DIAGNÓSTICO DE ENTEROPARASITOSIS HUMANAS

MÉTODOS DE ESTUDIO DE LAS

ENTEROPARASITOSIS

Prof. Adjta. Dra. Nora Fernández

Depto. Parasitología y Micología

IMPORTANCIA

Diagnóstico

- Enteroparasitosis sintomática

- Detección precoz, asintomática.

Diagnóstico diferencial de infecciones entéricas: parasitarias, bacterianas, virales.

Diagnóstico diferencial con otras patologías del tubo digestivo.

Instaurar el mejor tratamiento (específico).

Valorar respuesta al tratamiento.

Prevención.

COPROLOGÍA

Del griego ´´kopros´´: excremento, estudio de las materias fecales.

Comprende la observación microscópica, macroscópica y el análisis químico de las materias fecales (coprofuncional).

El examen de las heces tiene su indicación clínica en las diarreas, en procesos que cursan con insuficiencia digestiva o en los que se busca un agente etiológico:

Coprovirológico

Coprocultivo

Coproparasitario

COPROPARASITARIO

Se trata de un conjunto de técnicas complementarias, quepermiten demostrar la presencia de las diferentes formasevolutivas de los protozoos y helmintos enteroparásitos:esporas, trofozoítos, quistes, ooquistes, huevos, larvas yadultos.

Se utiliza también para el diagnóstico de parasitosis de

glándulas anexas Ej.: hígado. En la fascioliasis los huevos

de Fasciola hepatica son eliminados con las heces.

CONJUNTO DE TÉCNICAS ?

No existe un único método capaz de demostrar todas las formas evolutivas parasitarias

Diferente morfología y ciclos.

Diferencias estructurales y tintoriales.

Diferencias en la viabilidad debido a : pH, tratamientos farmacológicos, etc.

Distinta localización en el tubo digestivo por lo que su distribución y ubicación de los parásitos en el bolo fecal será diferente: centro o en la periferia.

Variaciones en la resistencia de las formas evolutivas.

La eliminación intermitente hace que existan períodos negativos.

ETAPAS DEL PROCESO DIAGNÓSTICO

PREANALÍTICA: está sujeta a mayor porcentaje de errores,insume mayor tiempos e involucra solicitud, asesoramiento,,obtención, almacenamiento, transporte y recepción en ellaboratorio.

ANALÍTICA: corresponde a la realización delprocedimiento diagnóstico.

- Incluye: elección de los métodos, la estandarización, larealización de control de calidad, etc.

POSTANALÍTICA: interpretación de resultados, validación,emisión del informe.

FASE ANALÍTICA

TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS EN LAS

ENTEROPARASITOSIS

IMPLEMENTACIÓN DE TÉCNICAS

Planta física del laboratorio, equipamiento, insumos, costos

“racionalización”.

Recursos humanos capacitados y entrenados.

Tiempo.

Actualmente existen diferentes metodologías diagnósticas

con diferente costo, utilidad, simplicidad y sensibilidad.

ELECCIÓN

Se debe tener presente la población y el objetivo del estudio:

Diagnóstico: orientación de acuerdo a los datos clínicos:

- Edad, procedencia, antecedentes personales; patológicos;

familiares; ambientales: acceso al agua potable,

saneamiento; control de tratamientos: antiparasitarios;

otros tratamientos : antidiarreicos, laxantes, etc.

Estudio epidemiológico: guarderías, escuelas, asentamientos,

población rural, hospitales, residencias para ancianos, carné

de salud para manipuladores de alimentos, viajes, etc.

Investigación:

‾ Especies y variedades

‾ Fármacos

OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

DE HECES PARA COPROPARASITARIO

Emisión

‾ Espontánea.

‾ Se puede administrar laxantes salinos, no oleosos (vaselina, glicerina).

‾ No luego de estudio radiográfico c/bario.

‾ No en período menstrual.

Régimen alimentario

- Hay quienes indican durante las 48 -72 hrs previas a la recolección de la

muestra no ingerir frutas, verduras y grasas. Desde nuestro punto de vista

no es necesario.

