurrido este tiempo, se obtuvo una viabilidad de 2.4 x108 UFC/g y el método de

coacervación se obtuvo una viabilidad de 2,4 x109 UFC/g. Los dos métodos de encapsulación

mostraron diferencias significativas en su propiedad de flujo y textura, ya que, las capsulas

obtenidas por el método de aspersión por pistola fueron menos duras y por lo tanto presentaron

menor fuerza a la hora de ser digeridas.

Gonzales et al., (2015) estudio la viabilidad durante el almacenamiento de Weissella spp.

incorporada en una matriz de cobertura de chocolate. La bacteria probiótica se encapsuló en tres


materiales diferentes de pared: Aloe vera, gel de aloe vera-Almidón al 10% y gel de Aloe vera-

Almidón al 15% y células libres como control. Posteriormente se liofilizó y las bacterias

encapsuladas se recubrieron en una matriz de chocolate. Los chips se almacenaron durante 5

semanas a 4°C, cada semana evaluó los cambios de la viabilidad de la bacteria probiótica y su

actividad de agua. En la semana 5, los chips de chocolate se sometieron a condiciones simuladas

de jugos intestinales. Durante el almacenamiento se mantuvo su carácter probiótico de >108

UFC/g, sin embargo, cuando la bacteria se encapsulo en aloe vera-almidón mantuvo un 2,1 x 108

UFC/g de bacterias vivas. La actividad de agua vario entre 0,470 a 0,810. La incorporación de

Weisella spp. encapsulada y libre a una matriz de cobertura de chocolate presenta resistencia al

medio intestinal, siendo los tratamientos Aloe Vera (AV) y Ale vera-almidón (AA15%) los que

presentan menor perdida de viabilidad.


5. Marco Legal

El Ministerio de Salud de la República de Colombia establece parámetros para los

laboratorios de investigación, que se rigen por la resolución N° 008430 de 1993 expedida el 4 de

octubre de 1993, donde establece las normas científicas, técnicas y administrativas. Esta

investigación tuvo en cuenta el Título IV de la bioseguridad de las investigaciones, Capítulo I de

la investigación con microorganismos patógenos o material biológico que pueda contenerlos.

Principalmente, en sus artículos 63-66 y 71 en donde se dispone la normatividad para el manejo

de estos microorganismos. Las bacterias que se usaron en este estudio hacen parte del grupo de

riesgo II (riesgo moderado individual y riesgo comunitario limitado). En cuanto a la

manipulación de estas bacterias y el hongo, el artículo 68 dispone que deben procesarse en

laboratorios básicos de microbiología empleando gabinetes de seguridad cuando se considere

necesario (Ministerio de protección social.

Cabe resaltar que esta investigación no fue realizada en seres humanos y evitó

considerablemente causar daños al ambiente y este proyecto se realizó con fines investigativos,

rigiéndonos de acuerdo con las medidas de bioseguridad implementadas por los laboratorios de

la Universidad de Santander, UDES. Los microorganismos utilizados no son patógenos y estos

fueron suministrados por el laboratorio de Agroecología, UDES.


6. Hipótesis

Hipótesis de Investigación. La estabilidad y la viabilidad del consorcio microbiano con

actividad PGPM depende de las condiciones de preparación de la matriz de almidón de yuca.

Hipótesis Nula. La estabilidad y la viabilidad del consorcio microbiano con actividad

PGPM no depende de las condiciones de preparación de la matriz de almidón de yuca.


7. Objetivos

7.1 Objetivo General

Evaluar la encapsulación de un consorcio microbiano con actividad promotora de

crecimiento vegetal a partir del almidón de yuca.

7.2 Objetivos Específicos

Evaluar el desarrollo de una matriz de almidón de yuca para encapsulación de

microorganismos PGPM.

Determinar la viabilidad y estabilidad del consorcio microbiano encapsulado a

diferentes concentraciones de la matriz de almidón de yuca.


8. Metodología

8.1 Ubicación

La multiplicación de los microorganismos, el desarrollo un prototipo para la

encapsulación del consorcio microbiano con actividad PGPM y la evaluación de la actividad de

estos, se llevó a cabo en el laboratorio de Agroecología y el laboratorio de Biotecnología y

Bioprocesos de la Universidad de Santander.

8.2 Manipulación de Microorganismos de Referencia

Se empleó microorganismos PGPM denominados TSEBT 05-01 TSEBT 01-01 (bacterias

solubilizadores de nitrógeno) y TSPHT 04-01 (hongo, solubilizadora de fosfato) aisladas y

caracterizadas por el programa de Microbiología Industrial los cuales conforman el consorcio

microbiano. Los microorganismos se encontraban en estado de crioconservación. Para su

activación, se utilizó el protocolo de Hernández, Acevedo y Agualimpia (2016) cada de cada

microorganismo se utilizó 108 UFC/mL para las bacterias y para el hongo 107 UFC/mL en caldo

NBY a 27 °C a 90 rpm durante 6 semanas. Mientras aumentaba la concentración microbiana del

microorganismo, cada 2 días se agregaba 5 mL de caldo NBY para su multiplicación (Figura 2).

8.3 Preparación del Inóculo

Se inocularon 10 mL a una concentración de 108 UFC/mL para las bacterias y para el

hongo 107 UFC/mL (TSEBT 05-01, TSPHP 04-01, TSEBT 01-01) en 90 mL de medio liquido

NBY fresco. Los medios se llevaron a incubación durante 72 horas a 28°C con agitación

constante (90 rpm). Pasado el tiempo de incubación se tomó un inoculo de 10 mL de cada

microorganismo, se centrifugó durante 5 minutos a 10000 rpm, se descartó el sobrenadante y se

volvió a centrifugar durante 2 minutos a 10000 rpm. Posteriormente, se tomaron 3,3 mL del

pellet obtenido construyendo la biomasa destinada para la encapsulación (Hernández et al, 2016).


Figura 2.

