1.1.1. Determinacin de actividad enzimtica.

1.1.1.1. Actividad enzimtica de la polifenoloxidasa:

1.1.1.1.1. Extraccin enzimtica Para la extraccin enzimtica de la polifenoloxidasa se tomaron 4 g de pulpa de Obo. Los cuales se le adicionaran 0,4 g de polivinilpirrolidona y 20 mL de buffer de fosfato 0,05M pH 6,5 ; la mezcla se homogenizo durante tres minutos, luego se filtr en papel filtro No. 1, el filtrado se centrifugo a 12.000 rpm durante 20 min a 4C, el sobrenadante obtenido es el extracto enzimtico.1.1.1.1.2. Determinacin de Actividad enzimtica. Del sobrenadante obtenido se extrajo 400 microlitros y se mezclaron con 200 microlitros de buffer de fosfatos pH 7,0 ms 560 microlitros de solucin de catecol de concentracin 100 mM, el cual ser utilizado cmo sustrato, la mezcla se homogenizo durante 30 s, a continuacin se llevo a un bao termostatizado durante 3 min a 30C, inmediatamente se sac la muestra del bao termostatizado, fue leda la absorbancia a una longitud de onda de 420 nm, durante 30 min cada min, en un espectrofotmetro marca Genesys 10 UV-VIS.Para el blanco se realiz el procedimiento anterior y se remplaz la solucin de catecol por 560 microlitros de agua destilada. 1.1.1.2. Determinacin De La Actividad Enzimtica De La Peroxidasa1.1.1.2.1. Extraccin enzimtica

El extracto enzimtico se obtuvo pesando 5 g de Pupa de Obo y se le adiciono 25 mL de tampn fosfato 0.05 M a pH de 6.5, 1 g de polivinilpirrolidona y 250 microlitros de tritn X- 100 al 1.5 %; Se homogenizo a 18000 rpm por 6 min la mezcla se centrifugo a 4400 rpm por 15 min y luego 12000 rpm por 30 min a 4 C, el sobrenadante se utiliz como extracto enzimtico.1.1.1.1.1. Determinacin de Actividad enzimtica. Para la determinacin de la actividad enzimaica se prepar un blanco que contena 2.7 mL de tampn fosfato 0.05 M a pH de 6.5, 0.2 mL de guayacol al 1%, 0.1 mL de H2O destilada, se ley en un espectrofotmetro a una longitud de onda de 470 nm. Para la muestra, se agregaron 0.075 mL del extracto al blanco, remplazando el H2O por 0.1 mL perxido de hidrgeno al 1.5 %, y se ley la absorbancia cada 3 min por 30 minutos. La actividad enzimatica se determin como el cambio de absorbancia por min (Abs/min) bajo las condiciones de ensayo a 25C. La pendiente se calcul con la parte lineal de la curva (RUDRA, SHIVHARE, & BASU, 2008).