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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
IZTAPALAPA i l - 9 T-
Desnaturalización de proteínas
inducida por temperatura y
desestabilizantes químicos
PROYECTO TERMINAL DE LA LIC. EN QUIMICA
POR:
MISAELA FRANCISCO MARQUE2
MAYO DEL 99
Este trabajo se realizó bajo la dirección de la Dra. Silvia Solís
Mendiola en el Area de Biofisicoquímica (R-209),
Departamento de Química, Universidad Autónoma
Metropolitana - Iztapalapa, División de CBI.
INDICE
INTRODUCCION
1. Proteínas
2. Caricaína, lisozima y tripsina
3. Dicroísmo Circular
4. Desnaturalización térmica
5. Desnaturalización por agentes orgánicos
6. Objetivos
7. Método experimental
8. Resultados y discusión
9. Conclusiones
1 O. Bibliografía
1
7
8
12
12
13
14
16
30
32
INTRODUCCION
l. Proteínas
Las proteínas son sustancias macromoleculares presentes en
todos los organismos vivos. Propiamente la palabra proteína deriva del
griego proteicos, que significa “primero”. Las proteínas son poliamidas,
las cuales por hidrólisis dan aminoácidos.
O O II 11 H20,H’
{-NHCHC-NHCHC-} + HNCHCOH + HNCHCOH etc. I I calor I I R R R R
Por lo común, sólo se encuentran veinte aminoácidos en las
proteínas en plantas y animales, sin embargo estos veinte aminoácidos
se pueden combinar en una gran variedad de formas, para originar
músculos, tendones, piel, uñas, plumas, seda, hemoglobina, enzimas,
anticuerpos y muchas hormonas.
Las masas moleculares de las proteínas van desde 10,000 hasta
más de 50 millones (I), se pueden clasificar de acuerdo al tipo de
función que desempeñan. Estas clases se resumen en la tabla 1. Las
I
función que desempeñan. Estas clases se resumen en la tabla 1. Las
proteínas fibrosas (llamadas también proteínas estructurales) están
compuestas por moléculas largas como hilo, que son resistentes e
insolubles.
Otro tipo de proteínas son las globulares. Estas son proteínas
pequeñas, algo esféricas a causa de plegarse las cadenas sobre sí
mismas. Las proteínas globulares son hidrosolubles y desempeñan
diversas funciones en el organismo. Por ejemplo, la hemoglobina
transporta oxígeno a las células, la insulina ayuda al metabolismo de
los hidratos de carbonos; los anticuerpos inactivan las proteínas
extrañas; el fibrinógeno (soluble) puede formar fibras insolubles, que
hacen que la sangre se coagule, y las hormonas llevan mensajes a
través de todo el cuerpo.
Las proteínas conjugadas, proteínas conectadas a una gran parte
no proteica tal como un azúcar, desempeñan diversas funciones en el
cuerpo. Un modo común de unión entre la proteína y la no proteica se
efectúa por medio de una función de la cadena lateral de la proteína
puede formar un éster con un grupo -OH de una molécula de azúcar.
2
TABLA 1 CLASES DE PROTEINAS
CLASE COMENTARIOS
Fibrosas o estructuras insolubles
Elastinas
Queratinas
Albúminas
Globulinas
Histonas
Protaminas
Forman tejido conectivo;
comprenden 30% de las proteínas
de los mamíferos; carecen de
cisteína y triptófano; ricas en
hidroxiprolina.
Forman tendones y arterias.
Forman pelo, pluma, uñas; ricas en
cisteína y cistina.
Ejemplos albúmina de huevo y
albúmina del suero.
Un ejemplo globulina del suero.
Se encuentran en los tejidos de las
glándulas y en los ácidos
nucleicos; ricas en lisina y argina.
Asociadas con ácidos nucleícos;
no contienen cisteína, metionina,
tirosina, triptófano, ricas en argina.
3
Los elementos presentes más abundantes en las proteínas son
carbono (50 a 55%), el hidrógeno (7%), el oxígeno (23%) y el nitrógeno
(16%). En la mayor parte de las proteínas se encuentra presente el
azufre, en una cantidad que va de 1 a 2%. El fósforo casi siempre esta
presente.
Los aminoácidos que se encuentran en las proteínas son ácidos
a-amino carboxílicos. La variación en las estructuras de estos
monómeros ocurre en la cadena lateral.