Recuperación de Microorganismos PGPM en Medio NBY

A. B. C.

Nota. Microorganismos durante 6 semanas en agitación constante a 28ºC en caldo NBY con cada una de las cepas de

referencia para la encapsulación microbiana A) TSEBT 05-01 B) TSPHP 04-01 C). TSEBT 01-01

8.3 Preparación del Inóculo

Se inocularon 10 mL a una concentración de 108 UFC/mL para las bacterias y para el

hongo 107 UFC/mL (TSEBT 05-01, TSPHP 04-01, TSEBT 01-01) en 90 mL de medio liquido

NBY fresco. Los medios se llevaron a incubación durante 72 horas a 28°C con agitación

constante (90 rpm). Pasado el tiempo de incubación se tomó un inoculo de 10 mL de cada

microorganismo, se centrifugó durante 5 minutos a 10000 rpm, se descartó el sobrenadante y se

volvió a centrifugar durante 2 minutos a 10000 rpm. Posteriormente, se tomaron 3,3 mL del

pellet obtenido construyendo la biomasa destinada para la encapsulación (Hernández et al, 2016).

8.3.1 Preparación de las Soluciones de los Polímeros Almidón Yuca - Alginato

Se realizaron soluciones stock de Alginato al 4% y almidón de yuca al 30% almacenadas

a temperatura ambiente hasta su uso para establecer la relación de las matrices respecto a la

estabilidad de los microorganismos dentro de la matriz. Se realizaron controles positivos con


Almidón comercial. En tal sentido, se preparó un volumen final de 10 mL de solución con las

siguientes relaciones utilizando cálculo matemático (apéndice 2), se utilizaron matrices de

Alginato 1%- almidón 5% y Alginato al 1% - Almidón de yuca al 15%. Así mismo, se tomó un

volumen de 3,3 ml correspondiente a cada microorganismo y cada polímero para su posterior

encapsulación (Tabla 1).

8.3.2 Encapsulación de Microorganismos en la Matriz de Alg-Almidón

Para la preparación de las perlas, cada una de las soluciones de Alginato-Almidón de

yuca fue goteada sobre una solución de cloruro de calcio (CaCl2) al 1,5 M, empleando una

jeringa hipodérmica de 10 mL y realizando el procedimiento de manera constante. La solución se

dejó en agitación constante a 110 rpm durante 30 minutos con el fin de lograr el

entrecruzamiento total del alginato por acción del CaCl2 permitiendo la formación de las perlas.

Posteriormente, se realizó un lavado con agua destilada para eliminar el exceso de las soluciones

de CaCl2. Las perlas obtenidas se almacenaron en viales estériles a 4 °C hasta su uso

(Krishnamoorthi, et al, 2015, p.104).

Tabla 1.

Soluciones para la Preparación de la Matriz de Almidón- Alginato

Relaciones Almidón- Alginato

Matiz mL por utilizar (%m) Stock

Almidón Yuca 3,3 mL 5%

15%

30%

Almidón Comercial 3,3 mL 5% 15%

Alginato 3,3 mL 1% 4%

Microorganismos 3,3 mL - -

Nota: Concentraciones utilizadas para las matrices de Almidón de yuca, Almidón comercial y Alginato, el (%m) es

el Porcentaje a masa a utilizar de cada polímero; Stock: Solución madre en alto % de las matrices Alginato-Almidón

de yuca a preparar.


8.4 Pruebas de Viabilidad de las Matrices de Alginato-Almidón de Yuca Encapsuladas

Con el fin de establecer la relación de componentes que permitirán la conformación de

perlas, se emplearon las soluciones stock de la matriz de Alginato- almidón de yuca con

microorganismos (tabla 1), se realizaron dos pruebas en las cuales se evaluó la viabilidad

(PGPM) de los microorganismos encapsulados, la forma y el tamaño de las perlas.

Figura 3.

Encapsulación de Consorcio Microbiano PGPM Mediante la Técnica de Goteo en Matriz

Alginato-Almidón de Yuca.

Nota: Procedimiento de encpasulación con una jeringa de 10 mL mediante la tecnica de goteo con una jeringa en

solución de Cloruro de Calcio (CaCl2) a una concentración de 1 Molar con una matriz de Almidón de yuca y Alginato.

8.4.1 Prueba de la Forma y Tamaño

Se seleccionaron aleatoriamente 15 perlas de cada una de la matriz de Alginato 1% -

Almidón yuca al 5% y Alginato 1% -Almidón yuca al 5% previamente preparadas realizando

una comparación entre cada una de ellas por su forma y el tamaño que presentaron después de

ser almacenadas. Como criterio se realizó una matriz control de Alginato-Almidón en las cuales

presentaron homogeneidad en su forma, peso y tamaño en ensayos anteriores.


8.4.2 Determinación de la Concentración Microbiana Obtenida Después de la Encapsulación

Para determinar la concentración microbiana por perlas, se agregaron 5 perlas en viales

estériles con 5 mL de citrato de sodio al 5%. Los viales se agitaron en vórtex durante 2 minutos

para permitir la disolución de la matriz. Para realizar el recuento de microorganismos viables se

empleó el recuento en placa; a partir de cada una de las soluciones de citrato se prepararon una

serie de diluciones seriada en base 10 desde 10-1 hasta 10-4 tubos estériles con medio NBY.

Posteriormente, se sembraron en agar NBY y se incubaron a 28 °C por 24 horas. Transcurrido el

tiempo de incubación, se realizó el recuento de microorganismos, el cual, se realizó por la

técnica de una cámara de neubauer (Ramirez, et ál, 2018, p.4-8).

Finalmente, con el número de microorganismos viables en cada recuento, se expresó el

valor como Cel/perla y de esta manera se calculó el promedio de la cantidad microbiana presente

en las 5 perlas empleadas por microorganismo de la siguiente manera:

Partículas por μl volumen= 𝑷𝒂𝒓𝒕í𝒄𝒖𝒍𝒂𝒔 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒂𝒅𝒂𝒔

𝑺𝒖𝒑𝒆𝒓 𝒇.𝒄𝒐𝒏𝒕.(𝒎𝒎𝟐)∗𝒑𝒓𝒐𝒇𝒖𝒏𝒅𝒊𝒅𝒂𝒅 𝒄á𝒎𝒂𝒓𝒂 (𝒎𝒎)∗𝑭𝒂𝒄𝒕𝒐𝒓 𝒅𝒊𝒍𝒖𝒄𝒊ó𝒏

8.4.3 Evaluación de Viabilidad Mediante Exposición Luz Ultravioleta

Se tomaron 10 perlas de obtenidas de cada microorganismo encapsulado y se expuso a

luz ultravioleta con una intensidad mínima de 70 mW/cm2 durante 60 segundos. Pasado el

tiempo, se realizaron las siguientes pruebas de estabilidad para evaluar el efecto de luz UV sobre

la actividad PGPR de los microorganismos encapsulados.

