Sepsis Panorama Mundial, en Mxico, en Yucatn

Fisiopatologa

Diagnstico de Sepsis Generalidades

Estndar de Oro

Pruebas convencionales

Diagnstico Molecular para Sepsis Qu es?

Aplicacin en Medicina

Ventajas y Desventajas

Proyecto de Investigacin Diagnstico Molecular en Sepsis Neonatal: Un Reto

1-5/1,000*

6-9/1,000**

7.1-38/1,000**

6.5-23/1,000**

3.5-8.9/1,000***

Rodrguez, M.; Lpez, C.; Arredondo, J.; Gutirrez, P.; Snchez, F. Morbilidad y mortalidad por sepsis neonatal en un hospital de tercer nivel de atencin. Salud Pblica de Mxico 2003.** Vergnano, S.; Sharland, M.; Kazembe, P.; Mwansambo, C.; Heath, P. T. Neonatal sepsis: an International perspective. Archives of Disease in Childhood Fetal Neonatal. 2005.** Coronell, W.; Prez, C.; Guerrero, C.; Bustamante, H. Sepsis Neonatal. Revista de Enfermedades Infecciosas en Pediatra. 2009.

Lawn, J.; Cousens, S.; Zupan, J. Neonatal Survival 1: 4 million neonatal deaths: When? Where? Why?. The Lancet. 2005, 365, 891-900.

Mrida 4.3*

9.6%*

Mxico 4-15.4*

9%*

Sistema Nacional de vigilancia epidemiologica. Mortalidad Infantil. Perfil epidmeiologico de las defunciones por asfixia. 2006; 23 (45): 1-3

Leal YA. Risk Factors and Prognosis for Neonatal Sepsis in the Southeatern of Mexico: Analysis of a four years historic cohort follow-up. BMC

Pregnancy Childbirth.2012; 12 (1):48

Inicia como una repuesta inflamatoria sistmica del hospedero frente a una infeccin localizada por bacterias u hongos; la cual, si no es controlada progresa a una infeccin sistmica con invasin, a tejidos del hospedero normalmente estriles con un resultado de cultivo positivo o negativo

Sepsis Confirmada con Cultivo positivo (Sangre, orina, LCR)

Sepsis Clnica con Cultivo negativo (con manifestaciones clnicas)

De acuerdo a temporalidad: Sepsis Temprana: Ocurre dentro de los 3 das de vida

Sepsis Tarda : Ocurre

Bacteria/Hongo

TLRs

Respuesta Equilibrada Eliminacin de la bacteria.

Tejido recuperado

Respuesta no Equilibrada

Hiper-inflamacin Patologa mediado por

citoquinas Activacin de la coagulacin Activacin del complemento

Anergia Inhibicin de la sealizacin de

los TLRs. Apoptosis de clulas inmunes

Mortalidad temprana con disfuncin orgnica mltiple

Mortalidad tarda y/o desarrollo de infecciones secundarias

PAMPs

SIRS

Choque Sptico

FOM

Mejora Muerte

SEPSIS

Hemocultivo: Estndar de Oro

Permite el aislamiento del microorganismo y el perfil antimicrobiano.

Sensibilidad y Especificidad del 80 al 90% en muestras de 3 mL. Sin embargo, se ha estimado una Sensibilidad del 20 al 30 % en muestras de 1mL.

Gram positivos Gram negativos

Staphylococcus aureus Klebsiella spp.

Staphylococcus coagulasa negativo Escherichia coli

Streptococcus pneumoniae Pseudomonas spp.

Streptococcus pyogenes Salmonella spp.

Incubar de 35 a 37 C. Registra produccin de CO2

Aumenta CO2 Hemocultivo Positivo

(verde a amarillo)

Se mantiene CO2 Hemocultivo Negativo

Otras pruebas de Laboratorio

Reactantes de Fase Aguda:

PcR: Sen 40 90% y Esp 70 -80%

PCT: Sen y Esp 80 90%

VSG: Sen y Esp 80 90%

Relacin B/N: Sen y Esp 60 90%

Cuenta de Leucocitos: Sen 20-90% y Esp 30 al 95%

Cuenta de Plaquetas: Sen y Esp 10 90%

Desventajas pruebas de Laboratorio

En general tienen baja sensibilidad y especificidad

No cumplen con los requerimientos de un marcador ideal: rpido, econmico, fcil interpretacin de resultados, alta especificidad y sensibilidad, que permita correlacionar con la gravedad de la infeccin.