Cantidad de muestra

- Aproximadamente 50 grs (tamaño de una nuez) para heces formadas;

liquidas al menos 4 mL (10-15 mL).

- En frasco de plástico limpio de boca ancha y tapa rosca.

- Rotulada con nombre paciente, C.I, Nº registro del

laboratorio.

- La de la mañana o la noche anterior, conservación en

heladera hasta 24 horas (sin conservantes).

- Muestra inadecuada aquella que se mantuvo más de 24 hrs a

temperatura ambiente.

- Si se utilizan sustancias para conservar la muestra, tener en

cuenta sus efectos sobre las formas evolutivas y

contaminación del medio ambiente.

- Evitar contaminación con orina, detergentes, hipoclorito de

Na +.

- La fermentación altera trofozoítos y las larvas de

Strongyloides stercoralis.

OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

RECOMENDACIONES PARA USUARIOS

No dejar las heces expuestas al aire

Cada laboratorio debe tener sus pautas

Debe existir comunicación entre :

‾ mensajero-recepcionista-técnicos-médicos-enfermeras

Se deben examinar lo mas rápido posible (condición ideal).

Cuando se reciben varias muestras al mismo tiempo, sedeberá separar las que son líquidas, tienen pus, mucus osangre, y deberán ser examinadas antes que las demás, yaque puede haber trofozoítos de amebas, los que con eltranscurso del tiempo pierden movilidad.

RECOMENDACIONES PARAPERSONAL TÉCNICO-NO TÉCNICO

NÚMERO DE MUESTRAS

Existen varios criterios al respecto.

Para diagnóstico de enfermedad por enteroparásitos

COPROPARASITARIO SERIADO 3 MUESTRAS

- Separadas c/3-7 días.

Se considera que una única muestra tiene una sensibilidad

del 40%-60%, ya que existen períodos negativos por los

propios ciclos biológicos de los enteroparásitos (eliminación

intermitente).

Múltiples muestras de material fecal, aumenta la probabilidad

de hallazgo.

Concentración de múltiples muestras en un solo examen.

Aplicación de un algoritmo ante la presencia de un resultado

negativo y la persistencia de síntomas.

POSITIVA

• Diagnóstico y mejoría con tratamiento. No justifica 2 muestra

• NEGATIVA

• Desaparición de los síntomas; se halló otra causa.

• Sin otra causa ni mejoría: solicitar 2 muestra

POSITIVA

• Diagnóstico y mejoría con tratamiento. No justifica 3 muestra

• NEGATIVA

• Desaparición de los síntomas; se halló otra causa.

• Sin otra causa ni mejoría: solicitar 3 muestra

POSITIVA

• Diagnóstico y mejoría con tratamiento.

• NEGATIVA

• Desaparición de los síntomas; se halló otra causa.

• Sin mejoría y firme sospecha de enteroparasitosis, evaluar detección de coproantígenos, Acs, realización de sondeo duodenal, biopsia, etc.

ALGORITMO CLÍNICO-PARASITOLÓGICO

1

2

3

ESTUDIO DE ENTEROPARÁSITOS

Métodos directos:

Coproparasitario

Coloraciones

Detección de coproantígenos

Método de Graham (espátula adhesiva)

Métodos Indirectos:

Detección de anticuerpos (Acs) en suero.

Utilizados para amebiasis, fascioliasis, estrongiloidiasis y

esquistosomiasis, etc.

1- MACROSCÓPICO

PARÁSITOS

PSEUDOPARÁSITOS

SANGRE

MUCUS

PUS

COLOR

CONSISTENCIA

LIENTERIA

2 –MICROSCÓPICO

a) Directo en fresco c/ SF

Heces s/concentrar

b) Técnicas de concentración

Para heces

c) Directo en fresco c/ colorantes: lugol, azul de tionina, etc.

d) Recuento de huevos

e) Coloraciones permanentes

f) Método de Graham

COPROPARASITARIO

COPROPARASITARIO

3

INMUNOLÓGICOS

Detección de coproantígenos

5

BIOLOGÍA

MOLECULAR

PCR

4

CULTIVOS

INVESTIGACIÓN

Laboratorios de referencia *

6

MICROSCOPÍA

ELECTRÓNICA

INVESTIGACIÓN

Laboratorios de referencia

Depende de la dieta y de la ingesta

de agua.