CO H I
H N-C-H l a R
El aminoácido más sencillo es el ácido aminoacético,
(H2NCH2C02H), llamado glicina, que no tiene cadena lateral y por
consiguiente no contiene carbono quiral.
Los aminoácidos se clasifican de acuerdo a su cadena lateral, los
que contienen grupos carboxílos se les llama aminoácidos ácidos y los
que tienen grupos amino, se clasifican como básicos. Estas cadenas
laterales ácidas y básicas ayudan a determinar la estructura y
reactividad de éstas. El resto se les conoce como neutros, algunas de
las cadenas contienen -OH, -SH u otros grupos polares, que pueden
aceptar enlaces de hidrógeno
4
A continuación se da la lista completa de los veinte aminoácidos,
en la tabla 2.
TABLA 2 AMINOACIDOS
Aminoácidos
Grupos R apolares alifáticos
Glicina Alanina Valina Leucina lsoleucina Prolina Grupos R aromáticos
Fenilalanina Tirosina Triptófano Grupos R polares sin carga
Serina Treonina Cisteína Metionina Asparagina Glutamina Grupos R cargados negativamente
Aspartato Glutamato Grupos R cargados positivamente
Lisina Arginina Histidina
Nombres abreviados
GlY G Ala A Val V Leu L Ile I P ro P
Phe F TYr Y T rp W
Ser S Thr T CYS C Met M Asn N Gln Q
ASP D Glu E
LYS K Arg R His H
5.97 6.01 5.97 5.98 6.02 6.48
5.48 5.66 5.89
5.68 5.87 5.07 5.74 5.41 5.65
2.77 3.22
9.74 10.76 7.59
5
La disposición o secuencia de los aminoácidos a lo largo de la
cadena determina la estructura primaria de una proteína y su identidad
única (1,2,3), esto se refiere al esqueleto covalente de la cadena
polipeptídica. Muchas de las propiedades se deben a la orientación de
la molécula como un todo, en la ordenación regular y periódica de una
dirección. La forma de hélice que adopta se le llama estructura
secundaria, la forma general de la proteína determinado por todos los pliegues, vueltas y bastón recibe el nombre de estructura terciaria. Se
podría suponer que una molécula de proteína larga y compleja, es
capaz de adoptar cualquier forma bajo una serie de condiciones
determinadas, pero este no es el caso. Algunos de los pliegues de la
cadena de la proteína dan lugar a disposiciones de energía más baja
(más estable) que otros patrones de plegamiento. La estructura
cuaternaria pone de manifiesto como se dispone en el espacio las
cadenas individuales polipeptídicas de una proteína que posee más de
una cadena.
La combinación de las estructuras, primarias, secundarias y
terciarias es la conformación de una proteína. Es la ordenación
espacial de los grupos sustituyentes que son libres de adoptar muchas
posiciones diferentes sin que se produzca ruptura de enlaces, debido a
la posibilidad de rotación alrededor de los enlaces simples de la
molécula
6
2. Caricaína, lisozima y tripsina
La caricaína, quimopapaína y papaína (4) se obtiene del látex de la
fruta de la papaya (Carica papaya), ha sido usado como fuente de las
proteinasas para uso industrial, por ejemplo, en la protección de
ablandadores de carne y prevención de la formación de turbidez en
bebidas. También, las proteinasas han sido de gran importancia
médica, por ejemplo en el tratamiento del prolapso de los discos
vertebrales.
La caricaína es el tercer constituyente proteolítico de látex de
papaya. Tiene 216 residuos de aminoácidos no contiene ningún
carbohidrato unido a su cadena polipeptídica y contiene 7 residuos de
cisteína de los cuales se forman 3 puentes disulfuro, (Cys-22-63, 56-95
y 153-204) y un residuo de cisteína libre (Cys-25) que es esencial para
la actividad cata1 ítica.
La lisozima provienen del huevo de gallina (lo), es una proteína
pequeña con 129 residuos de aminoácidos, la estructura se estabiliza
por cuatro puentes de disulfuro, éstos se mantienen durante la
desnaturalización, además esta proteína es reversible (1 O).
