DIAGNÓSTICO TEMPRANO DE LA DIAGNÓSTICO TEMPRANO DE LA INFECCIÓN POR EL VIH EN EL INFECCIÓN POR EL VIH EN EL

RECIÉN NACIDORECIÉN NACIDO

Lic. Melvi Pérez

INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN

El Recién Nacido adquiere la infección a traves de la madre VIH+ durante Embarazo, Parto ó Lactancia.

33

Método utilizado

Para el

Diagnóstico Temprano

de la

Infección por el VIH-1

en el

Recién Nacido

METODO ADNMETODO ADN--PCRPCR

Amplificación del ADN proviral mediante reacción en cadena de la polimerasa.

44

ADN PROVIRALADN PROVIRAL

Partícula que contiene la información genética necesaria para la replicación de los virus. Se encuentra en el interior de la célula CD4 hasta que se transforma en ADN vírico y sale de la célula ya convertida en virus activo.

REACCIÓN EN CADENA DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)POLIMERASA (PCR)

Conocida como PCR por sus siglas en Inglés(Polimerase Chain Reaction) es una técnica deBiología Molecular (descrita en 1985, por KaryMullis) cuyo objetivo es obtener un gran númerode copias de un fragmento de ADN.

Tras la amplificación, resulta mucho mássencillo identificar con una alta probabilidadVirus y/o Bacterias causante de una enfermedad.

55

¿CÓMO LLEGAMOS DE LA TÉCNICA DE PCR

AL MÉTODO USADO PARA

EL DIAGNÓSTICO TEMPRANO DE LA

INFECCIÓN POR EL VIH-1 EN EL

RECIÉN NACIDO?

66

EnsayoEnsayo Roche Roche AmplicorAmplicor VIHVIH--1 DNA (v 1.5) 1 DNA (v 1.5) AdaptadoAdaptado Para Discos De Sangre Para Discos De Sangre SecaSeca (DBS)(DBS)

77

DISCOS DE SANGRE SECA (DBS)DISCOS DE SANGRE SECA (DBS)

88

DBS por sus siglas en Inglés (Dried Blood Spot) es sangre seca en un papel filtro.

VENTAJAS DE LA MUESTRA DE VENTAJAS DE LA MUESTRA DE SANGRE SECA (DBS)SANGRE SECA (DBS)

Sólo requiere una pequeña cantidad de sangre.

Es termoestable.

Fácil de almacenar y transportar.

99

Objetivo Objetivo EnsayoEnsayo Roche Roche AmplicorAmplicorVIHVIH--1 DNA (v 1.5)1 DNA (v 1.5)

AdaptadoAdaptado Para Discos De Sangre Para Discos De Sangre SecaSeca(DBS)(DBS)

Detectar el ADN proviral del VIH-1 en niños nacidos de madres seropositivas; en una muestra de sangre total colectada en un papel filtro.

1010

Principio Del Principio Del EnsayoEnsayo Roche Roche AmplicorAmplicorHIVHIV--1 DNA (v 1.5)1 DNA (v 1.5)

AdaptadoAdaptado Para Discos De Sangre Para Discos De Sangre SecaSeca(DBS)(DBS)

Es un ensayo cualitativo In Vitro para la detección del ADN proviral de VIH-1 en sangre humana. Esta técnica utiliza la amplificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la hibridación de ácido nucleído para la detección de VIH-1 ADN en sangre humana colectada en un papel filtro.

1111

TOMA DE MUESTRA PARA PRUEBA TOMA DE MUESTRA PARA PRUEBA DE ADNDE ADN--PCR PCR

Sangre seca en un papel filtro (DBS).

A hijos de madres VIH positivo.

Se toma a partir de las ocho semanas de nacido.

Se obtiene de una punción y no de una flebotomía.

1212

MATERIALES NECESARIOS PARA TOMAR MATERIALES NECESARIOS PARA TOMAR UNA MUESTRA PARA UN ADNUNA MUESTRA PARA UN ADN--PCRPCR

Guantes (sin polvo).

Tarjetas de Papel Filtro.

Lanceta.

Alcohol.

Algodón.

Estante para secar las muestras.

1313

INFORMACIÓN QUE DEBE CONTENER EL INFORMACIÓN QUE DEBE CONTENER EL FORMULARIO Y LA TARJETA DE PAPEL FORMULARIO Y LA TARJETA DE PAPEL

FILTROFILTRO

Antes de tomar la muestra llene el formulario y la tarjeta y escriba claramente:

Los nombres y apellidos del niño.