1 y 2 indican constipación.

5-7 indican diarrea.

1- MACROSCÓPICO

2a- MICROSCÓPICO : directo en fresco c/ SF

formadas

pastosas

semi-líquidas

líquidas

quistes

trofozoítos

ooquistes

DATOS QUE APORTA

Las heces s/concentrar

Movilidad de trofozoítos y

larvas.

Células de mucosa intestinal.

Células inflamatorias.

Productos de una mala

digestión/ absorción de

alimentos.

2a - PREPARACION DEL EXAMEN DIRECTO

En portaobjetos colocar

1 gota de SF y otra de lugol.

Se hace una suspensión

c/ aprox. 2 mg de heces.

Se coloca un cubreobjetos de

24 x 24 mm y se observa al

MO a 10 x y luego a 40 x.

La suspensión de heces

preparada debe permitir leer a

través de la preparación.

2a- MICROSCÓPICO : directo en fresco c/ SF

Quistes de Giardia lamblia

Huevos de Hymenolepis diminuta

Fundamento: aumentar el número de parásitos a

partir de un volumen de heces preestablecido.

Procedimientos

a) Sedimentación

b) Flotación

c) Biológicos

Cada uno posee ventajas y desventajas.

Sensibilidad variable para protozoos y helmintos.

2b- TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN

a) SEDIMENTACIÓN

Están basados en la utilización de agua u otros líquidos debaja densidad, recobrándose las formas evolutivasmicroscópicas de los parásitos, en el fondo de un y tubocónico, donde se depositan por ser más densos.

Sedimentación espontánea o simple

Sedimentación-centrifugación

Telemann (éter-ácido clorhídrico)

Carles y Barthélémy (éter -ácido cítrico)

Ritchie (formol-éter)

Se homogeniza 2-5 grs de heces en 10 mL de SF.

La mezcla se vierte en tubo cónico de 50 mL de capacidad, filtrándola

a través de gasa (se puede utilizar las unidades de filtración).

Se completa el volumen solución salina y se tapa.

Se agita y se deja reposar 45 minutos.

Se elimina el sobrenadante .

Se toma con una pipeta una muestra del fondo del tubo.

Se colocan 3 gotas en dos láminas portaobjetos diferentes y se cubre

c/laminilla.

Sensibilidad 55 %

No requiere centrífuga

Disponible http://www.uady.mx/sitios/biomedic/revbiomed/pdf/rb061722.pdf

TÉCNICA DE SEDIMENTACIÓN ESPONTÁNEA

TÉCNICA DE SEDIMENTACIÓN/CENTRIFUGACIÓN

MÈTODO DE RITCHIE

Fundamento: lavados/centrifugados sucesivos partiendo de

un volumen de heces preestablecido, para eliminar la mayor

cantidad de restos vegetales y grasas que estén presentes,

ya que pueden interferir en la visualización microscópica.

Es el más utilizado, por su reproducibilidad, sensibilidad y

bajo costo.

Con el transcurso del tiempo se han incorporado diferentes

variantes de la misma; también hay varios kits comerciales.

ÉTER

Tapón de

grasa y

restos

vegetales

FORMOL

10%

SEDIMENTO

RITCHIE FORMOL / ÉTER

También se usa

acetato de etilo

NO INFLAMABLE

VARIACIONES DEL RITCHIE

HOMOGENEIZADO

Proporción 1volúmen de materias fecales y 9 volúmenes de solución salina.

En heces líquidas no es necesario agregar SF, se agita el recipiente que contiene la muestra y se procede a la filtración.

FILTRACIÓN

En heces c/grasas o mucus, pueden quedar atrapados en la gasa, por lo que puede ser innecesario la utilización.

LAVADOS

Hasta 3 lavados.