8.4.3.1 Concentración Microbiana Viable Después de Exposición UV. Para realizar el

recuento de la concentración microbiana de los microorganismos después de la exposición UV se

repitió el protocolo de (Ramirez, et ál, 2018, p.4-8) se tomaron 5 perlas expuestas a la radiación

UV de cada microorganismo encapsulado agrandándole citrato de sodio al 5% por separado, se

dejó agitando en vórtex durante 2 minutos para permitir la disolución de la matriz,


posteriormente, se tomó un 1 mL de la perla disuelta y se sembraron en agar NBY por siembra

masiva; incubando a 28 °C por 24 horas (Figura 4) Transcurrido el tiempo de incubación, se

hicieron repiques en agar NBY en siembra por agotamiento para obtener colonias aisladas, del

crecimiento microbiano se realizó recuento macroscópico.

Figura 4.

Representación del Proceso para el Crecimiento de Microorganismos Viables Encapsulados en

la Matriz Alg-Almidón de Yuca

Nota: Procedimiento para diluir perlas obtenidas después realizar el protocolo establecido de encapsulación para las

diferentes concentraciones de almidón de yuca; posterior a ello, se realizarón siembras en agar NBY de cada una de

ella para evaluar su crecimiento microbiano.

8.4.3.2 Evaluación de la Capacidad Promotora de Crecimiento Vegetal. Las perlas

sometidas al proceso de la UV por 60 segundos fueron evaluadas de forma aséptica, utilizando

viales estériles. Esto para evaluar si los microorganismos encapsulados mantienen su actividad

promotora de crecimiento vegetal a través de 8 y 16 días. Cada una de las perlas pertenecientes a

cada bacteria y hongo fueron disueltas en citrato de sodio al 5% durante 2 minutos en vortex.


Seguidamente, fueron sembradas en caldo NBY e incubados durante 48 horas a 28°C, para luego

tomar una alícuota de 1 mL realizando pases sucesivos aumentando la carga microbiana para

luego evaluar su actividad solubilizadores de fosfatos y producción de sustancias indolicas.

8.4.3.3 Prueba de Fijación de Nitrógeno. Para determinar la capacidad de fijación de

nitrógeno se empleó el método propuesto por (Pérez, et ál, 2015, p.213-223). Se disolvieron 3

perlas Alginato-Almidón yuca de TSEBT 01-01 y TSBT 05-01 en 3 mL de citrato de sodio al

5%. Posterior a la disolución, se inoculo 1 mL en un vial con 9 mL de medio Ashby y se incubó

a 28°C por 72 horas. Pasado el tiempo de incubación, se agregaron 2 gotas de azul de

bromotimol. Se estableció que las bacterias que presentaron la capacidad de fijar nitrógeno

atmosférico fueron aquellas que lograron crecer en un medio libre de nitrógeno virando el medio

a color azul. Posterior a ello, se hicieron 2 repiques sucesivos en medio líquido, incubándolos a

28°C durante 48 horas evaluando la viabilidad a través del tiempo.

8.4.3.4. Prueba de Solubilizadores de Fosfato. Los microorganismos con capacidad de

solubilización de fosfato se valoran por la capacidad de producir hidrolisis en un medio

específico. Para evaluar la capacidad de solubilizar fosfato por parte del hongo TSPHP 04-01 se

adicionó 1 mL de la perla disuelta y se agregó en medio en National Botanical Research Institute

Phosphate (NBRIP) en viales estériles con 9 mL de medio líquido y se incubó a 28°C durante

una semana. Se consideraron microorganismos con capacidad de solubilizar fosfato aquellos que

formaron hidrolisis transparente alrededor del medio. Posterior a ello, se hicieron 2 repiques

sucesivos en medio líquido, incubándolos a 28°C durante 48 horas evaluando la viabilidad a

través del tiempo (Johnston y Raizada, 2011, p-1-9).


9. Resultados y Discusión

9.1 Pruebas de Viabilidad de las Matrices de Alginato-Almidón de Yuca Encapsuladas

Las mezclas de Alginato- Almidón de yuca evaluadas permitieron la conformación de las

perlas, la matriz Alginato 1%-Almidón de yuca al 5% y 15% después de estar en

almacenamiento a 4° C durante 8 días mostraron una viabilidad en la forma y tamaño de la perla

obtenida de esta matriz polimérica.

La temperatura de almacenamiento permitió preservar las perlas uniformes durante el

tiempo de conservación sin cambiar su estructura física (figura 6).

9.1.1 Pruebas de la Forma y Peso de las Matrices

En la preparación de estas matrices, se realizó junto a un control positivo con alginato 1%

y almidón comercial al 15% para evidenciar si las perlas mantenían la misma morfologías

regulares o irregulares con la matriz polimérica de almidón de yuca.

El control positivo nos determinó que todas las perlas seguían un patrón en la forma

según la concentración polimérica y la forma del goteo a la hora de realizar la encapsulación

(figura 5).

El peso de las perlas durante 8 días de almacenamiento mostró que para la mezcla de

alginato 1% - almidón 5 % se mantuvo en un rango de peso entre 0,008 a 0,011 gramos siendo

estas las perlas menos pesada (figura 6A). Las mezclas de alginato 1%- almidón 15% se

mantienen en un rango de 0,015 a 0,017 gramos considerando ser el peso mayor en las perlas

formadas (figura 6B). Se encontró que el peso de las perlas depende de la concentración de

almidón empleada, por esto, las perlas con almidón de yuca al 5% fueron las menos pesada en

comparación a las perlas con almidón de yuca al 15%.


Figura 5.

Control positivo de Perlas Alginato-Almidón Comercial Almacenada a 4°C.

Nota: Se observa perla formada como control positivo para la encapsulación de microorganismos en una matriz de

almidón comercil y alginato la cual fue almacenada a 4ªC hasta su uso.

Figura 6.

