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UNIVERSIDAD DE OVIEDO Departamento de Biología Funcional Área de Microbiología DESARROLLO Y APLICACIÓN DE SISTEMAS VECTOR/HOSPEDADOR EN BIFIDOBACTERIAS Memoria presentada por Pablo Álvarez Martín para optar al grado de Doctor por la Universidad de Oviedo Oviedo – 2008 Este trabajo ha sido realizado en el Instituto de Productos Lácteos de Asturias
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UNIVERSIDAD DE OVIEDO
Departamento de Biología Funcional
Área de Microbiología
DESARROLLO Y APLICACIÓN DE SISTEMAS
VECTOR/HOSPEDADOR EN BIFIDOBACTERIAS
Memoria presentada por Pablo Álvarez Martín
para optar al grado de Doctor por la Universidad de Oviedo
Oviedo – 2008
Este trabajo ha sidoInstituto de Productos Láct
realizado en el eos de Asturias
Vicerrectorado de Convergencia Europea, Postgrado y Títulos Propios
Oviedo, 4 de Diciembre de 2007
EL TUTOR Director/a de la Tesis
Fdo: BARBES MIGUEL, COVADONGA LUDIVINA
Fdo: BALTASAR MAYO PEREZ
El Director del Departamento
Fdo.:
SR. PRESIDENTE DE LA COMISIÓN DE DOCTORADO DE LA UNIVERSIDAD DE OVIEDO
AUTORIZACIÓN PARA PRESENTACIÓN DE TESIS DOCTORAL Datos del alumno: Curso: 2007/2008 Apellidos: ALVAREZ MARTIN Nombre: PABLO DNI: 71767808B Domiciliado en: MOREDA-ALLER Teléfono: 985482453 Calle: BARRIO DEL CARMEN,P3-2ºD C.P. 33670 Datos Académicos:Programa de Doctorado cursado: Biología Funcional y Molecular Departamento responsable: BIOLOGIA FUNCIONAL Departamento en que presenta la tesis doctoral: BIOLOGIA FUNCIONAL Título definitivo de la Tesis: DESARROLLO Y APLICACIÓN DE SISTEMAS
VECTOR/HOSPEDADOR EN BIFIDOBACTERIAS
FOR
-OFE
-VC
E-02
4
Autorización del director/es de la tesis D/Dª: BALTASAR MAYO PEREZ Universidad: Autorización del tutor de la tesis D/Dª: BARBES MIGUEL, COVADONGA LUDIVINA Departamento: BIOLOGIA FUNCIONAL ResoluciónEl Departamento BIOLOGIA FUNCIONAL en su reunión de fecha 4 de Diciembre de 2007, acordó dar su conformidad para la presentación de la tesis doctoral a la Comisión de Doctorado, en cumplimiento de lo establecido en el RD 56/2005 de 21 de Enero. Asimismo el director/directores de la tesis doctoral, cumplen con el requisito establecido en el artículo 32.1.b del Reglamento de Tercer Ciclo de estudios universitarios, la obtención y expedición del título de Doctor y otros cursos de Postgrado, aprobado por Consejo de Gobierno de fecha 11 de julio de 2005 (BOPA 10.08.2005), y emiten el informe que se adjunta sobre la calidad científica de la misma, en cumplimiento de lo establecido en el R.D. 56/2005 y en el art. 35.1.a.bis del Reglamento de Tercer Ciclo de estudios universitarios, mencionado anteriormente.
AGRADECIMIENTOS
AGRADECIMIENTOS
Una vez escrita la tesis, y cuando prácticamente no te quedan neuronas para más, te das
cuenta que aún tienes que escribir los agradecimientos; uno de los apartados más
importantes de toda tesis, ya que, en la mayoría de los casos es el primer y/o el único leído
con verdadera atención por la mayor parte de la gente, comprobando siempre en que
posición aparece su nombre y que es lo que digo sobre su persona. Por lo tanto, para mi este
es un apartado muy importante y voy a intentar escribirlo con la mayor sinceridad posible:
Al doctor Baltasar Mayo Pérez como director de este trabajo, gracias por haberme acogido
en su grupo de investigación, por sus enseñanzas, por su cercanía, por todo lo que he
aprendido a través de nuestras charlas y sobre todo por su apoyo constante.
A la doctora Covadonga Barbes, mi tutora en la Universidad, por su ayuda en la revisión de
esta memoria, así como por sus sugerencias y consejos.
Al doctor Douwe van Sinderen por permitirme realizar una estancia en su laboratorio del
APC en Irlanda, a la doctora Mary O’Connell-Motherway por toda su ayuda y paciencia, al
resto de chicas del laboratorio por acogerme tan bien y en especial a Mati y Carlos por
todos los buenos ratos que pasamos juntos y por todas las pintas de Murphy’s que nos
bebimos.
A la doctora Gloria del Solar por permitirme realizar una estancia en su laboratorio del CIB,
por su inestimable ayuda en el aislamiento de ssDNA y sobre todo por sus consejos y
sugerencias a la hora de interpretar los geles. Gracias también a los compañeros de
laboratorio por hacerme sentir parte del grupo en tan poco tiempo.
Quiero también expresar mi agradecimiento al Dr. Juan Carlos Bada, Director del IPLA, por
permitirme realizar este trabajo en el centro y al resto del personal de instituto que de un
modo u otro ha colaborado en este trabajo y me han aguantado durante tanto tiempo casi
sin quejarse!
A todos mis compañeros del IPLA (espero no olvidarme de nadie), tanto de las “nuevas
generaciones”: Maria, Paula, Lore, Nuria, Fátima, Marina,… así como de la “vieja guardia”:
Luis, Susana, Nacho (del que aprendía recoger muestras de la bolsa del autoclave), Borja,
Noelia, Patri (gracias por tus inóculos de domingo), María, Carmen Madera, Alfonso
(maestro crackeador), Javi (el chico para casi todo), Miguel, Victor (el postdoc con todas
las respuestas) y en especial a Dani mi compañero de pupitre, con el que he compartido
muchas horas de música y también muchas “andanzas” y a Belén, que ha sido la mejor
compañera y amiga, tanto fuera como dentro del IPLA, que jamás hubiera podido imaginar
(Santi, como iplero consorte, para ti también va una parte). Gracias a todos por los buenos
ratos que hemos pasado juntos, por los viajes, por las cenas y las fiestas (míticos “viernes
IPLA”) y por haberme hecho sentir en el IPLA como en mi segunda casa durante todos estos
años. A todos gracias de verdad, os echare de menos!!
A mis amigos de Moreda, por no tener ni idea de lo que son las bifidobacterias, los
plásmidos ni los probióticos, pero estar siempre ahí para desconectar y tomarnos una
cervecilla.
A Caro, por estar siempre a mi lado y quererme tanto. Gracias por haber aguantado todos
mis lamentos, quejas y problemas y por ser mi principal punto de apoyo. Gracias mi princesa!!
Por último y en especial a mis padres, sin su apoyo y ayuda jamás hubiera llegado hasta aquí.
Gracias por haberme guiado y apoyado en mis decisiones, a ellos les debo la mayor parte de
todo lo que he conseguido.
A todos muchas gracias!!
ÍNDICE
ÍNDICE DE FIGURAS
ÍNDICE DE TABLAS
ABREVIATURAS
RESÚMENES
Resumen en español
Resumen en inglés
I. INTRODUCCIÓN 1
I.1. La microbiota del tracto gastrointestinal 1
I.2. El género Bifidobacterium 4
I.2.1. Características fenotípicas 5
I.2.2. Metabolismo de carbohidratos 7
I.3. Alimentos funcionales y probióticos 9
I.4. Uso de las bifidobacterias como probióticos 11
I.5. El genoma bacteriano 13
I.6. El genoma de las Bacterias del Ácido Láctico (BAL) 14
I.7. El genoma de las bifidobacterias 15
I.8. Plásmidos de bifidobacterias 18
I.9. Mecanismos de replicación 20
I.9.1. Mecanismo de replicación tipo círculo rodante (RC) 21
I.4.2. Mecanismo de replicación tipo Theta 24
I.10. Vectores 28
I.10.1. Vectores para las bifidobacterias 30
OBJETO DEL TRABAJO 33
II. MATERIAL Y MÉTODOS 35 II.1. Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de cultivo 35
II.1.1. Cepas bacterianas y plásmidos 35
II.1.2. Medios y condiciones de cultivo 35
II.1.3. Antibióticos 36
II.2. Obtención y manipulación de ADN 38
II.2.1. Aislamiento de ADN plasmídico 38
II.2.2. Electroforesis de ADN 38
II.2.3. Purificación de fragmentos de ADN 39
II.2.4. Digestión con enzimas de restricción 39
II.2.5. Ligación del ADN 40
II.2.6. Conversión de extremos cohesivos en romos 40
II.2.7. Electrotransformación de E. coli 40
II.2.8. Electrotransformación de bifidobacterias 41
II.3. Secuenciación de ADN y análisis de secuencias 42
II.3.1 Secuenciación automática de ADN 42
II.3.2. Análisis de secuencias 42
II.4. Análisis numérico 42
II.5. Técnicas de hibridación 43
II.5.1. Hibridación de ADN plasmídico 43
II.5.2. Detección de intermediarios de ADN de cadena sencilla 43
II.6. Técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 44
II.6.1 Técnica convencional de la reacción en cadena de la polimerasa 44
II.6.2. Técnica de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real 45
II.7. Determinación de la estabilidad segregacional de los plásmidos 47
II.8. Ensayos de resistencia a antibióticos mediante el método Etest 47
II.9. Determinación de actividad α-l-arabinofuranosidasa 48
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 51 CAPÍTULO 1: AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE pBC1 51
III.1. Determinación la presencia de plásmidos en cepas de bifidobacterias
del intestino humano 51
III.1.1. Clonación y secuenciación de pBC1 53
III.1.2. Organización general de pBC1 55
III.1.3. El gen repB y la proteína de replicación 56
III.1.4. El gen orfX-like, transcripcionalmente acoplado a repB 60
III.1.5. El gen copG-like 61
III.1.6. Regiones no codificadoras en el ori 62
III.1.7. Hibridación de ADN plasmídico de diferentes especies de
bifidobacterias con pBC1 65
CAPÍTULO 2: ESTUDIO FUNCIONAL DE LOS ELEMENTOS IDENTIFICADOS
EN pBC1 66
III.2. Análisis funcional de pBC1 66
III.2.1. Estabilidad plasmídica 69
III.2.2. Estimación del número de copias 71
III.2.3. Resistencia a cloranfenicol mediada por las construcciones
pBC1-pBif. 73
III.2.4. Deleción parcial del gen repB 73
III.2.5. Identificación de los intermediarios de ssADN en la replicación
de pBC1 75
CAPÍTULO 3: DESARROLLO DE VECTORES PARA BIFIDOBACTERIAS
BASADOS EN EL REPLICÓN DE pBC1 79
III.3. Plásmidos derivados de pBC1 79
III.3.1. Estabilidad plasmídica 83
III.3.2. Estimación del número de copias 83
III.3.3. Resistencia a eritromicina y tetraciclina mediada por vectores
derivados de pBC1. 84
III.3.4. Rango de hospedador 85
CAPÍTULO 4: ELECTROTRANSFORMACIÓN EN EL GÉNERO
BIFIDOBACTERIUM. 89
III.4. Estudio de las condiciones de transformación en el género Bifidobacterium 89
CAPÍTULO 5: APLICACIÓN DE LOS VECTORES DERIVADOS DE pBC1 92
III.5.1. Clonación y expresión del gen α-L-arabinofuranosidasa de B. longum 92
III.5.2. Expresión heteróloga en E. coli y B. pseudocatenulatum 94
IV. DISCUSIÓN GENERAL 97
V. CONCLUSIONES 109
Conclusiones en español 109
Conclusiones en inglés 111
VI. BIBLIOGRAFÍA 113
VII. ANEXOS 131
Entrada de la secuencia de pBC1 en GenBank
Artículos derivados del trabajo de esta Tesis:
- Screening for plasmids among human bifidobacteria species: sequencing
and analysis of pBC1 from Bifidobacterium catenulatum L48
- Functional analysis of the pBC1 replicon from Bifidobacterium
catenulatum L48
- Development and use of cloning vectors for bifidobacteria based
on the pBC1 replicon from Bifidobacterium catenulatum
ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Observación al microscopio electrónico de células de la especie Bifidobacterium longum. 5 Figura 2. Árbol filogenético de las especies y subespecies del género Bifidobacterium, obtenido a partir de la comparación de secuencias del genARNr 16S en la base de datos RDP. 7 Figura 3. Enfermedades y patologías sobre las que las bifidobacterias probióticas podrían ejercer un posible efecto beneficioso. 12 Figura 4. Diagrama del proceso de replicación de los plásmidos que utilizan el mecanismo RC. 22 Figura 5. Representación esquemática de la región de replicación de los plásmidos RC del grupo pLS1/pE194 y su control. 23 Figura 6. Diagrama del proceso de replicación de los plásmidos que utilizan el modo Theta de replicación. 25 Figura 7. Origen de replicación y mecanismos de control del grupo mayoritario de los plásmidos Theta de lactococos. 26 Figura 8. Electroforesis de los distintos perfiles plasmídicos obtenidos en las cepas de bifidobacterias analizadas y de plásmidos control de diferentes bacterias lácticas. 51 Figura 9. Restricción de ADN plasmídico de pBC1 con diferentes endonucleasas. 53 Figura 10. Mapa físico y genético de pBC1. 55 Figura 11. Distancia evolutiva medida como porcentaje de identidad aminoacídica de las proteínas RepB de todos los plásmidos de bifidobacterias secuenciados. 59 Figura 12. Secuencia nucleotídica del inicio del gen repB y de la región no traducida situada por delante del mismo. 64 Figura 13. Panel A: Electroforesis de los distintos perfiles plasmídicos obtenidos en las cepas de bifidobacterias analizadas y de plásmidos control de diferentes bacterias lácticas. Panel B: Hibridación del gel del panel A utilizando como sonda un fragmento del gen repB marcado con digoxigenina. 65 Figura 14. Distintos fragmentos de pBC1 generados por PCR y su posterior clonación en el vector pBif. 68 Figura 15. Estabilidad segregacional de los vectores derivados pBC1-pBif en las cepas B. pseudocatenulatum M115 y B. breve UCC2003. 70 Figura 16. Deleción parcial del gen repB mediante doble digestión con AarI y MluI y posterior religación. 74 Figura 17. Detección de intermediarios de ssDNA en la replicación de pBC1. 78 Figura 18. Vectores de clonación desarrollados a partir del replicón de pBC1. 82 Figura 19. Ensayo de estabilidad del plásmido pAM4. 83 Figura 20. Variaciones en la frecuencia de transformación de B. pseudocatenulatum M115 en función de las diferentes variables ensayadas. 91 Figura 21. Amplificación y clonación del gen abfB en el vector pAM1, generando la nueva construcción pAM-abfB. 93 Figura 22. Actividad específica α-L-arabinofuranosidasa de las cepas hospedadoras y las portadoras de la construcción pAM-abfB. 95
ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Principales géneros microbianos en heces humanas y su concentración estimada. 3 Tabla 2. Especies bacterianas usadas comúnmente como probióticos, entre paréntesis las cepas más conocidas. 10 Tabla 3. Características generales de los genomas secuenciados en las cepas de bifidobacterias. 16 Tabla 4. Plásmidos del género Bifidobacterium completamente secuenciados. 19 Tabla 5. Cepas y vectores utilizados en el presente trabajo. 37 Tabla 6. Oligonucleótidos utilizados en la secuenciación del plásmido pBC1. 44 Tabla 7. Oligonucleótidos utilizados en las reacciones de amplificación de PCR cuantitativa. 47 Tabla 8. Oligonucleótidos empleados para la amplificación de los distintos fragmentos de pBC1. 66 Tabla 9. Número de copias y concentración inhibitoria mínima para el cloranfenicol de los vectores derivados pBC1-pBif en las cepas B. pseudocatenulatum M115 y B. breve UCC2003. 72 Tabla 10. Concentración inhibitoria mínima ensayada en cepas de B. pseudocatenulatum M115 transformadas con los distintos vectores de clonación. 85 Tabla 11. Frecuencias de transformación, para el plásmido pAM4, obtenidas en diferentes especies de bifidobacterias. 86
ABREVIATURAS
Abreviaturas
(θ): Theta
A+T: Adenina + Timina
ADN: Ácido desoxirribonucleico
Ap: Ampicilina
ARN: Ácido ribonucleico
ARNm: ARN mensajero
ARNr: ARN ribosómico
ARNt: ARN de transferencia
BAL: Bacterias del Ácido láctico
CCC: “Covalently Closed Circular” (ADN
plasmídico en su forma superenrollada)
CIM: Concetración Inhibitoria Mínima
Cm: Cloranfenicol
Ct: Ciclo umbral
dNTPs: Desoxinucleótidos trifosfato
DR: Repetición directa
dsADN: ADN en doble cadena
DSMZ: “Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen”
(Colección Alemana de Cultivos Tipo)
dso: Origen de replicación de doble cadena
Em: Eritromicina
FAO/WHO: “Food and Agriculture
Organization/World Health Organization”
G+C: Guanina + Citosina
IPTG: Isopropil-β-D-tio-galactósido
IR: Repetición invertida
IS: Secuencia de Inserción
kbp: Kilo pares de bases
LMG: “Laboratotrium voor Microbiologie”
Universidad de Gante, Bélgica
Mpb: Mega pares de bases
MRSC: Medio de Man, Rogosa y Sharpe
suplementado con cisteína
NCBI: “National Center for Biotechnology
Information”, del Instituto Nacional de la
Salud de EEUU
OC: “Open Circular” (ADN plasmídico
circular pero no enrollado)
ORF: “Open Reading Frame” (Pauta abierta
de lectura)
ori: Origen de replicación
pb: Pares de bases
PCR: “Polimerase Chain Reaction”
(Reacción en cadena de la polimerasa)
RBS: “Ribosome Binding Site” (Sitio de
unión al ribosoma)
RC: “Rolling Circle” (Círculo rodante)
rpm: revoluciones por minuto
SC: “Start Codon” (Codón de iniciación)
ssADN: ADN en cadena sencilla
sso: Origen de replicación de la cadena
sencilla
Tc: tetraciclina
Tm: Temperatura de “melting” indicadora de
la fuerza de unión de un oligo a su secuencia
complementaria
TGI: Tracto gastrointestinal.
UCC: University College Cork, Cork, Irlanda
ufc: Unidades Formadoras de Colonias
UAE: Unidades de Actividad Específica
X-gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-
galactopiranósido
RESÚMENES
Resumen en español
Las bifidobacterias constituyen una de las poblaciones microbianas dominantes en
el intestino humano y de otros animales, donde ayudan a mantener el equilibrio microbiano
por medio de sus variadas actividades metabólicas, contribuyendo a mantener y preservar el
estado de salud. El conocimiento de estos mecanismos de probiosis es fundamental para
apoyar científicamente las supuestas acciones beneficiosas y el diseño y utilización racional
en los probióticos. Para llevar a cabo este propósito son necesarios sistemas
vector/hospedador adecuados así como mecanismos eficientes de transferencia génica. El
conocimiento acerca de los plásmidos de bifidobacterias así como su caracterización
molecular se revela fundamental para el desarrollo de nuevas y más versátiles herramientas
genéticas para el género Bifidobacterium.
Un total de 72 aislados de diferentes especies de bifidobacterias fueron analizadas
en busca de plásmidos, se encontraron seis perfiles plasmídicos distintos, dos de ellos con
un único plásmido y cuatro que contienen al menos dos. El plásmidos aislado de la cepa
Bifidobacterium catenulatum L48 (pBC1) fue seccionado para su posterior caracterización
debido a su pequeño tamaño y a su estabilidad. El plásmido se reveló como una molécula
circular de 2540 pares de bases con un contenido G+C del 64%. En el hipotético origen de
replicación se identificó una repetición de 24 nucleótidos repetida tres veces y media
además de cinco repeticiones invertidas, que recuerdan la organización de plásmidos theta
replicativos. El análisis de la secuencia también reveló la presencia de tres ORFs que
codifican para péptidos mayores de 50 aminoácidos: repB, que codifica para la replicasa de
315 aminoácidos, un gen transcripcionalmente acoplado (orfX-like), similar a otros genes
orfX de plásmidos de lactococos, y copG-like en la hebra complementaria, con un dominio
conservado presente en proteínas de la familia CopG. Con el fin de estudiar las relaciones
con pBC1, se realizó un alineamiento múltiple de la secuencia aminoacídica de RepB de
pBC1 con un total de 27 secuencias de proteínas de replicación procedentes de plásmidos
de bifidobacterias y de otras familias de bacterias tanto Gram-positivas como Gram-
negativas dando lugar a un árbol filogenético en el que la proteína RepB de pBC1 quedó
agrupada junto con las proteínas de replicación de los plásmidos pMB1 y pDOJH10S,
ambos procedentes de B. longum, pero también con las proteínas Rep de los plásmidos
ColE2 y pXZ10142) aislados de E. coli y Corynebacterium glutamicum, respectivamente, y
en los que la replicación tipo theta se ha demostrado experimentalmente. Experimentos de
hibridación mostraron que el replicón de pBC1 no es común entre las bifidobacterias.
Con el objeto de determinar el replicón mínimo de pBC1 así como la funcionalidad
de las distintas ORFs, diferentes fragmentos de pBC1 se amplificaron mediante PCR y se
clonaron en el vector pBif, que por si sólo no es capaz de replicar en bifidobacterias. Los
fragmentos generados van desde el que engloba prácticamente toda la secuencia de pBC1
hasta el menor de todos que solamente incluye el gen repB y sus secuencias
inmediatamente anteriores. Todos los derivados se mostraron capaces de replicar en
bifidobacterias. Sorprendentemente, tanto la estabilidad segregacional en ausencia de
presión selectiva por antibióticos como la frecuencia de transformación disminuyen al
reducir el tamaño plasmídico. El número de copias de las construcciones (con un rango
entre 3 y 23 copias por equivalente cromosómico, en comparación con las 30 copias del
plásmido original pBC1) resultó ser cepa dependiente y también disminuyó con el tamaño
del plásmido. Estos resultados sugieren que, a pesar de nos ser esenciales, los genes orfX-
like y copG-like juegan un papel importante en la replicación de pBC1. La interrupción del
gen repB supuso la perdida de la capacidad replicativa en bifidobacterias.
Se llevó a cabo un experimento de aislamiento de ssADN, con el fin de comprobar
el modo de replicación de pBC1. No se pudo detectar la acumulación de ADN de cadena
sencilla durante la replicación de pBC1, lo que nos indica que el plásmido no replica
mediante el mecanismo del “circulo rodante” sino que utilizaría un modo distinto de
replicación (posiblemente el modo theta).
En el presente trabajo se han desarrollado varios vectores basados en el replicón de
pCB1. Algunos de ellos (pAM1, pAM3 y pAM4) son “vectores lanzadera” que portan
como marca de resistencia genes de eritromicina y/o tetraciclina, mientras que pAM2 es un
vector específico para bifidobacterias. Todas estas construcciones mostraron una
estabilidad segregacional y un número de copias similar al del plásmido original pBC1. El
replicón de pBC1 se mostró funcional en varias especies de bifidobacterias, incluyendo B.
dentium, B. pseudolongum subsp. pseudolongum, B. longum, B. breve, B.
pseudocatenulatum, B. thermophilus, B. animalis y B. adolescentis.
Con el propósito de comprobar la funcionalidad de los vectores derivados de pBC1,
el gen de la α-L-arabinofuranosidasa se clonó en el vector pAM1, generándose una nueva
construcción, llamada pAM-abfB, que se introdujo mediante electroporación en células
competentes de E. coli y posteriormente en la cepa B. pseudocatenulatum M115. Los
niveles de actividad de α-L-arabinofuranosidasa fueron muy altos en las cepas portadoras
de la construcción.
Resumen en inglés
Bifidobacteria are members of the normal intestinal microbiota of animals and
humans, where they are thought to play positive health-promoting effects. Unravelling the
mode of action of their probiotic properties is essential to scientifically support their
rational application. For this purpose, suitable host/vector systems and appropriate gene
transfer techniques are required. Increased knowledge of bifidobacterial plasmids and their
molecular characterization is still needed for the development of new and more versatile
genetic tools for Bifidobacterium.
From our collection of human bifidobacteria, 72 isolates of different species were
screened for the presence of plasmids, six different plasmid profiles were found, two
profiles consisted of a single plasmid and four contained at least two. A plasmid identified
in the Bifidobacterium catenulatum L48 strain (pBC1) was chosen for further
characterization based on its small size and stability. The plasmid was shown to be a
circular molecule of 2540 base pairs with an overall G+C content of 64%. At the putative
origin of replication a direct repeat of 24 nucleotides repeated three and a half times was
observed, as well as five inverted repeats, which resembled the organization of theta-type
replicating plasmids. Three open reading frames (ORFs) encoding peptides larger than 50
amino acids were also identified: repB, encoding a replicase of 315 amino acids, a
transcriptionally coupled gene (orfX-like), similar to the orfX of some theta-replicating
lactococcal plasmids, and copG-like in the complementary strand, which showed a
conserved domain present in proteins of the CopG family. In order to establish the
relationship between pBC1, other bifidobacterial plasmids and plasmids from different
families of Gram-positive and Gram-negative bacteria, an alignment of 28 Rep proteins
was done and a phylogenetic tree which included all these sequences was generated. The
pBC1 Rep protein grouped with Rep proteins of pMB1 and pDOJH10S plasmids, both
from B. longum, it also merged with Rep proteins of the theta-replicating plasmids ColE2
and pXZ10142 from E. coli and Corynebacterium glutamicum, respectively. Hybridization
experiments showed the replicon was uncommon among bifidobacteria.
In order to determine the minimal replicon of pBC1 and to check the functionality
of its ORFs and surrounding sequences, different segments of pBC1 were amplified by
PCR and cloned into pBif, a replication probe vector for bifidobacteria. The largest
fragment tested in this manner encompassed most of the pBC1 sequence, while the shortest
just included the repB gene and its immediate upstream sequences. Derivatives were all
shown to allow replication in bifidobacteria. Surprisingly, both the transformation
frequency and segregational stability in the absence of antibiotic selection decreased with
reducing plasmid length. The relative copy number of the constructs (ranging from around
3 to 23 copies per chromosome equivalent, as compared to 30 copies for the original pBC1)
was shown to be strain dependent and to decrease with reducing plasmid length. These
results suggest that, although not essential, the copG-like and orfX-like genes of pBC1 play
important roles in pBC1 replication. Interruption of repB produced a construct incapable of
replicating in bifidobacteria.
An ssDNA isolation experiment was carried out to check the replication mode of
pBC1; there was not accumulation of ssDNA during pBC1 replication suggesting that the
plasmid do not replicate using the “Rolling Circle” mechanism, but it replicates with
another one, probably Theta mechanism.
Based on pBC1, different cloning vectors were developed. Some of them, (pAM1,
pAM3, and pAM4) were “shuttle vectors” for E. coli-Bifidobacterium that carried
erythromycin or/and tetracycline as antibiotic resistance marker while pAM2 was a specific
Bifidobacterium cloning vector. These constructions showed a segregational stability in the
absence of antibiotic and a relative copy number similar to the original pBC1. The pBC1
replicon proved to be functional in several Bifidobacterium species, including B. dentium,
B. pseudolongum subsp. pseudolongum, B. longum, B. breve, B. pseudocatenulatum, B.
thermophilus, B. animalis and B. adolescentis.
To check the functionality of the derivated pBC1 vectors the α-L-
arabinofuranosidase gene was cloned into the pAM1 vector, the new construction, called
pAM-abfB, was introduced by electroporation into E. coli and subsequently in the B.
pseudocatenulatum M115 strain. The expression of the α-L-arabinofuranosidase gene was
estimated in both E. coli and Bifidobacterium cells that carried the new construction
showing high level of activity.
INTRODUCCIÓN
Introducción
1
I.1 - LA MICROBIOTA DEL TRACTO GATROINTESTINAL.