KITS COMERCIALES DE SEDIMENTACIÓN/CENTRIFUGACIÓN

ASPECTOS COMUNES

Unidades de filtración

Limpios

Bioseguridad

DIFERENCIAS

tubos

c/ conservantes o sin

c/surfactante o sin

Cucharitas

Hisopos

bolsasCOSTOS

Reemplaza el embudo y la gasa.

Un vial 30 mL adapta a una unidad de filtración de 50 mL.

Los orificios del filtro miden 0,6 mm de diámetro, permitiendo el pasaje

de larvas, huevos, quistes y retiene la mayor parte de los desechos

fecales.

Surfactante Tritón X-100, disuelve y disgrega las heces y el mucus.

FECAL PARASITE CONCENTRATOR JUMBO EVERGREEN ®

FECAL PARASITE CONCENTRATOR JUMBO EVERGREEN ®

PARATEST ®

Utiliza como conservante formol tamponado al 5 %.

En un solo paso se procede a la dilución, filtrado y

concentración de la muestra.

Posee un filtro de 266 mm.

Disponibles 2 tipos más de conservantes: el SAF útil en

laboratorios que realizan la coloración tricrómica y el Greenfix ,

biodegradable, no contamina el medio ambiente ni es tóxico.

VIDEOS ON LINE

http://www.youtube.com/watch?feature=player_detailpage&v=Lu4Cq53l36Y

http://www.youtube.com/watch?v=01__FSqIqH8&feature=related

OTROS KITS COMERCIALES

b) FLOTACIÓN

Los elementos parasitarios se recogen de la superficie de unlíquido denso, a la cual ascienden por su menor pesoespecífico.

Flotación simple, Bass.

Faust (sulfato de zinc) huevos de helmintos, estudios detierra.

Sheather modificado ( azúcar) para coccidios.

Isospora

Cyclospora

Cryptosporidium

Sedimento

Película

superficial

Sulfato de

Zn

b) FAUST

FUNDAMENTO

Los elementos parasitarios se recogen de

la superficie de un liquido denso al cual

ascienden por su menor peso especifico.

CLASIFICACIÓN

Flotación Simple

Flotación / Centrifugación

c) BIOLÓGICOS

HARADA-MORI Strongyloides stercoralis

Fundamento:

Busca embrionar huevos de tremátodos y cestodos.

Separar larvas de nemátodos .

Sobre papel de filtro.

Agua destilada

Incubación a 20º C

Examinar luego de 3 días.

MÉTODO DE BAERMANN Strongyloides stercoralis

Basados en el conocimiento y la aplicación del ciclo vital del

parasito, fundamentalmente en formas juveniles.

Apropiado para el diagnostico de estrongiloidiasis.

Las larvas poseen termotropismo e hidrotropismo +.

Útil en coproparasitarios reiteradamente negativos.

c) BIOLÓGICOS

HARADA-MORI Strongyloides stercoralis

30-60% de sensibilidad para 1 sola muestra

c) BIOLÓGICOSMÉTODO DE BAERMANN

Gasa

Heces, tierra, cultivo: 8- 10 grs

Malla

Agua 40º C

Se deja por 60-90 minutos.

Las larvas sedimentan en el tubo.

Se abre la pinza, para obtener

gotas en portaobjetos, y se

observan al MO.

30-60% de sensibilidad para 1 sola muestra

2c- MICROSCÓPICO : directo en fresco c/ lugol

Quistes de Giardia lamblia

Forma vacuolar

Blastocystis hominis

Larvas de Strongyloides stercoralis

d) RECUENTO DE HUEVOS

Se utilizan para saber la intensidad de la infección de

helmintos transmitidos por el suelo.

Ascaris lumbricoides

Trichuris trichura

Hymenolepis nana, entre otros.

Tiene utilidad en estudios epidemiológicos y clínicos (eficacia

de tratamiento).

Cuantifican el número de huevos por gramo de materias

fecales (h.p.g):

- Leves

- Moderadas

- intensas

Recuento en placa microscópica

Sencillo, poco exacto.

