Detección de patógenos en acuicultura - … · (artemia, ostra, calamar y gusano de sangre) 20 mg...

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1Detección de Patógenos en Acuicultura -NHerrera

Webinar 30 de marzo 2017

DETECCIÓN DE PATÓGENOS EN ACUICULTURA

CASO EMS

NIMIADINA HERRERA TRISTAN

Bienvenidos a nuestro primer Webinar sobre temas de interés para la detección de patógenos en acuicultura, esperamos este sea uno de los muchos que tendremos y para actualizarnos un poco y a la vez homologar las prácticas de detección y diagnostico que llevamos a cabo por las tecnologías de PCR que orgullosamente distribuimos.

A nombre del Lic. Juan Albier nuestro gerente general, agradecemos profundamente que se hayan tomado el tiempo para participar con nosotros.

Mi nombre es Nimiadina Herrera para los que no me conocen soy Bióloga con más de 24 años de experiencia en laboratorios de Biología Molecular y desde 1999 asesora científica de la compañía Sea Technology Inc. Estoy certificada por la compañía fabricante de los productos IQ2000, IQREAL E IQ PLUS como capacitadora para toda la línea de productos y equipos.



TRANSPORTAR LA PCR DESDE LA MESA DE TRABAJO EN EL LABORATORIO

A LA FINCA.

Del laboratorio a la finca, el propósito del desarrollo de esta tecnología es acercar la ciencia al punto de Atención, al sitio donde tenemos problemas. Es más eficiente una detección temprana que esperar días para que el laboratorio central o externo nos de su resultado. Igualmente usted puede hacer confirmatorios con el laboratorio Central o local, una vez encuentre muestras positivas.



POCKIT EXPRESS

cubeemini centrifuga

Pipetas

Analizador de Acidos Nucleicos

1000ul

50ul

El Pockit es un Termociclador portátil puede ser llevado al mismo sitio cerca del estanque como lo apreciamos en la diapositiva. Un laboratorio portátil con todo lo que se requiere para realizar una amplificación en 1.5 hora. Contamos con otros dispositivos que hacen aun su vida más fácil y de los que les hablaremos más adelante-



MUESTREO1. Relacionado con las enfermedades de la lista de la OIE

2. Fines:

a. vigilancia; b. “certificación” de existencias o de la instalación

c. diagnóstico de la enfermedad.

La OIE, OIRSA, la FAO han establecido normas y procedimientos para homologar la actividad de monitoreo de los animales en nuestras instalaciones. Estas normas elaboradas por equipos de expertos .Para poder obtener resultados exitosos y confiables mediante la amplificación de ácidos nucleicos es imprescindible la muestra.

¿Cómo la preservamos? , ¿qué tipo y cantidad de muestra?. ¿Cuáles son los fines para la detección, diagnósticos, de vigilancia, de manejo?, usted determina que tipo de actividad va a realizar y dentro de estas normas encontrará la forma correcta y óptima de obtener resultados confiables y útiles.



¿QUÉ MUESTRA TOMAR ?

• dependen de la enfermedad o agente patógeno por

detectar

• del tamaño de los animales

• el objetivo de los análisis, ✓ diagnóstico de una enfermedad manifiesta, ✓ una detección de portadores subclínicos del agente

patógeno o ✓ una toma de muestras para la vigilancia dirigida con el fin de

demostrar la ausencia de una determinada enfermedad.

Guía de la OIE para la Vigilancia Sanitaria de los Animales Acuáticos (Corsin et al., 2009) y

los capítulos sobre cada enfermedad en particular en este Manual Acuático.



¿CÓMO PRESERVO MIS MUESTRAS ?

• DNA – ETANOL 95% GRADO MOLECULAR

• DNA – Buffer de Lisis

• DNA – Congelado

• RNA – Muestras vivas

• RNA – ETANOL 95%

• RNA Later o Trizol

Este ejemplo muestra la relación correcta entre etanol y tamaño de muestra el preservante debe ser suficiente para que la muestras sea protegida hasta su uso, si este no será inmediato.