El diagnstico no se puede establecer con una sola de stas pruebas.

Durante la ltima dcada, se ha reportado sobre la amplificacin de cidos nucleicos mediante PCR para la identificacin de bacterias,

La incorporacin de esta prueba molecular podra facilitar un diagnstico ms oportuno en los RN, ya que la sensibilidad de la prueba microbiolgica es muy baja en neonatas

La prueba molecular mediante PCR tienen una alta sensibilidad y especificidad en la deteccin de bacterias y por lo tanto en el diagnstico de sepsis.

Tipos de Muestras

Mtodos de Extraccin de Acidos Nuclicos

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Revelado

Interpretacin

Sangre total

Suero

Plasma

Lquido amnitico

Criterios de una muestra ideal en la PCR

1. Escoger la muestra clnica apropiada para el diagnstico

2. Volumen adecuado para ser procesado

3. Eficiencia en la extraccin de ADN y en la amplificacin por PCR

4. La secuencia a analizar debe ser estable durante la recoleccin de la muestra

5. Evitar las contaminaciones

6. Debe ser procesada inmediatamente

Cualitativa

Mltiplex

Amplificacin simultnea de dos o

ms regiones de ADN en una sola reaccin

Anidado

Se realizan dos amplificacin de la misma regin

gentica

Cuantitativa

Tiempo Real

Es un anlisis cintico que registra los cambios

(fluorescencia) en cada ciclo de amplificacin.

Las secuencias de cidos nuclicos que se utilizan para identificar bacterias se dividen en:

Secuencias de DNA que codifican para antgenos

Secuencias de DNA que codifican para toxinas

Secuencias de DNA plasmdico

Secuencias de rRNA

Pueden utilizarse bajos volmenes de muestra

Alta sensibilidad y especificidad

Detecta bacterias viables y no viables

Reproducible

Es rpida de realizar

Diagnstico ms rpido

Costo elevado

No brinda el patrn de sensibilidad de las bacterias frente a los antimicrobianos.

Riesgo de contaminacin

Inhibidores en las muestras

Algunos mtodos para eliminar contaminantes pueden afectar la muestra.

Cules son los niveles sricos de los reactantes de fase aguda en el recin nacido con y sin sepsis?

Reactantes de Fase

aguda

Sin sepsis

N=63

Sepsis

N= 14 *p

PcR (mg/dL)** 0.32 0.44 1.90 4.58 0.18

Leucocitos (mm3) 14138 6262 14861 7618 0.41

Relacin

Banda/Neutrfilo 0.02 0.06 0.07 0.22 0.49

VSG (mm/h)*** 3.38 3.5 5.3 7.6 0.25

Plaquetas (mm3) 222453 65404 175076 68187 0.009

*Prueba de t Student

** Protena C reactiva

*** Velocidad de sedimentacin globular

Cules son los niveles sricos de los reactantes de fase aguda en el recin nacido con y sin sepsis?

*Prueba de t Student

** Protena C reactiva

*** Velocidad de sedimentacin globular

Reactantes de Fase

aguda

Mejora

N= 67

Muerte o Secuela

N= 10 *p

PcR (mg/dL)** 1.0 2.3 1.1 1.4 0.42

Leucocitos (mm3) 16352 18573 15020 18652 0.41

Relacin

Banda/Neutrfilo 0.02 0.10 0.009 0.015 0.28

VSG (mm/h)*** 8.8 7.8 10.5 10.8 0.28

Plaquetas (mm3) 342823 459867 247900 85889 0.25

Cul es el valor pronstico de las concentraciones sricas de IL6, IL8, IL10, IL-17 y TNF- durante la progresin del proceso sptico en neonatos?

Interleucinas

pg/ml

Sin sepsis

N=43

Sepsis

N=14

* p

IL6 49.97 70.85 120.76 166 0.04

IL8 52.96 71.52 34.01 20.84 0.49

IL10 11.00 20.53 34.01 20.84 0.35

IL17 19.60 28.15 20.10 24.13 0.22

TNF 18.55 28.18 15.24 14.35 0.027

*Prueba de t Student

Cul es el valor pronstico de las concentraciones sricas de IL6, IL8, IL10, IL-17 y TNF- durante la progresin del proceso sptico en neonatos?