En el cuerpo humano se estima que hay más células microbianas que células
eucariotas constituyentes. De entre las más de 400 especies descritas en el tracto
gastrointestinal (TGI), unas 30 ó 40, compuestas en su mayoría por bacterias,
representan el 99% de los microorganismos y constituyen la microbiota normal
(Drasar and Barrow, 1985). La microbiota del TGI aumenta en cantidad y
complejidad a medida que avanzamos por el tubo digestivo. La microbiología de la
boca es ya compleja con infinidad de géneros y especies de bacterias Gram-positivas
y Gram-negativas (Sakamoto et al., 2005). En el estómago, debido a la secreción de
ácido gástrico, únicamente se desarrollan (o sobreviven) especies resistentes a pH
ácido, entre las que cabe destacar poblaciones de estreptococos y lactobacilos (Macy
et al., 1978). En el intestino delgado los niveles oscilan entre 104 unidades
formadoras de colonia (ufc) por gramo de contenido en la parte superior (duodeno y
yeyuno), donde son mayoritarios nuevamente los lactobacilos y los estreptococos
(Simon and Gorbach, 1982), hasta 108 ufc/g en la región distal del íleon más
próxima al intestino grueso. Los principales factores limitantes para el
establecimiento de la microbiota en el intestino delgado son los movimientos
peristálticos y la secreción de jugos pancreáticos y biliares. Las bifidobacterias,
enterobacterias, bacteroides y fusobacterias son las especies cultivables más
numerosas en esta última región (Duncan et al., 2007).
El mayor número de bacterias en el TGI humano reside en el intestino grueso,
donde constituyen entre el 35 y el 50% del volumen del contenido sólido (Stephen
and Cummings, 1980). En el colon existe un ambiente muy reductor y desprovisto de
oxígeno por lo que la mayoría de las poblaciones microbianas en esta porción del
TGI son anaerobias estrictas y constituyen lo que se denomina la microbiota
Introducción
2
dominante, caracterizada por concentraciones microbianas del orden de 109-1012
ufc/g de heces. Las especies bacterianas predominantes en el colon humano
pertenecen a los Phyla Citophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB), grupo en el
que se incluyen bacterias Gram-negativas que llegan a constituir aproximadamente el
25% del total, y el Phylum Firmicutes, constituido por bacterias Gram-positivas de
bajo contenido en G+C, entre las que se incluyen diversos “clusters” de clostridios.
Las bifidobacterias, que pertenecen al Phylum Actinobacteria y son
microorganismos Gram-positivos con alto contenido en G+C, constituyen de media
el 3-5% de la microbiota colónica (Duncan et al., 2007; Tannock, 1999). En
concentraciones inferiores aparecen las poblaciones de bacterias anaerobias
facultativas y anaerobias aerotolerantes como enterobacterias, enterococos,
lactobacilos y streptococos que constituyen la microbiota subdominante, con tasas
comprendidas entre 105 y 108 ufc/g (Tabla 1). A pesar de su escaso número, los
diversos componentes de este grupo tienen una gran influencia sobre el
mantenimiento de la salud o el desarrollo y la progresión de enfermedades
(Holzapfel et al., 1998; Hagiage, 1994).
Este enorme conjunto de microorganismos posee una extraordinaria
capacidad metabólica. De hecho, se ha estimado que el conjunto de los genes de
todos estos microorganismos o microbioma del intestino grueso contiene al menos
100 veces más genes que nuestro propio genoma (Gill et al., 2006), aportando una
enorme capacidad codificadora para actividades enzimáticas implicadas en el
metabolismo de glicanos, aminoácidos y xenobióticos, así como para la
metanogénesis y la biosíntesis de 2-metil-D-eritritol-4-fosfato, precursor de al menos
25.000 derivados conocidos entre los que se encuentran lípidos de membrana,
carotenoides, vitaminas del grupo B y colesterol. Así, nuestra microbiota intestinal se
Introducción
3
puede imaginar como un órgano microbiano (situado dentro de un órgano humano)
compuesto de linajes celulares muy diversos con capacidad de comunicarse entre
ellos y con el hospedador.
Tabla 1. Principales géneros microbianos en heces humanas y su concentración estimada.
Género-Grupo Número (ufc/g)
Bacteroides 109-1012 Bifidobacterium 109-1011 Eubacterium 109-1011 Peptoestreptococcus 109-1011 Peptocococcus 109-1011 Ruminococcus 105-1011 Fusobacterium 106-1010 Clostridium 106-109 Veillonella 105-108 Lactobacillus 105-108 Enterobacterium 105-108 Enterococcus 105-107 Estreptococcus 103-105 Levaduras 102-105 Staphylococcus 0-104 Pseudomonas 0-104 Compilado de Hagiage, 1994; Cummings and Macfarlane, 1997; Holzapfel et al.,
1998; Salminen et al., 1998.
Introducción
4
I.2 - EL GÉNERO Bifidobacterium.
Las bifidobacterias fueron descritas por primera vez por el Doctor Henry
Tissier a principios del siglo XX, quien observó bacterias con forma de Y en las
heces de niños alimentados con leche materna. Para éstas, Tissier propuso el nombre
de Bacillus bifidus (Tissier, H. 1900. “Recherches sur la flore intestinales des
nourrissons (Etat normal et pathologique)”. Thèse de medicine de l’Université de
Paris.). En un primer momento se clasificaron dentro de la Familia Lactobacillaceae,
pero ya en 1924 Orla-Jensen propuso que, debido a sus propiedades bioquímicas y
metabólicas, deberían ser reclasificadas en un género aparte que denominó
Bifidobacterium (Orla-Jensen, 1924). La falta de consenso sobre la clasificación
taxonómica de las bifidobacterias hizo que durante gran parte del siglo XX
permanecieran englobadas en el género Lactobacillus, ya que comparten con las
especies de este género la producción de ácido láctico a partir del metabolismo de los
azúcares. La octava edición del “Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology”
(Buchanan and Gibbons, 1974) ya incluyó a las bifidobacterias en el género
Bifidobacterium, tras la evidencia de que estas bacterias eran incapaces de
multiplicarse en presencia de oxígeno. Presentaban, además, un alto contenido en
G+C en sus genomas, por lo que se transfirieron también a la Clase Actinobacteria a
pesar de que, desde un punto de vista aplicado, muchos autores siguen considerando
las bifidobacterias como bacterias del ácido láctico (BAL).
Introducción
5
I.2.1. Características fenotípicas.
Las bifidobacterias son bacilos irregulares Gram-positivos, anaerobios,
inmóviles y no formadores de esporas. Su nombre deriva de las formas con dos
ramas en Y o en V que suelen presentar bajo ciertas condiciones de cultivo (Figura
1).
Figura 1. Observación al microscopio electrónico de células de la especie Bifidobacterium longum.
Tomado de www.genomenewsnetwork.org
El contenido en G+C de su ADN oscila entre el 55 y el 67% (Scardovi,
1986), su pH óptimo de crecimiento se sitúa entre 6,5-7,0, y no son capaces de crecer
a valores inferiores a 4,5 ni superiores a 8,5, su temperatura óptima de crecimiento
oscila entre 36 y 43ºC, distinguiéndose dos rangos según que las cepas sean de
origen humano (36-38ºC) o animal (41-43ºC). De esta consideración se exceptúan las
especies Bifidobacterium thermacidophilum, para la que se ha descrito una
temperatura óptima de crecimiento de 49,5ºC (Dong et al., 2000) y Bifidobacterium
psychraerophilum, capaz de crecer a una temperatura de 4 ºC (Simpson et al., 2004).
A pesar de tratarse de organismos anaerobios estrictos algunas especies toleran cierta
tensión de oxígeno en presencia de dióxido de carbono, como es el caso de
Bifidobacterium animalis, o crecen débilmente en aerobiosis como B.
psychraerophilum (Scardovi, 1986).
Introducción
6
Las especies del género Bifidobacterium forman una unidad filogenética
coherente con un grado de identidad superior al 93% en las secuencias del gen que
codifica el ARNr 16S (Figura 2) (Satokari et al., 2003). Este género queda englobado
en la subdivisión de bacterias Gram-positivas con alto contenido de G+C, y se
incluye en el Phylum Actinobacteria, Clase Actinobacteria, Subclase
Actinobacteridae, Orden Bifidobacteriales y Familia Bifidobacteriaceae. De acuerdo
con la base de datos de la Colección Alemana de Cultivos Tipo (DSMZ)
(http://www.dsmz.de/), el género Bifidobacterium contiene en la actualidad 29
especies: B. adolescentis, B. angulatum, B. animalis, B. asteroides, B. bifidum, B.
boum, B. breve, B. catenulatum, B. choerinum, B. coryneforme, B. cuniculi, B.
dentium, B. gallicum, B. gallinarum, B. indicum, B. longum, B. magnum, B.
merycicum, B. minimum, B. pseudocatenulatum, B. pseudolongum, B.
psychraerophilum, B. pullorum, B. ruminantium, B. saeculare, B. scardovii, B.
subtile, B. thermacidophilum y B. thermophilum. Dos subespecies constituyen las
especies B. animalis (subsp. animalis y lactis), B. pseudolongum (subsp. globosum y
pseudolongum) y B. thermacidophilum (subsp. thermacidophilum y porcinum);
además la especie B. longum está subdividida en 3 biotipos diferentes (Longum,
Infantis y Suis).
En los últimos años, se han llevado a cabo una serie de estudios filogenéticos
(Sakata et al., 2006; Ventura et al., 2004; Matsuki et al., 2003), basados en la
comparación de la secuencia total o parcial del gen del ARNr 16S y de otros genes
conservados, mediante los cuales las especies del género Bifidobacterium se han
dividido en 6 grupos, cuyas especies representativas son B. longum, B. pullorum, B.
adolescentis, B. asteroides, B. boum y B. pseudolongum (Felis and Dellaglio, 2007).
Introducción
7
Figura 2. Árbol filogenético de las especies y subespecies del género Bifidobacterium, obtenido a partir de la comparación de secuencias del gen ARNr 16S depositadas en la base de datos RDP (http://rdp.cme.msu.edu/).
I.2.2. Metabolismo de carbohidratos.
Las bifidobacterias poseen una única ruta de degradación de hexosas
conocida como la “vía de la fructosa-6-fosfato fosfocetolasa”, denominada “bifid
shunt” o “vía bífida”. La xilulosa-5-fosfato/fructosa-6-fosfato fosfocetolasa (Xfp,
E.C. 4.1.2.22) es la enzima clave de la ruta. Dicha enzima escinde la molécula de
fructosa-6-fosfato en eritrosa-4-fosfato y acetil-fosfato, y presenta por lo general
actividad sobre la xilulosa-5-fosfato, a la cual escinde en gliceraldehido-3-fosfato y
acetil-fosfato (Meile et al., 2001). El balance de la ruta es la formación de 1,5 moles
B. pseudolongum subsp. globosumB. choerinumB. animalis subsp. animalisB. cuniculi
B. magnumB. gallicum
B. corenyformeB. asteroidesB. thermophilum
B. boumB. thermacidophilum subsp. porcium
B. breveB. indicumB. pseudolongum subsp. pseudolongumB. longum biovar Longum
B. subtileB. pullorumB. saeculareB. gallinarum
B. adolescentisB. ruminantiumB. dentium
B. catenulatumB. pseudocatenulatumB. merycicum
B. angulatumB. bifidumB. scardovii
B. minimumB. psychraerophilum
Lactobacillus gasseri
Escala: 0.1
B. pseudolongum subsp. globosumB. choerinumB. animalis subsp. animalisB. cuniculi
B. magnumB. gallicum
B. corenyformeB. asteroidesB. thermophilum
B. boumB. thermacidophilum subsp. porcium
B. breveB. indicumB. pseudolongum subsp. pseudolongumB. longum biovar Longum
B. subtileB. pullorumB. saeculareB. gallinarum
B. adolescentisB. ruminantiumB. dentium
B. catenulatumB. pseudocatenulatumB. merycicum
B. angulatumB. bifidumB. scardovii
B. minimumB. psychraerophilum
Lactobacillus gasseri
Escala: 0.1
Introducción
8
de ácido acético y 1 mol de ácido láctico por cada mol de glucosa consumido. De
forma experimental, se detecta también la formación de pequeñas cantidades de
ácido fórmico y etanol así como de otros compuestos volátiles, pero no CO2. La
presencia de la actividad fructosa-6-fosfato fosfocetolasa es el test más comúnmente
usado para la identificación de este género bacteriano, ya que el resto de bacterias
Gram-positivas intestinales carecen de esta enzima. Además de los compuestos
propios de la fermentación, y al igual que otras bacterias entéricas, las bifidobacterias
son capaces de sintetizar varias vitaminas, especialmente del grupo B (Crittenden et
al., 2003).
Introducción
9
I.3 - ALIMENTOS FUNCIONALES Y PROBIÓTICOS.
En los últimos años se ha desarrollado un nuevo concepto de alimentación,
que procura, más allá de los objetivos nutricionales, la prevención de la enfermedad
y la promoción de la salud y el bienestar. En este contexto aparecen los alimentos
funcionales, una de cuyas definiciones más aceptadas es la del “alimento modificado
o ingrediente alimentario que provee un beneficio para la salud además de satisfacer
los requerimientos nutritivos tradicionales” (Sanders, 1998). El efecto positivo de un
alimento funcional puede ser tanto su contribución al mantenimiento del estado de la
salud, como la reducción del riesgo de padecer una enfermedad (Diplok et al., 1999).
El concepto de alimento funcional requiere que su ingesta se efectúe como
componente habitual y que ejerza sus efectos en las cantidades normales ingeridas en
una dieta equilibrada. Dentro de los alimentos funcionales tienen un papel destacado
y en general bien reconocido los probióticos y los prebióticos.
Los prebióticos son ingredientes alimenticios no asimilables por nuestro
organismo que estimulan el crecimiento y/o la actividad metabólica de un grupo o un
número limitado de los grupos bacterianos intestinales beneficiosos para la salud
(Gibson and Roberfroid, 1995).
El concepto de probiótico, del griego “a favor de la vida”, fue acuñado en
1965 por Lilly y Stillwell, refiriéndose a “factores estimulantes del crecimiento
producidos por microorganismos”. Sin embargo, el primero en utilizar el termino
probiótico en el sentido actual fue Parker en 1974, definiéndolo como
“microorganismos y sustancias con efectos beneficiosos para la salud por su
influencia en la microbiota intestinal”. Posteriormente, en 1989, Fuller definió a los
probióticos como “suplementos alimenticios con bacterias vivas que contribuyen a
mantener el equilibrio microbiano del TGI”. En la actualidad la definición más
Introducción
10
ampliamente aceptada es la acuñada en el año 2001 por la Organización Mundial de
la Salud y la Organización para la Alimentación y Agricultura de las Naciones
Unidas (WHO/FAO 2001) en la que se definen como “microorganismos vivos que
cuando son administrados en cantidades adecuadas confieren efectos beneficiosos
para la salud del hospedador más allá de los inherentes a la nutrición básica”.
Tabla 2. Especies bacterianas usadas comúnmente como probióticos, entre
paréntesis las cepas más conocidas.
Compilado de Collins et al. (1998), Fooks et al. (1999) y Salminen (2001).
En la actualidad existen en el mercado una importante y variada oferta de
productos elaborados o suplementados con prebióticos y/o probióticos. El principal
vehículo de administración de éstos son los productos lácteos, especialmente las
leches fermentadas tipo yogur. El espectro de microorganismos utilizados como
probióticos en humanos es muy amplio e incluye especies de muchos géneros
diferentes como Lactobacillus, Bifidobacterium, Propionibacterium, Bacillus,
Escherichia, Enterococcus, Streptococcus y algunas levaduras del género
Lactobacilos Bifidobacterias Otra Bacterias Lácticas Otros microorganismos
Lactobacillus acidophilus Bifidobacterium
animalis Enterococcus faecium Bacillus subtilis Lactobacillus johnsonii
(NCC 533) Bifidobacterium
bifidum Streptococcus thermophilus Bacillus cereus (Toyoi)
Lactobacillus bulgaricus Bifidobacterium
breve Escherichia coli (Nissle)Lactobacillus casei
(Shirota) Bifidobacterium
longum Propionibacterium
freudenreichii
Lactobacillus reuteri Bifidobacterium
lactis (Bb12) Sacharomyces cerevisiae
(subsp. boulardi) Lactobacillus rhamnosus
(GG) Bifidobacterium
adolescentis Lactobacillus delbrueckii
Lactobacillus gasseri Lactobacillus plantarum
(299v)
Introducción
11
Sacharomyces (Tabla 2). Sin embargo los microorganismos utilizados más
frecuentemente pertenecen al grupo de las bacterias lácticas o Bacterias del Ácido
Láctico (BAL), incluyendo en un sentido amplio entre éstas a las bifidobacterias
(Ouwenhand et al., 2002). La mayoría son bacterias aisladas previamente del
intestino humano, puesto que se supone que existe una interacción especie-específica
entre los microorganismos y su hospedador.
I.4 - USO DE LAS BIFIDOBACTERIAS COMO PROBIÓTICOS.
Las bifidobacterias constituyen la población microbiana mayoritaria en el
colon de los bebes lactantes y se mantienen como una de las poblaciones intestinales
dominantes en adultos, en números de hasta 1011 ufc/g (Harmsen et al., 2000). El
perfil de especies del género Bifidobacterium presentes en el TGI humano cambia
según la edad y se ve influenciado también por la dieta y las condiciones fisiológicas
del hospedador. Así, por ejemplo, las especies Bifidobacterium infantis y B. breve
que parecen ser mayoritarias en niños son reemplazadas por B. adolescentis en los
adultos, mientras que B. longum es una especie dominante a lo largo de toda la vida
(Tannock, 2002; Ouwehand et al., 2001).
La presencia de las bifidobacterias en elevadas concentraciones en el TGI de
los lactantes sanos se ha asociado con la maduración fisiológica de este órgano y del
sistema inmune de las mucosas (Figura 3). Al mismo tiempo, las bifidobacterias
declinan en número según avanza la vida, lo que a su vez se ha asociado con una
disminución de la salud intestinal. La razón que subyace a la utilización de estos
microorganismos como probióticos es que la ingesta de grandes cantidades de
bifidobacterias vivas contribuirá a elevar su número y a potenciar sus actividades
beneficiosas (Lehay et al., 2005). Del mismo modo, una gran parte de los prebióticos
Introducción
12
tienen como objetivo estimular el crecimiento específico de las bacterias de este
género para aumentar su número o actividad en el TGI.
Figura 3. Enfermedades y patologías sobre las que las bifidobacterias probióticas podrían ejercer un posible efecto beneficioso.
Modificado de Gueimonde y Salminen, 2005.
Eczema atópico
Intolerancia a la lactosa
Diarrea asociada a los antibióticos
Diarrea viral
Enfermedad inflamatoria
intestinal
Diarrea del viajero
Síndrome del colon
irritable
Enterocolitis necrotizante
H. pyloriEstreñimiento
Control de los niveles
de colesterol
Cancer
Evi
denc
ia c
ient
ífica
+
-
CEPAS PROBIÓTICAS
ESPECÍFICAS
Eczema atópico
Intolerancia a la lactosa
Diarrea asociada a los antibióticos
Diarrea viral
Enfermedad inflamatoria
intestinal
Diarrea del viajero
Síndrome del colon
irritable
Enterocolitis necrotizante
H. pyloriEstreñimiento
Control de los niveles
de colesterol
Cancer
Evi
denc
ia c
ient
ífica
+
-
CEPAS PROBIÓTICAS
ESPECÍFICAS
Introducción
13
I.5 - EL GENOMA BACTERIANO.
La mayor parte de los genes bacterianos están codificados en una larga
molécula de ADN de doble cadena denominada cromosoma bacteriano o, más
apropiadamente, genóforo. Muchas especies, junto al cromosoma presentan una o
varias moléculas menores denominadas plásmidos. Los plásmidos son también
moléculas de ADN de doble cadena, casi siempre circulares, con una configuración
más enrollada que la del ADN principal, propiedad que se utiliza con frecuencia para
su aislamiento selectivo. El genoma bacteriano se completa con los bacteriófagos
integrados en el cromosoma (profagos), cuando existen, y con las secuencias o
elementos de inserción.
La característica definitoria de los plásmidos es una replicación independiente
de la replicación del cromosoma, aunque para ello aprovechan toda la maquinaria
metabólica celular. Otras características típicas de los plásmidos son su pequeño
tamaño, en comparación con el tamaño del cromosoma bacteriano, y la de codificar
propiedades “no esenciales” para la vida de la célula. Sin embargo, pueden codificar
actividades importantes para la adaptación o supervivencia en determinados hábitats
o en determinadas condiciones ambientales como resistencia a antibióticos y metales
pesados, utilización de azúcares u otras fuentes de carbono, producción de toxinas,
pigmentos, factores de adherencia, etc. (Eberhard, 1989; Reanney, 1976). En otros
casos, por el contrario, no codifican más que la parte esencial de la maquinaria
replicativa y otras funciones relacionadas con su diseminación.
Introducción
14
I.6 - EL GENOMA DE LAS BACTERIAS DEL ÁCIDO LÁCTICO
(BAL).
Hasta el momento más de 20 genomas de BAL han sido completamente
secuenciados. El tamaño de estos genomas es relativamente pequeño (entre 1.7 y 3.3
Mpb) con un número de genes variable, desde los 1.600 hasta los 3.000 (Makarova
and Koonin, 2007; Klaenhammer et al., 2002). Éstos codifican para una amplia
batería de transportadores para una eficiente incorporación de fuentes de carbono y
nitrógeno al interior celular y para un número limitado de actividades biosintéticas y
degradativas.
Los análisis filogenéticos, la comparación del contenido en genes y la
reconstrucción de las rutas metabólicas indican que la adaptación a ambientes
nutricionalmente ricos (leche, material vegetal, TGI humano y animal, etc.) ha
promovido, para la mayoría de las especies, una amplia pérdida de genes
dispensables (degradación génica) desde los tipos bacterianos ancestrales, así como
la adquisición de otros genes adaptativos mediante transferencia horizontal
(Alterman et al., 2005; Bolotin et al., 2004; Pridmore et al., 2004; Kleerebezem et
al., 2003; Schell et al., 2002).
Introducción
15
I.7 - EL GENOMA DE LAS BIFIDOBACTERIAS.
El género Bifidobacterium, tal y como se ha comentado, se caracteriza por
poseer un genoma con un alto contenido de G+C, entre un 55 y un 67% (Scardovi,
1986). En la actualidad se encuentran secuenciados en su totalidad el genoma de tres
cepas de bifidobacterias: B. adolescentis ATCC 15703 (Número de Acceso GenBank
NC008618), B. longum NCC2705 (Schell et al., 2002) y B. longum DJO10A
(Número de Acceso GenBank NZAABM00000000). La secuenciación de un cuarto
genoma correspondiente a la cepa B. adolescentis L2-32 está próxima a su
finalización
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/MICROBES/microbial_taxtree.html), como
también el de la cepa B. breve UCC2003 (D. van Sinderen, comunicación personal).
Algunas de las características más típicas de los genomas de las cepas secuenciadas
se relacionan en la Tabla 3. La secuenciación del genoma de la cepa B. adolescentis
L2-32 se engloba dentro de un proyecto más complejo
(http://genome.wustl.edu/sub_genome_group.cgi?GROUP=3&SUB_GROUP=4),
cuyo objetivo final es la caracterización del microbioma intestinal humano, que
algunos autores consideran una continuación del proyecto de secuenciación del
genoma humano. Sin embargo, a pesar de todo el esfuerzo de secuenciación que
hemos comentado, en la actualidad sólo se halla publicado el análisis genómico de la
cepa B. longum NCC2705 (Schell et al., 2002). El análisis de la secuencia de esta
cepa contiene una serie de referencias cruzadas con la secuencia de la cepa B.
longum DJO10A (Klijn et al., 2005; Ventura et al., 2004; Klaenhammer et al., 2002;
Schell et al., 2002).
Introducción
16
Tabla 3. Características generales de los genomas secuenciados de diversas cepas de bifidobacterias.
El tamaño del cromosoma oscila entre las 2 y las 2,3 Mpb, siendo comparable
al tamaño del genoma de otras bacterias lácticas (Siezen et al., 2004). El genoma de
la cepa B. longum NCC2705 posee un porcentaje G+C del 60%, 4 operones rrn, 57
tRNAs y 16 secuencias de inserción (IS) completas, además de rutas biosintéticas
funcionales para la mayoría de los aminoácidos, todos los nucleótidos y algunas
vitaminas (ácido fólico, tiamina y ácido nicotínico). El análisis de la secuencia del
genoma ha puesto de manifiesto la adaptación de la cepa B. longum NCC2705 al
tracto gastrointestinal humano, más concretamente al colon. Así, se han identificado
un elevado número de proteínas (para las que codifica más del 8% del genoma)
especializadas en el transporte (con un gran número de transportadores del tipo
ABC) y el catabolismo de una amplia variedad de mono-, di- y oligosacáridos;
atributo compartido con otros microorganismos habituales en el colon. Muchos de
los genes se encuentran organizados en módulos autorregulados que podrían haberse
generado por duplicación o transferencia génica horizontal. El desarrollo de esta
variada versatilidad metabólica se ha interpretado como el fruto de una fuerte presión
Introducción
17
selectiva de tipo nutricional. El análisis genómico ha revelado también la presencia
de polipéptidos con elevada homología con las proteínas de las fimbrias que se unen
a glicoproteínas; estructuras que pueden jugar un papel importante en la adhesión y
el mantenimiento de la cepa en el tracto gastrointestinal (Schell et al., 2002).
Diversos fenómenos de transferencia horizontal de genes han quedado
también de manifiesto tras el análisis en profundidad de estos genomas. De este
modo, en la cepa B. longum NCC2705 se han identificado seis regiones que, debido a
su contenido diferencial en G+C y a su atípica utilización de codones, se postulan
que se han adquirido desde otros microorganismos. Tres de las regiones se
encuentran también presentes en el genoma de la cepa B. longum DJO10A, mientras
que de las tres regiones restantes no compartidas dos contienen genes implicados en
la biosíntesis de exopolisacáridos (Klijn et al., 2005), característica que podría ser
privativa de cepa.
La información sobre la presencia de fagos que infectan a bifidobacterias es
escasa (Sgorbati et al., 1983). Sin embargo, son varias las secuencias de fagos y
profagos descritas en otras bacterias filogenéticamente relacionadas con alto
contenido en G+C, adscritas, por ejemplo, a los géneros Mycobacterium,
Corynebacterium y Streptomyces (Canchaya et al., 2003; Casjens, 2003; Moreau et
al., 1995). En el genoma de las cepas B. longum DJO10A, B. longum NCC2705 y B.
breve UCC2003 se ha identificado una secuencia homóloga a profagos en cada cepa
(Klijn et al., 2005; Ventura et al., 2005; Schell et al., 2002). Los profagos están
integrados en todos los casos en el gen que codifica el ARN de transferencia para
metionina (ARNt-Met): un sitio típico de inserción fágica. El hecho de que en los
tres genomas se hayan identificado secuencias fágicas, podría indicar que los fagos
Introducción
18
asociados al genero Bifidobacterium pudieran ser más comunes que lo descrito hasta
el momento.
I.8 - PLÁSMIDOS DE BIFIDOBACTERIAS.
La presencia de plásmidos en especies del genero Bifidobacterium se
describió en el año 1982 (Sgorbati et al. 1982), y se ha refrendado en diversos
estudios con posterioridad (Park et al., 1997; Iwata and Morishita, 1989). El
significado de estos elementos de replicación autónoma en el género Bifidobacterium
es incierto puesto que su presencia no ha podido asociarse con claridad con ningún
fenotipo. De hecho, sólo existe una referencia en la que se sugiere que la producción
por B. bifidum de una bacteriocina estaría asociada a la presencia de un plásmido de
8 kpb (Yildirim et al., 1999).
En los últimos años, gracias a la universalización de las técnicas de
secuenciación, se han determinado las secuencias nucleotídicas de 23 plásmidos de
seis especies distintas de bifidobacterias, tal y como se relaciona en la Tabla 4. La
presencia de plásmidos se ha descrito también en otras especies como B. indicum y
B. globosum (Mattarelli et al., 1994) pero su secuencia no se encuentra disponible.
De las escasas cepas de bifidobacterias con plásmidos, la mayoría presentan
sólo uno, aunque en tres cepas de B. longum se han hallado cohabitando dos tipos
plasmídicos distintos (Lee and O’Sullivan, 2006; Corneau et al., 2004; Park et al.,
1997) y tres en la cepa B. longum biovar. Longum NAL8 (Guglielmetti et al., 2007).
El rango de tamaño de los plásmidos caracterizados del género Bifidobacterium
oscila entre las 1,8 kpb de pMB1 y las 10,2 kpb de pNAC3 (Tabla 4).
Introducción
19
Tabla 4.- Plásmidos del género Bifidobacterium completamente secuenciados.
Introducción
20
I.9 - MECANISMOS DE REPLICACIÓN.