Otra formas de preservación son por congelamiento, el congelamiento debe ser rápido, con nitrógeno liquido o con hielo seco ya que si lo colocan en hielo normal demorara en congelarse y para el RNA esto no es bueno. Las muestras en etanol pueden permanecer a temperatura ambiente o en hielo normal sin descongelar hasta arribo al sitio de extracción.

Otra sugerencia si usted lleva el proceso en el sitio, coloque la muestra en un tamaño apropiado directamente en el tampón de lisis.



TIPO Y CANTIDAD DE MUESTRA

El número y tipo de muestras que deben tomarse para el análisis varían en función de cuál fin se persiga.

Importante tomar el tejido adecuado donde se puede detectar el patógeno, la cantidad y la calidad de la muestra

son importantes

En el capítulo 1.1.4 de este Manual de animales acuáticos se describe la metodología para a la vigilancia y el

muestreo. El muestreo debe diseñarse de tal forma que se pueda realizar la detección en animales

infectados con un margen de confianza del 95%.



UNA TÉCNICA 100% SENSIBLE Y ESPECIFICA, PCR.

De acuerdo a la OIE, en el Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos pág.. 385 Especifica que para una técnica como la PCR con alta sensibilidad y especificidad para una prevalencia del 2% con una certeza del 95%. Por ejemplo en una población de 1000 animales una muestra representativa es de 140 animales.



TAMAÑO DE LA MUESTRAS DE ACUERDO AL TAMAÑO

DEL ESPÉCIMEN

Para las pruebas de detección de patógenos con las tecnologías que nosotros distribuimos estos tamaños de muestras son una buena referencia y permite no sobre saturar el sistema, al agregar mas muestra de la recomendada, este ejemplo sirve para todos los patógenos,. Recordar que cada patógeno tiene su órgano especifico donde se detecta en mayor cantidad y donde se localiza.

Para hacer agrupaciones de las muestras también debemos considerar las pruebas moleculares, se pueden agrupar cuando menos de 0,5 g. Se pueden agrupar muestras, especialmente PL o especímenes de hasta 0,5 g. Los camarones grandes no deben ser agrupados y deben ser procesados individualmente (Lightner, datos no publicados).

Tejidos y órganos asociados al intestino, como el hepatopáncreas, el estómago, el intestino medio, el intestino posterior y las heces son asociados a AHPND. Para los valiosos reproductores puede valer la pena sólo tomar las heces.



EMS- IQ PLUSTipo de muestras para la prueba del

kit seleccionado, en este caso el Kit

IQ PLUS AHPND/EMS Plásmido y

Toxina 1:• Tejidos de camarón (estómago,

intestino medio y hepatopáncreas),

• muestras fecales,

• post larvas (PL),

• agua de estanque • alimentos (incluyendo: artemia,

calamar, ostras y poliqueto).

Tipo de

muestraTamaño de muestra

Estomago 1 pieza

Intestino

medio1 cm

Muestra de heces

1 cm

< PL6 25-50 PLs

PL6-15 10-30 PLs

Agua del

estanque

1.5 ml agua del estanque;

Centrifugar la muestra a 12.000 x

g (12.000 rpm, r = 5 ~ 8 cm) o en

cubee durante 3 minutos.

Desechar el sobrenadante y

resuspender pellet en 100 μl de

PBS. Ir al procedimiento de

extracción paso 1

Tipo de muestra, cantidad y sensibilidad de 10 copias para todas las muestras con el Sistema IQ Plus iiPCR y también para IQ REAL. Si usted emplea la cantidad recomendada es seguro que sus resultados se verán como los esperados y sus decisiones serán eficientes. Podra usted tomar medidas rápida y oportunamente.



Muestra Cantidad de la

prueba

Límite de

detección (Copias

/ reacción)

Plásmido de ADN

de AHPND / EMS

50 copias / μl 100

<PL6 25-50 PLs 200

PL6 a 15 10-30 PL 200

Estómago 1 pieza 200

Intestino medio 1 cm 200

Hepatopancreas 10-25% 200

Estanque de agua 1,5 ml de agua del

estanque (véase la

sección V, parte c)

200

Organismo de

alimentación

(artemia, ostra,

calamar y gusano

de sangre)

20 mg 200

Muestra fecal 1 cm 200

3 4 5 6 7

Importante la cantidad de muestra de acuerdo al tamaño del individuo y a la sensibilidad del ensayo.