La tripsina es de origen animal (bovino) (1 9), esta proteína es
reversible a pH 3.0 y a temperaturas bajas, sin embargo a temperaturas
altas a un pH de 8.0 es irreversible, además pierde su actividad
enzimática a concentraciones altas de desnaturalizante tal como la
7
urea y clorhidrato de guanidina (GuHCI), se dice que alrededor de una
concentración de urea 4M retienen un 50% de su actividad. La tripsina
tiene 6 puentes de disulfuro (Cys-13-143; 31-47; 11 5-216; 122-1 89;
154-1 68 y 179-203) y tiene 229 residuos de aminoácidos.
TABLA 3 ALGUNAS PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS
Muestra Referencia Coeficiente Punto Masa
1 molecular de extinción isoeléctrico
(Da) (E M) (PI)
caricaína
24,000 tripsina
(4Y 10) 2.65 11.0 14,300 lisozima (4) 1.85 11.0 24,000
(1 Y W 1.48 10.1
3. Dicroísmo Circular
Dicroísmo Circular (DC) es una técnica (4) que nos sirve para
observar los cambios físicos como la estructura secundaria y terciaria
de una macromolécula, por lo tanto este método espectroscópico
resulta apropiado para estudiar los cambios conformacionales que
ocurren durante la desnaturalización de una proteína.
En moléculas hay por lo menos tres clases de asimetría que pueden
producir actividad óptica (8):
1. La estructura primaria puede ser asimetría. Por ejemplo, las
transiciones de los electrones próximos a los carbonos a de
8
aminoácidos y polipétidos serán ópticamente activas a causa de la
asimetría inherente en este punto; los carbonos a de muchos
aminoácidos tienen cuatro sustituyentes diferentes.
2. Las estructuras secundarias de muchos biopolímeros son
helicoidales. Esto puede producir actividad óptica en las transiciones
electrónicas, tanto de la cadena como de los grupos laterales
dispuestos helicoidalmente.
3. Las estructuras terciarias de una macromolécula puede ser tal que
un grupo intrínsecamente simétrico esté situado en un entorno
asimétrico. Por ejemplo, las transiciones de los electrones del anillo
en la tirosina son normalmente poco activas ópticamente, pero en
algunas proteínas globulares los alrededores de una tirosina situada
en el interior son tales que pueden producir electrónicos asimétricos
alrededor del anillo. Estos pueden desviarse del desplazamiento del
electrón en transición hasta producir fuerte actividad óptica.
Hasta la fecha el tipo de asimetría que ha recibido mayor atención
es el segundo; la influencia de la estructura secundaria helicoidal en la
actividad óptica.
A continuación se muestra un diagrama esquemático de un
espectropolarímetro (5).
I F M C P M0 ' M O I
m== R
F fuente MC monocromador
P prisma M0 modular
I haz incidente M muestra
D detector R registrador
y SE sistema electrónico.
10
La radiación de una fuente muy estable y de gran intensidad (F)
pasa a través de un monocromador (MC) y es polarizada en un plano
por un prisma (P). A continuación, el modulador (MO) actúa como
retardador de la fase de uno de los componentes de la radiación, la
variación en la fase depende de la señal eléctrica de alta frecuencia
que el sistema electrónico (SE) del aparato emite y que es recibida por
el modulador. De esta forma, el haz incidente (I) está alternativamente
formado por luz circularmente polarizada a la derecha y a la izquierda.
El haz atraviesa la muestra (M) y al emerger es convertido en una señal
eléctrica por el detector (D). El sistema electrónico calcula la diferencia
entre la absorción de la radiación circularmente polarizada en ambos
sentidos, convirtiéndola en el valor numérico de la elipticidad y
graficándola contra la longitud de onda en el registro (R)
Para determinar la elipticidad por residuo medio, [e] se calculó
utilizando una masa molecular de 110 g mol-’ por residuo, determinada
por la secuencia de aminoácidos de acuerdo a la siguiente relación:
[O] = 8 X 100 / c X I (grados cm2decimol-’ )
donde
[e] = elipticidad molar por residuo
8 = elipticidad en grados
c = concentración molar de residuos
I = longitud de recorrido óptico, en cm.