En las bacterias Gram-positivas, basándose en la comparación de secuencias
y en la organización de las regiones de replicación, se han encontrado cuatro
mecanismos de replicación bien definidos; el tipo círculo rodante (“rolling circle”, ó
RC) y el tipo Theta (θ) de los plásmidos circulares, y los dos mecanismos de
replicación diferentes de los plásmidos lineales de Streptomyces y Borrelia (Actis et
al., 1998; del Solar et al., 1998; Hinnebusch and Tilly, 1993). Los plámidos lineales
de Borrelia se caracterizan por la presencia de una proteína unida covalentemente a
los extremos de las moléculas, mientras que los plásmidos de Streptomyces se
caracterizan por la presencia en los extremos de secuencias invertidas y
complementarias (Actis et al., 1998). En lo que sigue vamos a centrarnos en los
plásmidos circulares porque hasta el momento pocos han sido los plásmidos lineales
observados en las bacterias lácticas (Roussel et al., 1993). Además los plásmidos
circulares son los que mayores posibilidades de manejo presentan.
Con relación a su estructura genética, los plásmidos poseen una región
esencial que contiene los genes involucrados en la replicación y su control. De forma
típica, suelen contener uno o más orígenes de replicación (ori) y uno o más
elementos de regulación en un segmento pequeño de ADN (entre 1 y 4 kpb). La
mayoría de los replicones albergan un gen que codifica una proteína necesaria para la
replicación (proteína Rep); otros plásmidos codifican una molécula de ARN que
actúa como cebador (“primer”) en la iniciación de la síntesis de las nuevas copias de
ADN por las replicasas celulares (Actis et al., 1998; del Solar et al., 1998).
Muchos plásmidos portan además genes considerados dispensables, a pesar
de que algunos participan activamente en la replicación del plásmido o en la
interacción de éste con el hospedador (reparto de moléculas en la progenie,
Introducción
21
estabilidad plasmídica, transferencia a nuevas células, etc.). En determinados casos,
estos genes considerados dispensables resultan ser esenciales. Así, los plásmidos de
bajo número de copias codifican diversos mecanismos para evitar la pérdida
segregacional tras la división celular. Entre estos mecanismos, podemos citar
sistemas para la resolución de multímeros, sistemas para la muerte de las células
libres de plásmidos y mecanismos de partición activa (Gerdes et al., 2000; Williams
and Thomas, 1992; Nordström and Austin, 1989).
I.9.1. Mecanismo de replicación tipo círculo rodante (RC).
En términos de su organización estructural y funcional, los plásmidos RC
constituyen un grupo muy homogéneo cuyo tamaño oscila entre poco más de una y
10 kpb, aproximadamente. Poseen estructuras muy compactas y, en la mayoría de los
casos, todos sus genes se transcriben en la dirección de la replicación. Otra
característica típica es la formación de intermediarios de cadena sencilla (“single-
stranded DNA”, ó ssDNA), cuya detección en los extractos celulares se utiliza como
prueba de este tipo de replicación (Figura 4).
Los plásmidos RC están organizados en una serie de módulos
intercambiables, de los que únicamente es esencial el que incluye el ori, el gen rep y
otros elementos de control (Figura 5). El ori consta de dos secuencias distintas de
ADN: una secuencia de reconocimiento y otra donde se produce el corte (“nick”) en
una de las hebras de la doble cadena para iniciar la replicación. Estos dos elementos
constituyen lo que se ha dado en llamar el origen de replicación de la doble cadena
(“double-stranded origin”, ó dso). Dentro de este módulo tenemos también al gen
rep, que codifica la proteína esencial Rep que reconoce y procesa los elementos del
dso. Un segundo módulo contiene una o más regiones con una fuerte simetría axial
Introducción
22
(repetición invertida, “inverted repeat”, ó IR), que constituyen el origen de
replicación de la cadena sencilla (“single-stranded origin”, ó sso) y funcionan como
sitios de inicio de la síntesis de la cadena retrasada a partir del intermediario de
cadena sencilla. En otros módulos se incluye el resto de los elementos que no están
involucrados de forma directa en la replicación, pudiendo contener una o más pautas
abiertas de lectura (“open reading frames”, o ORFs) que codifican mecanismos de
movilización conjugativa, recombinación, resistencia a antibióticos u otras
propiedades (del Solar et al., 1998; Khan, 1997).
Figura 4. Diagrama del proceso de replicación de los plásmidos que utilizan el mecanismo de replicación RC.
(+) ( )
(+)
+
RepB
dsDN
DSO
SSO
(+) ( )
RepB
dsDNA
(+) ( )
DSO
SSO
dsDN
DSO
SSO
( )
(+) ( )
5´ 3´
(+) ( )
ssDNA
SSO
(+)
RNA primer
DSO
nick
( )
(+)
(+)
( )
Introducción
23
Figura 5. Representación esquemática de la región de replicación de los plásmidos RC del grupo pLS1/pE194 y su control. El dso consta de dos secuencias, una repetición directa (DR) que funciona como sitio de reconocimiento y una repetición invertida (IR) donde se sitúa el punto de corte de la cadena líder con el que se inicia la replicación. Pcr y PctRNA representan los promotores a partir de los cuales se transcribe el ARNm de los genes cop y rep y el ctRNA, respectivamente. La proteína Rep inicia y activa la replicación, mientras que Cop la inhibe uniéndose al promotor Pcr. La traducción de Rep se inhibe también por el apareamiento de su ARNm con el ctRNA que se transcribe desde PctRNA. Tras una ronda de síntesis de la cadena líder, la síntesis de la cadena retrasada se inicia en el sso, compuesto por dos IRs. La flecha verde indica la dirección de la replicación. (Los distintos elementos no están reproducidos a escala).
La mayoría de los plásmidos descritos en bifidobacterias se postula que
replican mediante un mecanismo de círculo rodante (Tabla 4), sin embargo este tipo
de replicación sólo se ha demostrado para los plásmidos pKJ50 (Park et al., 1999),
pCIBb1 (O’Riordan and Fitzgerald, 1999), pNAC1 (Corneau et al., 2004),
pDOJH10L (Lee and O’Sullivan, 2006) y pBIFA24 (Park et al., 2008).
copG IR IR IR
DR
ctRNA
corte
Pcr
sso dso repB
unión Rep
PctRNA
+–
– cop-rep mRNA
Introducción
24
I.9.2. Mecanismo de replicación tipo Theta.
La replicación de ADN mediante el mecanismo tipo Theta se describió
primero en plásmidos de bacterias Gram-negativas aunque, al igual que ocurre con el
mecanismo tipo RC, este tipo de replicación se encuentra ampliamente extendido en
todos los grupos microbianos (del Solar et al., 1998).
Una de las diferencias más relevantes de estos plásmidos respecto a los de
replicación tipo RC es que las moléculas intermediarias de la replicación son
moléculas de ADN de doble cadena (Figura 6). Otro criterio importante para su
identificación es el tamaño, ya que todos los plásmidos con un tamaño superior a 12
kpb cuyo mecanismo de replicación se conoce pertenecen a este grupo. No obstante,
el tamaño puede variar notablemente, desde las 2,6 kpb del plásmido Theta más
pequeño (Hefford et al., 1993) hasta más de 100 kpb (Claesson et al., 2006; Seegers
et al., 1994). El grupo de los plásmidos que utilizan el modo Theta es muy
heterogéneo. Los plásmidos varían en tamaño, en la organización estructural, en la
dirección de replicación y en los requerimientos de factores plasmídicos y celulares.
Basándose en su organización y en los elementos que requieren, se pueden distinguir
tres clases de replicones Theta (denominadas A, B y C).
Los replicones de la clase A poseen un ori que consta de una región rica en
A+T que cuenta con varias secuencias repetidas. Aquí se produce la apertura de las
cadenas y la unión de los factores de iniciación del hospedador. Adyacente a esta
posición aparece un número variable de repeticiones directas (iterones) esenciales en
cis para el inicio de la replicación (Figura 7). Los replicones de clase A requieren de
una proteína de iniciación codificada por el plásmido (Rep), lo que implica la
existencia en el ori de secuencias específicas con las que la proteína interactúa. En
los plásmidos de las bacterias Gram-negativas que pertenecen a este grupo la
Introducción
25
replicación es independiente de la ADN polimerasa I del hospedador. En la zona del
origen son típicas también una o más secuencias similares a las que reconoce la
proteína iniciadora DnaA en el ori del cromosoma (5’-TTATCCACA-3’) (cajas
dnaA) (Kornberg and Baker, 1992).
Figura 6. Diagrama del proceso de replicación de los plásmidos que utilizan
el modo Theta de replicación.
En las bifidobacterias la replicación tipo Theta sólo se postula en tres
plásmidos: pMB1 (Rossi et al., 1996), pDOJH10S (Lee and O’Sullivan, 2006) y
pCIBA089 (Cronin et al., 2007) además del plásmido que se describe en esta Tesis,
pBC1 (Álvarez-Martín et al., 2007). En los cuatro casos, los plásmidos presentan
Origen de replicación
Estructura Theta
dsDNA dsDNA
Introducción
26
secuencias y estructuras similares a las descritas en plásmidos de otros géneros para
los cuales los mecanismos de replicación son bien conocidos. Sin embargo, la
demostración experimental de este tipo de replicación sólo se ha llevado a cabo de
modo indirecto, por homología de secuencia o por la ausencia de intermediarios de
cadena sencilla.
Figura 7. Origen de replicación y mecanismos de control del grupo mayoritario de los plásmidos Theta de lactococos. El replicón mínimo comienza con una típica DR en tandem de 10-11 pb separada por una región rica en A+T de las DRs de 22 pb repetidas tres veces y media. Una DR truncada se encuentra al final de los iterones, formando parte de una repetición invertida, IR1, a la que se une la proteína Rep. IR1 contiene el putativo sitio -35 de la región promotora de repB. A continuación el sitio -10 del promotor se encuentra en IR2, muy cerca de la secuencia RBS. Todas estas secuencias funcionan únicamente en cis para la replicación, mientras que repB funciona también en trans. La posición de las estructuras sugiere que participan en la replicación, así como en la regulación y en el control del número de copias. (Los diversos elementos no están representados a escala).
La replicación de los plásmidos de la clase B (como ColE1 p.ej.) no depende
de la presencia de proteínas iniciadoras codificadas por ellos mismos. También
carecen de la región ori típica. La replicación se inicia, en estos casos, por medio de
un cebador de ARN sintetizado por la ARN polimerasa del hospedador. Este cebador
-35 -10 RBS ATG
región del ori
unión de Rep
replicón mínimo
región rica A-T iterones IR 1 IR 2 repB orfXDR
++ ---35 -10 RBS ATG
región del ori
unión de Rep
replicón mínimo
región rica A-T iterones IR 1 IR 2 repB orfXDR
++ --
Introducción
27
se utiliza para el inicio de la síntesis de la cadena líder (Kornberg and Baker, 1992;
Marians, 1992).
Los replicones de la clase C codifican la proteína de replicación aunque
carecen de la región ori típica. Estos plásmidos requieren de la polimerasa I del
hospedador, aunque no se conoce el mecanismo exacto de iniciación de la
replicación. De este grupo se conocen tan sólo los plásmidos emparentados ColE2 y
ColE3 (Itoh and Horii, 1989). La iniciación de la replicación requiere en éstos del
ensamble en el origen del plásmido de toda una compleja maquinaria que incluye: el
holoenzima de la ADN polimerasa III, la helicasa DnaB y la primasa. En una primera
fase, se produce la apertura de las cadenas (en el origen de replicación) y la síntesis
de los cebadores de ARN. Para la elongación de la replicación se requiere la ADN
polimerasa III y otras proteínas del hospedador (Itoh and Horii, 1989).
Un caso especial de replicación tipo Theta es la replicación por
desplazamiento de cadena, en el que al igual que en los plásmidos RC se generan
moléculas de ssADN como intermediarias de la replicación. Los plásmidos con este
mecanismo requieren de la acción de tres proteínas plasmídicas, denominadas RepA,
RepB y RepC (Sakai and Komano, 1996). La actividad de estas tres proteínas es
suficiente para iniciar el proceso de replicación sin la necesidad de la transcripción
de la ARN polimerasa celular y de los factores celulares del huésped (DnaA, DnaB,
etc.). Los productos finales son círculos de cadena simple desplazada y círculos de
cadena doble superenrollada. Los ejemplos mejor conocidos de plásmidos con este
tipo de replicación son los plásmidos promiscuos de la familia IncQ (Sakai and
Komano, 1996). La independencia de la replicación de los factores celulares es la
razón del amplio rango de huésped de estos replicones.
Introducción
28
I.10 - VECTORES.
Se define vector como el vehículo que transporta un gen al interior de uno o
varios hospedadores y permite su replicación y/o expresión. Para actuar como
vehículos, los vectores deben ser capaces de introducirse en la célula hospedadora y,
una vez dentro, replicar y producir múltiples copias de sí mismo (Kok et al., 1984).
Todo vector consta de una unidad básica de replicación, uno o varios genes
que permiten su selección en la célula o células hospedadoras y sitios de restricción
que permiten la incorporación del ADN exógeno (Simon and Chopin, 1988). El
replicón básico puede provenir de un plásmido o de un bacteriófago de ADN de
cadena doble, o de cadena sencilla si tiene intermediarios de replicación de doble
cadena. Los vectores YAC (“yeast artificial chromosome”) replican merced a la
presencia de secuencias correspondientes a las regiones teloméricas, centroméricas y
de inicio de la replicación de los cromosomas de levaduras (Murria and Szoztak,
1983). En ocasiones, en la construcción de un vector se combinan más de un
replicón. En 1973 Cohen y col. describieron la primera construcción de un vector de
ADN recombinante, el plásmido pSC101 (Cohen et al., 1973). Desde entonces se
han desarrollado un gran número de vectores para todos los tipos microbianos. Éstos
se denominan vectores generales si se pueden utilizar con diversos propósitos y
especializados si se diseñan con un fin más concreto.
En función de su utilidad principal los vectores pueden clasificarse en
vectores de clonación, de expresión, de integración, etc. Los vectores de expresión,
son vectores de clonación en los que la expresión de las secuencias insertadas está
facilitada. Para optimizar la expresión, algunos vectores están provistos de
promotores fuertes, de manera que a mayor cantidad de ARN producido, mayor
cantidad de proteína. En muchos otros casos estos vectores poseen promotores
Introducción
29
inducibles, que impiden la sobre-expresión prematura del producto, lo que resulta
necesario cuando el producto puede ser tóxico para la célula hospedadora o alcanzar
niveles que interfieran con la división celular (Simons et al., 1990; Pouwels et al.,
1985). También podemos hablar de vectores homólogos y vectores heterólogos
cuando el replicón básico procede o no del género o la especie en la que va a ser
utilizado. Podemos mencionar también los vectores lanzadera (“shuttle vector”);
denominando con este término a vectores de clonación que se multiplican en al
menos dos hospedadores diferentes, frecuentemente poco relacionados. Los vectores
de integración son aquellos incapaces de replicar en un hospedador y que al ser
seleccionados han de integrarse necesariamente en el genoma del hospedador. Con
este tipo de vectores, se evitan o disminuyen los problemas derivados de la
inestabilidad segregacional porque se comportan como un elemento cromosomal
más. Además los genes integrados presentan el mismo número de copias que los
genes cromosómicos (Leenhouts et al., 1990; Chopin et al., 1989)
Dependiendo de las características de los vectores, para su introducción en la
célula hospedadora se pueden utilizar diversos métodos de transferencia de ADN:
transducción, conjugación y/o transformación.
Los métodos de introducción de ADN exógeno en BAL han sufrido una
evolución a lo largo de los años; en un principio las vías de transformación genética
fueron la conjugación y la transformación y fusión de protoplastos (Gasson, 1980;
Gasson and Davies, 1979). Sin embargo, estos métodos iniciales presentaban serios
inconvenientes como una baja eficiencia, un procesado largo y tedioso y poca
reproducibilidad. En el año 1988 tuvo lugar un punto de inflexión en la
transformación de las BAL cuando Chassy y Flickinger adaptaron el método de
electroporación de Luchansky y colaboradores (1988) para introducir ADN
Introducción
30
plasmídico en especies de varios géneros de bacterias Gram-positivas, incluyendo los
principales tipos de BAL. Desde entonces y hasta la actualidad se han producido
diversas mejoras de las condiciones de electroporación, incrementando su eficacia y
reproducibilidad. En las bifidobacterias las herramientas génicas y las técnicas de
transformación se han desarrollado de manera tardía repecto a otros géneros y
especies de BAL. Baste mencionar que la electroporación comenzó a utilizarse en
especies de bifidobacterias a mediados de los años 90 (Argnani et al., 1996; Missich
et al., 1994). A la escasez de herramientas y técnicas de transformación, se añade la
ya citada falta de bacteriófagos y la ausencia de procesos conjugativos (Klijn et al.,
2005).
I.10.1. Vectores para las bifidobacterias.
En los últimos años ha tenido lugar un incremento en los conocimientos
genéticos en el género Bifidobacterium, gracias sobre todo, como se ha comentado, a
la secuenciación de los genomas de tres de sus cepas. A pesar de ello, las
herramientas y técnicas de ingeniería genética para este género se encuentran aún
menos desarrolladas que para el resto de bacterias del ácido láctico como
consecuencia, quizás, de la escasez de plásmidos y de las dificultades de su cultivo
(Klijn et al., 2005).
A partir de los plásmidos secuenciados en las distintas cepas de
bifidobacterias se han desarrollado una serie de vectores de clonación, que resultan
en su mayoría de la clonación directa del plásmido en vectores de E. coli junto con
distintos genes de selección que codifican resistencia a antibióticos como
espectinomicina, eritromicina o cloranfenicol. De esta manera se han desarrollado
distintos vectores lanzadera (Álvarez-Martín et al., 2007; Guglielmetti et al., 2007;
Introducción
31
Klijn et al., 2006; Lee and O’Sullivan, 2006; Park et al., 1999; Rossi et al., 1998;
Matsumura et al., 1997; Rossi et al., 1996; Missich et al., 1994). También se han
desarrollado en bifidobacterias vectores como pMDY23, que porta el gen gusA de E.
coli (Klijn et al., 2006), vectores de expresión como pBES2, que se ha utilizado para
expresar el gen de la α-amilasa de B. adolescentis en B. longum (Rhim et al., 2006),
pBLES100, utilizado en estudios de supresión tumoral (Yazawa et al., 2001) y para
la expresión de los genes de las proteínas del flagelo de Salmonella (para
inmunización de mucosa) (Takata et al., 2006), y pBV22210, empleado en la
expresión de la proteína anti-tumoral endostatina (Xu et al., 2007).
En estos moementos no se dispone aún de ningún vector de grado alimentario
(“Food Grade”) para bifidobacterias; es decir, vectores en los que los genes de
resistencia a antibióticos se sustituyen por genes metabólicos (implicados por
ejemplo en la utilización de azúcares), o que codifican la resistencia a la infección
fágica o a determinadas bacteriocinas (de Vos, 1989).
Gracias a las secuencias de inserción (IS) y a las secuencias de profagos
halladas en los genomas de las cepas B. longum NCC2705, B. longum DJO10A y B.
breve UCC2003 en los próximos años se abre también la posibilidad de desarrollar
vectores de inserción y otras herramientas basadas en las secuencias de estos
elementos.
OBJETO DEL TRABAJO
Objeto del trabajo
33
Los alimentos funcionales se contemplan como elementos clave en los
modernos conceptos de alimentación, de forma que, además de participar en los
aspectos nutricionales básicos, contribuyan a la promoción de la salud y el bienestar
y a la prevención de determinadas enfermedades. En este contexto, los prebióticos y
los probióticos tienen un papel destacado y bien reconocido. En la actualidad los
microorganismos utilizados de forma más frecuente como probióticos son especies
de lactobacilos y bifidobacterias de origen intestinal.
Las bifidobacterias, como ya se ha mencionado, constituyen una de las
poblaciones microbianas dominantes en el intestino humano y de otros animales
desde los primeros estadíos de la vida, contribuyendo a mantener el equilibrio
microbiano necesario para la salud y aportando nutrientes y energía al hospedador
por medio de sus variadas actividades metabólicas, participando, por último, en la
maduración del sistema inmune y en el mantenimiento de su competencia. En estos
momentos, se desconocen la mayoría de los mecanismos moleculares subyacentes a
su capacidad de colonización y mantenimiento en el intestino, así como de los
procesos de antagonismo microbiano y comunicación con las células intestinales. El
conocimiento de estos mecanismos es fundamental para demostrar de forma
científica las supuestas acciones beneficiosas lo que será útil, en último término, para
su utilización racional como probióticos.
Los avances en genética molecular de las bifidobacterias debidos a la
secuenciación genómica han de complementarse con nuevas herramientas y técnicas
que faciliten el estudio funcional de sus propiedades y sus relaciones con los demás
componentes del ecosistema intestinal. Estos conocimientos posibilitaran en un
futuro la modificación y mejora de sus propiedades. En particular, son escasos los
vectores de clonación para las diversas especies del género (generales y
Objeto del trabajo
34
especializados) y faltan también cepas receptoras adecuadas y métodos eficientes de
transformación. La mayor parte de los vectores desarrollados para las bifidobacterias,
basados en algunos de los plásmidos caracterizados, presentan inestabilidad
estructural, segregacional o ambas a la vez, por lo que es necesario estudiar y
caracterizar más plásmidos hasta encontrar replicones con los que desarrollar
herramientas genéticas mejoradas. Se precisa también conocer en mayor detalle la
biología básica de los plásmidos para que su diseño se sustente en el conocimiento de
las proteínas que codifican y la función de las secuencias no codificadoras que
participan en la replicación y su control.
Estos motivos nos han llevado a plantear el presente trabajo de Tesis Doctoral
con los siguientes objetivos:
1.- Determinar la presencia de plásmidos en cepas de bifidobacterias
procedentes de una reciente caracterización de la microbiota intestinal humana.
2.- Secuenciar algún plásmido con características deseables para su
conversión en vectores de clonación.
3.- Diseccionar, en la medida de nuestras posibilidades, sus secuencias y
pautas de lectura para determinar su función.
4.- Desarrollar y aplicar vectores bifuncionales E. coli-Bifidobacterium y
vectores específicos para bifidobacterias.
5.- Revisar las técnicas de electrotransformación de bifidobacterias tratando
de aumentar la frecuencia de transformación.
MATERIAL Y MÉTODOS
Material y Métodos
35
II.1 - CEPAS BACTERIANAS, PLÁSMIDOS Y CONDICIONES DE
CULTIVO.
II.1.1. Cepas bacterianas y plásmidos.
La cepa Bifidobacterium catenulatum L48 y el resto de bifidobacterias
empleadas en este trabajo fueron aisladas previamente por Delgado y colaboradores
como componentes dominantes de las poblaciones de bifidobacterias intestinales de
individuos sanos (Delgado et al., 2006). La cepa Bifidobacterium breve UCC2003
fue cedida a nuestro Grupo por el Dr. Douwe van Sinderen (Deparment of
Microbiology, University College Cork y Alimentary Pharmabiotic Center, Cork,
Irlanda).
Estas cepas, junto con otras de Escherichia coli, se relacionan en la Tabla 5.
En la misma tabla, se incluyen también los plásmidos y vectores de clonación
utilizados a lo largo de la investigación.
II.1.2. Medios y condiciones de cultivo.
Las cepas de bifidobacterias se crecieron en condiciones anaeróbicas a 37ºC
sin agitación en el medio de Man, Rogosa y Sharpe (MRS) (Merck) suplementado
con 0,25% de cisteína (MRSC) con el fin de mantener un bajo potencial redox en el
medio, o en “Reinforced Clostridial Medium” (RCM) (Merck). E. coli se creció en
caldo de Luria Bertani (LB) (composición 10 g de triptona, 5 g de extracto de
levadura y 5 g de NaCl por litro) a 37ºC con agitación (200-400 rpm,
aproximadamente). Los correspondientes medios sólidos se prepararon adicionando
agar hasta una concentración final del 2%.
Material y Métodos
36
Para su conservación, las cepas se cultivaron en el medio y las condiciones
adecuadas durante una noche. Transcurrido este tiempo, los cultivos se centrifugaron
y resuspendieron en una mezcla a partes iguales de medio líquido fresco y glicerol al
50%. Las cepas se almacenaron congeladas a -80ºC.
II.1.3. Antibióticos.
Para la selección de las distintas construcciones y vectores se han utilizado
los siguientes antibióticos: ampicilina (Ap), eritromicina (Em), cloranfenicol (Cm) y
tetraciclina (Tc), todos suministrados por Sigma (Sigma-Aldrich). Las
concentraciones finales en los medios de cultivo variaron en función, principalmente,
de la cepa hospedadora de los vectores: ampicilina 100 µg/ml para E. coli;
eritromicina 250 µg/ml para E. coli y 5 µg/ml para Bifidobacterium; tetraciclina 5
µg/ml para E. coli y Bifidobacterium; y cloranfenicol 10 y 2 µg/ml, respectivamente,
para E. coli y Bifidobacterium.
Material y Métodos
37
Tabla 5. Cepas y vectores utilizados en el presente trabajo.
Cepas y vectores Características más relevantes Fuente o referencia
Bifidobacterium
B. catenulatum L48 Cepa original portadora del plásmido pBC1
Delgado et al. (2006)
B. pseudocatenulatum M115 Cepa original libre de plásmidos Delgado et al. (2006)
B. breve UCC2003 Cepa original libre de plásmidos APC, University College Cork
B. dentium F101 Cepa original libre de plásmidos Delgado et al. (2006)
B. longum L25 Cepa original libre de plásmidos Delgado et al. (2006)
B. adolescentis LMG10502 Cepa original libre de plásmidos Laboratotrium voor Microbiologie Universiteit
Gent (LMG) B. animalis LMG 10508 Cepa original libre de plásmidos LMG
B. breve LMG 13208 Cepa original libre de plásmidos LMG
B. thermophilum LMG 11571 Cepa original libre de plásmidos LMG
B. pseudolongum subsp. pseudolongum LMG 11571
Cepa original libre de plásmidos LMG
E. coli
DH5α F-, φ80dlacZ∆M15, ∆(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44, λ-, thi-1, gyrA96, relA1
Invitrogen
TOP 10 F-mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) F80lacZ∆M15 ∆lacX74 recA1 deoR araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rspL (Strr) endA1nupG
Invitrogen
DH11S mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) ∆(lac-proAB) ∆(rec1398) deoR rpsL srl-thi-/F'proAB+ lacIqZ∆M15
Invitrogen
Plásmidos
pBC1 Endógeno de B. catenulatum L48 (2,5kpb)
Este trabajo
pUC18/19 Vector de selección positiva de E. coli; Apr, LacZ+; origen ColE1 (2,6kpb)
Yanish-Perron et al. (1985)
pUC19E Derivado de pUC19; Apr, Emr (3,8kpb)
Leenhouts et al. (1990)
pBif Vector de selección positiva de E. coli; Apr, Cmr (6,5kpb)
Sangrador-Vegas et al. (2007)
pBC1.2 Región de replicación de pBC1 clonada en pBif (ori, repB, ∆orfX-like, ∆IR, ∆copG-like)
Este trabajo
pBC1.3 Región de replicación de pBC1 clonada en pBif (ori, repB, orfX-like, ∆IR, ∆copG-like)
Este trabajo
Material y Métodos
38
pBC1.4 Región de replicación de pBC1 clonada en pBif (ori, repB, orfX-like, IR, ∆copG-like)
Este trabajo
pBC1.5 Región de replicación de pBC1 clonada en pBif (ori, repB, orfX-like, IR, copG-like)
Este trabajo
pAM1 Vector bifuncional E.coli-Bifidobacterium; Apr, Emr (6,1kpb)
Este trabajo
pAM2 Vector de selección positiva de Bifidobacterium; Emr (3,6kpb)
Este trabajo
pAM3 Vector bifuncional E.coli-Bifidobacterium; Apr, Emr, Tcr (8,6kpb)
Este trabajo
pAM4 Vector bifuncional E.coli-Bifidobacterium; Apr, Tcr (7,6kpb)
Este trabajo
II.2 - OBTENCIÓN Y MANIPULACIÓN DE ADN.
II.2.1. Aislamiento de ADN plasmídico.
La extracción de ADN plasmídico a partir de las cepas de bifidobacterias se
realizó según el protocolo descrito por O’Sullivan y Klaenhammer (1993) con las
siguientes modificaciones: una vez recogidas, las células se resuspendieron en
tampón TSE (sacarosa 25%, 50 mM Tris–HCl pH 8.0 y 10 mM EDTA pH 8.0) y se
incubaron con lisozima a 37ºC durante 30 minutos. Para el aislamiento del ADN
plasmídico de E. coli se utilizó el kit comercial “Plasmid Miniprep kit” (Eppendorf)
siguiendo las instrucciones del fabricante.