La tecnología transferida de la Universidad de Arizona, el grupo del Prof. Donald Lightner y la Universidad Nacional Cheng Kung, el grupo del Profesor Chu-Fang Lo, GeneReach ha desarrollado con éxito el Sistema de Detección y Prevención de Toxina 1 AHPND / EMS IQ2000 ™ para detectar el factor de virulencia, 1, y un marcador plasmídico asociado a AHPND / EMS (la región más estable del plásmido AHPND). Este sistema IQ2000 ™ sirve como una herramienta para detectar y diferenciar entre los plásmidos AHPND con y sin el factor de virulencia de la toxina 1 para facilitar la implementación del programa de control de enfermedades de camarón en la industria de cultivo de camarón.



En este video podemos ver la cantidad de muestra para correr una prueba de AHPND-EMS, de intestino y estomago, la cantidad pequeña de muestra que toma el presentados. Esto es importante sobre todo para la detección por iiPCR, cuya sensibilidad es de 10 copias.

Los mejores órganos o tejidos asociados al intestino, como el hepatopáncreas, el estómago, el intestino medio, el intestino posterior y las heces. Para los valiosos reproductores puede valer la pena sólo tomar las heces. Para IQPLUS los órganos seleccionados deben ser estomago, intestino e intestino con heces-



KIT IQ PLUSUN SOLO FORMATO – TODAS LAS ENFERMEDADES

El sistema de Detección IQ PLUS combina dos kits el de extracción todos los reactivos e insumos necesarios y el de amplificación con los reactivos, sondas, tampones y oligonucleótidos específicos para hacer una amplificación de los plásmidos y toxina relacionados con EMS.

El kit de plásmido AHPND / EMS IQ Plus ™ se dirige a un marcador de plásmido asociado a AHPND / EMS, la región más estable del plásmido AHPND, en camarones o entorno de cultivo basado en la tecnología isotérmica aislada de PCR (iiPCR). El kit de plásmido IQ Plus ™ AHPND / EMS está destinado a la detección y monitoreo de los plásmidos asociados a AHPND / EMS con o sin el factor de virulencia de la toxina 1 en camarones, agua, alimento vivo u otras posibles fuentes. Este kit está especialmente diseñado para ser utilizado en un instrumento compatible con iiPCR, el Analizados de Ácidos Nucleicos, POCKIT ™.

Un ensayo de diagnóstico PCR complementario dirigido a la secuencia de la toxina 1 del plásmido AHPND / EMS también está disponible en GeneReach.



PROCEDIMIENTOMuestreo

Preparacion de la Muestra

Extraccion de DNA/RNA

Disolver la premezcla

Agregar Acidos nucleicos

Corrida en el POCKIT

Resultados en la pantalla del POCKIT

15~20 minutes

57 minutes

15~20 minutes

Flujo de trabajo de la actividad desde la extracción hasta la presentación de los resultados en el POCKIT- IQPLUS



• 1. IQ2000™ Sistema para la Detección y Prevención del AHPND/EMS Toxina 1: Para detectar el factor de virulencia, toxina 1, y el plásmido asociado a la AHPND/EMS (la región más estable del plásmido del AHPND)

• 2. IQ REALTM Sistema Cuantitativo AHPND/EMS Toxina 1: Para detectar el factor de virulencia, de la toxina 1, y el marcador del plásmido asociado al AHPND/EMS- ( en la región más estable del plásmido del AHPND)

• 3. IQ Plus™ Kit para Detección de AHPND/EMS Toxina 1: Para detectar la IQ Plus™ la secuencia de la proteína Toxina 1 relacionada con la virulencia por AHPND/EMS en el plásmido en camarones de cultivos y en los ambientes de fincas,

• 4. IQ Plus™ kit para la detección del plásmido a AHPND/EMS: Para detectar y monitorear el plásmido asociado a Vibrio que puede o no contener el factor de virulencia la toxina 1.