11
4. Desnaturalización térmica
Muchas moléculas proteicas sólo retienen su actividad biológica
dentro de una fluctuación muy limitada de temperatura y de pH, a
temperaturas elevadas que consiste en el desplegamiento de la
estructura nativa, característica de cada cadena polipeptídica de las
moléculas. La consecuencia más significativa de la desnaturalización
es que las proteínas pierden su actividad enzimática y un cambio
conocido como desnaturalización, el efecto más visible consiste en un
descenso de la solubilidad, pues los grupos hidrofóbicos ubicados en el
interior de la molécula quedan expuesto al solvente acuoso puesto que
en los enlaces químicos covalentes del esqueleto peptídico de las
proteínas no se rompe durante este tratamiento relativamente suave,
se ha llegado a la conclusión que la estructura primaria permanece
intacta. La mayor parte de las proteínas globulares experimentan el
proceso de desnaturalización cuando se calienta arriba de 60 y 70 "C
(5Y 9).
5. Desnaturalización por agentes orgánicos
Soluciones orgánicas como la urea o el clorhidrato de guanidina
(GuHCI) (2,3,4), son agentes desnaturalizantes de la proteína, el
desplegamiento está acompañado por la interacción no covalente del
agente desnaturalizante con las moléculas de proteína.
12
La desnaturalización necesita una alta concentración de urea y
clorhidrato de guanidina (6 M de GuHCl y 8 M de urea), lo que indica
que las interacciones no pueden ser ni fuertes ni específicas. La
desnaturalización es entonces una consecuencia particular de un
fenómeno termodinámico general, la unión preferencial de los
componentes del solvente a la proteína, es decir, una solvatación
preferencial, que se une preferencialmente a la proteína. En
consecuencia la acción del agente se define exclusivamente por el
balance entre las afinidades de la proteína con los agentes
desnaturalizantes.
6. Objetivos
a). Aislar y purificar la caricaína
b). Realizar estudios de desnaturalización térmica por dicroísmo circular
de la caricaína, lisozima y tripsina.
c). Realizar estudios de desnaturalización con urea y clorhidrato de
guanidina (GuHCI) por dicroísmo circular de la caricaína, lisozima y
tripsina.
13
7. Método experimental
Para seguir la desnaturalización de la caricaína, lisozima y tripsina
se utilizó un espectropolarímetro JASCO J-500 A con celda de 1 mm de
trayectoria óptica, con chaqueta de circulación de agua conectada a un
baño de agua HAAKE NK-22. La temperatura se registró directamente
en la celda óptica con un termómetro digital COLE-PARMER 8402-20. .
Se utilizó quimopapaína parcialmente purificada.. Se aislaron por
cromatografía líquida de intercambio catiónico de alta resolución,
(HPLC) Varian 9012/9050, las muestras de quimopapaína y caricaína.
Después se dializó la caricaína, para eliminar todas las moléculas
pequeñas, una vez que quedó totalmente pura se midió la
concentración, con la ayuda de un espectrofotómetro, donde se midió la
absorbencia a 280 nm y el coeficiente de extinción A’” 1.85, para
determinar la concentración de la caricaína.
Se realizaron estudios de desnaturalización con. la caricaína a
diferentes valores de pH (2.0, 2.5, 3.0, 3.5, y 3.9). Se colocaron en la
celda óptica 0.87 ml de la muestra y 1.23 ml de regulador de glicina
0.05M, para obtener una concentración aproximada de 0.1 1 mg/ml. Se
hicieron barridos de 260 a 190 nm a temperatura ambiente y a 60 “C.
Posteriormente se prepararon muestras de lisozima y tripsina a
las mismas concentraciones, repitiendo los mismos experimentos a pH
constante de 2.5, sin embargo para la lisozima también se hicieron a-un
pH de 2.9.
14
Después se realizaron estudios con la caricaína en presencia de
agentes desnaturalizaste como la urea y clorhidrato de guanidina, de
acuerdo con la siguiente tabla:
TABLA 1
Muestra
I caricaína
pH (regulador glicina
0.05M)
I caricaína I 3.0 I 6 y 8 M I I caricaína I 3.9 I 6 y 8 M I
Los espectros de dicroísmo circulador se obtuvieron a
temperatura ambiente antes y después de agregar la urea.
Con la lisozima y tripsina se hizo el mismo tratamiento con el
mismo agente desnaturalizante a pH constante como se muestra en la
tabla 2.
TABLA 2
lisozima
pH (regulador glicina 0.05M)
U rea
I
2.5 6 y 8 M 2.5 6 y 8 M
I
1s
Para finalizar se hicieron estudios de desnaturalización de las
proteínas, en presencia del clorhidrato de guanidina (GuHCI) 6M de
acuerdo a la tabla 3.