II.2.2. Electroforesis de ADN.
La separación de los plásmidos o de los correspondientes fragmentos de ADN
se llevó a cabo en geles de agarosa a concentración de 0,8-1,2% en tampón TBE
(Tris-borato 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8,0). Las condiciones de electroforesis se
modificaron en función del tamaño de los fragmentos que se querían separar,
siguiendo las recomendaciones de Sambrook y Russell (2001). Como patrones de
Material y Métodos
39
peso molecular se utilizó el “Molecular Ruler” 1kpb (Bio-Rad), el “Gene Ruler TM
DNA ladder mix” (Fermentas) y en algunos casos el ADN del bacteriófago λ
digerido con HindIII ó PstI.
Las bandas de ADN se visualizaron en un equipo “Gel Doc 2000” (Bio-Rad)
después de su tinción con una solución de bromuro de etidio (0,5 µg/ml) (Sambrook
and Russell, 2001).
II.2.3. Purificación de fragmentos de ADN.
La purificación de los productos amplificados por PCR así como la de los
fragmentos de ADN en geles de agarosa se realizó mediante el kit comercial “GFX
PCR DNA and Gel Band Purification Kit” (G.E. Healthcare), siguiendo las
instrucciones de la casa comercial. En ocasiones para el aislamiento de ADN desde
geles de agarosa también se utilizó el sistema “freeze and squeeze” (Sambrook and
Russell, 2001). Para ello, se recorta la porción del gel donde ha migrado la banda de
ADN que se desea purificar, se introduce en una jeringuilla estéril y se congela;
seguidamente, se aplica una suave presión sobre el émbolo y se recogen las gotas de
tampón que resultan de la descongelación. Éstas contendrán el tampón con el ADN,
quedando la agarosa retenida en la jeringuilla. El ADN se purifica con una mezcla
fenol-cloroformo tamponado (USB), se precipita y a continuación se resuspende en
tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0).
II.2.4. Digestión con enzimas de restricción.
Las condiciones y tampones empleados para las digestiones enzimáticas con
endonucleasas de restricción, fueron las recomendadas, en cada caso, por las firmas
suministradoras (Takara y Roche).
Material y Métodos
40
II.2.5. Ligación del ADN.
Las ligaciones se realizaron con la ligasa del fago T4 (Invitrogen) en el
tampón recomendado. En la mayoría de los casos se mantuvo la proporción de 1
molécula de vector por 4 de inserto, y la reacción se llevó a cabo en un volumen de
10-20 µl a una concentración de ADN entre 25-100 µg/ml. Las mezclas de ligación
se incubaron a 12-16ºC durante una noche.
Cuando la ligación se llevó a cabo con el kit “PCR 2.1 TOPO TA Cloning
Kit” (Invitrogen), las cantidades fueron las recomendadas por la casa comercial.
II.2.6. Conversión de extremos cohesivos en romos.
Para generar extremos romos a partir de ADN cortado con enzimas de
restricción que producen extremos cohesivos, se procedió al rellenado de los mismos
mediante reacción con el fragmento Klenow de la ADN Polimerasa I de E. coli
(USB) y una mezcla de nucleótidos (Eppendorf). Las reacciones se llevaron a cabo a
una temperatura de 37ºC durante 15 minutos.
II.2.7. Electrotransformación de E. coli.
Las células electrocompetentes de E. coli se obtuvieron según el
procedimiento recogido en Sambrook and Russell (2001). Las condiciones de
descarga eléctrica en este caso fueron 12,5 kV, 200 Ω y 25 µF. Una vez
transformadas, las células se incubaron en 1 ml de medio LB a 37ºC durante 1 hora
con agitación constante. Una vez transcurrido este tiempo, se sembraron en placas
del mismo medio con un 2% de agar y el antibiótico de selección correspondiente.
Cuando se utilizó pUC18 ó pUC19, se agregó al medio IPTG (isopropil-β-D-
tio-galactopiranósido) y X-gal (5’-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido),
Material y Métodos
41
ambos de Sigma, en concentraciones respectivas de 0,5 mM y 80 µg/ml, para
detectar las moléculas recombinantes.
II.2.8. Electrotransformación de bifidobacterias.
Para la preparación de células electrocompetentes de bifidobacterias, se
siguió el siguiente protocolo: partiendo de un cultivo de una noche se inoculó MRSC
fresco (8% de inóculo) y se creció durante 3-4 horas hasta alcanzar una densidad
óptica a 600 nm de 0,5-0,6. Los cultivos se mantuvieron en hielo durante 20 minutos
y posteriormente se lavaron dos veces en un tampón 0,5 M de sacarosa y 1 mM de
citrato amónico pH 5,8. Después de los lavados, las células se resuspendieron en 100
µl del mismo tampón y se mantuvieron en hielo durante 20 minutos.
La electroporación se llevó a cabo en un “Gel Pulser Apparatus” (Bio-Rad)
en cubetas de 0,2 cm de separación entre polos. Las condiciones del pulso eléctrico
aplicado fueron 10 kV, 200 Ω y 25 µF. Tras el pulso eléctrico, las células se
diluyeron inmediatamente en 1 ml de RCM. Tras 2-3 horas de incubación en
anaerobiosis a 37ºC, las células se sembraron en placas del mismo medio con agar al
2% y con el antibiótico de selección adecuado en función del vector.
Material y Métodos
42
II.3 - SECUENCIACIÓN DE ADN Y ANÁLISIS DE SECUENCIAS.
II.3.1. Secuenciación automática de ADN.
Las muestras de ADN se secuenciaron mayoritariamente en los servicios
externos de la empresa SECUGEN S.L. (Madrid), utilizando un secuenciador ABI
PRISM® 3700 (Applied Biosystems) o en la Unidad de Secuenciación de la
Universidad de Oviedo, utilizando, en este caso, un secuenciador ABI PRISM® 3100
(Applied Biosystems).
II.3.2. Análisis de secuencias.
Los cromatogramas de secuenciación se leyeron con el programa CHROMAS
(v 1.45) (Technelysium Pty. Ltd.) y se analizaron utilizando el programa VECTOR
NTI ADVANCE (v 9.1) (Informax). La búsqueda de homologías de las secuencias
con las existentes en las bases de datos se llevó a cabo empleando los programas
BLASTN y BLASTP (Altschul et al., 1997), que proporciona a través de Internet el
National Center for Biotechnology Information (NCBI)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.library.vu.edu.au/BLAST/).
II.4 - ANÁLISIS NUMÉRICO.
La construcción de los distintos árboles filogenéticos se realizó por el método
de “neighbor-joining” (Saitou and Nei, 1987). Para ello se construyeron matrices de
distancias con los datos de los alineamientos múltiples entre las secuencias
aminoacídicas deducidas de las ORFs en estudio y las proteínas homólogas de otros
plásmidos presentes en las bases de datos con el programa DNAman (Lynnon
Biosoft) y se representaron gráficamente.
Material y Métodos
43
II.5 - TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN.
II.5.1. Hibridación de ADN plasmídico.
El ADN se separó por electroforesis en geles de agarosa al 0,8%, y se
transfirió en condiciones desnaturalizantes a membranas “Hybond-N” (GE Heath
Care Bio-Sciences) siguiendo el protocolo estándar descrito por Sambrook y Russell
(2001).
El marcaje de la sonda y la detección se llevó a cabo mediante el kit
comercial “DIG High Prime DNA Labelling and Detection Kit” (Roche) siguiendo
las instrucciones del fabricante.
II.5.2. Detección de intermediarios de ADN de cadena sencilla.
Para la detección de intermediarios de ssADN, se procedió al aislamiento de
ADN total a partir de células crecidas en presencia o ausencia de cloranfenicol y
rifampicina, siguiendo el método descrito por te Riele y colaboradores (1986). El
ADN se separó en un gel de agarosa al 0,7%, y se transfirió en condiciones
desnaturalizantes y no desnaturalizantes a membranas “Hybond-N”. Los
intermediarios de ssADN se detectaron mediante hibridación, utilizando como sonda
de forma conjunta un fragmento derivado del plásmido pBM02, que se utilizó como
control, y un fragmento de pBC1 para la detección de ssADN en este plásmido,
marcando ambas sondas con fósforo radioactivo (32P) (Amersham Biosciences).
Material y Métodos
44
II.6 - TÉCNICAS DE REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR).
II.6.1. Técnica convencional de la reacción en cadena de la polimerasa.
Para la amplificación de fragmentos concretos de ADN, se recurrió a técnicas
de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), siguiendo las instrucciones de los
suministradores de la ADN polimerasa termoestable Taq (Eppendorf), del kit
“Extensor Hi-Fidelity PCR Master Mix” (ABgene) y del sistema “Expand Long
Template PCR System” (Roche). La amplificación se llevó a cabo en un
termociclador “PCR Sprint” (Hybaid). Los oligonucleótidos utilizados en las
distintas amplificaciones se sintetizaron en Sigma-Genosys y se detallan en la Tabla
6.
Tabla 6. Oligonucleótidos utilizados en la secuenciación de pBC1.
Nombre Secuencia nucleotídica (5’-3’) Orientación Posición 5F GATATTTCAGCCCAGCAAAGC + 2044-2024 5R TGTGACCGACGCGCTCAGATG - 694-710 10F AGACCACCGTGGTGTTACTCTG + 2489-2504 10R CATCTCCATGTGGATGTCCATG - 313-333 RepF GCTGCGAATACTCGTCAGAC + 1946-1965 R1 CATCGAGGCGAATCCCTCG - 717-735 R2 CCAAGGCGATGGCCCTGTGG - 779-798 11F ACATCAGCCGCAGCGAGTAC + 492-511 R3 CCCAAGAGCATCCACAAGTG - 1319-1337
Material y Métodos
45
De forma general, las condiciones de las reacciones de amplificación fueron
las siguientes:
1 ciclo Desnaturalización 95ºC 5 min
Desnaturalización 94ºC 30-45 s 30 ciclos
Anillamiento 5ºC por debajo de la Tm de los
oligonucleótidos
1 min
Extensión 68-72ºC
dependiendo de la polimerasa
1 min por kpb a amplificar
1 ciclo Extensión 68-72ºC 10 min
Para su secuenciación, los amplicones se purificaron a través de las columnas
limpiadoras del kit “GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit” (G.E.
Healthcare) siguiendo las instrucciones de la casa suministradora. De esta forma, se
evita que los dNTPs y los oligonucleótidos presentes en la reacción de amplificación
interfieran en la subsiguiente reaccion de secuenciación.
II.6.2. Técnica de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real.
El número de copias de pBC1 así como el de sus vectores derivados pBif-
pBC1 y alguno de los vectores de clonación se estimó mediante la técnica de la PCR
cuantitativa en tiempo real, siguiendo las condiciones descritas por Lee y
colaboradores (Lee et al., 2006). La reacción tuvo lugar en un sistema 7500 Fast
Real-Time PCR (Applied Biosystems) en placas de 96 pocillos utilizando “Power
SYBER Green PCR Master Mix” (Applied Biosystems). Los oligonucleótidos
cebadores fueron diseñados empleando el programa PRIMER EXPRESS (v 2.0)
(Applied Biosystems). Los cebadores FrepB y RrepB (Tabla 7) se diseñaron
basándose en la secuencia del gen repB del plásmido pBC1, generando un segmento
Material y Métodos
46
de 113 nucleótidos. En la cepa B. breve UCC2003 el gen empleado como control
interno fue el 1-deoxi-d-xilulosa-5-fosfato-sintasa (dxs) (D. van Sinderen
comunicación personal), del cual se amplificó un segmento de 119 pares de bases
con los oligonucleótidos Fdxs y Rdxs (Tabla 7). Mientras que para la cepa B.
pseudocatenulatum M115, se utilizó como control un segmento (de 109 pares de
bases) del gen xilulosa-5-fosfato/fructosa-6-fosfato-fosfocetolasa (xfp) amplificado
con los oligonucleótidos Fxfp y Rxfp, basándose en la secuencia del mismo gen de
B. catenulatum ATCC 27539 (Número de Acceso GenBank AY377401).
Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: desnaturalización
inicial de 10 minutos a 95ºC seguida de 40 ciclos de 95 ºC durante 15 seg y extensión
a 60 ºC durante 1 min. Para verificar la especificidad de la reacción se añadió como
paso adicional el análisis de la curva de disociación. En cada reacción, se incluyó un
control negativo para cada pareja de oligonucleótidos. La fluorescencia se normalizó
con respecto a un fluoróforo de referencia (ROX, carboxi-rodamina) incluido en cada
reacción. El valor utilizado para la comparación de la expresión génica fue el ciclo
umbral (CT), definido como el número de ciclos necesario para que la señal de
fluorescencia aumente de forma significativa con respecto al nivel basal.
El número de copias de los plásmidos relativo al número de copias del
cromosoma bacteriano se calculó según la formula Nrelativa=(1+E)-∆CT (Lee et al.,
2006) donde E es la eficiencia de la reacción de amplificación y ∆CT es la diferencia
entre el ciclo umbral (CT) del gen diana y el gen control. Cada experimento se llevó a
cabo por triplicado y los resultados se expresan como la media de los valores
obtenidos.
Material y Métodos
47
Tabla 7. Oligonucleótidos utilizados en las reacciones de amplificación de PCR cuantitativa.
Gen Oligo directo (5´- 3´) Oligo reverso (5´- 3´ ) Longitud del amplicón (pb)
repB GCCACGTTCGTCGCCATCCA CCGAACAGCTCTGCCTTTTG 113 dxs ACTCATTCCCCCGACTCAGG TCGCGGCATAGCTCATTCAG 119 xfp GACGTCACCAACAAGCAGTG CTTCCATCTGGTGCTCGGAG 109
II.7 - DETERMINACIÓN DE LA ESTABILIDAD SEGREGACIONAL
DE LOS PLÁSMIDOS.
Para el estudio de la estabilidad segregacional de los derivados obtenidos a
partir del plásmido pBC1, se partió de colonias portadoras de las distintas
construcciones aisladas en placa con el agente de selección correspondiente. Estas
colonias se inocularon en medio líquido sin antibiótico y se incubaron durante 24
horas. A partir del cultivo del día anterior, se inoculó medio fresco al 1% de forma
diaria hasta alcanzar unas 100 generaciones celulares. Para obtener colonias aisladas,
se sembraron a diario en medio no selectivo diluciones seriadas de los cultivos,
transfiriéndose tras su crecimiento a placas nuevas con el antibiótico o antibióticos
de contraste. Los resultados del número de colonias resistentes se expresaron en
valores porcentuales respecto del número total.
II.8 - ENSAYOS DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS MEDIANTE
EL MÉTODO ETEST.
La susceptibilidad/resistencia a antibiticos se realizó en las cepas originales
de B. pseudocatenulatum M115 y/o B. breve UCC2003 y en las transformadas con
las distintas construcciones generadas a partir de pBC1.
Colonias individuales se inocularon, desde placas de MRSC, mediante un
hisopo en 2-5 ml de solución salina esteril (Oxoid) hasta alcanzar una densidad
Material y Métodos
48
óptica correspodiente a la suspensión 1 de la escala de McFarland o su equivalente
espectrofotométrico (en torno a 3.0 x108 ufc/ml).
La suspensión celular se utilizó para inocular placas de LSM (90%
IsoSensitest, 10% MRS, ambos de Oxoid), un medio propuesto de forma reciente
para los ensayos de resistencia a antibióticos en bacterias del ácido láctico (Klare et
al., 2005). La superficie de las placas inoculadas se dejó secar durante unos 15
minutos. Una vez transcurrido ese tiempo se colocaron las tiras Etest con un
gradiente de antibiótico desde 0.016 a 256 µg ml-1 (AB Biodisk).
Los resultados se registraron después de 48 horas de incubación en
condiciones de anaerobiosis. Como concetración inhibitoria mínima (CIM) para los
distintos antibióticos se consideró aquel punto en el que el crecimiento estaba
considerablemente inhibido (en torno al 80%, estimado de manera visual) siguiendo
las recomendaciones del fabricante.
II.9 - DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD α-L-
ARABINOFURANOSIDASA.
Para la medida de la actividad α-L-arabinofuranosidasa se utilizaron extractos
celulares obtenidos mediante el siguiente protocolo: 10 ml de cultivos en fase
estacionaria se centrifugaron y se resuspendieron en 2 ml de tampón fosfato potásico
100 mM a pH 6,8. Posteriormente las células se sometieron a ruptura mecánica
utilizando un “Cell Disruptor” (Constant Systems). El ensayo de actividad se realizó
con estos extractos en microplacas en un volumen final de reacción de 200 µl en un
tampón acetato 40 mM, pH 5,5 y una concentración final de p-NP-α-L-
arabinofuranósido de 1,6 mM. Las placas se analizaron utilizando un lector de
microplacas Benchmark Plus (Bio Rad) aplicando los siguientes parámetros de
Material y Métodos
49
lectura: longitud de onda 420 nm, a 37ºC durante 10 min, obteniéndose 40 puntos de
lectura que nos permitieron confeccionar las curvas de actividad.
Una unidad arbitraria (UA) de actividad α-L-arabinofuranosidasa (UA/min)
se definió como la variación de la absorbancia por minuto y los resultados se
expresaron como unidades por µg de proteína del extracto (UA min-1 µg prot-1).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Resultados y Discusión
51
CAPÍTULO 1: AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE pBC1.
III.1 - DETERMINACIÓN LA PRESENCIA DE PLÁSMIDOS EN
CEPAS DE BIFIDOBACTERIAS DEL INTESTINO HUMANO.
Un total de 72 aislados de bifidobacterias, pertenecientes a las especies B.
longum (37), B. bifidum (11), B. animalis (1), B. dentium (1), B. pseudocatenulatum
(16), B. adolescentis (3) y B. catenulatum (3) fueron analizados en busca de
elementos extracromosomales. Se detectaron plásmidos en 19 aislados pertenecientes
a las especies B. longum, B. catenulatum y B. bifidum, con un tamaño aproximado
comprendido entre las 1.5 y 15 kpb. Los 6 perfiles plasmídicos distintos que se
identificaron se muestran en la Figura 8. Las cepas adscritas a las especies B.
catenulatum y B. bifidum presentan únicamente un plásmido por cepa, mientras que
las cepas de B. longum portan al menos dos tipos plasmídicos diferentes. Algunas
bandas pueden corresponder a formas relajadas de los plásmidos (circular abierta o
liniales) que se producen durante el aislamiento y la purificación.
Figura 8: Electroforesis de los distintos perfiles plasmídicos obtenidos en las cepas de bifidobacterias analizadas (calles 1 al 7). Orden: Calle 1, B. catenulatum L21; Calle 2, B. catenulatum L48; Calle 3, B. bifidum L71; Calle 4, B. longum C63; Calle 5 B. longum C72; Calle 6, B. longum M44; Calle 7, B. longum M62. M, ADN de lambda digerido con EcoRI y HindIII.
M M1 2 3 4 5 76M M1 2 3 4 5 76
Resultados y Discusión
52
En las especies del género Bifidobacterium los plásmidos, no parecen ser
abundantes, tal y como han descrito diversos autores (Park et al., 1997; Iwata and
Morishita, 1989; Sgorbati et al., 1982). De los detectados, sólo unos pocos han sido
caracterizados y secuenciados completamente (Guglielmetti et al., 2007; Park et al.,
2008; Sangrador-Vegas et al., 2007; Lee and O’Sullivan, 2006; Tanaka et al., 2005;
Corneau et al., 2004; O`Riordan and Fitzgerald, 1999; Park et al., 1997; Rossi et al.,
1996) Además, de los que se recogen en estos trabajos, hay unos pocos más cuyas
secuencias se hallan depositadas en la base de datos GenBank (Tabla 4 de la
Introducción).
A diferencia de otras bacterias lácticas como los lactococos y algunas
especies de Lactobacillus en las que el ADN extracromosómico puede llegar a ser
especialmente abundante, con cepas que pueden presentar entre 4 y 7 tipos distintos
por célula, pudiendo incluso llegar a 12 o más (Ruiz-Barba et al., 1991; Mayo et al.,
1989; McKay, 1983; Davies and Gasson, 1981), las bifidobacterias presentan unos
niveles de plásmidos muy modestos. En la mayoría de los casos, además, y no sólo
entre nuestros aislados, sólo se encuentra un tipo molecular por célula, siendo
infrecuente la cohabitación de dos o más plásmidos. A pesar de esto, se han descrito
dos plásmidos en unas pocas cepas de B. longum (Lee and O’Sullivan, 2006;
Corneau et al., 2004; Park et al., 1997), y también se ha descrito de forma reciente
una cepa de B. longum biovar longum con tres (Guglielmetti et al., 2007).
De los plásmidos que identificamos en este trabajo, se seleccionó para una
posterior caracterización el que presentaba la cepa B. catenulatum L48. Este
plásmido, que se denominó pBC1, presentaba un tamaño aparente próximo a las 2,5
kpb y un número de copias mayor que los plásmidos de las otras cepas; aunque esto
pudiera ser debido también a un mejor rendimiento del proceso de lisis. Un plásmido
Resultados y Discusión
53
semejante apareció también en la cepa B. catenulatum L21; ambos aislados
provienen de la misma muestra fecal de un mismo individuo y fueron identificadas
fenotípica (mediante API50CHL) y genéticamente (tipificación por RAPD) como
una única cepa (resultados no mostrados), por lo que concluimos que el plásmido
debía ser el mismo también. Este resultado se vio reforzado tras la hibridación de los
perfiles plasmídicos con una sonda basada en la secuencia codificadora de la proteína
de replicación de pBC1, tal y como aparace en la Figura 13 que se muestra más
adelante.
III.1.1. Clonación y secuenciación de pBC1.
De la cepa B. catenulatum L48 se aisló y purificó ADN plasmídico suficiente
como para permitir su restricción con diversas endonucleasas de restricción (Figura
9).
Figura 9. Restricción de ADN plasmídico de pBC1 con diferentes
endonucleasas. Orden: Calle 1: RsaI; Calle 2: Sau3AI; Calle 3: BamHI; Calle 4: HaeIII; Calle 5: EcoRV; Calle 6: SmaI; M, ADN de lambda digerido con HindIII.
M M1 2 3 4 5 6M M1 2 3 4 5 6M M1 2 3 4 5 6M M1 2 3 4 5 6M M1 2 3 4 5 6M M1 2 3 4 5 6
Resultados y Discusión
54
Tras el análisis de los patrones de restricción obtenidos, se constató que su
secuencia nucleotídica presentaba pocos sitios útiles que permitieran la clonación
directa. Sin embargo, la secuencia plasmídica presentaba suficientes sitios de
reconocimiento para la endonucleasa Sau3AI que podrían permitir la clonación de
fragmentos de pequeño tamaño que fueran fácilmente secuenciables en un vector
general de E. coli.
Por lo tanto, el ADN plasmídico de pBC1 se digirió con el enzima de
restricción Sau3AI y una alícuota de esta digestión se ligó con el vector pUC18
cortado con el enzima BamHI, que genera extremos cohesivos compatibles con los
de Sau3AI. La mezcla de ligación, una vez purificada y concentrada, se utilizó para
transformar células electrocompetentes de la cepa E. coli DH5α. Tras la
electroporación se obtuvieron varios clones recombinantes de los que se
secuenciaron las dos cadenas de ADN. Basándose en las secuencias obtenidas, se
diseñaron oligonucleótidos que se utilizaron para amplificar las regiones no clonadas
de pBC1 mediante reacciones de PCR. De este modo se obtuvo la secuencia
completa del plásmido, revelándose como una molécula circular de 2540 pb que
numeramos de forma arbitraria situando la base número 1 en la primera A del sitio
único de restricción BglII.
El mapa físico y genético de la secuencia de pBC1 puede verse en la Figura
10.
Resultados y Discusión
55
III.1.2. Organización general de pBC1.
El análisis de la secuencia de pBC1 mostró un contenido medio en G+C del
64% y tres posibles ORFs con capacidad para codificar péptidos mayores de 50
aminoácidos: un gen que denominamos repB, que bien pudiera codificar la replicasa
de pBC1, un gen transcripcionalmente acoplado a repB que denominamos orfX-like
por su homología con los genes orfX descritos en plásmidos de lactococos y una
tercera ORF, situada en la cadena complementaria, que denominamos CopG-like
porque la proteína deducida muestra un dominio conservado presente en diversas
proteínas de la familia CopG.
Figura 10. Mapa físico y genético de pBC1. Las flechas muestran la longitud
y dirección de las ORFs completas. También se representan los sitios de restricción más relevantes y su posición en la molécula. Las cabezas de flecha indican diversas repeticiones directas e invertidas y su posición relativa en el plásmido.
BglII (1)
SpeI (565)
PvuI (753)
AccI (2388)
PvuII (676)
PvuII (2084)
SacII (1928)
SacI (2186)
NcoI (114)
NcoI (332)
NcoI (380)
pBC12540 bp
repBorfX-like
copG-like
NcoI (1880)
MluI (1011)
AarI (1265)
BglII (1)
SpeI (565)
PvuI (753)
AccI (2388)
PvuII (676)
PvuII (2084)
SacII (1928)
SacI (2186)
NcoI (114)
NcoI (332)
NcoI (380)
pBC12540 bp
repBorfX-like
copG-like
NcoI (1880)
MluI (1011)
AarI (1265)
Resultados y Discusión
56
III.1.3. El gen repB y la proteína de replicación.
El gen repB comienza en la posición 574 (ATG) de la secuencia de pBC1 y
tiene una longitud de 945 pb. Muestra un contenido en G+C del 67% y el producto
deducido podría constituir la putativa proteína de replicación de pBC1 (Rep). Ésta
constaría de 315 aminoácidos, con un peso molecular estimado de 35,6 kDa.
En las posiciones inmediatamente anteriores a repB no se encontró ninguna
secuencia conservada de unión al ribosoma (GGAGG), aunque se identificó una
secuencia similar (AAGGAG) 86 nucleótidos por encima del gen, situada en
posición 5’ respecto a una pequeña ORF (que no aparece en la Figura 10) con
capacidad para codificar para un péptido de 28 aminoácidos que, sin embargo, no
muestra homología con secuencias depositadas en las bases de datos.
La comparación de la secuencia de la proteína RepB con otras presentes en
las bases de datos identificó el plásmido pBM1 de B. longum B2577 (Rossi et al.,
1996) como el más próximo a pBC1. De hecho la proteína deducida Rep de pBC1
muestra una homología del 81% en su secuencia aminoacídica con la proteína
correspondiente de pMB1. Además, muestra una identidad del 56% con la proteína
Rep del plásmido pDOJH10S de B. longum DJO10A (Lee and O’Sullivan, 2006). La
proteína de replicación de pBC1 muestra homología también (aunque con un
porcentaje menor al 50%) con proteínas de replicación de plásmidos pertenecientes a
especies de otros géneros como Propionibacterium acidipropionici (plásmido
pRG01, 45%; Número de Acceso GenBank NC002611.1), Propionibacterium
jensenii (plásmido pLME106, 45%; Número de Acceso GenBank NC005705.1),
Rhodococcus rubber (plásmido pNC903, 49%; Número de Acceso GenBank
AB218986.1), Brevibacterium linens (plásmido pRBL1, 46%; Número de Acceso
GenBank AAB03568), y Mycobacterium fortuitum (plásmido pAL5000, 47%;
Resultados y Discusión
57
Número de Acceso GenBank NC001381.1). Todos estos microorganismos
pertenecen a la Clase Actinobacteria de microorganismos Gram-positivos con alto
contenido G+C, y, por tanto, están filogenéticamente emparentados.
En la secuencia de la proteína Rep de pBC1 se identificó un dominio
conservado Pfam (Número de Acceso Pfam PF03090), el cual es característico de
una familia de proteínas de iniciación de la replicación plasmídica (Bateman et al.,
2004). Las proteínas pertenecientes a estas familias se encuentran generalmente en
un equilibrio entre formas diméricas y monoméricas, aunque ambas formas son
activas y participan en el proceso de replicación (del Solar et al., 1998); los
monómeros se unen a secuencias del ADN con repeticiones directas (iterones)
activando la replicación; por el contrario, las formas diméricas reprimen la
transcripción de la proteína de replicación mediante su unión a repeticiones
invertidas situadas en la proximidad de los iterones (estas secuencias se conocen
como los operadores de los genes de replicación). La disociación de los dímeros
puede tener lugar de manera espontánea o mediada por las proteínas chaperonas
celulares Hsp70 (del Solar et al., 1998).