Perlas de Alginato-Almidón de Yuca Almacenadas a 4°C. A) Alginato 1%-Almidón 5% B)

Alginato 1%- Almidón 15%

A. B.

Nota: Perlas de Alginato- Almidón de yuca almacenadas a 4ºC durante 8 días donde posterior a este tiempo se

realizaron los diferentes ensayos metodologìcos para evaluar los microorganismos PGPM encapsulados.

Se evidencia que a mayor concentración del polímero las perlas estructuralmente son más

grandes, siendo esto uno de los parámetros más relevantes porque este puede influir en la

eficiencia de la encapsulación y la dispersión del polímero a la hora de realizar la perla. Se

considera que el tamaño y la forma de las perlas están influenciado por factores como la

concentración del almidón de yuca y el tamaño del poro de la jeringa utilizada. El peso de las

perlas no es homogéneo en todas y este está influenciado por la velocidad de goteo y la

concentración de la solución endurecedora de cloruro de calcio utilizada (Amorós, 2013, p.20)


Figura 7.

Perlas de Alginato-Almidón de Yuca Almacenadas a 4°C. A) Perlas Alginato 1% -Almidón 15%

TSEBT 05-01. B) Perlas Alginato 1% -Almidón 5% TSEBT 05-0. C). Perlas Alg 1% -Almidón

15% TSEBT 01-01. D) ). Perlas Alginato 1% -Almidón 5% TSEBT 01-01 E). Perlas Alginato 1%

-Almidón 15% TSPHT 04-01. F) Perlas Alginato 1% -Almidón 5% TSPHT 04-01

A. B. C. D.

E. F.

Nota: Perlas de Alginato- Almidón de yuca almacenadas a 4ºC durante 8 días donde posterior a este tiempo se

realizaron los diferentes ensayos metodologìcos donde se evaluan y se comparan los microorganismos PGPM

encapsulados a diferentes concentraciones de Almidón de yuca al 5% y 15%.

Pese a que se utilizó la misma cantidad de mezcla para la conformación de las perlas, se

encontró que, con alginato al 1% y almidón yuca al 5% se tiene perlas con un volumen de 0,0060

mm3 siendo las más pequeñas y transparentes en comparación con las demás. Las mezclas

alginato al 1% - almidón yuca 5% permiten la formación de perlas grandes y redondas con un

volumen entre 0,0345 a 0,1180 mm3 de color blancuzcas (figura 7). Se encontró que la forma de

las perlas depende de la concentración empleada de almidón yuca, como se evidencia en la figura

7A, C, D las perlas presentaron forma redonda y de color blancuzcas, en la figura 7 B, E y F se

observan perlas más irregulares en el sentido que no toma una forma uniforme en comparación a

las demás.


Shin et al, (2001) estudió que la interacción del alginato con el almidón inhibe su

expansión a la hora de encapsular, lo cual podría producir una reducción en el tamaño de las

perlas como se observó en las mezclas de alginato al 1% y almidón de yuca al 5% donde se su

valor fue de 0,0060 mm3. Según Flores en (2011), si se incrementa la concentración de alginato

se obtendrán estructuras más grandes y el volumen de las estructuras que se obtengan es uno de

los parámetros más importantes porque pueden influir en la eficiencia de la encapsulación y la

dispersión de la matriz polimérica.

Tabla 2.

Contingencia de Frecuencias Absolutas de Perlas de TSEBT 01-01 en matriz Alginato-Almidón

Yuca Respecto a su Forma

Frecuencias absolutas en columnas: Forma

Tratamiento 8 días 0 1 Total

T15% 10 5 15

T5% 10 5 15

Total 20 10 30

Estadístico Valor gl p

Chi Cuadrado

Pearson

0,00 1 >0,9999

Nota. La Tabla 2 establece que para el consorcio TSEBT 01-01, la variable forma no se ve influenciada por la

concentración de almidón de yuca en la matriz debido a que la prueba de Chi Cuadrado Pearson es menor a 0,05

donde en la tabla representa 0 = No cambio; 1 = Cambio su forma; T15% = Concentración almidón de yuca; T5% =

Concentración almidón de yuca.

De acuerdo con los resultados obtenidos de la Tabla 2 se puede establecer que para el

consorcio TSEBT 01-01, la variable forma no se ve influenciada por la concentración de almidón

de yuca en la matriz debido a que la prueba de Chi Cuadrado Pearson contiene un valor >0,05.

Por otra parte, se indica en ambos casos que de las 15 perlas evaluadas 5 de ellas sin importar el

orden cambian su forma.


Lo que nos da una probabilidad de cambio del 0.33, es decir se espera que a los 8 días de

cada 10 perlas cambie la forma de 3 perlas en comparación al control positivo (figura 5) donde

este no ha mostrado ningún tipo de cambio en su forma.

Tabla 3.

Contingencia de Frecuencias Absolutas de Perlas de TSEBT 01-01 en Matriz Alginato-Almidón

Yuca Respecto a su Tamaño

Frecuencias absolutas en columnas: Tamaño


T15% 11 4 15

T5% 9 6 15

Total 20 10 30

Estadístico Valor Gl p

Chi Cuadrado

Pearson

0,60 1 0,4386

Nota. La tabla 3 se puede establecer que para el consorcio TSEBT 01-01, la variable tamaño no se ve influenciada

por la concentración de almidón de yuca de la matriz donde en la tabla representa 0 = No cambio; 1 = Cambio su

forma; T15% = Concentración almidón de yuca; T5% = Concentración almidón de yuca.

En la tabla 3 se puede establecer que para el consorcio TSEBT 01-01, la variable tamaño

no se ve influenciada por la concentración de almidón de yuca de la matriz; lo que es

corroborado por la prueba de Chi Cuadrado Pearson (>0,05).

Por otra parte, se indica que a la concentración del almidón de yuca al 15% en las 15

perlas evaluadas, 4 de ellas cambian su tamaño.

Lo que nos da una probabilidad de cambio de tamaño del 0,26; en comparación a las

perlas conformadas de 5% de almidón de yuca donde 4 de ellas cambian su tamaño, obteniendo

una probabilidad de cambio de tamaño de 0.6.


Tabla 4.