Fecha de nacimiento.

Nombre de la madre.

Fecha de recolección.

1414

DEDE DONDE TOMAR LA MUESTRADONDE TOMAR LA MUESTRA

1515

• Niños 6 semnas – 4 meses: talón

• Niños 4m - 10m: dedo grande pie

• Niños >10m o >10 kg: pulgar

COMO TOMAR UNA MUESTRA COMO TOMAR UNA MUESTRA DEL TALÓNDEL TALÓN

1616

1717

CALIENTE EL ÁREACALIENTE EL ÁREA

1818

LÁVESE LAS MANOS Y PÓNGASE LÁVESE LAS MANOS Y PÓNGASE GUANTESGUANTES

1919

POSICIONE EL BEBE CON EL PIE POSICIONE EL BEBE CON EL PIE HACIA ABAJO HACIA ABAJO

2020

LIMPIE EL ÁREA, SÉQUELA Y LIMPIE EL ÁREA, SÉQUELA Y ESPERE ESPERE 3030 SEGUNDOS SEGUNDOS

2121

PRESIONE CON LA LANCETA PRESIONE CON LA LANCETA CONTRA EL PIE, HASTA QUE SE CONTRA EL PIE, HASTA QUE SE

HAGA UNA PERFORACIÓNHAGA UNA PERFORACIÓN

2222

LIMPIE LA PRIMERA GOTA DE LIMPIE LA PRIMERA GOTA DE SANGRESANGRE

2323

ESPERE HASTA QUE SE ACUMULÉ ESPERE HASTA QUE SE ACUMULÉ UNA GOTA GRANDE UNA GOTA GRANDE

2424

TOQUE LA GOTA CONTRA EL PAPEL TOQUE LA GOTA CONTRA EL PAPEL

FILTRO Y LLENE EL CIRCULOFILTRO Y LLENE EL CIRCULO

2525

MANTENGA EL PIE PRESIONADOMANTENGA EL PIE PRESIONADO

2626

LLENE UN MLLENE UN MÍÍNIMO DE TRES NIMO DE TRES CCÍÍRCULOSRCULOS

2727

LIMPIE EL PIELIMPIE EL PIE

UN TRABAJO BIEN HECHO UN TRABAJO BIEN HECHO

2828

COMO TOMAR UNA MUESTRA DEL COMO TOMAR UNA MUESTRA DEL DEDO GRANDE DEL PIEDEDO GRANDE DEL PIE

2929

3030

CALIENTE EL ÁREA CALIENTE EL ÁREA

3131

LLÁVESE LAS MANOS Y PÓNGASE ÁVESE LAS MANOS Y PÓNGASE

GUANTESGUANTES

3232

POSICIONE EL BEBE CON EL PIE POSICIONE EL BEBE CON EL PIE HACIA ABAJO HACIA ABAJO

3333

LIMPIE EL ÁREA, SÉQUELA Y LIMPIE EL ÁREA, SÉQUELA Y

ESPEREESPERE30 30 SEGUNDOS SEGUNDOS

3434

PRESIONE CON LA LANCETA CONTRA PRESIONE CON LA LANCETA CONTRA

EL PIE, HASTA QUE SE HAGA UNA EL PIE, HASTA QUE SE HAGA UNA PERFORACIÓNPERFORACIÓN

3535

LIMPIE LA PRIMERA GOTA DE LIMPIE LA PRIMERA GOTA DE

SANGRESANGRE

3636

ESPERE HASTA QUE SE ACUMULE ESPERE HASTA QUE SE ACUMULE

UNA UNA GOTA GRANDE GOTA GRANDE

3737

TOQUE LA GOTA CONTRA EL PAPEL TOQUE LA GOTA CONTRA EL PAPEL

FILTROFILTRO

3838

MANTENGA EL PIE PRESIONADOMANTENGA EL PIE PRESIONADO

3939

LLENE UN MLLENE UN MÍÍNIMO DE TRES NIMO DE TRES CÍRCULOSCÍRCULOS

4040

LIMPIE EL PIELIMPIE EL PIE

COMO SECAR LAS MUESTRASCOMO SECAR LAS MUESTRAS

No toque la muestra.

Coloque las muestras en posición horizontal.

Espere un mínimo de tres horas para que la

muestra se seque.

No exponga las muestras al sol, polvo u otros contaminantes.

No caliente las muestras.