Después de un alineamiento múltiple de la secuencia aminoacídica de RepB
de pBC1 con un total de 27 secuencias de proteínas de replicación procedentes de
plásmidos de bifidobacterias y de otras familias de bacterias tanto Gram-positivas
como Gram-negativas, se construyó un árbol filogenético utilizando el método de
“neighbor-joining” (Figura 11). Como puede observarse RepB de pBC1 quedó
agrupada junto con las proteínas de replicación de los plásmidos pMB1 y
pDOJH10S, ambos procedentes de B. longum, pero también con las proteínas Rep de
los plásmidos ColE2 (Hiraga et al., 1994) y pXZ10142 (Número de Acceso
GenBAnk NC002099) aislados de E. coli y Corynebacterium glutamicum,
Resultados y Discusión
58
respectivamente, y en los que la replicación tipo Theta se ha demostrado
experimentalmente.
Basándose en la homología de la proteína Rep y en la presencia de proteínas
de distintas familias Pfam, Guglielmetti y colaboradores han agrupado los plásmidos
de bifidobacterias en cinco grupos (I a V) (Guglielmetti et al., 2007). pBC1, pMB1 y
pDOJH10S conformarían el grupo III.
Resultados y Discusión
59
Figura 11. Distancia evolutiva medida como porcentaje de identidad aminoacídica de las proteínas RepB de todos los plásmidos de bifidobacterias secuenciados. Se han incluido también diferentes plásmidos tipo de especies Gram-positivas y Gram-negativas (marcadas con asterisco). La flecha señala el plásmido pBC1 de B. catenulatum L48.
*ColE2 E. colipBC1pMB1 B. longum
pDOJH10S B. longum*pXZ10142 C. glutamicum
pAP1 B. asteroidespCIBAO89 B. asteroidespNAC3 B. longumpDOJH10L-Rep B. longum*pCRY4 C. glutamicum
pB44 B. longumpKJ36 B. longum
pDOJH10L-RepB B. longumpNAC2 B. longumpMG1 B. longum
pBLO1 B. longumpDOJH10L-RepA B. longumpNAL8M B. longum
pKJ50 B. longumpNAC1 B. longumpNAL8L B. longum*pC194 S. aureus*pWV02 L. lactis
p4M B. pseudocatenulatumpASV479 B. pseudolongumpCIBb1 B. brevepNBb1 B. brevepB21a B. breve*pT181 S. aureus
*ColE2 E. colipBC1pMB1 B. longum
pDOJH10S B. longum*pXZ10142 C. glutamicum
pAP1 B. asteroidespCIBAO89 B. asteroidespNAC3 B. longumpDOJH10L-Rep B. longum*pCRY4 C. glutamicum
pB44 B. longumpKJ36 B. longum
pDOJH10L-RepB B. longumpNAC2 B. longumpMG1 B. longum
pBLO1 B. longumpDOJH10L-RepA B. longumpNAL8M B. longum
pKJ50 B. longumpNAC1 B. longumpNAL8L B. longum*pC194 S. aureus*pWV02 L. lactis
p4M B. pseudocatenulatumpASV479 B. pseudolongumpCIBb1 B. brevepNBb1 B. brevepB21a B. breve*pT181 S. aureus
Resultados y Discusión
60
III.1.4. El gen orfX-like, transcripcionalmente acoplado a repB.
En la región 3’ inmediatamente posterior a repB se identificó una segunda
ORF que codifica para un posible péptido de 96 aminoácidos con un peso molecular
estimado de 11,2 kDa que denominamos orfX-like. El codón de iniciación de este
gen (ATG en la posición 1518) se encuentra solapando el codón de terminación del
gen repB, lo que sugiere que ambos genes se pudieran transcribir de manera
acoplada. Once pares de bases por encima del codón de iniciación de orfX-like se
identificó una posible secuencia de unión al ribosoma (AAGGAGA).
Un gen similar a orfX-like se encuentra también en el plásmido pMB1 de B.
longum (Rossi et al., 1996), el plásmido que muestra mayor homología con pBC1.
En el plásmido pDOJH10S no se anotó en un principio ninguna secuencia
equivalente (Lee and O’Sullivan, 2006), sin embargo, la comparación posterior con
la secuencia de pBC1 reveló una identidad nucleotídica del 67% entre el gen orfX-
like de pBC1 y la secuencia comprendida entre las bases 875 y 1172. El gen orfX-
like de pDOJH10S presenta una organización similar a la de pBC1 y pMB1 con el
codón de iniciación solapando el codón de terminación de su gen repB
correspondiente.
El gen repB de pBC1 presenta una identidad del 81% con el gen repB de
pMB1, mientras que los correspondientes genes orfX-like solamente comparten un
62% de su secuencia de nucleótidos. Por el contrario la homología entre el gen orfX-
like de pBC1 y su secuencia equivalente en pDOJH10S es mayor (66%) que la que
muestran los genes respectivos de sus proteínas de replicación (56%).
Una ORF similar a la de estos genes se identificó primeramente en la región
3’ posterior del gen repB en varios plásmidos de lactococos que replican mediante
mecanismo de tipo Theta. En el caso de los lactococos se ha comprobado
Resultados y Discusión
61
repetidamente que los genes orfX no son esenciales para la replicación plasmídica
(Sánchez et al., 2000; Gravesen et al. 1995; Frère et al., 1993; Hayes et al., 1991).
De hecho son varios los plásmidos que presenta el gen orfX interrumpido de forma
natural, y en otras ocasiones el gen está asusente por completo como ocurre en los
plásmidos pWV02 (Kiewiet et al., 1993) y en los genes repB1 y repB2 de los cuatro
replicones funcionales que presenta pNZ4000 (van Kranenburg and de Vos, 1998). A
pesar de que la función real del producto del gen orfX no se conoce, en algunos
plásmidos se ha comprobado que participa en la regulación del número de copias, en
la estabilidad plasmídica o en ambas funciones a la vez (Sánchez et al., 2000;
Gravesen et al., 1995; Frère et al., 1993; Kiewiet et al., 1993; Hayes et al., 1991).
III.1.5. El gen copG-like.
Una tercera ORF (copG-like) se identificó en la hebra complementaria de
pBC1. El codón de iniciación de esta ORF se sitúa en la posición 2284 y tiene una
capacidad codificadora de un péptido de 94 aminoácidos con un peso molecular de
10,7 kDa. Seis pares de bases por encima del codón de iniciación se encuentra una
secuencia que podría funcionar como sitio RBS (AAGGAG). El hipotético producto
de copG-like presenta un dominio conservado Pfam HTH_4 Ribbonhelix-helix
(Número de Acceso PF01402) que está presente en las proteínas de la familia CopG
(Bateman et al., 2004). No obstante la homología de este gen con el de otras
proteínas de la familia CopG no es significativa a nivel nucleotídico ni aminoacídico.
Las proteínas CopG se identificaron inicialmente en plásmidos que replican mediante
el mecanismo del círculo rodante (del Solar et al., 1998). Estas proteínas son
funcionales en forma de homodímeros (a través de su dominio HTH), los cuales
reconocen secuencias en la zona del promotor del gen repB a las que se unen
Resultados y Discusión
62
regulando así la transcripción del gen, lo que, en último término, determina la
capacidad de replicación y el número de copias.
III.1.6. Regiones no codificadoras en el ori.
Además de las secuencias codificadoras, en el plásmido pBC1 también se han
identificado diversas secuencias no codificadoras que podrían estar implicadas en el
inicio de la replicación y su control. Mientras que las primeras actúan normalmente
en trans, las secuencias no transcritas llevan a cabo su función en cis (del Solar et al.,
1998). La secuencia de ADN de la región de pBC1 anterior a repB se muestra en
detalle en la Figura 12. Por encima de zona inicial de repB se han hallado varias
secuencias ricas en A+T (especialmente las secuencias entre las posiciones 421-481
que tan sólo muestran un contenido en G+C del 46%), también rica en A+T es la
secuencia de las posiciones 511-530, con tan sólo 5 GCs. Estas regiones están
flanqueadas por zonas más ricas en G+C. Cuatro repeticiones invertidas (IR) de
diferente longitud (nombradas consecutivamente IR1 a IR4) se identificaron
inmediatamente por encima de una repetición directa (DR) imperfecta de 24
nucleótidos (ATGGACATCTCCATGTGGATGTCC; Fig. 12) que se repite tres
veces y media (ya que la última repetición presenta una secuencia truncada
ATGGACATCTCCAT). En el interior de estas repeticiones directas también se
observaron posibles repeticiones invertidas. En la región inmediatamente anterior al
codón de iniciación del gen repB se identificó también otra repetición invertida
(denominada IR5). Por último, en la región 3’ de la IR3 se identificó una secuencia
(AGGAGG) que recuerda al origen de replicación oriV del fago lambda (Grosschedl
and Hobom, 1979).
Resultados y Discusión
63
Estas estructuras repetidas se denominan iterones y se han descrito en el
origen de replicación de varios plásmidos de tipo Theta (del Solar et al., 1998; Khan,
1997). También se pueden identificar iterones en las regiones ori de plásmidos con
replicación mediante círculo rodante. Sin embargo, estos últimos suelen ser más
cortos que los de los plásmidos tipo Theta y suelen estar acompañados de otras
estructuras conservadas con una fuerte simetría axial (el origen de replicación de
doble cadena o dso y el origen de replicación de cadena sencilla o sso) (del Solar et
al., 1998; Khan, 1997). Repeticiones similares a las que presenta pBC1 se han
identificado también en los plásmidos de Lactococcus lactis de la familia
pCI305/pWV02, repetidas igualmente tres veces y media (Frére et al., 1993; Kiewiet
et al., 1993). La organización de las repeticiones es común para todos los plásmidos
mientras que la secuencia de ADN repetida es muy variable, confiriendo así una
relación específica a la interacción entre la proteína Rep de un plásmidos y la
secuencia repetida (Seegers et al., 1994).
A pesar de que el mecanismo de replicación de pBC1 no ha sido demostrado
de forma concluyente en esta tesis, está comparación inicial de secuencias ya sugiere
un mecanismo de replicación de tipo Theta. Además, en pBC1 no se ha identificado
ninguna secuencia que sugiera un sitio sso. En la secuencia situada por debajo del
codón de parada de gen orfX-like se han identificado tres IRs, con una ∆G entre -
4,40 kcal/mol y -30,20 kcal/mol, pudiendo funcionar cualquiera de ellas o todas
como un terminador de la transcripción independiente de la proteína de replicación
Rho. Las IR que flanquean la región que comprende los genes repB y orfX-like
sugieren que el módulo de replicación pudiera estar separado del resto del plásmido.
Si esto fuera así, el gen copG-like quedaría situado fuera del bloque de replicación,
pudiendo ser un gen accesorio de pBC1 o la reminiscencia de un hipotético plásmido
Resultados y Discusión
64
compuesto primigenio con un doble mecanismo de replicación (Theta y de círculo
rodante), tal como ha sido descrito en un plásmido de Bacillus subtilis (Oskman et
al., 1992).
Figura 12. Secuencia nucleotídica del inicio del gen repB y de la región no
traducida situada por delante del mismo. Las repeticiones directas e invertidas se indican mediante flechas coincidentes y divergentes, respectivamente, y se numeran de forma consecutiva (excepto las IRs incluidas en las DRs). También se señalan sitios de restricción relevantes, el posible codón de iniciación del gen repB (SC), la secuencia similar al oriV del fago lambda (doblemente subrayada)y las zonas ricas en A+T.
BglII 1 AGATCTCCAAACAGCACCTCCAAGCAAAGTTGATACCAGAGTAACACCACGGTCACACAA
61 GTGGAACACCGTTGTGGCACAAGCCGCGCGAGCGGTCTGGAGGCTCCGCCGACCATGGGG
IR1 IR1 IR2 IR2121 TACGGGTCTTCCCGGCAAGCCGATTCGCACCGCGAATCGAGTGATTGTAGCTACAATCAC
IR3181 GTCGCTTGCTACTCCGGCCTTGCGGCTTTTTCCTCGGCCTCGGGTTGTTGCTCCTGCGCC
IR3 IR4 IR4241 GAAGGGCGCAGGAGGTGCTGCGTTCGGTTCATGTACATGAACCGTCTAGCTTGCTTACCT
DR1 DR2301 TCGATTTGATGGACATCTCCATGTGGATGTCCATGGACATATCCATGTGGGTGTCCATAG
DR3 DR4361 ACGTGTCCATGTGGGTATCCATGGATATATCCATCTGAGCGCATAGGAAGCGCATGAGGG
421 TGGATGATCGTTCGGTTTGGGGTGTTTTTGGCCAGATTTCGACAGTTTTGGGTAACTCTG
IR5481 GGAAGGAGCAGCCCATGCTTTGCTGGGCTGAAATATCTGACTTGGTTTTAGGCGAACTTG
IR5 SpeI SC541 ACCAGTGGTCAAGTACGACGTACACTAGTGCCCATGTCTGACGAGTATTCGCAGCCGACG
M S D E Y S Q P T
601 CTTGAGCTGTCGCGCACGTTCGAGGGCTGGTGGCTGCCCCGGCGTCCGCTGTGCTGCGACL E L S R T F E G W W L P R R P L C C D
PvuII661 GACGACTACAGCCAGCTGGTGCGCCGGAGCCGCACCGACGCGCTCAGATGCAAGCACATC
D D Y S Q L V R R S R T D A L R C K H I
BglII 1 AGATCTCCAAACAGCACCTCCAAGCAAAGTTGATACCAGAGTAACACCACGGTCACACAA
61 GTGGAACACCGTTGTGGCACAAGCCGCGCGAGCGGTCTGGAGGCTCCGCCGACCATGGGG
IR1 IR1 IR2 IR2121 TACGGGTCTTCCCGGCAAGCCGATTCGCACCGCGAATCGAGTGATTGTAGCTACAATCAC
IR3181 GTCGCTTGCTACTCCGGCCTTGCGGCTTTTTCCTCGGCCTCGGGTTGTTGCTCCTGCGCC
IR3 IR4 IR4241 GAAGGGCGCAGGAGGTGCTGCGTTCGGTTCATGTACATGAACCGTCTAGCTTGCTTACCT
DR1 DR2301 TCGATTTGATGGACATCTCCATGTGGATGTCCATGGACATATCCATGTGGGTGTCCATAG
DR3 DR4361 ACGTGTCCATGTGGGTATCCATGGATATATCCATCTGAGCGCATAGGAAGCGCATGAGGG
421 TGGATGATCGTTCGGTTTGGGGTGTTTTTGGCCAGATTTCGACAGTTTTGGGTAACTCTG
IR5481 GGAAGGAGCAGCCCATGCTTTGCTGGGCTGAAATATCTGACTTGGTTTTAGGCGAACTTG
IR5 SpeI SC541 ACCAGTGGTCAAGTACGACGTACACTAGTGCCCATGTCTGACGAGTATTCGCAGCCGACG
M S D E Y S Q P T
601 CTTGAGCTGTCGCGCACGTTCGAGGGCTGGTGGCTGCCCCGGCGTCCGCTGTGCTGCGACL E L S R T F E G W W L P R R P L C C D
PvuII661 GACGACTACAGCCAGCTGGTGCGCCGGAGCCGCACCGACGCGCTCAGATGCAAGCACATC
D D Y S Q L V R R S R T D A L R C K H I
BglII 1 AGATCTCCAAACAGCACCTCCAAGCAAAGTTGATACCAGAGTAACACCACGGTCACACAA
61 GTGGAACACCGTTGTGGCACAAGCCGCGCGAGCGGTCTGGAGGCTCCGCCGACCATGGGG
IR1 IR1 IR2 IR2121 TACGGGTCTTCCCGGCAAGCCGATTCGCACCGCGAATCGAGTGATTGTAGCTACAATCAC
IR3181 GTCGCTTGCTACTCCGGCCTTGCGGCTTTTTCCTCGGCCTCGGGTTGTTGCTCCTGCGCC
IR3 IR4 IR4241 GAAGGGCGCAGGAGGTGCTGCGTTCGGTTCATGTACATGAACCGTCTAGCTTGCTTACCT
DR1 DR2301 TCGATTTGATGGACATCTCCATGTGGATGTCCATGGACATATCCATGTGGGTGTCCATAG
DR3 DR4361 ACGTGTCCATGTGGGTATCCATGGATATATCCATCTGAGCGCATAGGAAGCGCATGAGGG
421 TGGATGATCGTTCGGTTTGGGGTGTTTTTGGCCAGATTTCGACAGTTTTGGGTAACTCTG
IR5481 GGAAGGAGCAGCCCATGCTTTGCTGGGCTGAAATATCTGACTTGGTTTTAGGCGAACTTG
IR5 SpeI SC541 ACCAGTGGTCAAGTACGACGTACACTAGTGCCCATGTCTGACGAGTATTCGCAGCCGACG
M S D E Y S Q P T
601 CTTGAGCTGTCGCGCACGTTCGAGGGCTGGTGGCTGCCCCGGCGTCCGCTGTGCTGCGACL E L S R T F E G W W L P R R P L C C D
PvuII661 GACGACTACAGCCAGCTGGTGCGCCGGAGCCGCACCGACGCGCTCAGATGCAAGCACATC
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BglII 1 AGATCTCCAAACAGCACCTCCAAGCAAAGTTGATACCAGAGTAACACCACGGTCACACAA
61 GTGGAACACCGTTGTGGCACAAGCCGCGCGAGCGGTCTGGAGGCTCCGCCGACCATGGGG
IR1 IR1 IR2 IR2121 TACGGGTCTTCCCGGCAAGCCGATTCGCACCGCGAATCGAGTGATTGTAGCTACAATCAC
IR3181 GTCGCTTGCTACTCCGGCCTTGCGGCTTTTTCCTCGGCCTCGGGTTGTTGCTCCTGCGCC
IR3 IR4 IR4241 GAAGGGCGCAGGAGGTGCTGCGTTCGGTTCATGTACATGAACCGTCTAGCTTGCTTACCT
DR1 DR2301 TCGATTTGATGGACATCTCCATGTGGATGTCCATGGACATATCCATGTGGGTGTCCATAG
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IR5 SpeI SC541 ACCAGTGGTCAAGTACGACGTACACTAGTGCCCATGTCTGACGAGTATTCGCAGCCGACG
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601 CTTGAGCTGTCGCGCACGTTCGAGGGCTGGTGGCTGCCCCGGCGTCCGCTGTGCTGCGACL E L S R T F E G W W L P R R P L C C D
PvuII661 GACGACTACAGCCAGCTGGTGCGCCGGAGCCGCACCGACGCGCTCAGATGCAAGCACATC
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oriV
Zona rica en A+T
Zona rica en A+T
BglII 1 AGATCTCCAAACAGCACCTCCAAGCAAAGTTGATACCAGAGTAACACCACGGTCACACAA
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DR1 DR2301 TCGATTTGATGGACATCTCCATGTGGATGTCCATGGACATATCCATGTGGGTGTCCATAG
DR3 DR4361 ACGTGTCCATGTGGGTATCCATGGATATATCCATCTGAGCGCATAGGAAGCGCATGAGGG
421 TGGATGATCGTTCGGTTTGGGGTGTTTTTGGCCAGATTTCGACAGTTTTGGGTAACTCTG
IR5481 GGAAGGAGCAGCCCATGCTTTGCTGGGCTGAAATATCTGACTTGGTTTTAGGCGAACTTG
IR5 SpeI SC541 ACCAGTGGTCAAGTACGACGTACACTAGTGCCCATGTCTGACGAGTATTCGCAGCCGACG
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601 CTTGAGCTGTCGCGCACGTTCGAGGGCTGGTGGCTGCCCCGGCGTCCGCTGTGCTGCGACL E L S R T F E G W W L P R R P L C C D
PvuII661 GACGACTACAGCCAGCTGGTGCGCCGGAGCCGCACCGACGCGCTCAGATGCAAGCACATC
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BglII 1 AGATCTCCAAACAGCACCTCCAAGCAAAGTTGATACCAGAGTAACACCACGGTCACACAA
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DR1 DR2301 TCGATTTGATGGACATCTCCATGTGGATGTCCATGGACATATCCATGTGGGTGTCCATAG
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421 TGGATGATCGTTCGGTTTGGGGTGTTTTTGGCCAGATTTCGACAGTTTTGGGTAACTCTG
IR5481 GGAAGGAGCAGCCCATGCTTTGCTGGGCTGAAATATCTGACTTGGTTTTAGGCGAACTTG
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601 CTTGAGCTGTCGCGCACGTTCGAGGGCTGGTGGCTGCCCCGGCGTCCGCTGTGCTGCGACL E L S R T F E G W W L P R R P L C C D
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BglII 1 AGATCTCCAAACAGCACCTCCAAGCAAAGTTGATACCAGAGTAACACCACGGTCACACAA
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DR3 DR4361 ACGTGTCCATGTGGGTATCCATGGATATATCCATCTGAGCGCATAGGAAGCGCATGAGGG
421 TGGATGATCGTTCGGTTTGGGGTGTTTTTGGCCAGATTTCGACAGTTTTGGGTAACTCTG
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BglII 1 AGATCTCCAAACAGCACCTCCAAGCAAAGTTGATACCAGAGTAACACCACGGTCACACAA
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IR3 IR4 IR4241 GAAGGGCGCAGGAGGTGCTGCGTTCGGTTCATGTACATGAACCGTCTAGCTTGCTTACCT
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421 TGGATGATCGTTCGGTTTGGGGTGTTTTTGGCCAGATTTCGACAGTTTTGGGTAACTCTG
IR5481 GGAAGGAGCAGCCCATGCTTTGCTGGGCTGAAATATCTGACTTGGTTTTAGGCGAACTTG
IR5 SpeI SC541 ACCAGTGGTCAAGTACGACGTACACTAGTGCCCATGTCTGACGAGTATTCGCAGCCGACG
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601 CTTGAGCTGTCGCGCACGTTCGAGGGCTGGTGGCTGCCCCGGCGTCCGCTGTGCTGCGACL E L S R T F E G W W L P R R P L C C D
PvuII661 GACGACTACAGCCAGCTGGTGCGCCGGAGCCGCACCGACGCGCTCAGATGCAAGCACATC
D D Y S Q L V R R S R T D A L R C K H I
oriV
Zona rica en A+T
Zona rica en A+T
Resultados y Discusión
65
III.1.7. Hibridación de ADN plasmídico de diferentes especies de
bifidobacterias con repB de pBC1.
Con objeto de comprobar la abundancia del replicón de pBC1 o replicones
similares entre los distintos plásmidos de bifidobacterias aislados en este trabajo,
DNA plasmídico procedente de los seis perfiles identificados se sometió a
hibridación utilizando como sonda un fragmento interno del gen repB de pBC1
obtenido mediante PCR. Como se puede observar en la Figura 13B señales de
hibridación positivas solamente se obtuvieron para los plásmidos que portaban los
dos aislados de B. catenulatum (L42 y L48; líneas 1 y 2). En la hibridación, se
utilizaron como controles plásmidos de L. lactis y L. plantarum con replicación tanto
de tipo Theta como círculo rodante (líneas 8 – 11). Como se puede ver en la figura,
en ningún caso se obtuvo señal de hibridación para los plásmidos de estas cepas en
las condiciones de astringencia (hibridación a 68ºC, lavado con 0,1% SDS a 68ºC)
utilizadas.
Figura 13. Panel A: Electroforesis de los distintos perfiles plasmídicos obtenidos en las cepas de bifidobacterias analizadas (calles 1 al 7) y de plásmidos control de diferentes bacterias lácticas (calles 8 al 11). Orden: Calle 1, B. catenulatum L21; Calle 2, B. catenulatum L48; Calle 3, B. bifidum L71; Calle 4, B. longum C63; Calle 5, B. longum C72; Calle 6, B. longum M44; Calle 7, B. longum M62; Calle 8, L. lactis subsp. lactis 1AA22; Calle 9, L. lactis subsp. cremoris C2; Calle 10, L. plantarum C3.8; Calle 11 L. plantarum BE1. M, ADN de lambda digerido con EcoRI and HindIII y marcado con DIG. Panel B: Hibridación del gel del panel A utilizando como sonda un fragmento del gen repB marcado con digoxigenina.
A BM M1 2 3 4 5 76 8 9 1011 M M1 2 3 4 5 76 8 9 10 11
A BM M1 2 3 4 5 76 8 9 1011 M M1 2 3 4 5 76 8 9 10 11
Resultados y Discusión
66
CAPÍTULO 2: ESTUDIO FUNCIONAL DE LOS ELEMENTOS
IDENTIFICADOS EN pBC1.
III.2 - ANÁLISIS FUNCIONAL DE pBC1.
Mediante el diseño de oligonucleótidos adecuados (Ori, OrfX1, OrfX2,
CopG1 y CopG2; Tabla 8) se procedió a la amplificación de diferentes segmentos del
plásmido original pBC1, utilizando como molde ADN plasmídico previamente
purificado (Figura 13A). En la secuencia de los oligonucleótidos se incluyeron sitios
de reconocimiento SphI para facilitar su posterior clonación en el vector pBif, un
vector que no replica en bifidobacterias pero contiene un gen de resistencia a
cloranfenicol que permite su selección en las especies de este género (Sangrador-
Vegas et al., 2007).
Tabla 8. Oligonucleótidos empleados para la amplificación de los distintos
fragmentos de pBC1.
F (forward), dirección 5’-3’ en el sentido de las agujas del reloj en la secuencia de pBC1. R (reverso), dirección 5’-3’ en la cadena complementaria.
El primero de los segmentos amplificados contiene la secuencia completa del
plásmido pBC1 a excepción de las últimas 300 pares de bases, en donde podría estar
situada la región promotora del gen copG-like.
Nombre Secuencia nucleotídica (5' - 3') Orientación Posición Ori GTCACTGCATGCCCAGAGTAACACCACGGTCACAC F 36-59 OrfX1 CGTCATGCATGCCGTCATTGCCCCATCATCTCCTTG R 1515-1540 OrfX2 CTGATGGCATGCCACTTGCTACTCCGGCCTTGC R 1808-1831 CopG1 CTGACTGCATGCTCGCCGGAGCCGTCTGAC R 2011-2031 CopG2 GACTCAGCATGCGTGGAGATGGTCTACGAGCAGCG R 2394-2417
Resultados y Discusión
67
En segundo lugar se amplificó un fragmento de pBC1 que presenta
delecionados los últimos 600 nucleótidos de la molécula, incluyendo la secuencia
completa del gen copG-like. El posible producto de este gen, tal y como se comentó,
contiene un dominio conservado Pfam HTH_4 Ribbon-helix-helix (Número de
Acceso PF01402) (Álvarez-Martín et al., 2007), que está presente en proteínas de la
familia CopG (Bateman et al., 2004) que bien podría estar involucrado en la
replicación o el control de la replicación de pBC1, aspecto que podríamos comprobar
de forma experimental con estos derivados.
El tercero de los segmentos generados por PCR contiene los genes repB y
orfX-like, pero no las repeticiones invertidas situadas después de este último gen y
que podrían actuar como terminadores de la transcripción. De hecho, una estructura
similar ha sido identificada en otros plásmidos de bifidobacterias, como por ejemplo
en el plásmido de B. longum pMB1 (Rossi et al., 1996), aunque su función
terminadora no ha sido probada experimentalmente.
El último de los segmentos amplificados contiene solamente la región ori y el
gen repB y carece del gen acoplado orfX-like. La participación de este gen en la
estabilidad y el número de copias de pBC1 podremos ensayarla con esta última
construcción, comparándola con la función de otras ORF relacionadas de otros
plásmidos.
Resultados y Discusión
68
Figura 14. Representación esquemática de los distintos segmentos de pBC1
amplificados por PCR y su posterior clonación en el vector pBif.