Los reactivos de GeneReach para detección del Plásmido y la Toxina 1 relacionados con la enfermedad AHPND. Los tenemos en todas las tecnologías de PCR, Están diseñados basados en las publicaciones realizadas por los equipos de Asia y América, Dr. Flegel, Dra. Lo, Dr. Lightner y Dra. Nunan. Con la posibilidad de nuevos hallazgos estos kits también se actualizan de acuerdo a los cambios presentados, para detección del plásmido asociado a la enfermedad y del factor de virulencia toxina 1

Las sondas, los primers en el caso de iiPCR y IQ REAL, y los primers en el caso de IQ2000 bordean las regiones de interés tanto para el plasmido como para Pir A/B asi que los aminoácidos para estos estén presentes los resultados serán positivos si el limite de detección es alcanzado.



IQ PLUS™ AHPND/EMS TOXINA 1

IQ Plus™ AHPND/EMS Plásmido

Multiplex iiPCR para la detección cualitativa del plásmido o la

toxina 1 en muestras de tejido de camarón (estómago, intestino

medio), muestras fecales, PL, agua y alimentos vivos.

Los fluorocromos o fluoroforos son VIC para Plasmido y NED para el

IC en el kit de deteccion del plasmido. Para la deteccion de la

Toxina 1 los flouroforos son FAM Y NED.

Su uso es complementarios ya que cada Sistema tiene reactivos

para la deteccion del control interno de las muestras.

El ensayo se basa en iiPCR multiplex para la detección cualitativa del plásmido y la toxina 1. Además de cebadores específicos, la química de la sonda de la hidrólisis fluorogénica se utiliza para generar una señal fluorescente cuando la secuencia específica de la toxina 1 del plásmido AHPND / EMS está presente en las muestras. Los cebadores y la secuencia diana de la sonda del plásmido y no reaccionan con el ADN genómico del camarón y los ácidos nucleicos de otros patógenos. Los cebadores de control interno (IC) y la sonda se dirigen a un gen del hospedero los camarones Penaeidos.



UN LABORATORIO DE PCR PORTÁTIL

En la granjaEn el laboratorio de

diagnóstico



RESULTADOS DE LA PRUEBA

Mostrados en la pantalla

Data almacenada en la tarjeta SD

Los resultados son procesados por sistema óptico y transferidos a la pantalla táctil, donde usted podrá al patógeno en la longitud de onda 520nm y al hospedero el camarón en la 550nm. Para que el resultado sea valido, debe tener respuesta en 520 y 550, ya sea positivo o negativo.Si en una muestra de camarón observamos positivos a 520 y 550 es una muestra positiva para el patógeno; si observamos 520 negativo en el patógeno y 550 positivo, es una muestra de camarón negativa; si una muestra de camarón da negativo en 520 y 550 es una muestra inhibida y debemos revisar desde la extracciónLos resultados también se dan en una hoja de Excel en la tarjeta de memoria que encontrara en el Pockit, esta hoja nos sirve para hacer un historial de las muestras que analizamos.



INTERPRETAR LOS RESULTADOS

IQ2000

1-2 control positivo, 3 control negativo, 4 positivo ambos toxina 1 y plásmido; 5y7 negativo plásmido; 6 NTC;.



Formato IQ2000 IQ REALIQ PLUS

PLASMID

IQ PLUS

TOXIN 1 IQ2000

IQ

REAL

IQ PLUS

PLASMID

IQ PLUS

TOXINA

1

PLASMIDO 558 bp Ct 14 + + 0 Ct 35 - -

TOXINA1 252bp Ct 14 + + 0 Ct 35 - -

LIMITE DE

DETECCION

100

copias

10

copias

10

copias

10

copiasna na na na

Estos son los resultados esperados de acuerdo a la modalidad de PCR utilizada, IQ2000 ANIDADA, IQREAL TIEMPO REAL, y IQ PLUS iiPCR. Estos kits permiten identificar el plásmido, con o sin factor de virulencia, en el caso de IQ2000 E IQ REAL el mismo kit puede hacer la identificación, en tanto que, en IQPLUS tenemos dos versiones una para identificar el factor de virulencia toxina 1 y la otra para el plásmido que puede o no tiene el factor de virulencia. Al detectar ambos se confirma la existencia del camarón afectado, un positivo independiente sin el otro, solo indica la existencia de un riesgo.