No colocar una muestra encima de otra.

No dejar que la muestra se ponga en contacto con ningún objeto (incluso otros PCRs) mientras se esté secando.

4141

MANTENER LAS MEDIDAS DE MANTENER LAS MEDIDAS DE BIOSEGURIDADBIOSEGURIDAD

4242

QUE NO QUE NO SESE DEBE HACER AL TOMAR DEBE HACER AL TOMAR LA MUESTRALA MUESTRA

4343

No se debe presionar el dedo. Las gotas de sangre son muy

pequeñas.

MUESTRAS VALIDASMUESTRAS VALIDAS

4444

Círculos completamente

llenos de sangre

Claramete Idntificada

Círculos no estan

llenos completamete

pero es suficiente para

un disco de 6mm y

repeticiones

Claramente Identificada

3 Buenos discos de sangre

Claramente Identificada

MUESTRAS INVALIDASMUESTRAS INVALIDAS

4545

Toma de muestra incorrecta.

No hay suficiente sangre

para un disco de 6 mm.

Círculos con halo de alcohol.

El alcohol usado para

desinfectar interfiere en la

toma de muestra.

Muestra no fue secada

correctamente antes de ser enviada.

Muestra parece estar muy saturada .

Quizás fue mojada por los dos lados.

Quizás la sangre fue aplicada con

una jeringuilla.

Sangre coagulada.

Quizás múltiple gotas fueron

aplicadas una encima de otra.

Sangre coagulada.

Probablemente llenada con sangre de una

jeringuilla.

MUESTRAS CONDICIONALESMUESTRAS CONDICIONALES

4646

Información Incompleta

Contactar remitente

para clarificación

Rechazar si no se

clarifica la identficación

Muestra no Identificada

Información no clara

Contactar remitente

para clarificación

Rechazar si no se

clarifica la identficación

EMBALAJE Y LOGÍSTICA DE EMBALAJE Y LOGÍSTICA DE TRANSPORTETRANSPORTE

4747

COMO EMPACAR LAS MUESTRASCOMO EMPACAR LAS MUESTRAS

4848

Sólo un papel filtro debe ir dentro del sobre de papel de cera.

Coloque hasta 5 sobres dentro de

la funda plástica

COMO EMPACAR LAS MUESTRASCOMO EMPACAR LAS MUESTRAS

4949

5 desecantes por cada

muestra .

1tarjeta para medir la humedad

por funda.

presione la funda para sacar todo el

aire y ciérrela. Asegúrese que la funda

este bien cerrada.

COMO ALMACENAR LAS COMO ALMACENAR LAS MUESTRAS MUESTRAS

Mantenga las muestras en la funda plástica cerrada. en un lugar fresco y seco hasta ser enviadas al laboratorio.

Refrigerarlas (4°c) si va almacenarlo por más de una semana.

Evite dejarlo en el carro porque el sol las dañará.

5050

COMO ENVIAR LAS MUESTRAS AL COMO ENVIAR LAS MUESTRAS AL LABORATORIOLABORATORIO

Coloque la funda que contiene las muestras dentro de un sobre protector para evitar sufra maltrato en el envío.

Coloque los formularios en el sobre.grape el sobre para que se mantenga cerrado.

5151

IMPORTANTE RECORDARIMPORTANTE RECORDAR

Para la toma y almacenaje de la muestra, sólo use los insumos contenidos en el kit.

Los insumos sólo deben ser utilizados para la toma de muestras de ADN-PCR.

La lata con los secantes y tarjetas de humedad siempre debe estar cerrada.

Almacene los insumos en un lugar fresco y seco.

5252

RESPONSABILIDAD DEL RESPONSABILIDAD DEL LABORATORIOLABORATORIO

Coordinar con la persona responsable de citar los niños el día y la horaen que se tomarán las muestras.

Llevar el control de las muestras enviadas y recibidas.

Guardar en archivo los resultados para cuando el medico los necesite.

Llevar una relación de los materiales e insumos y gestionar suadquisicion.

Contactar la persona que va hacer el envío de las muestras al Laboratorio Nacional Dr. Defilló en Santo Domingo, para coordinar el envío de las mismas.

Gestionar los resultados cuando sea pertinente.

5353

ESTA TÉCNICA SE REALIZA ENESTA TÉCNICA SE REALIZA ENTRES PASOS:TRES PASOS:

5454

1- Obtención del Disco de Sangre Seca y

Extracción de ADN.