T15% 11 4 15

T5% 7 8 15

Total 18 12 30


Chi Cuadrado

Pearson

2,22 1 0,1360

Nota. La variable forma de las perlas que contienen el consorcio TSEBT 05-01, se evidencia que no existen

diferencias significativas entre una concentración de 15% donde en la tabla representa 0 = No cambio; 1 = Cambio

su forma; T15% = Concentración almidón de yuca; T5% = Concentración almidón de yuca.

En cuanto a la variable forma de las perlas que contienen el consorcio TSEBT 05-01, se

evidencia que no existen diferencias significativas entre una concentración de 15% de almidón

de yuca a las perlas que contienen almidón de yuca al 5% Chi Cuadrado de Pearson (>0,05). De

esta manera, como se observa en la tabla 4, la concentración de almidón de yuca utilizada es una

variable que no se encuentra asociada a el cambio de forma de las perlas.

Sin embargo, se puede inferir con los datos de la tabla de contingencia las perlas del

consorcio TSEBT05-01, cambian en menor grado cuando la matriz posee una composición del

15% de almidón de yuca, esto es 1.5 veces mayor la probabilidad de que no cambie una perla

que está compuesta de almidón de yuca al 15% en relación con las que tiene 5% de almidón de

yuca.

Cuando se analiza la variable tamaño de las perlas donde se encapsuló el consorcio

TSEBT 05-01, se evidencia que no existen diferencias significativas entre una concentración de


15% de almidón de yuca a las perlas que contienen 5% del mismo (Chi Cuadrado de Pearson

>0,05). Como se logra ver en la tabla 5, de frecuencias la probabilidad de que no cambie el

tamaño de las perlas en este caso es mayor en las perlas del 5% (0,73) que en las del 15% (0.66).

Tabla 5.





T15% 10 5 15

T5% 11 4 15

Total 21 9 30


Chi Cuadrado

Pearson

0,16 1 0,6903

Nota. Para la bacteria TSEBT 05-01 no existen diferencias significativas en cuanto a su forma respecto al analisis

estdistico donde 0 = No cambio; 1 = Cambio de tamaño; T15% = Concentración almidón de yuca; T5% =

Concentración almidón de yuca.

Con base en la prueba de Chi Cuadrado de Pearson (<0,05) para las perlas que contienen

el hongo TSHPT 04-01, no existen diferencias significativas en cuanto a su forma (tabla 6) y

tamaño (tabla 7).

Sin embargo, se puede afirmar que la probabilidad de no cambio de forma es mayor en

las perlas que tienen 15% de almidón de yuca (0.6), a las que tienen 5% de almidón de yuca

(0.46). En comparación a la probabilidad de no cambio de tamaño es mayor en las perlas que

tienen 15% de almidón (0.66), a las que tienen 5% de almidón (0.50).


Tabla 6.

Contingencia de Frecuencias Absolutas de Perlas de TSPHP 04-01 en Matriz Alginato-Almidón




T15% 9 6 15

T5% 7 8 15

Total 16 14 30


Chi Cuadrado

Pearson

0,54 1 0,4642

Nota. Para el hongo TSHPT 04- se observó que la humedad se conserva, lo que en principio puede favorecer su

estructura; la humedad que se mantiene se encuentra de forma líquida, donde 0 = No cambio; 1 = Cambio de

tamaño; T15% = Concentración almidón de yuca; T5% = Concentración almidón de yuca.

La viabilidad de los microorganismos encapsulados está relacionada con la forma, peso,

tamaño y la temperatura de almacenamiento. A 4°C se observó que la humedad se conserva, lo

que en principio puede favorecer su estructura; la humedad que se mantiene se encuentra de

forma líquida, favoreciendo las relaciones enzimáticas de la actividad PGPM de los

microorganismos. Lo anterior, es debido a que el alginato por sus propiedades de intercambio

iónico, su capacidad de formar geles al contacto con CaCl2 y al contener materiales orgánicos

(polímeros) facilitan la forma de cualquier estructura (Tapias, et ál, 2010, p.29-33).

Considerando que, el almidón de yuca mejora significativamente la eficiencia de la

encapsulación, porque actúa como un material de relleno reforzando la estructura y ocupando

parcialmente espacios internos de la matriz, disminuyendo así la porosidad de la perla. (Lopez,

et ál, 2012, p.1692-7125) Por ello, es que las perlas no se vieron afectadas al ser almacenadas a

una temperatura de 4°C.


Tabla 7.

Contingencia de Frecuencias Absolutas de Perlas de TSPHP 04-01 en Matriz Alginato-Almidón




T15% 10 5 15

T5% 7 8 15

Total 17 13 30


Chi Cuadrado

Pearson

1,22 1 0,2690

Nota. Hongo TSHPT 04-01 evaluado estadisticamente no acepta el porcentaje de Chi Cuadrado de Pearson donde 0

= No cambio; 1 = Cambio de tamaño; T15% = Concentración almidón de yuca; T5% = Concentración almidón de

yuca.

9.1.2 Recuento de la Concentracion Microbiana Obtenida por Perla Despues de la

Encapulación

La concentración inicial de los microrganismos antes de encapsular se encontraba ha 108

UFC/mL para las bacterias y para el hongo, la concentración de 107 UFC/mL dado que a esa

concentración expresan su actividad. A partir de esto, se obtuvo un recuento de células viables

rango entre 10*104 cel/perla y 13*104 cel/ perla para las bacterias TSEBT 01-01 en alginato- 5%

y 15% de almidón de yuca; 15*104 cel/ perla y 16*104 cel/ perla y TSEBT 05-01 en alginato- 5%

y 15% almidón de yuca, en el caso del hongo TSPHP 04-01 se obtuvo un rango entre 16*104

esporas/perla y 17,5 *104 cel/perla en alginato5% y 15% de almidón de yuca (apéndice 3). Del

conteo celular obtenido de estas perlas, se realizó un promedio de perlas evaluadas en este

parámetro (Tabla 2), observando que, el promedio celular se afecta para cada microorganismo,

afectando actividad PGPM de cada uno de ellos.


Tabla 8.