Una vez digeridos, los amplicones se ligaron de forma independiente con el
vector pBif, cortado con SphI (Figura 14B), generándose cuatro nuevas
construcciones denominadas pBC1.2, pBC1.3, pBC1.4 y pBC1.5, que se utilizaron
para transformar en primer lugar células competentes de E. coli y posteriormente,
tras comprobar en esta especie que las construcciones eran correctas, células de las
cepas B. breve UCC2003 y B. pseudocatenulatum M115. El vector pBif sólo replica
en Gram-negativas, por lo que la replicación en bifidobacterias estará mediada, en
todo caso, por las secuencias y estructuras presentes el fragmento de pBC1
correspondiente.
pBC1
repB OrfX-like copG-like
IRIR DR
1.5
1.4
1.3
1.2
1.5
1.4
1.3
1.2
pBif6.5 kb
SphI
SphI
Fragmento pBC1
1.5 1.41.31.2 Vectores derivados
pBC1/pBif
pBC-1.5 pBC-1.4pBC-1.3pBC-1.2
A
B
M
repB OrfX-like copG-like
IRIR DR
repB OrfX-like
IRIR DR
repB OrfX-like
IR DR
repB
SphI SphI
SphI SphI
SphI SphI
SphI SphI
BglII BglII
Apr
Cmr
1 kb
1,6 kb2 kb3 kb
pBC1
repB OrfX-like copG-like
IRIR DR
1.5
1.4
1.3
1.2
1.5
1.4
1.3
1.2
pBif6.5 kb
SphI
SphI
Fragmento pBC1
1.5 1.41.31.2 Vectores derivados
pBC1/pBif
pBC-1.5 pBC-1.4pBC-1.3pBC-1.2
A
B
M
repB OrfX-like copG-like
IRIR DR
repB OrfX-like
IRIR DR
repB OrfX-like
IR DR
repB
SphI SphI
SphI SphI
SphI SphI
SphI SphI
BglII BglII
Apr
Cmr
pBC1
repB OrfX-like copG-like
IRIR DR
1.5
1.4
1.3
1.2
1.5
1.4
1.3
1.2
pBif6.5 kb
SphI
SphI
Fragmento pBC1
1.5 1.41.31.2 Vectores derivados
pBC1/pBif
pBC-1.5 pBC-1.4pBC-1.3pBC-1.2
A
B
M
repB OrfX-like copG-like
IRIR DR
repB OrfX-like
IRIR DR
repB OrfX-like
IR DR
repB
SphI SphI
SphI SphI
SphI SphI
SphI SphI
BglII BglII
Apr
Cmr
1 kb
1,6 kb2 kb3 kb
Resultados y Discusión
69
Se obtuvieron transformantes para todas las construcciones, tanto en B. breve
UCC2003 como en B. pseudocatenulatum M115, aunque la frecuencia de
transformación varió entre los distintos plásmidos recombinantes (desde 1,0x101
ufc/ml a 1,2x103 ufc/ml), aumentando a medida que aumentaba el tamaño del
fragmento de pBC1 presente en la construcción; este efecto fue más acusado aún en
la cepa de B. breve. El análisis de los transformantes demostró que los genes orfX-
like y copG-like no eran esenciales para la replicación de pBC1, no obstante las
diferencias obtenidas en las frecuencias de transformación parecen sugerir que algún
papel importante cumplen en la replicación del plásmido.
III.2.1. Estabilidad plasmídica.
Siguiendo el protocolo descrito en el apartado correspondiente de Material y
Métodos, se ensayó la estabilidad segregacional de todos los derivados pBif-pBC1
durante 100 generaciones, en ausencia de presión selectiva, en la cepa B. breve
UCC2003 y en B. pseudocatenulatum M115. Como puede observarse en la Figura
15, el comportamiento de los distintos derivados varía entre las dos cepas de
bifidobacterias. En la cepa B. pseudocatenulatum M115 el derivado pBC1.5 presenta
una estabilidad similar a la obtenida para el vector pAM4 (construcción pBC1-
pUC19E que porta el gen tet(W) de resistencia a la tetraciclina) mientras que para el
resto de construcciones se ve sensiblemente reducida a medida que aumenta el
número de generaciones. En la cepa B. breve UCC2003, durante las primeras 60
generaciones, todos los derivados presentan unos niveles de estabilidad superiores a
los correspondientes en la cepa B. pseudocatenulatum M115. Sin embargo, en las
generaciones siguientes la estabilidad cae de forma drástica, incluso para la
construcción pBC1.5. En general, el tamaño del fragmento de pBC1 presente en cada
Resultados y Discusión
70
uno de los vectores derivados está otra vez relacionado, como ocurría con la
frecuencia de transformación, con la estabilidad plasmídica. La estabilidad de las
construcciones en las que el gen copG-like y/o orfX-like han sido delecionados decae
de forma brusca. Este hecho puede ser debido a que los genes estén implicados en el
control de la estabilidad plasmídica o a una cuestión de estabilidad estructural de los
propios segmentos de ADN.
Figura 15. Estabilidad segregacional de las construcciones pBC1-pBif en las
cepas B. pseudocatenulatum M115 y B. breve UCC2003.
B. pseudocatenulatum M115
0
20
40
60
80
100
120
20 40 60 80 100
Generaciones
% C
m r
esis
ten
tes pBC1.2
pBC1.3
pBC1.4
pBC1.5
pAM4
B. breve UCC 2003
0
20
40
60
80
100
120
20 40 60 80 80 100
Generaciones
% C
m r
esis
ten
tes pBC1.2
pBC1.3
pBC1.4
pBC1.5
pAM4
Resultados y Discusión
71
III.2.2. Estimación del número de copias.
El número de copias de las construcciones pBC1.2, pBC1.3, pBC1.4 y
pBC1.5 se estimó a partir de cultivos celulares en fase exponencial mediante técnicas
de PCR cuantitativa en tiempo real, tal y como se establece en Material y Métodos.
Diluciones seriadas de ADN total de B. breve UCC2003 y B. pseudocatenulatum
M115 se utilizaron para realizar las curvas de calibración para los genes repB, dxs y
xfp. Las curvas estándar obtenidas para los genes repB, dxs y xfp fueron lineales en el
rango ensayado (R2> 0,99), oscilando las pendientes entre 3,67 y 3,72, lo que
representa sólo una pequeña diferencia respecto a los valores teóricos, en los que una
dilución 1/10 del ADN equivale a un valor de Ct de 3,322 ciclos (Lee et al., 2006).
Los resultados del número de copias de los distintos vectores en las dos cepas
que estamos considerando, B. breve UCC2003 y B. pseudocatenulatum M115, se
muestran en la Tabla 9. Como se señaló anteriormente, el plásmido original (pBC1) y
el vector pAM4 presentan un número de copias similar y cercano a 30 copias por
cromosoma equivalente. Sin embargo, el número de copias de los distintas derivados
pBif-pBC1 en la cepa B. breve UCC2003 se ve reducido de forma considerable en
todos los casos, disminuyendo hasta valores en torno a 3 copias por cromosoma
equivalente. En el caso de la cepa B. pseudocatenulatum M115 el número de copias
de estos mismos derivados disminuye de manera directamente proporcional al
tamaño de la construcción, desde valores de 23,15 para pBC1.5 hasta valores de 5,15
copias por cromosoma para el derivado pBC1.2 (Tabla 9).
Al igual que en los ensayos de estabilidad, aquellas construcciones en las que
el gen copG-like y/o orfX-like se encuentran delecionados presentan un número de
copias menor que la del plásmido original. La combinación de estos resultados de
Resultados y Discusión
72
estabilidad y número de copias parece indicar que, de alguna forma, estos genes
están implicados en el control y modulación de ambas propiedades.
El descenso en el número de moléculas plasmídicas, hasta niveles propios de
los plásmidos con bajo número de copias como pBS2 de Bacillus subtilis (Darabi et
al., 1989) o pWCFS102 y pWCFS103 de L. plantarum (van Kranenburg et al.,
2005), confiere a estos vectores utilidades diferentes respecto a los plásmidos de
elevado número de copias. Además utilizando vectores basados en las distintas
construcciones se podría modular por ejemplo la dosis de los genes que pudiéramos
clonar en ellos.
Tabla 9. Número de copias y concentración inhibitoria mínima para el
cloranfenicol de los vectores derivados pBC1-pBif en las cepas B. pseudocatenulatum M115 y B. breve UCC2003.
Vectores pBC1/pBif
Numero de copias en UCC2003
CIM (µg ml-1) de
cloranfenicol Numero de copias en
M115
CIM (µg ml-1) de
cloranfenicol pBC1.5 3,33 ± 0,18 48 23,15 ± 3,52 24 pBC1.4 7,25 ± 1,56 64 16,78 ± 5,35 24 pBC1.3 7,85 ± 0,98 48 10,76 ± 2,17 16 pBC1.2 7,66 ± 0,92 4 7,66 ± 0,92 16
Resultados y Discusión
73
III.2.3. Resistencia a cloranfenicol mediada por las construcciones pBC1-
pBif.
El nivel de susceptibilidad/resistencia al cloranfenicol de los distintos
vectores se examinó en las cepas de bifidobacterias B. breve UCC2003 y B.
pseudocatenulatum M115 transformadas con las construcciones pBC1-pBif. Los
niveles de resistencia obtenidos en la cepa B. pseudocatenulatum M115 (Tabla 9)
muestran una tendencia que concuerda en líneas generales con los resultados del
número de copias en esta misma cepa: la resistencia aumenta en la medida que el
número de copias es mayor. Sin embargo, en la cepa B. breve UCC2003 los niveles
de resistencia no guardan una relación clara con el número de copias y son
sensiblemente superiores para casi todos los derivados pBC1-pBif (excepto para
pBC1.5) a los obtenidos en la cepa de B. pseudocatenulatum. Los niveles de
resistencia, sin embargo, permiten en todos los casos una selección eficiente de las
células transformadas.
III.2.4. Deleción parcial del gen repB.
A pesar de nuestro convencimiento de la necesidad de una proteína RepB
intacta para la replicación de pBC1, como se demostraba con anterioridad mediante
el vector pBC1.2 que incluye únicamente el gen repB y las secuencias adyacentes,
estábamos interesados en demostrarlo de forma experimental. Para llevar a cabo la
deleción parcial de repB, se seleccionaron los enzimas de restricción MluI y AarI, los
cuales presentan sitios de reconocimiento únicos en la secuencia del gen en las
posiciones 1.011 y 1.256 respectivamente (Figura 10), mientras que no tienen sitios
de restricción en el vector pUC19E. ADN correspondiente al vector lanzadera
pAM1, derivado de pBC1-pUC19, se sometió a una doble digestión MluI-AarI; con
Resultados y Discusión
74
posterioridad, los extremos cohesivos generados se sometieron a un proceso de
relleno mediado por el fragmento Klenow de la ADN Polimerasa I de E. coli y a una
posterior ligación. La construcción resultante se introdujo mediante electroporación
en E. coli donde se seleccionaron las moléculas recombinantes y se comprobaron las
construcciones mediante análisis de restricción y secuenciación. Por último ADN
plasmídico de las construcciones correctas procedentes de E. coli se utilizó para
transformar células competentes de B. pseudocatenulatum M115. Los plásmidos en
los que la secuencia de repB estaba interrumpida entre los sitios de restricción MluI y
AarI se revelaron incapaces de replicar en ésta y en otras cepas de bifidobacterias, de
lo que se deducía que una proteína RepB intacta era esencial para la replicación de
pBC1.
Figura 16. Deleción parcial del gen repB mediante doble digestión con AarI
y MluI y posterior ligación.
repB
MluI440
AarI694
Digestión AarI + MluI
Ligación
repB
MluI440
AarI694
Digestión AarI + MluI
Ligación
Resultados y Discusión
75
III.2.5. Identificación de los intermediarios de ADN de cadena sencilla en
la replicación de pBC1.
La detección de ssDNA como intermediario de la replicación de un plásmido
es la prueba que se utiliza frecuentemente para demostrar que éste replica de forma
efectiva por medio de un mecanismo tipo RC (del Solar et al., 1998; Khan, 1997;
Gruss and Ehrlich, 1989). En ocasiones, la conversión de ssADN en dsADN es tan
rápida, que de la no detección no se puede concluir de forma taxativa que el
plásmido replica por otro mecanismo distinto (Leenhouts et al., 1991).
En nuestro caso los indicios obtenidos mediante la comparación de
secuencias en las bases de datos y la construcción de árboles filogenéticos indicaban
que el plásmido pBC1 podría replicar mediante un mecanismo Theta. La
demostración experimental del tipo Theta de replicación precisa de electroforesis en
dos dimensiones de ADN marcado radiactivamente, técnicas para las que no
disponemos de equipamiento. De forma que, como alternativa, llevamos a cabo un
experimento para la detección de ssADN como posible intermediario en la
replicación de pBC1. Aunque nuestra hipótesis era una hipótesis negativa en la que
no esperábamos detectar ssADN, en el ensayo se utilizaron plásmidos RC de control
mediante los cuales podemos saber si el experimento se ha realizado en buenas
condiciones.
Para llevar a cabo el experimento, se utilizó además del plásmido original,
pBC1, los derivados pBC1.2, que sólo cuenta con un gen completo, repB, y pBC1.5,
en el que se encuentra delecionada la posible región promotora del gen copG-like. Se
utilizan estas construcciones además del plásmido original por si en alguna de ellas la
conversión de ssADN en dsADN es menos eficiente y, por tanto, más fácil de
detectar. Como plásmido control de la replicación RC se utilizó el plásmido de L.
Resultados y Discusión
76
lactis p210 (3,8 kpb), derivado del plásmido pMB02, capaz de replicar en E. coli, y
en el que la replicación RC se había comprobado experimentalmente con
anterioridad en nuestro laboratorio (Sánchez and Mayo, 2003). Al mismo tiempo,
examinamos también la participación de la ARN polimerasa celular (que
supuestamente ha de iniciar la síntesis de los cebadores de ARN) mediante la adición
a los cultivos de rifampicina, inhibidor de esta enzima. Una vez alcanzado el grado
de crecimiento deseado, se recogió parte del cultivo y se centrifugó, y al resto se le
añadió cloranfenicol, eritromicina en el caso de las cepas de bifidobacterias
resistentes al cloranfenicol, que inhiben la síntesis de proteínas permitiendo la de
ácidos nucleicos, y rifampicina (100 µg/ml de cada uno). En estas condiciones la
incubación se continuó a 37ºC durante una hora más. Posteriormente se realizaron
extractos celulares de todas las muestras y tras electroforesis en un gel de agarosa al
0,7% (Figura 17, Paneles Ay B) se transfirieron a membranas de nylon con y sin
desnaturalización previa. En condiciones no desnaturalizantes se transferirá a la
membrana de nylon de forma mayoritaria el ADN monocatenario mientras que la
desnaturalización posibilitará la transferencia del ssADN y del dsADN. La
hibridación se llevó a cabo utilizando como sonda una mezcla de un fragmento del
plásmido pBM02, que hibrida con p210 y sus intermediarios, y un fragmento de
pBC1, que hibridará con este plásmido, sus derivados e intermediarios.
Como se puede observar en la Figura 17 (Paneles C y D) los resultados
mostraron una acumulación de ssADN en las muestras correspondientes al plásmido
p210 que se incrementa de manera notable en presencia de rifampicina y
cloranfenicol; lo que concuerda, como esperabamos, con los resultados previamente
descritos por Sánchez y Mayo (2003). Por el contrario, en las muestras del plásmido
pBC1 y sus derivados pBC1.2 y pBC1.5 no se aprecia acumulación de ADN
Resultados y Discusión
77
monocatenario en ningún caso, lo que sugiere que el plásmido pBC1 no replica
mediante un mecanismo RC, sino que posiblemente lo haga por un modo Theta.
El resultado, con todo, no es absolutamente claro, ya que en el experimento se
produjo una pequeña transferencia de ADN bicatenario también en condiciones
desnaturalizantes (Figura 17, Panel C, calles 3,4,7,8), pero en ningún caso se observa
ADN en las posiciones que corresponderían a las formas de ssADN, ni diferencias
significativas entre las muestras tratadas y no tratadas con antibióticos.
En el caso del plásmido pBC1, de unas 2,5 kpb, se observa una señal de
hibridación en la muestra no tratada con rifampicina y cloranfenicol que se
encontraría incluso por encima de la señal del plásmido p210 (3,8 kpb) (Figura 17,
Panel D, calle 3). Sin embargo, en la muestra tratada con los antibióticos puede
observarse además otra señal que sí podría corresponderse al plásmido de 2,5 kpb
(Figura 17, Panel D, calle 7). La presencia de estas dos bandas es posible que se deba
a que pBC1 pudiera estar formando dímeros en la célula que se resuelven por la
acción de la rifampicina y/o el cloranfenicol. También puede ser debido a una mayor
proporción de formas plasmídicas OC respecto a formas CCC en la muestra tratada
con antibióticos como consecuencia de una mayor degradación del ADN plasmídico
en estas condiciones.
En la muestra correspondiente a la construcción pBC1.5 se observa en todos
los casos una debil señal de hibridación correspondiente a un tamaño
considerablemente menor al de esta construcción (Figura 17 Paneles C y D, calles 2
y 6). La señal podría corresponder a la hibridación de la sonda con construcciones
derivadas de pBC1.5 como consecuencia de su inestabilidad estructural.
Resultados y Discusión
78
Figura 17.- Detección de intermediarios de ssDNA en la replicación de pBC1. Paneles A y B: Calles 1 y 5: ADN total de B. pseudocatenulatum M115 conteniendo la construcción pBC1.2 (8,0 kpb); Calles 2 y 6: ADN total de B. pseudocatenulatum M115 conteniendo la construcción pBC1.5 (8,7 kpb); Calles 3 y 7: ADN total de B. catenulatum L48 conteniendo el plásmido pBC1 (2,5 kpb); Calles 4 y 8: ADN total de E. coli conteniendo la construcción p210 (3,8 kpb), conteniendo el ADN procedente de células no tratadas (N) y tratadas (R) con rifampicina (y cloranfenicol o eritromicina). M: Marcador de peso molecular. Panel C: Autorradiografía del gel tratado en condiciones no desnaturalizantes; Panel D: Autorradiografía del gel tratado en condiciones desnaturalizantes.
Resultados y Discusión
79
CAPÍTULO 3: DESARROLLO DE VECTORES PARA
BIFIDOBACTERIAS BASADOS EN EL REPLICÓN DE pBC1.
III.3- PLÁSMIDOS DERIVADOS DE pBC1.
Como se ha señalado con anterioridad, las herramientas y las técnicas de
ingeniería genética se encuentran en el género Bifidobacterium mucho menos
desarrolladas que para el resto de bacterias lácticas (Klijn et al., 2005). De este
modo, los vectores descritos en la actualidad para bifidobacterias son en la mayoría
de los casos vectores lanzadera que resultan de la clonación directa de los plásmidos
en vectores de E. coli (Álvarez-Martín et al., 2007; Guglielmetti et al., 2007; Klijn et
al., 2006; Lee and O’Sullivan, 2006; Park et al., 1999; Rossi et al., 1998; Matsumura
et al., 1997; Rossi et al., 1996; Missich et al., 1994). Además los replicones
seleccionados hasta este momento para el desarrollo de vectores no parecen ser
demasiado estables, según comunican algunos de los grupos más activos en este
campo (Dpto. Microbiology, University College Cork, Irlanda y Nestle Research
Center, Suiza). Por lo tanto, es necesario continuar la caracterización de plásmidos
con este fin. Por este motivo, uno de los objetivos que nos propusimos en este trabajo
fue el desarrollo de una serie de vectores de clonación, basados en el replicón de
pBC1, tanto bifuncionales Bifidobacterium-E. coli como específicos para
bifidobacterias.
Con este propósito, el plásmido pBC1 se digirió con el enzima BglII y se
clonó en el sitio único BamHI del vector pUC19E (Leenhouts et al., 1991). El
plásmido recombinante, denominado pAM1 (6,1 kpb), se introdujo mediante
electroporación en E. coli DH5α y posteriormente en la cepa libre de plásmidos B.
pseudocatenulatum M115. En ambos casos la construcción se mostró totalmente
Resultados y Discusión
80
funcional. Una vez desarrollado el vector lanzadera pAM1 y con el fin de generar un
vector específico de bifidobacterias, y asegurarnos, al mismo tiempo, que la
replicación en las bacterias de este género estaba dirigida por la proteína de
replicación y las estructuras de pBC1, el ADN correspondiente a pUC de pAM1 se
eliminó mediante doble digestión con los enzimas de restricción EcoRI y HindIII
(ninguno de los dos presentan secuencia de reconocimiento en pBC1). Seguidamente
los extremos cohesivos generados se transformaron en extremos romos mediante la
acción del enzima Klenow y se sometieron a una nueva ligación. La mezcla de
ligación se introdujo directamente mediante electroporación en la cepa B.
pseudocatenulatum M115 y a partir de los transformantes se pudo recuperar la
construcción que deseabamos, de unas 3,6 kpb, y que denominamos pAM2.
En un trabajo previo concurrente con el de esta Tesis, nuestro grupo
caracterizó el gen de resistencia a tetraciclina de la cepa B. longum H66 (Flórez et
al., 2006). Con la idea de incorporar este gen de resistencia a nuestros vectores para
darle mayor versatilidad utilizando, además, un gen de selección propio de
bifidobacterias, el gen tet(W) completo se amplificó por PCR utilizando
oligonucleótidos con el sitio SacI incorporado en los extremos 5’. Posteriormente el
fragmento con el gen se clonó en el sitio único SacI del vector bifuncional pAM1,
dando lugar a un nuevo vector denominado pAM3 (8,6 kpb). Éste se introdujo
satisfactoriamente en E. coli en primer lugar y posteriormente, tras la pertinente
comprobación de su estructura mediante la utilización de diversos enzimas de
restricción, en B. pseudocatenulatum M115. El nuevo vector formado porta genes de
resistencia a los antibióticos ampicilina, eritromicina y tetraciclina, lo que permite
una sencilla selección de las células portadoras tanto en E. coli como en
bifidobacterias.
Resultados y Discusión
81
Con el fin de eliminar el gen de la eritromicina del vector pAM3, debido a su
origen heterólogo (más concretamente de la especie Staphylococcus aureus)
(Horinouchi and Weisblun, 1982) y permitir, llegado el caso, la introducción de dos
vectores en un mismo hospedador, el ADN plasmídico fue sometido a una digestión
parcial con SalI, posteriormente la banda de interés se aisló de un gel de agarosa y se
purificó. El fragmento purificado se sometió a ligación obteniéndose de este modo
una nueva construcción, de 7,6 kpb, que se denominó pAM4, la cual se introdujo
primero en E. coli mediante electroporación y después en Bifidobacterium. pAM4
tiene sitios de reconocimiento únicos para enzimas tan comunes con XbaI, SalI, PstI
y HindIII
Hasta la fecha todos los vectores de clonación de bifidobacterias
desarrollados, como por ejemplo pDG7 (Argnani et al., 1996), pRM2 (Missich et al.,
1994), pDOJHR (Lee and O’Sullivan, 2006) o pGOSBif33 (Guglielmetti et al.,
2007), portan como marcadores de selección genes de resistencia a antibióticos
heterólogos tales como cloranfenicol, espectinomicina o eritromicina. En lo que
nosotros sabemos pAM3 y pAM4, son los primeros vectores para bifidobacterias que
portan como marca un gen de resistencia a tetraciclina aislado de las propias
bifidobacterias. Este gen, que se ha visto ampliamente distribuido en bifidobacterias
y otros microorganismos intestinales (Amor et al., 2007) podría aportar estabilidad a
la construcción y una expresión eficiente de la marca de selección. Además se
expresa también en bacterias Gram-negativas (incluyendo E. coli) (Florez et al.,
2006), con lo que los vectores son más funcionales que los que portan resistencia a
eritromicina, antibiótico para el que presentan resistencia intrínseca los coliformes.
Resultados y Discusión
82
Figura 18. Vectores de clonación desarrollados a partir del replicón de pBC1.
pAM23,6 kpb
repB
orfX-like
copG-like
Emr
DigestiónBamHI
DigestiónBglII
Digestión EcoRI+HindIIITratamiento con Klenow
Ligación
DigestiónSacI
Digestión Parcial con SalILigación
tet(W) SacISacI
repB
BglII
orfX-like
copG-like
pBC12,5 kpb
Ligación
Ligación
DigestiónSacI
pAM1
repB
orfX-like
copG-like
Emr
EcoRISacIKpnISalI
6,1 kpb
ori pUC
Apr
pAM38,6 kpb
repBorfX-like
copG-like
Emr
tet(W)
KpnISalI
EcoRI
SalI
ori pUC
Apr
pAM47,6 kpb
tet(W)
repB
orfX-like copG-like
EcoRI
KpnISalI
ori pUC
Apr
EcoRISacIKpnISalI
pUC19E
lac Z
Apr
Emr
3,7 kpb
ori pUC
BamHIXbaISalIPstISphIHindIII
XbaISalIPstISphIHindIII
XbaISalIPstISphI
HindIII
XbaISalIPstISphI
HindIII
SacIKpnISalIXbaISalIPstISphI
pAM23,6 kpb
repB
orfX-like
copG-like
Emr
DigestiónBamHI
DigestiónBglII
Digestión EcoRI+HindIIITratamiento con Klenow
Ligación
DigestiónSacI
Digestión Parcial con SalILigación
tet(W) SacISacI
repB
BglII
orfX-like
copG-like
pBC12,5 kpb
LigaciónLigación
Ligación
DigestiónSacI
pAM1
repB
orfX-like
copG-like
Emr
EcoRISacIKpnISalI
6,1 kpb
ori pUC
Apr
pAM38,6 kpb
repBorfX-like
copG-like
Emr
tet(W)
KpnISalI
EcoRI
SalI
ori pUC
Apr
pAM47,6 kpb
tet(W)
repB
orfX-like copG-like
EcoRI
KpnISalI
ori pUC
Apr
EcoRISacIKpnISalI
pUC19E
lac Z
Apr
Emr
3,7 kpb
ori pUC
BamHIXbaISalIPstISphIHindIII
XbaISalIPstISphIHindIII
XbaISalIPstISphI
HindIII
XbaISalIPstISphI
HindIII
SacIKpnISalIXbaISalIPstISphI
Resultados y Discusión
83
III.3.1. Estabilidad plasmídica.
La estabilidad segregacional del vector pAM4 se ensayó tal y como se
describe en el apartado correspondiente de Material y Métodos. pAM4 se creció en
ausencia de presión selectiva durante unas 100 generaciones, cada 24 horas se
plaquearon alícuotas para obtener colonias aisladas en medio no selectivo (sin
antibiótico), y éstas se dejaron crecer y se replicaron en MRS sólido con 5 µg/ml de
tetraciclina. Después de las 100 generaciones cerca del 100% de las células
mantenían la construcción, lo que nos indica una gran estabilidad segregacional
(Figura 19).
Figura 19. Ensayo de estabilidad del plásmido pAM4.
III.3.2. Estimación del número de copias.
El número de copias del plásmido original pBC1 y de su vector derivado
pAM4 se estimaron mediante la técnica de la PCR cuantitativa en tiempo real, tal y
como se ha comentado en capítulos precedentes. El resultado obtenido para pBC1
(30,98±4,28) fue similar al obtenido para pAM4 (27,59±2,94), estos valores son
similares a los que presentan plásmidos que se consideran de un alto número de
80
85
90
95
100
20 40 60 80 100
Nº de generaciones
% t
et r
esis
ten
tes
pAM4
Resultados y Discusión
84
copias como pGA1 de C. glutamicum (Nesvera et al., 1997) e incluso superior al del
plásmido de E. coli pBR322 (Lin-Chao and Bremer, 1986), y contrasta con el bajo
número de copias que se ha calculado para otros plásmidos de bifidobacterias, como
pPKCm1 derivado de pCIBA089 que presenta tan sólo 4 copias por célula (Cronin et
al., 2007).
III.3.3. Resistencia a eritromicina y tetraciclina mediada por vectores
derivados de pBC1.
Con el propósito de verificar la expresión de los genes de resistencia a
antibióticos de los vectores pAM1, pAM2, pAM3 y pAM4 y conocer los niveles que
podrían llegar a utilizarse para su selección, se determinó la CIM de los
transformantes para la eritromicina y la tetraciclina utilizando para ello el sistema
“Etest”.
Para los transformantes de la cepa B. pseudocatenulatum M115 se determinó
su susceptibilidad/resistencia en función de los genes de resistencia presentes en el
vector; así en las células que portan los vectores pAM1 o pAM2 se ensayó la CIM
para la eritromicina, mientras que en las células transformadas con el vector pAM3 el
ensayo se realizó para la eritromicina y la tetraciclina, y, por último, para los
transformantes del plásmido pAM4 se determinó la CIM para la tetraciclina.
Los resultados, tomados tras 48 horas de incubación a 37ºC en condiciones
anaeróbicas, se relacionan en la Tabla 10. Como se puede ver la CIM para la
eritromicina muestra valores similares, entre 8 µg/ml y 12 µg/ml,
independientemente del vector del que se trate. La CIM para la tetraciclina, sin
embargo, es significativamente superior, con valores de hasta 48 µg/ml.