2- Amplificación por Reacción en Cadena de

la Polimerasa del ADN.

3- Detección de productos de PCR en placa

(ELISA).

OBTENCIÓN DEL DISCO DE OBTENCIÓN DEL DISCO DE SANGRE SECA.SANGRE SECA.

5555

Usar un perforador limpio para cada

muestra (6mm o ¼ pulgadas).

Por cada tirada agreagar: CONTROLES EXTERNOS POSITIVO y

NEGATIVO de DBS.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA.PREPARACIÓN DE LA MUESTRA.

5656

Lavados de los Discos de Sangre Seca.

CONTROL DE CALIDAD INTERNOCONTROL DE CALIDAD INTERNO

A cada muestra se adiciona un Control Interno (Clamidia Tracomati) provisto en el Kit de reactivos, el cual determina la presencia de Inhibidores de la PCR y a la vez permite evaluar el desempeño del técnico y la calidad de los procedimientos de Extracción y Amplificación del material genético.

5757

EXTRACCIÓN DEL AND DEL VIHEXTRACCIÓN DEL AND DEL VIH--1 Y 1 Y DEL CONTROL INTERNO.DEL CONTROL INTERNO.

5858

AMPLIFICACIÓN DEL ADN AMPLIFICACIÓN DEL ADN EXTRAÍDO DE VIHEXTRAÍDO DE VIH--1 Y 1 Y

CONTROL INTERNOCONTROL INTERNO

5959

DETECCIÓN DE LOS AMPLICONES DETECCIÓN DE LOS AMPLICONES EN PLACAEN PLACA.

6060

EJEMPLO DE UNA PLACA DE EJEMPLO DE UNA PLACA DE ELISAELISA

6161

1 HIV 2 CT 3 HIV 4 CT 5 HIV 6 CT 7 HIV 8 CT 9 HIV 10 CT 11 H IV 12 CT

ARoche

(-)

Roche

(-)5 5

B Roche

(+)

Roche

(+)6 6

C CDC

(NC)

CDC

(NC)7 7

D CDC

(PC)

CDC

(PC)8 8

E 1 1 9 9

F 2 2 10 10

G 3 3 11 11

H

4 4 12 12

RESULTADOS ESPERADOSRESULTADOS ESPERADOS

6262

++

CT*

+++

VIH*

++

CT*

-

VIH*

Muestra HIV-1 NEG Muestra HIV-1 POS

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOSINTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

6363

VIH-1 A450 CI A450 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

< 0.2 ≥ 0.2 ADN de VIH-1 NO DETECTADO.

Muestra presumiblemente negativa para ADN de VIH-1

< 0.2 < 0.2 Muestra con inhibición.

Si ADN de VIH-1 esta presente, no puede ser detectado.

Procesar una nueva alícuota de la muestra y repetir el test.

Si no hay muestra, solicitar una nueva toma.

≥ 0.8 cualquiera ADN de VIH-1 detectado.

Muestra positiva para la presencia deADN de VIH-1

+/+ => AND detectado

+/- => resultado discordante, repetir en duplicado

0.2 ≤ A < 0.8 cualquiera Indeterminado o equivoco.

Resultados no definitivos para ADN de VIH-1. Repetir el ensayo en

duplicado con alícuotas de la muestra original.

VENTAJAS DE LA PRUEBA VENTAJAS DE LA PRUEBA ADNADN--PCRPCR

6464

Aumenta captación temprana de casos de

transmisión vertical.

Presenta 100% de sensibilidad y especificidad

para la detección del ADN proviral del VIH-1.

Se realiza a un menor costo que una carga

viral.

DESVENTAJAS DE LA PRUEBA DESVENTAJAS DE LA PRUEBA ADNADN--PCR PCR

Es una técnica manual y muy extensa.

(8-10 horas) si se trabaja en un día, pero generalmente la hacemos en dos días.

Por esta razón está siendo desplazada por la PCR en tiempo Real.

6565

PROGRAMA DE CONTROL DE PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD EXTERNO CALIDAD EXTERNO

CDC ofrece y recomienda un programa de prueba de proeficiencia para DBS.

– Voluntario y sin costo.

– 3 veces al año.

– 10 muestras DBS codificadas.

– Controles negativos y positivos de DBS del CDC.

– Informar los resultados en 4 semanas.

– Análisis de todos los informes y envío de reporte final a cada laboratorio.

– Identificación de problemas y medidas correctivas en colaboración con CDC.

6666