Promedio del Recuento del Microorganismo Encapsulados en Matriz de Alginato-Almidón Yuca

Perla Concentración

Inicial (Cel/mL)

Concentración Final

(cel/mL)

Almidón 5%

Concentración Final

(cel/mL)

Almidón 15%

TSEBT 01-01

10*108 11,3*104 11,1*104

TSEBT 05-01

10*108 1572*103 1552*103

TSPHP 04-01 10*107 1684*103 1704*103

Nota. Recuento obtenido mediante la metodología de camara de Neubauer para cada una de las concentraciones de

almidón de yuca (5% y 15) utilizado, donde se obtuvo un recuento cel/mL comprobando que el conteo estimado esta

menor a su concentración inicial.

La inmovilización del consorcio microbiano en las capsulas de alginato 1%-Almidón

yuca al 5% y 15% mostraron que los microorganismos siguieron viables después de ser

encapsulados y almacenados a 4°C durante 8 días pero no se obtuvo la concentración esperada

por perla ya que, el promedio del recuento celular esta 11,3*104 cel/perla, 1572*103 y 1684*103

cel/ perla para la concentración de alginato 1% - almidón yuca 5% y un promedio de 11,1*104 ,

1552*103 y 1704*103 cel/perla para la concentración alginato 1% - almidón yuca 15% según

Lupo en 2018, el recuentos de microorganismos viables después de ser encapsulados para

microorganismos con actividad probiótica se estima a estar entre un rango de 106 cel/perla, la

cual puede estar en concordancia a nuestros requerimientos en la concentración microbiana de

los PGPM. Como se evidencia en el conteo celular obtenidos (apéndice 3), se encontró que el

recuento de células se mantuvo por debajo de la concentración respecto al inoculo inicial (10*107

cel/mL y 10*108) con el cual se realizó el procedimiento de encapsulación, es decir, con esto se

demostró que hubo perdidas de células microbianas viables al momento de la encapsulación.


9.2 Concentración Microbiana Viable Después de Exposición UV

9.2.1 Crecimiento Microbiano Viable Después de Exposición UV

En la Tabla 9A, se puede apreciar la comparación del desarrollo macroscópico de la

bacteria TSEBT 05-01 antes de ser encapsulada observando colonias circulares, convexa,

brillantes de color beige y en el recuento microscópico se pudo determinar que este

microrganismo pertenece a un bacilo gran negativo corto.

En la tabla 9D, se puede apreciar el desarrollo macroscópico de la misma encapsulada en

almidón de yuca al 5% y 15% -Alginato 1%, se puedo establecer que luego de ser sometidas a

este proceso conservan sus características igual en comparación con el hongo TSPHP 04-01

encapsulado en almidón de yuca a 5% y 15 -alginato 1% encontrándose que sus características

macroscópicas cambiaron en sus bordes y forma de crecimiento.

Sin embargo, su viabilidad se vio afectada debido a que la bacteria no presenta estrías

abundantes en comparación en el crecimiento inicial sin exposición a UV.

Tabla 9.

Características Morfológicas de Microorganismos PGPM en Agar NBY Antes de Ser Expuestos

a UV y Características Morfológicas Después a Exposición UV

Microrganismos Antes de exposición a UV Después de exposición UV

TSEBT 05-01 A. Colonias circulares, convexa,

brillantes de color beige con

abundante crecimiento.

D. Colonias de color beige,

circulares, convexas y brillantes con

bajó crecimiento.


Microrganismos Antes de exposición a UV Después de exposición UV

TSEBT 01-01

B. Colonias blancas, alargadas,

elevadas y enteras.

E. Colonias blancas, circulares,

elevadas, pegajosas, con poco

crecimiento.

TSPHP 04-01

C. Textura vellosa amarillo-oliva,

con bordes beige e irregulares, sin

elevación.

F. Textura vellosa-amarillo, con

bordes beige con una pequeña

elevación en el centro del medio.

Nota. Siembra de cada microorganismo PGPM en agar NBY después de 72 horas de incubación a 28ºC donde se

tiene la comparación de cada uno de los microorganismos antes y después de encapsulados en las diferentes

concentraciones de las matrices de Almidón de yuca.

Con base a las características microscópica de la bacteria endófita TSEBT 01-01 se

encuentra clasificada en los bacilos Gram positivos, a partir de un cultivo axénico en NBY antes

de exponerlo a la luz UV se observaron colonias blancas, alargadas, elevadas y enteras y con una

concentración microbiana abundante (tabla 9B); en el momento de que esta bacteria fue sometida

a la encapsulación y a la luz ultravioleta presentaron algunos cambios en su morfología, como se

observa en la tabla 9E las colonias son más circulares, de color blancas y enteras. Los cambios

que presenta la bacteria podrían ser por residuos de partículas de CaCl2 presenten en las perlas.


Por ultimo, a partir de la tabla 9F, se puede observar el cultivo de un hongo epifito

perteneciente al codigo TSPHP 04-01 después de un repique con 6 días de incubación en medio

NBY. Su característica morfológica presentada es de textura vellosa amarillo-oliva, con bordes

beige entero de forma circular, sin ninguna elevación.

En comparación al hongo obtenido después de la exposición a UV donde este hongo

creció con textura vellosa-amarillo, con bordes ondulados de color beige, el centro es circular,

entero y acuminado observando que notablemente presento cambios morfológicos en su

estructura macroscópica.

Los resultados obtenidos demostraron que la encapsulación protege a los

microorganismos de estrés ambiental, demostrando que las matrices poliméricas muestran gran

atractivo para las nuevas aplicaciones.

Durante la Inmovilización de los microorganismos en esta matriz, se observó que

independientemente de la concentración utilizada, la matriz actúa como una barrera de

protección para el inoculo encapsulado.

Sin embargo, se debe utilizar una concentración celular mayor para que se obtenga por

perla la concentración necesaria de 107 UFC/perla de cada microorganismo para mantener su

actividad PGPM. Como expone (Martozavian, et ál, 2008, p.1-18).

La encapsulación en matrices poliméricas protege a los PGPM de estrés mecánico,

cambios de pH, humedad, resequedad y UV; siempre y cuando las concentraciones de la

solución endurecedora sean apropiadas.


9.3 Verificación de Forma Cualitativa la Capacidad Promotora del Crecimiento Vegetal

9.3.1 Capacidad Fijadora de Nitrógeno

Para la confirmación de la actividad de solubilizadores de nitrógeno se realizó un control

positivo (figura 8) donde se observa que el medio está totalmente azul después de agregarle 3

gotas de azul de bromotimol, esto se debe a que se convierte en ácido, ya que se le agrega

oxígeno al medio, lo cual confirma la solubilización de fosfatos en medio Ashby.