TABLA 3
Muestra (GuHCI) pH (regulador glicina 0.05M)
caricaína
6M 2.5 tripsina
6M 2.5 lisozima
6M 3.9 caricaína
6M 3.0 caricaína
6M 2.5
8. Resultados y discusión
Se obtuvieron los espectros por dicroísmo circular a temperatura
ambiente y posteriormente a una temperatura aproximada de 60 OC, en
regulador de glicina 0.05 M a diferentes valores de pH: 2.0, 2.5, 3.0, 3.5
y 3.9, en el intervalo de 190 a 260 nm.
En la figura 1 se observan cinco pares de gráficas que tienen la
misma tendencia en el estado nativo y en estado desnaturalizado, a
pesar de la variación del pH, con esto podemos decir que el efecto de
la variación de pH no desestabiliza a la macromolécula.
16
A temperatura ambiente, todos los espectros tienen la forma y
magnitud característica de la conformación nativa de la enzima (2 y 9),
a temperatura alta en las curvas se observa un mínimo alrededor de los
200 nm que es característico de la aparición de estructuras
desordenadas.
La diferencia entre los dos espectros es que en estado nativo la
proteína tienen forma globular, donde posee todas sus propiedades
biológicas así como su estructura, sin embargo a medida que aumenta
la temperatura ésta se va abriendo poco a poco para adquirir una
conformación aleatoria. En el estado desnaturalizado, la proteína ha
perdido su estructura secundaria, terciaria y también su actividad, pero
su estructura primaria probablemente queda intacta por el tratamiento
térmico relativamente suave (3 y 9).
La figura 2 muestra los espectros de dicroísmo circular a
temperaturas de 25 y 60 O C , en regulador de glicina 0.05 M, a dos
valores de pH 2.5 y 2.9, si observamos éstas curvas podemos decir
que en los dos estados nativo y desnaturalizado siguen el mismo
comportamiento y nuevamente el efecto del pH no desestabiliza la
enzima.
A temperatura ambiente, todos los espectros tienen la forma y
magnitud característica de la conformación nativa de la proteína, a
temperatura alta, también se observa un mínimo alrededor de los 200
nm (12).
17
CARICAINA
3
c .d
m O a
b13 2
grafica 1
O
-2000
-4000
-m -8000
- l o o 0 0
-12000
-14000 O
-2000
-4000
-6000
-8Ooo
- l o o 0 0 O
-2000
-4000
-m
-8000
- l o o 0 0 O
-2000
-4000
-m
-8000
- l o o 0 0
O
-2000
-4000
-6Ooo
-8000
- l o o 0 0
-12000 1 ‘ 9 0 200 2 I O 220 230 240 250 260
LONGITUD DE ONDA (nm )
O
-2000
-4000
-6000
-8000
- 1 O000
- 12000 O
-2000
-4000
-6000
-8000
- 1 O000
- 12000
190 200 21 O 220 230 240 250 260
LONGITUD DE ONDA (nm)
Figura 2: Desnaturaiización térmica de la lisozima por dicroísmo circular, en regulador de glicina 0.05M a pH 2.5 (LN) lisozima nativa, (LD) lisozima desnaturalizada.
19
La figura 3 muestra los espectros de dicroísmo circular de la
caricaína, lisozima y tripsina, en regulador de glicina 0.05 M, a pH 2.5, a
temperatura ambiente y 60 'C. A temperatura ambiente los espectros
obtenidos en la región del UV lejano (1 90-260 nm) tienen la forma y
magnitud característica de la conformación nativa de cada una de las
enzimas (7, 12 y 14). Por otro lado, a temperaturas superiores la forma
de las curvas de elipticidad es semejante entre ellas, donde se observa
un mínimo alrededor de los 200 nm, el cual nos indica la aparición de
estructura desordenada en la cadena polipeptídica. Las curvas de
elipticidad son semejantes a la observada con otras proteínas
desnaturalizadas térmicamente (1 3 y 14).
A continuación tenemos la desnaturalización de la caricaína por
agentes químicos, como se muestra en las figuras 4 y 5, en regulador
de glicina 0.05 M a diferentes valores de pH 2.5, 3.0 y 3.9, a
temperatura ambiente, las desnaturalizaciones se hicieron con
desestabilizantes fuertes, urea 6 y 8 M y con GuHCl 6.