Detección de blanco: AHPND-asociado al plásmido

Colección de muestras(intestine medio, estómago, heces, agua, alimentos

vivos, u otra possible fuentes)

Pruebas enel sitio

Positiva Negativa

•Contiene el plásmido asociado al AHPND• Debe hacer un confirmatorio con laboratorio central o local. •Procedimiento de emergencia que pueda ser aplicada a la finca.

•No contiene plásmido asociado al AHPND.•Debe continuar el monitoreo periódicamente.

Un ejemplo de flujo de trabajo a partir de la detección o no del plásmido en este caso.



Eficaz para controlar / prevenir la enfermedad infecciosa mediante la detección temprana -

Gestión de riesgos• Genera resultados rápidos

• Mejorar el nivel de seguridad biológica• Monitoreo en tiempo real

• Inicie el control de la epidemia temprano de forma oportuna

• Reducir las posibilidades de propagación de la enfermedad

• Minimizar las pérdidas económicas

Diagnóstico in situ (punto de atención):



¿CUÁNDO USARLO?

➢Cuarentena

➢Animales con síntomas

➢Crias debilitadas

➢Sospecha de brotes

➢Proyectos de Control o Vigilancia

➢Antes de Cruzar animales para crias

NLHT-09042013



Las áreas donde se lleva la actividad si bien es cierto no llegan a ser como un laboratorio central, si se debe conservar un mínimo en bioseguridad. Esto lo dan elementos de cómo los guantes desechables, como las puntas con filtro, el acceso a un mechero, etc. El personal que aplica la técnica debe estar preparado y con un mínimo de destrezas para manejar las pipetas y realizar las extracciones sin contaminación cruzada.



La documentación es importante para la toma de decisiones esta documentación debe venir desde el momento de la colecta hasta la identificación del extracto final, la preparación de pooles también es importante para poder hacer las detecciones dentro de los rangos estadísticos validos y recomendados.



El Termociclador en su área debe ser encendido antes de iniciar todo el proceso. La temperatura ambiental de funcionamiento esta entre 15 a 35 grados centigrados



TACOMINI

Extracción automática solo coloque el plato y 30 minutos después el extracto estará listo.



APLICACIONES DE IIPCR

Acuicultura Mascotas Ganado Seguridad de los alimentos

Amenazas

biológicas

para

humanos

La tecnología iiPCR esta desarrollada para un gran numero de aplicaciones en detección de patógenos, nuestro personal de ventas gustoso podrá contactarlos con los precios y los productos existentes.



PREGUNTAS1. Por qué se toma la muestra de la parte más distal del camarón, y no de

musculo más cercano.

R: Por ejemplo, en Mancha blanca el Pleópodo es un lugar donde se puede

localizar el patógeno, pero también es un área en la cual usted le causa

menos daño su usted desea preservar el camarón para reproducción. Es

utilizada frecuentemente para declarar los reproductores libres de

patógenos.

2. ¿Podemos sustituir el mechero por una cabina de bioseguridad?

R: No. Si usted tiene una cabina de bioseguridad la puede usar durante el

proceso de extracción, no obstante, el uso que le damos al mechero es para

desinfección de los instrumentos, con o sin cabina.

Se abre el tiempo de preguntas.



RESPUESTAS

4. ¿Para usar post larva tenemos que quitarles los ojos?

R: no a todas las PL hay que quitarles los ojos depende del tamaño- Los

pigmentos en los ojos que inhiben la PCR. Las Pls de .5 a 2 cm.

5. Para detectar EMS en IQ2000 se toman muestras de hepatopáncreas y de

estomago?

R: Dentro de los tejidos blanco para detectar AHPND, está el

hepatopáncreas,

6. Ya en el laboratorio, el proceso de extracción, cuáles son los puntos críticos

para evitar la contaminación.

R: Mantener las áreas limpias, utilizar mechero para limpiar los instrumentos

entre muestras o mantener un buen número de pinzas y tijeras, no reutilizar

ningún consumible, usar puntas de pipetas con filtro todo el tiempo. Usar

guantes todo el tiempo y cambiarlos entre procesos. Utilizar contenedores

para descartar todos los elementos inmediatamente se termine la sesión de

análisis de las muestras.



GRACIAS



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