Figura 8.

Control Positivo del Medio Ashby. El Medio Presentó un Viraje a Color Azul Luego de Agregar

Dos Gotas de Azul de Bromotimol.

Nota. Se observa cambios en el color del medio Ashby después de agregar 3 gotas de azul de bromotimol obteniendo

un control positivo en la trazabilidad de la investigación.

En la figura 9 se observa que después de 72 horas de incubación, la bacteria TSEBT 01-

01 mostró capacidad fijadora en medio libres de nitrógeno (Ashby) después de agregarle una

gota de azul de bromotimol, donde el medio viro a color azul obteniendo que los

microorganismos en medio libres de nitrógeno mantienen su actividad (figura 9A y B).


Figura 9.

Prueba de Viabilidad de las Bacterias PGPM Encapsuladas. A) Bacteria TSEBT 01-01


Trascurrido este Tiempo, se Agregaron Azul de Bromotimol, Realizando un Viraje a Color Azul.

B) Bacteria TSEBT 01-01 Encapsuladas en Matriz Alginato 1% -Almidón 15% Almacenadas a

4°C e Inoculadas en Medio Ashby Durante 48 horas. Trascurrido este Tiempo, se Agregaron

Gotas de Azul de Bromotimol.

A). B)

Nota. En los viales se observa el crecimiento del microorganismo TSEBT 01-01 encpasulado en matrices de almidòn

de yuca al 5% y 15% incubado a 20ºC durante 72 horas.

En la figura 10 no se observa crecimiento de la bacteria TBSEBT 05-01 despues de 72

horas de incubación, el medio ashby pero no presento ningun viraje de color despues de

agregarle azul de bromotimil demostrando que esta bacteria no mantuvo su capacidad

solubilizadora de nitrogeno despues de la exposición a luz UV.

Sin embargo, se dejó incubada durante 72 horas más para observar si el desarrollo de la

bacteria fue afectada por la encapsulación, aunque se observó que no mantuvo su actividad ni a

72 horas ni a 144 horas de incubación.


Alvares et al, (2014) determinó que la actividad bioquímica relacionada a la capacidad de

fijar nitrógeno en microorganismos rizosféricos asociados a plantas se mantiene un 10% en la

capacidad de sobrevivir a los repiques sucesivos en medios de cultivos libres de nitrógeno.

Por lo anterior, los resultados obtenidos demuestran afinidad a ese estudio, determinando

que la bacteria TSEBT 05-01 no es tan resistente al ser sometida a procesos de encapsulación y

exposición a UV.

Figura 10.

Prueba de Viabilidad de las Bacterias PGPM Encapsuladas. A) Bacteria TSEBT 05-01


Trascurrido este Tiempo, se Agregaron Azul de Bromotimol Mostrando que no Hubo Cambio de

Color. B) TSEBT 05-01 05-01 Encapsuladas en Matriz Alginato 1% -Almidón 15% Almacenadas

a 4°C e Inoculadas en Medio Ashby Durante 48 Horas. Trascurrido este Tiempo, se Agregaron

Gotas de Azul de Bromotimol y no Mostro Ningún Cambio.

A). B)

Nota. Para la bacteria TSEBT 05-01 encpasulado en matrices de almidòn de yuca al 5% y 15% incubado a 20ºC

durante 72 horas en medio Ashby observando que no hubo cambio de color despues de agregar el azul de bromotimol.

En base a la encapsulación, no encontramos efectos reversibles a los PGPM en cuanto a

la matriz utilizada mostrando viabilidad a los PGPM almacenados. Ribaudo et al., (2012) estudio

la actividad para solubilizar fosfato de bacterias promotoras crecimiento vegetal inoculadas en


cultivos de arroz y papa, donde demostraron la capacidad de solubilizar fosfato entre las cepas

PGPB en concentraciones de 150 a 200 ufc/mL.

Se ha conocido que las bacterias que solubilizan el fosfato utilizan varios mecanismos

para convertirse de insolubles a formas solubles el fosforo; demostrando, que las bacterias PGPR

son capaces de solubilizar el fosfato poniéndolo a disposición de la planta y dándole potencial a

el cultivo (Jha y Saraf, 2015, p.108-119).

Por otra parte, Según Santos, et al, (2010) encapsularon microorganismos PGPM en

matrices poliméricas de alginato de sodio donde el 36% de ellas no mostraron una respuesta

positiva, esto estuvo asociado a que las especies de microorganismos que tienen una resistencia

natura pese al medio ambiente severa el cual se exponen cambia su actividad enzimática y junto

a una matriz basada en polímeros no ayudo a su rendimiento; otra consecuencia fue que el

polímero pudo haber afectado la viabilidad o liberación de las células, ya que, no es tan es fácil

de diluir las perlas formadas con alginato de sodio.

9.3.2 Solubilizadores de Fosfato

En la figura 11 se observa que el hongo TSEBT 04-01 después de 72 horas de incubación

demostró que mantienen la capacidad de solubilizar fosfato en medio carentes de él, formando

hidrolisis en el medio.

Con esta evaluación se demostrado que con esta prueba cualitativa este microorganismo

mantiene la actividad promotora de crecimiento vegetal la cual está asociada a la solubilización

de nitrógeno, corroborando que este microorganismo no se vio afectado por la luz UV a la cual

estuvo expuesta donde la matriz de alginato-almidón de yuca le proporciono la protección

necesaria para no perder su actividad manteniéndola viable.


Figura 11.

Prueba de Viabilidad del Hongo PGPM Encapsuladas. A) Hongo TSPHP 04-01 Encapsulada en

Alginato 1%- Almidón 5% Almacenada a 4°C e Inoculada en Medio NBRIP. Trascurrido este

Tiempo. B) Hongo TSPHP 04-01 Encapsuladas en Matriz Alginato 1% -Almidón 15%

Almacenadas a 4°C e Inoculadas en Medio NBRIP Durante 48 Horas. Trascurrido Este Tiempo,

se Observó una Sedimentación en el Medio.