En la figura 4 se muestran los espectros de DC, a diferentes
valores de pH, donde la desnaturalización se llevó a cabo a dos
diferentes concentraciones de urea 6 y 8 M, como podemos obsenrar
en los espectros a medida que se aumenta la concentración de urea, la
desnaturalilzación también aumenta. En ambas concentraciones de
20
urea, las curvas tienen un mínimo alrededor de 210 nm, pero a la
concentración de 8 M disminuye la magnitud de los espectros, lo cual
nos indica la desnaturalización completa de la caricaína.
La figura 5 muestra los espectros de DC de la caricaína a
diferentes valores de pH, a temperatura ambiente, donde la
desnaturalización se realizó con clorhidrato de guanidina 6 M. En
presencia de GuHCl las curvas tienen un mínimo alrededor de 215 nm
y disminuye notablemente la magnitud de los espectros, lo cual nos
indican la desnaturalización de la caricaína a menor concentración (6
M) -
Las figuras 4 y 5 muestran los espectros de la caricaína que
llevan la misma tendencia en el estado nativo, en el estado
desnaturalizado existen diferencias en los espectros con presencia de
urea y con clorhidrato de guanidina, donde podemos observar el
distinto comportamiento de los desestabilizantes orgánicos, lo que nos
indica que la (GuHCI) tiene una capacidad desnaturalizante mayor a la
urea (18).
21
O
-2000
-4000
-6Ooo
-8000
- l o o 0 0
O
-2000
-4000
-m -8000
- l o o 0 0
-12000 O
-2000
-4000
-m
-8000
- l o o 0 0 190 200 210 220 230 240 250 260
LONGITUD DE ONDA ( nm )
Figura 3: Desnaturalización térmica de las tres proteínas, en regulador de glicina 0.05M a pH 2.5. (CN), caricaína nativa, (CD) caricaína desnaturalizada, (LN) lisozima nativa, (LN) lisozima desnaturalizada, (TN) tripsina nativa y (TD) tripsina desnaturalizada.
22
h, w
[O] grados cm* decirnol-*
I I I I I
# m"-- /--
YD
2000
O
-2000
-4000
-m -8000
- l o o 0 0 M
e I 2000
E O O .M
8 -2000
Td -4000
S O U
-2000
-4000
-6Ooo
-8000
- l o o 0 0
-12000
c 7.
I f pH 3.0
190 200 210 220 230 240 250 260
LONGITUD DE ONDA ( nm )
Figura 5: Desnaturalización de la caricaína con clorhidrato de guanidina (GuHCI) 6M, regulador de glicina 0.05M, a diferentes pH. (CN) caricaína nativa y (CD) caricaína desnaturalizada.
24
Las figuras 6 y 7 muestran los espectros de dicroísmo circular, en
regulador de glicina 0.05 M a pH 2.5, a temperatura ambiente, la
caricaína, lisozima y tripsina se desnaturalizaron con urea 6 y 8 M y con
clorhidrato de guanidina 6 M, respectivamente. Los espectros en el
estado nativo de las diferentes enzimas siguen el mismo
comportamiento de la conformación nativa de cada enzima.
En la figura 6 se muestran los espectros de dicroísmo circular de
la caricaína, lisozima y tripsina, donde la desnaturalización se llevó a
cabo a diferentes concentraciones de urea (6 y 8 M) para cada una de
las enzimas. Podemos observar en los espectros que conforme
aumenta la concentración de la urea disminuye la magnitud de cada
una de ellas, pero difieren en su forma, teniendo un mínimo alrededor
de 210, 205 y 21 5 nm, respectivamente para la caricaína, lisozima y
tripsina. En la figura 7 se muestran los espectros de DC de las mismas
enzimas, donde la desnaturalización se realizó con clorhidrato de
guanidina 6 M, si observamos los espectros desnaturalizados con
guanidina podemos decir que disminuye notablemente la magnitud de
25
estos y difieren en su forma pero todos tienen un mínimo alrededor de
215 nm.