Resultados y Discusión
85
Estas diferencias en los niveles de CIM pueden ser debidos a la distinta
naturaleza de la actividad que confiere la resistencia, aunque también podría deberse
en parte al distinto origen filogenético de los genes de resistencia como se ha
comentado. En todo caso, los niveles de resistencia suponen unos aumentos de más
de 100 y 400 veces, respectivamente, de la resistencia de las células hospedadoras sin
plásmido.
Tabla 10. Concentración inhibitoria mínima de las cepas de B.
pseudocatenulatum M115 transformadas con los distintos vectores de clonación.
III.3.4. Rango de hospedador.
Con el fin de conocer el rango de hospedador del replicón de pBC1 y
determinar, por tanto, la utilidad de los vectores desarrollados a partir de su replicón,
ADN plasmídico correspondiente al vector pAM4 se introdujo mediante
electroporación en un número significativo de distintas especies de bifidobacterias.
En concreto se introdujo en las cepas: B. dentium F101, B. longum L25 y B.
pseudocatenulatum M115 (Delgado et al., 2006), B. adolescentis LMG10502, B.
animalis LMG 10508, B. breve LMG 13208, B. thermophilus LMG 11571 y B.
Construcción Antibiótico CIM (µg/ml) Cepa original B. pseudocatenulatum M115 Eritromicina 0,064 Tetraciclina 0,125 pAM1 Eritromicina 8 pAM2 Eritromicina 8 pAM3 Eritromicina 12 Tetraciclina 48 pAM4 Tetraciclina 48
Resultados y Discusión
86
pseudolongum subsp. pseudolongum LMG 11571 (Laboratorium voor Microbiologie
Universiteit Gent, colección LMG) y B. breve UCC2003 (University College Cork).
Las condiciones de electroporación (25 µF, 200 Ω y 10 kVcm-1) y la catidad de ADN
(1µg) fueron en todos los casos las mismas.
Tabla 11. Frecuencias de transformación, para el plásmido pAM4, obtenidas
en diferentes especies de bifidobacterias.
En todas las especies se obtuvieron transformantes, que se examinaron para la
presencia de plásmidos mediante lisis y electroforesis, lo que nos indica que el
replicón posee un amplio rango de hospedador en el género Bifidobacterium. Las
frecuencias de transformación, que se relacionan en la Tabla 11, oscilaron entre 40
transformantes µg-1 ADN en B. animalis LMG 10508 y 1,0x105 transformantes µg-1
ADN en B. pseudocatenulatum M115.
Cepa Frecuencia de transformación
ufc/µg ml B. dentium F101 9,5x101 B. pseudolongum subsp. pseudolongum LMG 11571 6,3x101 B. longum L25 6,6x101 B. breve UCC 2003 1,4x102 B. pseudocatenulatum M115 1,0x105 B. thermophilum LMG 11571 4,6x101 B. breve LMG 13208 1,0x102 B. animalis LMG 10508 4,0x101 B. adolescentis LMG 10502 9,2x102
Resultados y Discusión
87
Estas frecuencias se pueden comparar con las obtenidas en trabajos previos.
Así, la frecuencia de transformación más alta descrita hasta el momento en
bifidobacterias es de 2.6x106 transformantes µg-1 ADN, obtenida por Tanaka y
colaboradores (2005) utilizando la cepa B. longum 105-A y el vector bifuncional para
Bifidobacterium-E. coli pBRASTA101. También Cronin y colaboradores (2007)
refieren eficiencias cercanas a 106 para vectores derivados de pCIBA089. Sin
embargo, Lee y O’Sullivan (2006) utilizando también el vector lanzadera
Bifidobacterium-E. coli pDOJHR y una cepa de B. longum (B. longum VMK44)
obtuvieron una frecuencia máxima considerablemente inferior, de 20 transformantes
por µg-1 de ADN. Rossi y colaboradores (1997) por su parte describen una frecuencia
de transformación en la cepa B. pseudocatenulatum MB264 de 50 por µg de ADN.
En nuestro caso la eficiencia máxima obtenida con pAM4 en la cepa B.
pseudocatenulatum M115 fue de 1,0x105 transformantes µg-1 ADN; un valor
intermedio entre los descritos, pero que se podría utilizar con garantías en diversos
procedimientos de ingeniería genética. En estos experimentos utilizamos ADN
procedente de E. coli, dónde el rendimiento y la purificación del ADN son más
sencillos. Pero ya habiamos observado que, para la misma cantidad de ADN, la
eficiencia de transformación es mayor cuando el ADN procede de la propia cepa que
se va a transformar; lo que pudiera estar relacionado con la presencia de sistemas de
restricción/modificación. También creemos que la frecuencia de transformación es
cepa dependiente, más que especie dependiente, lo que aconseja la busqueda de
cepas más fácilmente transformables para utilizarlas como hospedadoras en los
estudios genéticos.
ADN plasmídico del vector pAM2, en el que el ADN de E. coli había sido
totalmente eliminado, se utilizó para electroporar células competentes de L. lactis, L.
Resultados y Discusión
88
casei, Enterococcus durans y E. coli con el fin de determinar si el replicón de pBC1
pudiera ser funcional en otros grupos bacterianos. En ningún caso se obtuvieron
transformantes, resultados que concuerdan con los obtenidos para otros plásmidos de
bifidobacterias por distintos autores (Lee and O’Sullivan, 2006; Argnani et al.,
1996).
Resultados y Discusión
89
CAPÍTULO 4: ELECTROTRANSFORMACIÓN EN EL GÉNERO
BIFIDOBACTERIUM.
III.4. Estudio de las condiciones de transformación de bifidobacterias.
Crucial para el desarrollo de las técnicas de ingeniería genética en este género
es el establecimiento de un protocolo de transformación adecuado que permita una
introducción eficaz de ADN exógeno (Ventura et al., 2004). Estudios de este tipo son
poco frecuentes en las bifidobacterias (Argnani et al., 1996; Rossi et al., 1997), por
lo que, la frecuencia de transformación es todavía insuficiente para determinados
propósitos y se contempla muy necesario alcanzar una frecuencia mayor.
Con el fin de establecer las condiciones óptimas de transformación para la
cepa B. pseudocatenulatum M115, que había mostrado la frecuencia más alta, se
estudió el efecto de diferentes parámetros de la electroporación. Todos los
experimentos se llevaron a cabo por triplicado y utilizando el vector derivado de
pBC1 pAM1 (6,1 kpb). En la Figura 20 se relacionan resumidos los resultados más
sobresalientes de las distintas experiencias.
Los cambios en el voltaje, con rangos entre 7,5 y 12,5 kV cm-1, no afectaron
de manera significativa a la frecuencia de transformación. No obstante, se puede
observar un pequeño incremento en el número de transformantes con el aumento de
la intensidad del voltaje, desde 3,9 x 103 transformantes µg-1 DNA con 7,5 kV a 9,8 x
103 transformantes µg-1 DNA con 12,5 kV.
Con una capacitancia de 25 µF y un voltaje aplicado de 10 kV cm-1, la
eficiencia en la transformación se incrementa a medida que aumentamos la
resistancia aplicada. De este modo, la eficiencia más alta (1,83 x 104 transformantes
µg-1 DNA) se obtuvo cuando las células se sometieron a un único pulso de 10 kV cm-
Resultados y Discusión
90
1 y 400 Ω. Este resultado contrasta con el que obtuvieron Argnani y colaboradores
que observaron un descenso muy acusado en la viabilidad celular, lo que se tradujo
en un menor número de transformantes, con una resistancia de 400 Ω (Arganani et
al., 1996).
Rossi y colaboradores concluyeron que las condiciones óptimas de
electrotransformación de la cepa B. animalis MB209 eran 12,5 kV cm-1 y 200 Ω,
obteniendo una frecuencia de transformación cercana a 104 transformantes µg-1 de
ADN (Rossi et al., 1997), similar a la obtenida en el presente trabajo para la cepa B.
pseudocatenulatum M115 con un pulso de 10 kV cm-1 y 400 Ω. Según describen en
su artículo, aplicando resistencias superiores a 200 Ω obtenían de manera frecuente
arcos voltaicos que limitaban la transformación. En nuestro caso, esto no sucedió
nunca, lo que podría deberse a una menor carga iónica en las células (células más
lavadas) o a la utilización de ADN más puro (con menos sales).
En 1996 Argnani y colaboradores (1996) desarrollaron un protocolo para la
introducción de ADN plasmídico en cepas del género Bifidobacterium que aplicaron
a un alto número de especies de bifidobacterias. El método se basaba en la
incubación de las células antes del pulso eléctrico en el tampón de electroporación
durante varias horas a una temperatura de 4ºC. Con el propósito de verificar si estas
condiciones eran aplicables a la cepa B. pseudocatenulatum M115, células
competentes de esta cepa se incubaron a 4ºC durante 3,5 horas y 24 horas, antes de
someterlas a electrotransformación. En ambos casos las frecuencias de
transformación obtenidas fueron menores que las obtenidas para las células
incubadas en las condiciones que habíamos utilizado hasta entonces (20 minutos en
hielo tras el lavado y antes de la electroporación).
Resultados y Discusión
91
Con el fin de comprobar la viabilidad de las células competentes de B.
pseudocatenulatum M115 tras su almacenamiento a una temperatura de -80ºC,
alícuotas de estas células almacenadas durante 1, 3 y 7 días se sometieron a
electrotransformación; las frecuencias de transformación obtenidas son en todos los
casos inferiores a las obtenidas utilizando células competentes preparadas
inmediatamente antes de su utilización.
Debido a la relación filogenética existente entre los géneros Corynebacterium
y Bifidobacterium, células competentes de la cepa B. pseudocatenulatum M115
fueron sometidas a electrotransformación siguiendo las condiciones previamente
descritas para Corynebacterium glutamicum (25 µF, 600 Ω y 12,5 kV) (van der Rest
et al., 1999). Según este procedimiento, tras el pulso eléctrico la suspensión celular
se incuba durante 6 minutos a 46ºC, este choque térmico produce un incremento en
la frecuencia de transformación de Corynebacterium glutamicum como
consecuencia, según los autores discuten, de una posible desnaturalización parcial de
las nucleasas pericelulares (van der Rest et al., 1999). Sin embargo, los resultados
obtenidos para nuestra cepa, siguiendo este protocolo, fueron siempre inferiores a los
obtenidos con las células competentes control.
Figura 20. Variaciones en la frecuencia de transformación de B.
pseudocatenulatum M115 en función de las diferentes variables ensayadas.
0,00E+002,00E+034,00E+036,00E+038,00E+031,00E+041,20E+041,40E+041,60E+041,80E+042,00E+04
1.5kV
2 kV 2.5kV
100 Ω 200 Ω 400Ω 3.5h4ºC
24h4ºC
1 día -80ºC
3 días-80ºC
7 días-80ºC
Fre
cuen
cia
de
tran
sfo
rmac
ión
2 kV200 Ω
0,00E+002,00E+034,00E+036,00E+038,00E+031,00E+041,20E+041,40E+041,60E+041,80E+042,00E+04
1.5kV
2 kV 2.5kV
100 Ω 200 Ω 400Ω 3.5h4ºC
24h4ºC
1 día -80ºC
3 días-80ºC
7 días-80ºC
Fre
cuen
cia
de
tran
sfo
rmac
ión
2 kV200 Ω
Resultados y Discusión
92
CAPÍTULO 5: APLICACIÓN DE LOS VECTORES DERIVADOS DE
pBC1.
III.5.1. Clonación y expresión del gen α-L-arabinofuranosidasa de B.
longum.
Con el fin de comprobar la funcionalidad de los vectores derivados de pBC1
desarrollados en el presente trabajo se procedió a la clonación y expresión del gen
abfB, procedente de la cepa B. longum B667, que codifica para una enzima α-L-
arabinofuranosidasa. Las arabinofuranosidasas son enzimas que degradan los
residuos de arabinosa de diferentes oligosacáridos y polisacáridos. Estas enzimas
tienen seguramente una gran importancia en las bifidobacterias al permitirles utilizar
como fuente de energía diversos carbohidratos no digeribles de la dieta. El aumento
de esta actividad enzimática podría proporcionar probióticos más eficientes o más
competitivos en el ambiente intestinal, y con una mayor capacidad fermentativa que
beneficiaría, en último término, también al hospedador.
El gen que seleccionamos había sido clonado y caracterizado en nuestro
Instituto con anterioridad (Margolles and de los Reyes-Gavilán, 2003). Para la
amplificación del gen abfB se utilizó ADN total de B. longum B667 como molde y
los oligonucleótidos abfBF (5’-
CGAATCCCGCATGCGTACGAGGCAGTGTGGAATCC-3’) y abfBR (5’-
TGTTCGCGCTGCAGGCTTCGATGACGTGGAGGAATC-3’), en los cuales se
incluyeron sitios de restricción para SphI y PstI, respectivamente (en negrita en la
secuencia). Posteriormente el producto de PCR se sometió a una doble digestión
SphI-PstI y se ligó en el vector pAM1 digerido previamente con ambos enzimas,
dando lugar a una nueva construcción denominada pAM-abfB (Figura 21). El
Resultados y Discusión
93
plásmido resultante se introdujo en primer lugar en células electrocompetentes de E.
coli y después, tras su comprobación por medio de restricción y secuenciación, en la
cepa B. pseudocatenulatum M115.
Figura 21. Amplificación y clonación del gen abfB en el vector pAM1,
generando la nueva construcción pAM-abfB.
Apr
Emr
repB
orfX-like
copG-like
abfB
pAM-abfB8.4 kpb
EcoRISacIKpnI
pAM1
repB
orfX-like
copG-likeApr
Emr
XbaISalIPstISphIHindIII
EcoRISacIKpnI
6.1 kpb
abfBSphI PstI
2.3 kpb
abfB
Amplificación PCR
Digestión SphI+PstILigación
XbaISalIPstI
HindIIISphI
ori pUC
ori pUC
Apr
Emr
repB
orfX-like
copG-like
abfB
pAM-abfB8.4 kpb
EcoRISacIKpnI
pAM1
repB
orfX-like
copG-likeApr
Emr
XbaISalIPstISphIHindIII
EcoRISacIKpnI
6.1 kpb
abfBSphI PstI
2.3 kpb
abfBabfB
Amplificación PCRAmplificación PCR
Digestión SphI+PstILigación
XbaISalIPstI
HindIIISphI
ori pUC
ori pUC
Resultados y Discusión
94
III.5.2. Expresión heteróloga en E. coli y B. pseudocatenulatum.
La actividad de la arabinofuranosidasa se puede estimar mediante una
reacción colorimétrica gracias a su capacidad para la degradación del sustrato
cromogénico pNP- α-L-arabinofuranósido.
El análisis cuantitativo de la actividad α-L-arabinofuranosidasa se realizó en
los transformantes obtenidos con la construcción pAM-abfB en E. coli y en la cepa
B. pseudocatenulatum M115 utilizando como controles negativos las cepas sin
transformar. El experimento se llevó a cabo en tres cultivos independientes en cada
caso y los resultados que se muestran representan la media de los valores obtenidos
(Figura 22). Los resultados se expresan como Unidades de Actividad Específica
(UAE) min-1 µg prot-1, tanto para las cepas de E.coli y de B. pseudocatenulatum
M115 hospedadoras como para los distintos transformantes. La cepa de
bifidobacteria presenta una actividad arabinofuranosidasa basal de 0,12 UAE min-1
µgprot-1, mientras que en E. coli el valor obtenido es prácticamente nulo. Por el
contrario, los niveles de actividad en los transformantes portadores de la
construcción pAM-abfB, tanto en E. coli como en las bifidobacterias, son mucho más
elevados, con valores que oscilan entre 12,74 y 16,15 UAE min-1 µg prot-1, lo que
supone incrementos de actividad superiores en más de 100 veces en algunos casos
respecto a las cepas control.
Además, la estabilidad del vector y de la actividad en la cepa receptora fue
excelente ya que, en las condiciones ensayadas, nunca se detectaron segregantes sin
actividad arabinofuranosidasa.
Resultados y Discusión
95
Figura 22. Actividad específica α-L-arabinofuranosidasa de las cepas hospedadoras y las portadoras de la construcción pAM-abfB.
Cepas
02468
1012141618
DH11S
DH11S clon 1
DH11S clon 3
M115M115 clon 1.2
M115 clon 1.4
M115 clon 3.1
M115 clon 3.2
M115 clon 3.4
UA
E m
in-1
µgp
rot-1
DISCUSIÓN GENERAL
Discusión General
97
Los plásmidos son moléculas de ADN, en la mayoría de los casos circulares y
covalentemente cerradas, que varían ampliamente de tamaño, entre las 300 pb y las
1,7 Mpb (Giuntini et al., 2005; Kado, 1998). Las propiedades que codifican son
también extremadamente variables, desde plásmidos que no codifican nada más que
secuencias de reconocimiento que permiten su replicación por los factores celulares
hasta otros mayores que el cromosoma de algunos microorganismos que codifican un
sinnúmero de genes y que podrían ser considerados cromosomas o minicromosomas.
En general, el complemento génico de los plásmidos no suele codificar propiedades
esenciales ni las rutas bioquímicas de los sistemas celulares del metabolismo central,
entre las que se incluye, por ejemplo, la glicólisis, el metabolismo de aminoácidos y
la biosíntesis de ácidos grasos.
El número de plásmidos por célula también es muy variable; así, once
plásmidos se han identificado en una cepa de Pantoea stewardii (antes Erwinia)
(Coplin et al., 1981) y diez de entre 6 y 166 kpb en cepas de Bacillus megaterium
(Vary, 1994). En algunas cepas de Borrelia burgdorferi pueden sobrepasar los 20
entre plásmidos lineares y circulares (Stewart et al., 2004), siendo algunos esenciales
para la infectividad de este patógeno. En las bacterias lácticas el tamaño de los
plásmidos analizados varía entre 1,8 y las 380 kpb del mayor de los megaplásmidos
encontrados de forma muy reciente en cepas de Lactobacillus salivarius (Claesson et
al., 2007; Davidson et al., 1996). El número de plásmidos por cepa depende en gran
medida de las especies. L. lactis y L. plantarum presentan un abundante
complemento plasmídico por cepa, entre 4 y 7, pero llegando a 10 o más (Davidson
et al., 1996), mientras que en otras especies, como Streptococcus thermophilus
(revisado en Somkuti and Steinberg, 2007), los lactobacilos intestinales (Powels and
Leer, 1994) y las especies de bifidobacterias (revisado en Álvarez-Martín et al.,
Discusión General
98
2007) los plásmidos son menos frecuentes. En el caso concreto de las especies del
género Bifidobacterium, solamente entre un 9-10% de las cepas presentan plásmidos
(Park et al., 1997; Iwata and Morishita 1989; Sgorbati et al., 1982). Además, en la
mayoría de los casos las cepas presentan un tipo molecular único. De hecho, en la
literatura que hemos revisado sólo en tres cepas de B. longum se han hallado
coexistiendo dos tipos plasmídicos distintos (Lee and O’Sullivan, 2006; Corneau et
al., 2004; Park et al., 1997) y tres en la cepa B. longum biovar. Longum NAL8
(Guglielmetti et al., 2007). Estos elementos extracromosomales del género
Bifidobacterium son en general de pequeño tamaño; el mayor de los plásmidos
secuenciado (pNAC2, Tabla 4) hasta el momento tiene 10 kpb (Corneau et al., 2004).
En algunas especies los plásmidos se revelan como un material genético
esencial al que se incorporan, en primera instancia, aquellos genes que las bacterias
necesitan para responder a cambios rápidos en su entorno; entorno desde el que, sin
duda, toman los genes (Teuber et al., 1999). Algunos autores proponen, incluso, que
se los considere como organismos vivos con una historia evolutiva propia (Datta,
1985). Lo que parece claro es que en los plásmidos se acumulan genes que confieren
ventajas adaptativas locales, de forma que sólo se mantienen de forma eficaz en los
nichos en los que la ventaja selectiva compensa el gasto energético adicional que
suponen (Eberhard, 1989 ; Reanny, 1976). Además de que las funciones metabólicas
codificadas en los plásmidos suponen una ventaja selectiva para la célula
hospedadora, los genes codificados en plásmidos presentan también una mayor
frecuencia de mutación, lo que se considera una ventaja (Metzgar and Willis, 2000).
Incluso se presume que los plásmidos que no codifican ninguna propiedad
(plásmidos crípticos) pudieran beneficiar al hospedador al promover la
recombinación (tanto homóloga como heteróloga) durante los procesos de
Discusión General
99
replicación, aumentando, de esta forma, la adaptabilidad ecológica de la población
(Thomas, 2004).
En los lactococos, aunque no se ha examinado en detalle el complemento
genético de las cepas “salvajes” (Farrow, 1980), que en general albergan también
muchos plásmidos, las cepas que forman parte de los cultivos iniciadores industriales
por sus excelentes condiciones para la rápida fermentación de la leche contienen en
plásmidos gran parte de la maquinaria bioquímica necesaria para este fin (Mills et
al., 2006). Como ejemplo, baste decir que el complemento plasmídico de la cepa L.
lactis subsp. cremoris SK11 que totaliza unas 140 kpb, contiene en plásmidos genes
relacionados con la utilización de la lactosa (lacR-lacABCDFEGX), el sistema
proteolítico (prtM-prtP, pepO, pepF), el sistema de incorporación de oligopéptidos
(oppDFBCA), componentes de sistemas de incorporación de cationes, genes
necesarios para la síntesis de folato, enzimas relacionados con la obtención de
energía (lactato deshidrogenasa, antiporter de oxalato, α-acetolactato decarboxilasa)
y al menos cuatro proteínas relacionadas con respuestas a estrés (Siezen et al., 2005).
Otros plásmidos de cepas como L. lactis subsp. lactis DPC3147 y L. lactis subsp.
lactis biovar. Diacetylactis DRC3 concentran genes que codifican bacteriocinas,
resistencia a bacteriófagos y la maquinaria completa para su transferencia
conjugativa (O’Driscoll et al., 2006; Dougherty et al., 1998). La reciente
secuenciación genómica de dos cepas de L. lactis aisladas de plantas, apoya también
la hipótesis de los plásmidos com elementos adaptativos. Estas dos cepas tienen
plásmidos con un tamaño entre las 50 y 70 kpb en los que codifican resistencia a
arsenato/arsenito, sistemas de resistencia a fagos y transportadores de metales
(Siezen et al., 2007). En esta especie, por tanto, los plásmidos funcionan como
elementos adaptativos de primer orden, en los que parecen incorporarse muchos de
Discusión General
100
los genes necesarios para un buen y rápido crecimiento en el medio en el que se
encuentran, que han sido reclutados en su mayoría desde otras especies bacterianas.
Otra forma de aumentar la eficacia es situar en plásmidos los genes cromosómicos
más necesarios, incrementando, de esta forma la dosis génica y escapando de la
estricta regulación a la que están sometidos (Nardi et al., 1997). La organización
génica de las distintas propiedades que codifican suele estar constituida por módulos
flanqueados por secuencias de inserción (IS) (O’Driscoll et al., 2006; Sánchez et al.,
2000; Dougherty et al., 1998), para las que se ha propuesto un papel importante en la
evolución de los fenotipos asociados a los replicones plasmídicos (Romero and
Klaenhammer, 1993).
La cepa L. plantarum WCFS1, cuyo genoma se halla secuenciado en su
totalidad, contiene tres plásmidos, dos crípticos y un tercero de más de 36 kpb que
codifica resistencia a arsenato/arsenito y seguramente otros metales pesados (van
Kranenburg et al., 2005). Sin embargo, en esta especie (Molenaar et al., 2005;
Kleerebezem et al., 2003) como en otras bacterias lácticas y bifidobacterias (Klijn et
al., 2005) parecen existir islas adaptativas en el cromosoma; lugar al que se
incorporan la mayoría de los genes necesarios para afrontar los cambios ambientales.
En el caso de los microorganismos patógenos estas islas adaptativas (conocidas como
islas de patogenicidad) están bien estudiadas y concentran genes necesarios para el
inicio de la infección, mecanismos de evasión del sistema inmune y otros muchos
factores de virulencia, genes de resistencia a antibióticos, etc. (Hochhut et al., 2005).
Los plásmidos, cuando existen, podrían servir también de puente entre el acervo
genético extracelular y las islas adaptativas (Siezen et al., 2007).
En las bifidobacterias, y en otras especies bacterianas, en las que todos los
plásmidos caracterizados hasta el momento son plásmidos crípticos, el papel
Discusión General
101
adaptativo no es tan claro. El interés del estudio de sus plásmidos sin embargo, sigue
siendo grande. Por un lado, los plásmidos son elementos muy manejables para
determinados estudios básicos de replicación, interacción ADN/proteína, regulación,
etc. Por otro lado, constituyen, hoy por hoy, la base de la mayor parte de las
herramientas para el estudio molecular y la manipulación genética de los
microorganismos.
El trabajo de esta Tesis se ha centrado, tras una búsqueda inicial de plásmidos
en cepas de bifidobacterias de origen humano, en el estudio del plásmido pBC1
procedente de la cepa B. catenulatum L48. El tamaño de pBC1 es de 2540 pb y no
presenta más fenotipo que el que concierne a su replicación. El replicón de pBC1 se
mostró funcional en todas las especies de bifidobacterias ensayadas, pero se mostró
incapaz de replicar en otras especies Gram-positivas y Gram-negativas como L.
lactis, L. casei, E. durans y E. coli. El análisis de la secuencia reveló tres ORFs con
capacidad para codificar otros tantos péptidos de más de 50 aminoácidos: repB, que
codifica para la replicasa, un gen transcripcionalmente acoplado (orfX-like), similar a
otros genes orfX de plásmidos de lactococos y copG-like, con un dominio
conservado presente en proteínas de la familia CopG.
La construcción de un árbol filogenético con las secuencias aminoacídicas de
las proteínas de replicación de todos los plásmidos de bifidobacterias y algunos de
otras familias de bacterias tanto Gram-positivas como Gram-negativas, mostró que el
plásmido pBC1 queda encuadrado junto con los plásmidos de B. longum pMB1 y
pDOJH10S en un subgrupo en los que todas las proteínas de replicación contienen el
motivo Pfam_03090. Estos plásmidos están lejanamente emparentados con los
plásmidos ColE2 y pXZ10142 de E. coli y C. glutamicum, respectivamente, en los
que se ha demostrado un tipo Theta de replicación. En pBC1 otros indicios de
Discusión General
102
replicación Theta son la presencia de iterones de 24 pb en la región ori y la similitud
que muestra con la organización estructural de algunos plásmidos que replican por
mecanismo Theta de L. lactis como es la presencia de un gen transcripcionalmente
acoplado a repB.
La mayoría de los plásmidos aislados de bifidobacterias, relacionados en la
Introducción (Tabla 4) parecen replicar mediante el mecanismo RC, aunque este
modo de replicación se ha demostrado experimentalmente en sólo unos pocos casos:
pKJ50 (Park et al., 1997), pCIBb1 (O’Riordan and Fitzgerald, 1999), pNAC1
(Corneau et al., 2004), pDOJH10L (Lee and O’Sullivan, 2006) y pBIFA24 (Park et
al., 2008). Aunque en este trabajo no hemos podido demostrar el modo de
replicación Theta para pBC1 si podemos excluir el modo de replicación RC ya que
durante su replicación no hemos podido detectar ADN de cadena sencilla.
Con el fin de estudiar el posible papel de las ORFs orfX-like y copG-like, así
como el de otras estructuras y secuencias presentes en pBC1, se llevó a cabo un
análisis funcional mediante amplificaciones diferenciales de la secuencia plasmídica.