A) B)

Nota. En los viales se observa el crecimiento del Hongo TSPHP 04-01 encpasulado en matrices de almidòn de yuca

al 5% y 15% incubado a 20ºC durante 72 horas en medio NBRIP.

La respuesta general del hongo PGPM encapsulado en esta matriz alginato-almidón yuca

durante la fase de almacenamiento a 4°C fue positiva; permitiendo observar su comportamiento a

las 96 horas después de inoculado; estudios han demostrado que la solubilidad del fosfato está

ligada a la producción de ácidos orgánicos o actividades enzimáticas presentes en habitad.

Investigaciones demuestran que la solubilización de fosfato está asociada a la producción de

ácidos orgánicos o a la actividad enzimática, siendo este un elemento importante junto a la

solubilización de nitrógeno actuando como nutriente principal en el desarrollo de las plantas.

Con lo anterior, se puede inferir que los resultados obtenidos respecto al hongo TSPHP 04-01

presenta un notable índice en cuanto a su solubilización de fosfato en fuentes de fosforo

insolubles por las condiciones ambientales en las que se están manteniendo viable su actividad


PGPM, donde esto se encuentra asociado a que los polímeros utilizados para la encapsulación

del consorcio microbiano fueron los apropiados (Guzmán, et ál, 2012, p.182-190).

Según lo expuesto anteriormente, con las pruebas realizadas para la determinación de la

capacidad promotora de crecimiento vegetal se pudo concluir que los microorganismos

mantienen viable su actividad fijadora de nitrógeno y solubilizadora de fosfato después de ser

encapsulados en una matriz de alginato-almidón de yuca.


10. Conclusiones

Se estableció que el alginato permite la formación de estructuras con el almidón de yuca

en cualquier concentración evaluada. Sin embargo, se obtuvieron perlas uniformes en las

concentraciones de alginato al 1%- almidón de yuca 15%, a diferencia de alginato al 1%-

almidón de yuca al 5% donde se obtienen estructuras de forma irregular.

Se pudo establecer que el cambio de forma o tamaño no son dependientes de la

concentración de almidón de yuca de la que está compuesta la perla. Con base a las

probabilidades donde no se espera cambios en tamaño o forma es conveniente usar

concentraciones de almidón de yuca al 15%, previniendo cambios a nivel de calidad del

encapsulado.

A 4°C las perlas alginato-almidón conservan su estructura, sin cambios físicos. Las

relaciones de los polímeros de inmovilizados de Alginato 1% - Almidón yuca 5% y Alginato 1%

- Almidón yuca 15%, tuvieron efectos favorables en la viabilidad de la actividad PGPM

(solubilizadores de fosfato y nitrógeno) en los microorganismos después de la exposición UV.


11. Recomendaciones

Dado los resultados obtenidos del estudio de la encapsulación con una matriz de alginato

- almidón de yuca se cree conveniente hacer las siguientes recomendaciones para futuras

investigaciones:

Evaluar la viabilidad de los microorganismos PGPM encapsulados a diferentes tiempos

de almacenamiento realizando un registro a través del tiempo.

Utilizar un diámetro diferente de la jeringa hipodérmica para que el tamaño de las perlas

aumente y la cantidad de cel/perlas sea mayor a la requerida para futuros estudios.


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Apéndices

Apéndice A. Preparación del medio NBY Liquido y sólido para los microorganismos PGPM

Tabla 10.

Composición del Medio NBY Líquido

COMPUESTO CANTIDAD

Caldo nutritivo 8 gr

Extracto de levadura 2 gr

K2HPO4 0,5 gr

KH2PO4 2 gr

MgS04-6H2O 0,25gr

GLUCOSA 5 gr

Tabla 11.

Composición del Medio NBY Sólido

COMPUESTO CANTIDAD

Caldo nutritivo 8 gr

Extracto de levadura 2 gr

K2HPO4 0,5 gr

KH2PO4 2 gr

MgS04-6H2O 0,25gr

GLUCOSA 5 gr

Agar -Agar 17 gr

Tabla 12.

Composición del Medio Ashby Líquido

COMPUESTO CANTIDAD

Sacarosa 5 gr

Glucosa 5 gr

CaCO3 2 gr

KH2PO4 5 gr

MgS04 0,2gr

NaCl 0,2

CaSO4 5 gr


Tabla 13.

Composición del Medio NBRIP Líquido.

COMPUESTO CANTIDAD

Ca3 (PO4) 2,5 gr

MgCl2-6H2O 2,5 gr

MgCl2- 7H2O 0,125 gr

KCL 0,2 gr

(NH4)2 SO4 0,5gr

GLUCOSA 5 gr


Apéndice B. Cálculos de la Concentración de Almidón de Yuca y Alginato para la

Encapsulación de Microorganismos

Calculo 1 Alginato

Concentración 4% de alginato

V1= 2% x 15mL = 7,5 mL alg 4% + 7,5 mL de H2O = 2% de alginato

4%

Para la preparación del alginato al 1% este se mantuvo en una placa de calentamiento con

agitación constante a 100 rpm hasta estar completamente diluido y la solución viscosa.

Calculo 2 Almidón de yuca

Concentración de 30% y 10%

V1= 10% x 15mL = 1,6 mL almidón yuca 90% + 13,4 mL de H2O = 10% de alginato

90%

V1= 30% x 15mL = 5 mL almidón yuca 90% + 10 mL de H2O = 30% de alginato

90%

Al diluir la concentración de almidón con alginato queda 5% de almidón y 15%


Apéndice C. Recuento de Microorganismos Viables Después de la Encapsulación en

Alginato-Almidón de Yuca por Cámara de Neubauer

Tabla 14.

Recuento del Microorganismo Encapsulados en Matriz de Alginato-Almidón Yuca

Perla

Concentración final (cel/mL)

Almidón 5%

Concentración final (cel/mL)

Almidón 15%

TSEBT 01-01

1 12*104 10*104

2 10*104 115*103

3 13*104 10*104

4 10*104 13*104

5 115*104 11*104

TSEBT 05-01

1 157*103 16*104

2 16*104 15*104

3 159*103 15*104

4 16*104 16*104

5 15*104 156*103

TSPHP 04-01

1 177*103 16*104

2 16*104 17*104

3 175*103 176*103

4 16*104 176*103

5 17*104 17*104

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