Por último tenemos la figura 8, donde presentamos los resultados
de desnaturalización de la caricaína a diferentes velocidades de
calentamiento 0.1, 0.3, 0.5, 1 .O y 1.5 'C/min. Estos estudios se hicieron
en DC, con regulador de glicina 0.05 M a un pH de 2.5, midiendo de
manera continua la temperatura y manteniendo constante la elipticidad
a 220 nm. A partir de los valores de elipticidad, éstos fueron
transformados a fracción desnaturalizada de la caricaína. Esta gráfica
muestra la transición del estado nativo al estado desnaturalizado, lo
cual es fuertemente afectada por la velocidad de calentamiento, con lo
cual se comprobó que es un modelo de dos estados.
26
O
-2000
-4000
-m
-8000
-8000 o g -lm % -12000
-2000
-4000
-m I I I I I I
190 200 210 220 230 240 250 260
LONGITUD DE ONDA ( nm )
Figura 6: Desnaturalización de las tres proteínas a temperatura ambiente con urea 6 y 8M en regulador de glicina 0.05M a pH 2.5. (CN) caricaína nativa, (CD) caricaína desnaturalizada, (LN) lisozima nativa, (LD) lisozima desnaturalizada, (TN) tripsina nativa y (TD) tripsina desnaturalizada.
27
2000 II
-4ooo
-6ooo
-8000
l o o 0 0
2000 O
-2000 -4000 -m -8000
-loo00 -12000 - 14000
f ?
1 I-
U W
O
-2000
-4000
-m
1 9 0 200 210 220 230 240 250 260
LONGITUD DE ONDA ( nm )
Figura 7: Desnaturalización de las tres proteínas con (GuHCI) 6M, en regulador de glicina 0.05M a pH 2.5, A temperatura ambiente (CN) caricaína nativa, (CD) caricaína desnaturalizada), (LN) lisozima nativa, (LD) lisozima desnaturalizada, (TN) tripsina nativa y (TD) tripsina desnaturalizada.
28
a 1.0 n
a
a
n 0 0.2
a N 7 0.8
CT
t- 7
w
7
0.6
0.4
-
L
m
-
o o a 0.0 CT LL 1 I I I I I
30 40 50 60 70 80
TEMPERATURA ( O C )
Figura 8: Fracción de la proteína desnaturalizada en función de la
temperatura, con una dependencia de la elipticidad a 220 nm.
Caricaína en regulador de glicina 0.02M y pH 2.5, a diferentes
velocidades de calentamiento.
29
En los procesos de desnaturalización de la caricaína, lisozima y
tripsina, existen diferencias en los espectros cuandose aumenta la
temperatura y en los espectros donde se induce la desnaturalización
por agentes desnaturalizantes. Por lo tanto, las proteínas globulares
estudiados, tienden a desdoblarse de acuerdo a la capacidad
desnaturalizante del clorhidrato de guanidina, urea y altas
temperaturas, donde los agentes orgánicos son desestabilizantes
fuertes (GuHCI > urea) y las altas temperaturas son desestabilizantes
menos fuertes.
Debido a lo anterior, podemos concluir que en la desnaturalización
térmica y la inducida por agentes químicos se rompen enlaces no
covalentes pero en diferentes proporciones y en el caso de la presencia
de los agentes desnaturalizantes el desdoblamiento es completo (16 y
17), y probablemente se rompan puentes disulfuro, además existen
interacciones no covalente al desplegamiento de la proteína con éstos.
Para la urea a altas concentraciones se lleva a cabo la
desnaturalización completa, resultando similar al desdoblamiento del
clorhidrato de guanidina.
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9. Conclusiones
La técnica de dicroísmo circular nos permite seguir físicamente la
desnaturalización térmica y la desnaturalización con agentes químicos
de la caricaína, lisozima y tripsina.
En el proceso de desdoblamiento térmico de la caricaína, lisozima y
tripsina, se observa un mínimo alrededor de los 200 nm que es
característico de la aparición de estructuras desordenadas.
En el estado nativo de la caricaína, lisozima y tripsina, todos los
espectros tienen la forma y magnitud característico de la conformación
nativa de cada enzima, a pesar de la variación del pH, con lo que
podemos concluir que el efecto del pH, en el intervalo estudiado, no
desestabiliza a la caricaína.
En el proceso de desdoblamiento de la caricaína, lisozima y tripsina,
inducido por agentes desnaturalizantes existen diferencias en los espectros con urea y con clorhidrato de guanidina, donde se puede
corroborar que la GuHCl tienen una capacidad desnaturalizante mayor
a la de la urea.
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