DETECCIN DEL ALELO HLA B27 AutoresDra. Flora Calzadilla Lugo Lic. Ral P. Ferreira Capote

DepartamentoOBJETIVO

Biologa Molecular y Gentica

Definicin con baja resolucin de la presencia o no del alelo HLA B27 Se realizar en individuos con diagnsticos presuntivos de espondilitis anquilosante o uvetis remitidos por las consultas de Reumatologa y Oftalmologa, respectivamente, del Hospital C.Q. Hermanos Ameijeiras. En el caso de un diagnostico presuntivo de espondilitis anquilosante, es requisito un factor reumatoide negativo previo. Se aceptarn casos de otras instituciones previa coordinacin con nuestro laboratorio. Se realiza la deteccin del alelo HLA B27 mediante la metodologa PCR conocida como cebadores de secuencias especificas (SSP, del ingls) utilizando una mezcla de 3 cebadores especficos para los distintos subtipos de este alelo que amplifican un fragmento de 149-150 pb. En el mismo tubo de reaccin se coamplifica como control interno un fragmento de 796 pb correspondiente al tercer intrn de DRB1. Un profesional Relacionados en el protocolo equipos comunes requeridos para el trabajo en Gentica Molecular Relacionados en el protocolo reactivos comunes requeridos para el trabajo en Gentica Molecular

Indicaciones

Breve descripcin

Personal requerido Equipos

Reactivos

Cebadores

Para la deteccin del alelo HLA B27

CdigoB280 B281 B282

Orientacin 5- 3GCT ACG TGG ACG ACA CGC T CTC GGT CAG TCT GTG CCT T TCT CGG TAA GTC TGT GCC TT

Para la amplificacin del control interno

CdigoR63 R64

Orientacin 5- 3TGC CAA GTG GAG CAC CCA A GCA TCT TGC TCT GTG CAG AT

ALELO HLA B27Preparacin de las soluciones especiales

Mezcla CPMCebador R63, 2000 g/mL . Cebador R64, 2000 g/mL . 3 L Agua destilada estril Rojo cresol, 6 mg/mL ... 2 mL 20 L 3 L

Primer Mx 62 (PM 62)Cebador B280 2000 g/mL . 10 L Cebador B281 2000 g/mL . 10 L Cebador B282 2000 g/ml . 10 LMezcla CPM .. 970 L

Buffer 10 X Base (670 mM Tris-HCl pH 8,9, 166 mM (NH4)2 SO4, 1 % v/v Tween 20) Disolver 40,568 gramos de Tris base y 10,96 gramos de sulfato de amonio en 400 mL de agua destilada y ajustar a pH 8,9 con HCl Filtrar a travs de un filtro de 0,22 micras en un frasco estril. Aadir 5 mL de Tween 20 y llevar a 500 mL con agua destilada estril. Preparar alcuotas de 10 mL y conservar a 70oC. Buffer 10 x Base MgCl2, 25 mM Sacarosa, 8,33% dATP, 100 mM dCTP, 100 mM dGTP, 100 mM dTTP, 100 mM Toma de muestra 0,668 mL 1,104 mL 1,324 mL 16,8 L 16,8 L 16,8 L 16,8 L

Buffer TDMH

Colectar 1 mL sangre perifrica en tubo conteniendo 20 L de EDTA 5.6% La muestra se conservar en refrigeracin hasta su procesamiento, el cual debe realizarse en un plazo no mayor de 48 horas despus de la toma de muestra. Se realizar utilizando el mtodo de precipitacin salina miniescalado descrito en el protocolo con cdigo salting out micro. Cumplir las normas establecidas en el documento Buenas Prcticas de Trabajo en Pre-PCR Rotular tubos de PCR de 0.2 mL estriles con el cdigo de cada paciente, preparando por lote adems uno correspondiente al control positivo y otro al control negativo. Preparar en microtubo estril la siguiente mezcla de reaccin:

Extraccin del DNA

Preparacin de la mezcla de reaccin y amplificacin

SolucinBuffer TDMH Primer Mix 62 Amplicen

Para un individuo (L)3 5 1

Para n individuos (L)3(n+1) 5(n+1) (n+1)

Donde: n = N de muestras a estudiar en el lote (incluye los controles)

Dar toque de vortex, toque de centrifuga y aadir en cada uno de los tubos un volumen de 9 L de la mezcla de reaccin Aadir en cada uno de los tubos una gota de parafina lquida y tapar los tubos. Se transportan los tubos sobre hielo hacia el rea de extraccin de DNA y se les aade 2 L de la muestra de DNA 50 ng/L de sus respectivos individuos y controles. Se da toque de centrfuga a los tubos y se colocan en el termociclador, garantizndose que queden bien justos en los pozos. Correr el siguiente programa de PCR: 960 C x 60 segundos cinco ciclos de 960 C x 20 segundos 700 C x 45 segundos 720 C x 30 segundos Cuatro ciclos de 960 C x 30 segundos

50 C x 60 segundos 720 C x 90 segundos Deteccin de los fragmentos amplificados Cumplir las normas establecidas en el documento Buenas Prcticas de Trabajo en Post-PCR Retirar los tubos del termociclador y darles toque de centrfuga antes de abrirlos. Aadir en cada tubo 2 L de buffer de carga conteniendo bromofenol azul y dar toque de centrfuga. Cargar todo el contenido de cada tubo (aproximadamente 12 L) en pozos independientes de un gel de agarosa 2 % en buffer 0,5 X TBE y sumergido en el mismo buffer, ambos conteniendo 0,5 g/mL de bromuro de etidio. Cargar en pozo independiente 10 L del marcador que contiene fragmentos de 204 pb y 314 pb. Realizar la corrida hasta que el colorante migre aproximadamente 3-4 centmetros. La presencia del fragmento de aproximadamente 150 pb en el control negativo invalida todo el lote por indicar contaminacin con producto amplificado. La ausencia del fragmento de aproximadamente 150 pb en el control positivo pone en duda el resultado negativo de algn caso. Ausencia tanto del fragmento correspondiente al control interno como del fragmento de 150 pb exige la repeticin del estudio en dicho individuo. La presencia del fragmento de 150 pb indica independientemente de la presencia o no del control interno positividad,

Interpretacin de los resultados

La presencia de un fragmento de tamao diferente a 150 pb, independiente de la presencia o no del control interno, exige la repeticin del estudio en dicho individuo. La presencia solo del fragmento correspondiente al control interno indica negatividad Se informar como presencia o ausencia del alelo HLA B27 Un mes

Informe de resultado Plazo de entrega