Se realiza un ex. directo que contenga aproximadamente 2

mg de heces, se cubre c/ laminillas de 22 x 22 mm.

Se recorre toda la laminilla y el número de huevos se

multiplica por 500, el resultado se informa en h.p.g.

Técnica de Kato-Katz

Es el sugerido por la OMS, para diagnósticos individuales,

como para investigaciones epidemiológicas.

Más compleja, exacta.

Disponible kit comercial.

d) TÉCNICAS PARA RECUENTO DE HUEVOS

Heces frescas s/concentrar

Heces concentradas

Rotular con lápiz

Confección

Fijación: metanol

Luego de la coloración

pueden sellarse

e) COLORACIONES PERMANENTES: PREPARACIÓN DE FOTIS

1) Kinyoun

2) Kinyoun modificado

3) Safranina

4) Tricrómica

5) Tricrómica modificada

e) COLORACIONES PERMANENTES

1

5

3 4

2

Diagnóstico de oxiurosis : Enterobius vermicularis.

FUNDAMENTO

Sobre la base del ciclo biológico del agente, obtener

huevos de E. vermicularis que están en la región peri-anal.

Mediante la aplicación de un baja lenguas c/ cinta adhesiva

o paleta de plástico engomada, alrededor de dicha zona.

Durante 3 mañanas consecutivas.

Higiene la noche previa; no aplicar cremas.

Realizar el estudio en la mañana antes de que el niño se

levante.

Si usa pañal y a la mañana nota que está con materias

fecales : no realizar el estudio ese día.

No requiere refrigeración.

Lavarse las manos después de realizar la toma de muestra.

f) MÉTODO DE GRAHAM

f) MÉTODO DE GRAHAM

DETECCION DE COPROANTÍGENOS

Productos específicos parasitarios

Utilizan anticuerpos (Acs) mono o policlonales

Los Acs se inmovilizan en diferentes tipos de soporte

sólido: microplacas , membranas cromatográficas y otros

materiales inertes.

ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO

DETECCIÓN DE COPROANTÍGENOS

Duración del ensayo 1h:20’

Placas con AcMo proteínas específicas: de la pared quística, membrana, etc.

Giardia lamblia (GSA 65 CWP1)

Cryptosporidium sp

Entamoeba histolytica (lectina Gal/gal Nac)

Cualitativo.

VENTAJAS

> Sensibilidad

Estudios de campo

DESVENTAJAS

Costo

Equipos

INMUNOFLUORESCENCIA

Giardia lamblia

Crypstosporidium sp

Microsporidios

VENTAJAS

Mayor sensibilidad

DESVENTAJAS

Costo

Microscopio IF

INMUNOCROMATOGRÁFICOS

Heces frescas.

No concentradas.

Diluidas en buffer NaNO3 al 0,1%.

Ac conjugado con fosfatasa alcalina a un sustrato (indoxil fosfato) la reacción positiva da una línea azul.

AcMo ESPECÍFICOS

E.histolytica proteína 29kDa

G.lamblia a-l-giardina

C. parvum proteína disulfido isomerasa

Sensibilidad y especificidad menor para E. histolytica

FUNDAMENTO

Reacción Ag-Ac colorimétrica

Técnica cualitativa

DETECCIÓN DE ANTICUERPOS

Única herramienta: Estrongiloidiasis, Fascioliasis.

Herramienta complementaria: Amebiasis, Criptosporidiosis,

Giardiasis.

Se realizan en suero.

Presentan mayor sensibilidad que las técnicas clásicas.

VENTAJAS

Buena sensibilidad y especificidad.

Control de tratamiento, negativización/ quimioterapia eficaz.

Diferenciación especies de amebas.

Procesar gran número de muestras simultáneamente.

DESVENTAJAS: COSTOS

EN SUMA:

Recursos de cada laboratorio.

Población a estudiar.

Orientación clínica

Implementación de coloraciones permanentes.

Capacitación

Controles

Métodos tradicionales siguen siendo los de primera línea.

Racionalización de todos los recursos.

nfernandez@higiene.edu.uy