Interleucinas

pg/ml

Mejora

N=67

Muerte o secuela

N=10 * p

IL6 88.06 550 21.31 18.67 0.35

IL8 74.44 177 41.12 29.22 0.27

IL10 10.34 14.92 6.78 3.76 0.05

IL17 17:26.36 37 5.58 6.37 0.001

TNF 29.86 13.99 13.99 18.47 0.02

*Prueba de t Student

* ANOVA de una va. Intervalo de confianza 95%

Reactante de

fase aguda

Sin infeccin

n= 16

Con infeccin

n=64

*p

Prematurez

extrema

Pre-trmino Pre-trmino

tardo

Prematurez

extrema

Pretermino Pre-trmino

tardo

PcR (mg(dL) 0.55 0.32

0.78 0.52 5.44 4.52 0.61 0.34 0.87 0.56 6.72 4.04 0.003

VSG (mm/h) 5.12 2.36 5.41 3.88 11.38 7.04 5.02 2.72 6.30 3.84 13.69 5.53 0.009

Leucocitos 20856 7359 16209 4159 14738 1837 21257 8434 17307 3878 15193 1765 0.003

Rel B/N 0.12 0.17 0.03 0.05 0.03 0.04 0.151 0.186 0.045 0.057 3.01 5.989 0.485

Plaquetas

(mm3) 201233 39343 203627 38105 257890 82193 195291 42761 259845 80486 271230 88437 0.063

Dentro de los reactantes de fase aguda el conteo de plaquetas puede ayudar al diagnstico de sepsis neonatal

En nuestros resultados preliminares documentamos un incremento de los niveles sricos de IL6 y una disminucin de TNF en neonatos con factores de riesgo para sepsis sugieren evolucin a gravedad del proceso sptico, en contra parte una disminucin de los niveles sricos de IL10, IL17 y TNF en sepsis grave sugieren un desenlace fatal o egreso hospitalario con secuelas

PcR, VSG y Leucocitos se observo una diferencia estadsticamente significativa entre los grupos de prematuro con y sin sepsis.

15%

85%

Positivo Negativo

Hemocultivos Solicitados

entre 2005 al 2011:

4269 solicitudes

Gram + Gram- Otros

77.08%

15.71%

7.21%

En 75 (12%) pacientes se aisl ms de

un microorganismo

Bacterias

579 =92.8%

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

80.0 72.4

18.3

2.7 5.0 1.7

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011

CoNS CoPS Streptococcus Enterococcus Otros

26.5 23.5

15.3 15.3

10.2 9.2

0.00%

5.00%

10.00%

15.00%

20.00%

25.00%

30.00%

28

56.2%

50%

16

22.2 18.7

16.7

12.5

36

0.00%

10.00%

20.00%

30.00%

40.00%

50.00%

60.00%

2005 2006 2007

Klebsiella pneumoniae Pseudomonas ssp

Enterobacter ssp Escherichia coli

Serratia marcescens Otros

28.5

43.7

50.0

10 12.5

42.8

25

16.6

30

6.25

50

0.00%

10.00%

20.00%

30.00%

40.00%

50.00%

60.00%

2008 2009 2010 2011 Klebsiella pneumoniae Pseudomonas ssp

Enterobacter ssp Escherichia coli

Serratia marcescens Otros

ANTIBITICO GRAM POSITIVOS

%

GRAM NEGATIVOS

%

Amikacina - 8.7 Ampicilina/Sulbactam 11.6 30.4 Ampicilina 91.1 47.8 Cefalotina 42.9 4.3 Cefepima - 30.4 Cefotaxima 42.9 47.8 Ceftazidima - 30.4 Ceftriaxona 11.6 47.8 Cefuroxima - 26.1 Clindamicina 52.7 - Eritromicina 71.4 - Gentamicina 62.5 21.7 Imipenem 64.3 4.3 Linezolid 0.9 0.0 Meropenem - 8.7 Oxacilina 75.9 - Penicilina 91.1 0.0 Piperacilina/Tazobactam 0.9

21.7 Vancomicina 1.8 -

ANTIBITICO GRAM POSITIVOS

%

GRAM NEGATIVOS

%

Amikacina - 82.6 Ampicilina/Sulbactam 7.1 21.7 Ampicilina 6.3 4.3 Cefalotina 0.9 - Cefepima - 65.2 Cefotaxima 0.9 39.1 Ceftazidima - 56.5 Ceftriaxona 7.1 43.5 Cefuroxima - 26.1 Clindamicina 30.4 - Eritromicina 21.4 - Gentamicina 24.1 69.6 Imipenem 7.1 73.9 Linezolid 44.6 Meropenem - 60.9 Oxacilina 14.3 - Penicilina 8.0 - Piperacilina/Tazobactam 5.4 52.2 Vancomicina 87.5 -

Aunque el hemocultivo continua siendo el estndar de oro para el diagnstico para sepsis ste muestra un porcentaje bajo de aislamiento.

Los microorganismos ms frecuentemente aislados son las bacterias CoNS los cuales presentan mayor sensibilidad y resistencia.

Los antibiticos que presentan mayor sensibilidad son Vancomicina para Gram-positivo y Amikacina para Gram-negativo.

Los antibioticos con mayor resistencia son Penicilina y Oxacilina para Gram-positivos; para Gram-negativo Amipicilina, cefotaxima y ceftriaxiona.

EL rRNA 16S BACTERIANO

La especificidad es dictada por el diseo de los dos oligonucletidos que hibridan

con las secuencias complementarias al ADN bacteriano.

Para la identificacin de las regiones conservadas se ha propuesto la utilizacin de

los oligonucletidos: RW01 y DG74, para amplificar un fragmento de 380 pb.

16S 23S 5S

1500 pb

2900 pb

100 pb

Nombre Secuencia del oligonucletido (5-3) Tamao

(pb)

RW01 AAC TGG AGG AAG GTG GGG AT 380pb

DG74 AGG AGG TGA TCC AAC CGC A

- Jordan, J. A.; Butchko, A. R.; Beth, M. Use of Pyrosequencing of 16S rRNA Fragments to Differentiate between Bacteria Responsible for Neonatal Sepsis. Journal of Molecular Diagnostics. 2005, -Jordan, J. A.; Durso, M. B. Real-Time Polymerase Chain Reaction for Detecting Bacterial DNA Directly from Blood of Neonates Being Evaluated for Sepsis. Journal of Molecular Diagnostics. 2005 -Persing, D. H.; Smith, T. F.; Tenover, F. C.; White, T. J. Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, 1a ed.; ASM Press: Washington, D. C., 1993 -Matar,G.; Khoudoud, V.; Fayad, M.; Mikati, M.; Abdelnoor, A. A two-step protocol for the identification of the etiology of bacterial meningitis in cerebrospinal fluid by PCR amplification of the 16s ribosomal RNA gene. Eastern Journal of Medicine. 1999

mpm (100 pb) 500 300 100

mpm (100 pb) 500 300 100

1 2 3 4

Amplificacin del gen ARNr 16S bacteriano. Carril 1. Marcador de

peso molecular (mpm) de 100pb, carril 2 control positivo, carril 3

muestra, carril 4 control negativo.

La identificacin de la regin ARNr 16S mediante PCR ha demostrado ser una prueba molecular muy sensible y especfica en la deteccin de sta regin bacteriana. En un futuro se podra considerar a la PCR y al hemocultivo en conjunto para su uso como pruebas de laboratorio de rutina en el diagnstico de la sepsis neonatal bacteriana

Dra. Martha Gmez

Jefe del Servicio de Neonatologa

UMAE-IMSS

Dra. Ana Lavadores May

Neonatologa-HGR IMSS

Dra. Nidia Diego Rodrguez

Neonatologa-UMAE-IMSS.

Personal Laboratorio Clnico del CMN Ignacio Garca Tllez Mrida. IMSS

Dra. Mara del Carmen Reyes S.

Neonatologa UMAE-IMSS

Dr. Abdi Oliva Garca

Mdico General-UAJ

Dra. Etna Paz Baeza.

Neonatologa-HGR-IMSS

PSS. Orlando Antonio Gernimo

PSS. Mara Palma Chim

Facultad de Qumica de la UADY