Como ya se ha comentado a lo largo de la memoria, genes homólogos y con similar
posición a orfX-like han sido identificados en varios plásmidos de lactococos con el
tipo Theta de replicación (Sánchez et al., 2000; Gravesen et al. 1995; Frère et al.,
1993; Hayes et al., 1991). Aunque su función continúa siendo, en esencia,
desconocida y, de hecho, en algunos plásmidos naturales este gen está interrumpido
o ausente (van Kranenburg and de Vos, 1998; Kiewiet et al., 1993), en otros parece
estar relacionado con el control del número copias y la estabilidad plasmídica
(Sanchez et al., 2000; Gravesen et al., 1995; Frère et al., 1993; Kiewiet et al., 1993;
Hayes et al., 1991). Por su parte el producto del gen copG-like presenta un dominio
conservado en la familia de las proteínas CopG (Bateman et al., 2004). Genes
Discusión General
103
especificando proteínas CopG se encuentran de manera habitual en posiciones
próximas al gen que codifica la proteína esencial de replicación en plásmidos de tipo
RC donde regulan el número de copias mediante su unión a la región promotora del
gen rep (del Solar et al., 1998). En función de los resultados obtenidos podemos
concluir que tanto orfX-like como copG-like no son esenciales para la replicación de
pBC1, puesto que la construcción pBC1.2, en la que ambos genes han sido
delecionados, es aún capaz de replicar en bifidobacterias. Sin embargo, a la vista de
las diferencias en la frecuencia de transformación, el número de copias y en la
estabilidad de las construcciones pBC1.2, pBC1.3, pBC1.4 y pBC1.5 parece lógico
pensar que los genes orfX-like y copG-like juegan, de alguna forma que no hemos
podido determinar, un papel importante en el proceso de replicación. En bacterias
Gram-positivas la estabilidad de los plásmidos de pequeño tamaño y replicación RC
está relacionada con un alto número copias de los mismos (del Solar et al., 1998),
careciendo de otros mecanismos de reparto a la progenie o de estabilidad. Por lo
tanto, estas dos variables están en general estrechamente relacionadas. De hecho,
problemas de estabilidad plasmídica han sido identificados en plásmidos con
defectos en su replicación, lo que conlleva a su vez una disminución del número de
copias. En pBC1 esta correlación entre el número de copias y la estabilidad, aunque
existe, no es absoluta. Se podría argumentar que en un plásmido que utiliza el modo
de replicación Theta, como proponemos, la estabilidad no tiene porque regirse por
los mismos principios que en los plásmidos RC. Llama la atención las diferencias
existentes en el número de copias y la estabilidad de las distintas construcciones
entre las cepas B. breve UCC2003 y B. pseudoactenulatum M115. En esta última
cepa, a medida que disminuye el tamaño de la construcción, y por tanto la secuencia
de pBC1, disminuyen de una manera directamente proporcional el número de copias
Discusión General
104
y la estabilidad plasmídica. Sin embargo, en la cepa B. breve UCC2003 la relación
entre el tamaño de la construcción, el número de copias y la estabilidad es mucho
menos clara, de hecho la construcción de mayor tamaño (pBC1.5) es la que presenta
un menor número de copias y su estabilidad decae drásticamente a partir de las 40
generaciones. Estas diferencias entre cepas pueden deberse a su distinto fondo
genético, en el que podemos incluir interferencias con plásmidos integrados en el
genoma bacteriano o secuencias residuales de éstos (Schell et al., 2002), o
interacciones específicas de otras proteínas celulares con las secuencias plasmídicas
durante la replicación. El hecho de que los resultados siguen una relación mucho más
proporcionada en la cepa B. pseudocatenulatum M115 que en la cepa B. breve
UCC2003, puede ser debido a que la especie B. pseudocatenulatum está mucho más
próxima filogenéticamente a B. catenulatum (especie de la que fue aislado pBC1)
que B. breve (Ventura et al., 2004).
La funcionalidad del gen repB se ensayó mediante la introducción de una
deleción de aproximadamente 200 pb dentro de su secuencia, lo que supuso la
pérdida de la capacidad replicativa del plásmido. Parecía evidente pero, de esta
forma, se demostró de manera experimental que la replicación de pBC1 depende de
la presencia de una proteína de replicación funcional.
Los plásmidos no son, ni mucho menos, unidades inalterables sino que se ven
sometidos a continuas y drásticas reorganizaciones génicas. Las reorganizaciones se
producen por la adquisición de genes de procedencia diversa: del propio cromosoma
(Fernández et al., 1999; Nardi et al., 1997), de otros plásmidos endógenos
(O’Sullivan et al., 2001; Anderson and McKay, 1984) o de ADN exógeno
procedente de especies o cepas que ocupan, permanente o temporalmente, el mismo
hábitat (Teuber et al., 1999). En un proceso inverso a la adquisición, los genes
Discusión General
105
también pueden perderse. En todo caso estas reorganizaciones son las responsables
del tamaño y fenotipo actual asociado con cada plásmido en particular. La presencia
de la ORF copG-like en pBC1, proteínas más comúnmente asociadas a plásmidos
con replicación RC, puede ser el resultado de reorganizaciones que hayan tenido
lugar durante la historia del plásmido. Un ejemplo de posibles reorganizaciones en
plásmidos de bifidobacterias lo encontramos en el plásmido de B. longum
pDOJH10L en el que se pueden identificar en su secuencia nucleotídica tres
regiones, dos de las cuales muestran una homología del 98% y 96% con los
plásmidos de B. longum pNAC2 y pKJ50, respectivamente (Lee and O’Sullivan,
2006).
El desarrollo de nuevas herramientas genéticas y herramientas mejoradas
(vectores de clonación, de inserción, de expresión, etc.) que permitan abordar el
estudio de las bases moleculares de las características de probiosis de las
bifidobacterias, así como el análisis de la interacción de éstas con bacterias de otras
especies y con las células intestinales es un objetivo importante a corto plazo. Se
hace necesario demostrar de modo fehaciente las propiedades beneficiosas y
desentrañar los mecanismos moleculares de acción para apoyar de forma científica el
éxito comercial que están teniendo los probióticos. Es en este punto donde cobra
especial importancia la caracterización de plásmidos endógenos del género
Bifidobacterium que sirvan de base para el desarrollo de vectores tanto generales
como especializados. Las características mostradas por el plásmido pBC1, pequeño
tamaño (2540 pb), alta estabilidad, replicación Theta, replicación en todas las
especies analizadas del género Bifidobacterium, lo convierten en un candidato idóneo
para la utilización de su replicón en el desarrollo de alguna de las herramientas
génicas mencionadas. En el presente trabajo se han desarrollado, a partir de pBC1,
Discusión General
106
varios vectores que replican en E. coli y bifidobacterias como pAM1, pAM3 y pAM4
y un vector, pAM2 que sólo replica en bifidobacterias. Los vectores pAM3 y pAM4
portan un gen de resistencia a tetraciclina, tet(W), aislado previamente de una cepa
B. longum, que puede utilizarse para su selección en Gram-positivas y Gram-
negativas. Este conjunto de vectores, gracias a su estabilidad y a su amplio rango de
huésped en el género Bifidobacterium, pueden suponer una buena base para el
desarrollo de herramientas más especializadas. En primer lugar, será necesario
incorporar sitios de clonación multiple (“polilinkers”) con un mayor número de
secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción que faciliten la
incorporación del ADN exógeno que queramos clonar, y también puede ser
interesante incorporar el péptido αLacZ que permita una fácil discriminación de las
moléculas recombinantes en E. coli. Aunque, dada la versatilidad de las técnicas de
amplificación por PCR, ya no es necesario alcanzar la sofisticación de los vectores
como pUC, pBluescript, etc. Mediante PCR se pueden introducir de una manera
sencilla sitios de restricción en los amplicones que nos favorezcan o permitan la
clonación. También se pueden emplear técnicas de clonación más recientes como la
clonación “PCR In-FusionTM” (Clontech Lab. Inc.). Esta es una técnica
independiente de la ligación que está basada en la actividad exonucleasa 3’-5’ de la
ADN polimerasa de los poxvirus (Hamilton et al., 2007). Mediante esta técnica se
pueden unir dos moléculas de ADN cualesquiera que compartan una secuencia de al
menos 15 pb en sus extremos; secuencia compartida que también se añade durante la
amplificación.
También se han obtenido vectores derivados de pBC1 en los que la
estabilidad y el número de copias se ven reducidos a medida que delecionamos
distintas partes del plásmido original lo que podría ser de utilidad para regular la
Discusión General
107
expresión de los genes clonados o la construcción de sistemas depurativos en los que
el último paso exige la curación del plásmido (Martín et al., 2000). En todo caso,
nuestros vectores podrían complementar los desarrollados en otros trabajos (Cronin
et al., 2007; Guglielmetti et al., 2007; Sangrador-Vegas et al., 2007; Klijn et al.,
2006) para su posible utilización sucesiva o combinada.
Otro punto crucial para el desarrollo y mejora de las técnicas de ingeniería
genética en el género Bifidobacterium es el desarrollo de un protocolo de
transformación adecuado que permita la introducción eficaz de ADN exógeno. A
pesar de que se han llevado a cabo algunos estudios para incrementar la frecuencia
de transformación en las bifidobacterias (Rossi et al., 1997; Argnani et al., 1996), a
este aspecto se han dedicado mucho menos esfuerzos que a la obtención de datos
genéticos. De esta forma, la frecuencia de transformación es todavía insuficiente para
propósitos como la clonación directa en bifidobacterias o la disrupción génica por
doble sobrecruzamiento. En el presente trabajo se ha estudiado el efecto de las
variaciones de algunos parámetros implicados en la electroporación sobre la
frecuencia de transformación en la cepa B. pseudocatenulatum M115. A pesar de los
pequeños incrementos en la frecuencia a medida que aumentamos el voltaje o la
resistencia, los resultados no suponen una mejora cualitativa sobre los resultados
obtenidos en otros trabajos previos (Rossi et al., 1997; Argnani et al., 1996).
Estamos convencidos, y nuestros resultados preliminares así lo apoyan, que la
frecuencia de transformación es cepa-específica, con lo que, habrá que transformar
un mayor número de cepas tratando de localizar la más transformable, y seguir
ensayando otros procedimientos de electroporación.
En los últimos años, gracias a la secuenciación del genoma de varias cepas de
bifidobacterias se tiene un conocimiento razonable del complemento genético de
Discusión General
108
estos microorganismos. La homología de los genes y/o sus productos permite
hipotetizar sobre algunas de las propiedades más importantes de las bifidobacterias
en relación con sus propiedades probióticas y su utilizaión industrial. Sin embargo, la
función real “in vitro” e “in vivo” habrá de ser ensayada en mutantes bien
caracterizados. Se abre también la posibilidad de “mejorar” las cepas para ofrecer
propiedades nuevas por medio de la modificación genética dirigida. Para todo ello se
precisan herramientas y técnicas como las que se han estudiado en esta Tesis y otras
mejoradas. La identificación de secuencias de inserción (IS) y profagos abre la
posibilidad de desarrollar nuevos tipos de vectores de inserción con los que podrán
estabilizarse en los cromosomas las propiedades de interés. De igual modo, resultará
interesante sustituir los genes de resistencia a antibióticos de los vectores actuales
por otros que codifiquen actividades enzimáticas y/o metabólicas que puedan
considerarse de grado alimentario (“Food Grade”) de los que en la actualidad no
existe ninguno para las bifidobacterias.
CONCLUSIONES
Conclusiones en español
109
1- Se han detectado plásmidos en el 26% de los 72 aislados de bifidobacterias
procedentes del intestino humano analizadas que se han agrupado en 6
perfiles distintos: dos de un solo plásmido y cuatro de dos plásmidos. Las
cepas con plásmidos pertenecen a las especies B. catenulatum, B. bifidum y
B. longum.
2- El plásmido pBC1 procedente de la cepa B. catenulatum L48 se ha
secuenciado por completo, revelándose como una molécula circular de 2540
pb, con un contenido en G+C del 64%. Mediante hibridación, utilizando
como sonda un segmento interno de repB, se comprobó que el replicón no
presenta homología de secuencia con ninguno de los otros plásmidos
observados. En la secuencia de pBC1 se han identificado tres posibles ORFs
que codificarían para péptidos mayores de 50 aminoácidos: repB, orfX-like y
copG-like.
3- El gen repB, cuya deleción supone la perdida de la capacidad replicativa en
bifidobacterias, codifica para una péptido (RepB) de 315 aminoácidos, la
comparación de su secuencia amoniacídica con la proteína de replicación de
plásmidos de bifidobacterias y otras especies Gram-positivas y Gram-
negativas agrupó a RepB con las proteínas de replicación de los plásmidos de
B. longum pMB1 y pDOJH10S. Estos plásmidos están emparentados de
forma lejana también con los plásmidos ColE2 y pXZ10142 aislados de E.
coli y C. glutamicum, respectivamente, que replican mediante un mecanismo
de replicación de tipo Theta.
4- Acoplada traduccionalmente a repB, aparece otra pauta que denominamos
orfX-like. La deleción de esta ORF demostró que no es esencial para la
replicación de pBC1 pero su ausencia influye en el número de copias y en la
estabilidad.
5- copG-like, la tercera ORF identificada en pBC1, se codifica en la hebra
complementaria a la que se codifican repB y orfX-like y tampoco resultó
esencial para la replicación del plásmido.
Conclusiones en español
110
6- Entre las secuencias no codificadoras, que bien pudieran estar involucradas
en la replicación de pBC1 o su control, destaca una región rica en A+T
situada por delante del gen repB, varias repeticiones invertidas (IR) de
diferente longitud y una repetición directa (DR) imperfecta de 24 nucleótidos
repetida tres veces y media. En esta zona se sitúa, posiblemente, el origen
físico de replicación del plásmido (sitio ori).
7- Además de la homología de secuencia, la replicación de tipo Theta de pBC1
se vio reforzada por la imposibilidad de detectar ADN de cadena sencilla
durante su multiplicación; en contra de lo que ocurre en plásmidos que
replican mediante el mecanismo de círculo rodante (RC).
8- El replicón de pBC1 fue capaz de replicar en las ocho cepas de las especies
de bifidobacterias ensayadas pero no en cepas de las especies L. lactis, L.
casei, E. durans y E. coli.
9- Se han desarrollado vectores bifuncionales E. coli-Bifidobacterium y
específicos para bifidobacterias basados en el replicón de pBC1. Éstos
mostraron una alta estabilidad estructural y/o segregacional y un número de
copias cercano a 30 por equivalente cromosomal.
10- Mediante la utilización de uno de los vectores derivados de pBC1 (pAM1)
fue posible la clonación y expresión en E. coli DH11S y en B.
pseudocatenulatum M115 del gen que codifica la actividad α-L-
arabinofuranosidasa procedente de una cepa de B. longum. La actividad
arabinofuranosidasa aumentaba unas 100 veces en las células recombinantes.
11- Con el fin de establecer las condiciones óptimas de tranformación para la
cepa B. pseudocatenulatum M115, se estudiaron diferentes parámetros
implicados en el proceso de electroporación. La frecuencia de transformación
más elevada (1,0 x 105 transformantes µg-1 ADN) se obtuvo con un pulso de
10 kV cm-1, una capacitancia de 25 µF y una resistencia de 400 Ω.
Conclusiones en inglés
111
1- Plasmids have been detected in 26% of the 72 bifidobacteria isolates from
the gastrointestinal tract of healthy humans; they were grouped into six
different profiles: two profiles consisting of single plasmids and four
containing at least two different plasmids. Plasmid-harbouring strains
belonged to the species B. bifidum, B. catenulatum and B. longum.
2- The single plasmid present in the strain B. catenulatum L48, named pBC1,
has been completely sequenced. It proved to be a circular DNA molecule of
2540 base pairs with an overall G+C content of 64%. Hybridization
experiments, using as a probe an internal fragment of its putative repB gen,
showed that this replicon was unique among all other plasmids observed.
Three open reading frames (ORFs) encoding peptides larger than 50 amino
acids were identified in the pBC1 sequence: repB, orfX-like and copG-like.
3- Deletion experiments proved that an intact repB gene was essential for the
replication of pBC1 in bifidobacteria. Comparison of its nucleotide and
deduced amino acid sequences to those in databases identified pMB1 and
pDOJH10S plasmids, both from B. longum strains, as its closest relatives.
repB encodes a 315 amino acids long replicase (RepB) that presents
homology to replication proteins from bifidobacterial plasmids and other
from Gram-positive and Gram-negative species. These proteins grouped
with those from the well-known theta-replicating plasmids ColE2 and
pXZ10142 from E. coli and C. glutamicum, respectively.
4- Downstream of the repB gene, a second ORF, called orfX-like, was
encountered, which seemed to be translationally coupled to repB. The orfX-
like gene proved to be not essential for pBC1 replication, although its
deletion had a deleterious effect on copy number and plasmid stability of
the constructs.
5- A third ORF identified in pBC1, copG-like, was encoded in the
complementary strand of repB and orfX-like genes. As this last gene, copG-
like was dispensable for plasmid replication.
Conclusiones en inglés
112
6- Besides the mentioned protein-enconding sequences, several untranslated
ones were also observed in the pBC1 molecule, which might be involved in
plasmid replicaction and/or its control. Noteworthy, two A+T stretches
were found immediately upstream repB, and several (at least five) inverted
repeats (IR) of different length and an imperfect direct repeat (DR) of 24
nucleotides repeated three and a half times were spread around this region,
which may represent the physical replication origin of pBC1 (the ori site).
7- In addition to the sequence homology of the repB product of pBC1, the
utilization of a theta type replication mechanism by this plasmid was
reinforced by the fact that single stranded DNA (ssDNA) was not detected
during pBC1 replication.
8- The pBC1 replicon was functional in strains of all bifidobacteria species
analysed (eight), but not in strains of L. lactis, L. casei, E. durans and E.
coli.
9- Shuttle vectors E. coli-Bifidobacterium and Bifidobacterium specific
vectors were developed using the pBC1 replicon. They all showed a rather
high segregational and/or structural stability and a relative copy number of
around 30 per chromosomal equivalent.
10- Using one of the the pBC1 derived vectors (pAM1) was able to clone and
express in E. coli DH11S and in B. pseudocatenulatum M115 the gen that
encodes the α-L-arabinofuranosidase activity, originate from one B. longum
strain. Arabinofuranosidase activity was increased around 100 times in the
recombinant cells.
11- Different parameters involved in electrotransformation were studied in
order to optimise the transformation conditions for B. pseudocatenulatum
M115; the bifidobacteria strain with the highest transformation efficiency in
our hands. The best results (1,0 x 105 transformants per µg-1 of DNA) were
obtained with a pulse of 10 kV cm-1, and a capacitance of 25 µF and a
resistance of 400 Ω.
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.
ANEXOS
Anexos
131
LOCUS NC_007068 2540 bp DNA circular BCT 17-JUN-2005 DEFINITION Bifidobacterium catenulatum plasmid pBC1, complete sequence. ACCESSION NC_007068 VERSION NC_007068.1 GI:66473484 PROJECT GenomeProject:13899 KEYWORDS . SOURCE Bifidobacterium catenulatum ORGANISM Bifidobacterium catenulatum Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium. REFERENCE 1 (bases 1 to 2540) AUTHORS Alvarez-Martin,P. and Mayo,B. TITLE Sequence and analysis of plasmid pBC1 from Bifidobacterium catenulatum L48 JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 2540) CONSRTM NCBI Genome Project TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (23-MAY-2005) National Center for Biotechnology Information, NIH, Bethesda, MD 20894, USA REFERENCE 3 (bases 1 to 2540) AUTHORS Alvarez-Martin,P. and Mayo,B. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (19-APR-2005) IPLA-CSIC, Carretera de Infiesto s/n, Villaviciosa, Asturias 33300, Spain COMMENT PROVISIONAL REFSEQ: This record has not yet been subject to final NCBI review. The reference sequence was derived from DQ011664. COMPLETENESS: full length. FEATURES Location/Qualifiers source 1..2540 /organism="Bifidobacterium catenulatum" /mol_type="genomic DNA" /strain="L48" /db_xref="taxon:1686" /plasmid="pBC1" repeat_region 141..159 /note="IR1" /rpt_type=inverted
Anexos
132
repeat_region 161..179 /note="IR2" /rpt_type=inverted repeat_region 231..254 /note="IR3" /rpt_type=inverted repeat_region 265..284 /note="IR4" /rpt_type=inverted repeat_region 309..332 /rpt_type=direct repeat_region 333..356 /rpt_type=direct repeat_region 357..380 /rpt_type=direct repeat_region 381..394 /rpt_type=direct repeat_region 536..554 /note="IR5" /rpt_type=inverted gene 574..1521 /gene="repB" /locus_tag="pBC1_01" /db_xref="GeneID:3416008" CDS 574..1521 /gene="repB" /locus_tag="pBC1_01" /note="replicase; essential replication protein" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="RepB" /protein_id="YP_241107.1" /db_xref="GI:66473485" /db_xref="GeneID:3416008" /translation="MSDEYSQPTLELSRTFEGWWLPRRPLCCDDDYSQLVRRSRTDAL RCKHIEANPSALVNTIVVDIDDANAKAMALWGHRGMLPNWIAENPANGHAHAGWVLTY PVPRTDMARLKPLKLLHAVTEGLRRSVDGDEGYSGLLMKNPLSDAWDSDLCREDTYDL PDLVAALEEHGDMPPKSWTRTKRAREVGVGRNCTLFDEARTLAYRQVRRLPDRTPASS DLLREYVRRTCHEINASFPDPLPVREVNDTAKSIHKWITTRSRMWRDGAVANAATFVA IQSARGRKGGRGNKRDKQGNVQNAFKQKAELFGKEMMGQ" gene 1518..1808 /locus_tag="pBC1_02" /db_xref="GeneID:3416010" CDS 1518..1808 /locus_tag="pBC1_02" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="OrfX" /protein_id="YP_241108.1" /db_xref="GI:66473486" /db_xref="GeneID:3416010" /translation="MTIQTIRKKRPLPAKELAAMYDVSVRTIQRWASQTRKDWIDEQA
Anexos
133
TLRESIRAYHDDEGHTWPQTAEHFGMSQDAVRSRCYRARKERAAEAKAARPE" repeat_region 1736..1761 /note="IR6" /rpt_type=inverted repeat_region 1817..1835 /note="IR7" /rpt_type=inverted repeat_region 1838..1856 /note="IR8" /rpt_type=inverted repeat_region 1917..1936 /note="IR9" /rpt_type=inverted repeat_region 1941..1981 /note="IR10" /rpt_type=inverted gene complement(2000..2284) /gene="copG" /locus_tag="pBC1_03" /db_xref="GeneID:3416009" CDS complement(2000..2284) /gene="copG" /locus_tag="pBC1_03" /note="contains conserved motif found in CopG proteins" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="CopG-like" /protein_id="YP_241109.1" /db_xref="GI:66473487" /db_xref="GeneID:3416009" /translation="MSDFSERDRELLAMFGMGEDQVRDDVERMESETAGHGITGPVHY ALHMLPEHGEEMVSMTVKLPKSQLEKVTETARRYHISRSEYVRRQLAGAV" ORIGIN 1 agatctccaa acagcacctc caagcaaagt tgataccaga gtaacaccac ggtcacacaa 61 gtggaacacc gttgtggcac aagccgcgcg agcggtctgg aggctccgcc gaccatgggg 121 tacgggtctt cccggcaagc cgattcgcac cgcgaatcga gtgattgtag ctacaatcac 181 gtcgcttgct actccggcct tgcggctttt tcctcggcct cgggttgttg ctcctgcgcc 241 gaagggcgca ggaggtgctg cgttcggttc atgtacatga accgtctagc ttgcttacct 301 tcgatttgat ggacatctcc atgtggatgt ccatggacat atccatgtgg gtgtccatag 361 acgtgtccat gtgggtatcc atggatatat ccatctgagc gcataggaag cgcatgaggg 421 tggatgatcg ttcggtttgg ggtgtttttg gccagatttc gacagttttg ggtaactctg 481 ggaaggagca gcccatgctt tgctgggctg aaatatctga cttggtttta ggcgaacttg 541 accagtggtc aagtacgacg tacactagtg cccatgtctg acgagtattc gcagccgacg 601 cttgagctgt cgcgcacgtt cgagggctgg tggctgcccc ggcgtccgct gtgctgcgac 661 gacgactaca gccagctggt gcgccggagc cgcaccgacg cgctcagatg caagcacatc 721 gaggcgaatc cctcggcgct ggtgaacacg atcgtggtgg acatcgacga cgcgaacgcc 781 aaggcgatgg ccctgtgggg gcaccgtggg atgctgccga actggatcgc ggagaacccg 841 gccaacgggc acgctcacgc gggctgggtg ctgacctacc ccgtgccccg caccgacatg 901 gcccggctca aaccgctgaa gctcctgcac gccgtcaccg aggggctgcg ccgcagcgtg 961 gacggcgacg agggctattc cggcctgctg atgaagaacc cgctgagcga cgcgtgggac 1021 agcgacctgt gccgcgagga cacctacgac ctgcccgacc tcgtggccgc gctcgaagag 1081 cacggggaca tgccgcccaa gagctggacg cgcaccaaac gcgcccgcga ggtcggcgtg 1141 ggccgcaact gcaccttgtt cgacgaggcc cgcaccctcg cctaccgtca ggtgcgccga 1201 ctgcccgacc gcacgcccgc ctcctccgac ctgctgcgcg agtacgtgcg ccgcacctgc 1261 cacgaaatca acgcctcgtt ccccgacccg ctgcccgtgc gcgaggtcaa cgacaccgcc 1321 aagagcatcc acaagtggat caccacgcga agccgcatgt ggagggacgg tgccgtcgcc 1381 aacgccgcca cgttcgtcgc catccaatcc gcgcgcggac gcaaaggcgg tcgcggaaac 1441 aaacgcgaca agcaagggaa cgttcaaaat gccttcaagc aaaaggcaga gctgttcggc
Anexos
134
1501 aaggagatga tggggcaatg acgattcaga cgattcgcaa gaagcgtccg cttcccgcca 1561 aggagctggc ggcaatgtac gacgtctccg tgcgcactat tcagcgatgg gcttcacaaa 1621 cccgtaagga ctggatagac gaacaggcaa cgttgcgcga atccatccgt gcctaccacg 1681 atgacgaggg ccatacgtgg ccgcagaccg ccgagcactt cggcatgagc caagacgcgg 1741 tgcgtagccg ctgctaccgc gcgcgcaagg agcgtgcggc cgaggcaaaa gccgcaaggc 1801 cggagtagca agtgacgtga acgtatatac gttcactcga ttcgcaccgc gaatcggctt 1861 gccgggaaga cccgtacccc atggtcggct gcgcctccag accgctcgcg cggcatggtg 1921 acaccgcggt gtcacctatg ggaacacccg tgtgccacga atgatggcac acgggtgttc 1981 cgtcttcgcg cggcggcggt cagacggctc cggcgagctg ccggcgcacg tactcgctgc 2041 ggctgatgtg gtagcgcctg gcggtctccg tgaccttctc cagctgactc ttgggcagct 2101 tgacggtcat gctgaccatc tcctcgccgt gctcggggag catgtgcagc gcgtagtgga 2161 cgggtccggt tatgccgtgg cccgcggtct cggactccat gcgctccacg tcgtccctga 2221 cctgatcctc gcccatgccg aacatcgcca acagctccct gtcgcgttcg ctgaaatcgc 2281 tcatcggtcg ctccttcccc cgcgcaggcg ggctatctcg cttcgggtct tcttcgtcgg 2341 cggcgtcatg gcgtggtaga tgagcgcgcg gtcgccgcgc tgctcgtaga ccatctccac 2401 gtccctgccg cgcccgtcga ggccgatgca gacccacgtg ccgttgtccc tgcgggcgtc 2461 caccatgacg ctcctgaacg ccgcaagcac gtcctccacg gacagctcgg gatgccgctc 2521 atgcacgcgc ggcagcacgt //
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Plasmid 57 (2007) 165–174
www.elsevier.com/locate/yplas
Screening for plasmids among human bifidobacteriaspecies: Sequencing and analysis of pBC1
from Bifidobacterium catenulatum L48
Pablo Alvarez-Martın, Ana Belen Florez, Baltasar Mayo *
Instituto de Productos Lacteos de Asturias (IPLA), Consejo Superior de Investigaciones Cientıficas (CSIC),
Carretera de Infiesto s/n, 33300 Villaviciosa, Asturias, Spain
Received 20 April 2006, revised 3 July 2006Available online 22 August 2006
Communicated by Manuel Espinosa
Abstract
Analysis of 72 bifidobacterial isolates for plasmid DNA identified six different plasmid profiles, two profiles consisted ofa single plasmid and four contained at least two. A plasmid identified in a Bifidobacterium catenulatum strain (pBC1) waschosen for further characterization based on its small size and stability. The plasmid was shown to be a circular molecule of2540 base pairs with an overall G + C content of 64%. At the putative origin of replication a direct repeat of 24 nucleotidesrepeated three and a half times was observed, as well as five inverted repeats, which resembled the organization of theta-type replicating plasmids. Three open reading frames encoding peptides larger than 50 amino acids were also identified:repB, encoding a replicase of 315 amino acids, a transcriptionally coupled gene (orfX-like), similar to the orfX of sometheta-replicating lactococcal plasmids, and copG-like in the complementary strand, which showed a conserved domainpresent in proteins of the CopG family. Comparison of the deduced RepB protein of pBC1 to other replication proteinsin databases, identified pMB1 from Bifidobacterium longum as its closest relative (81% amino acid identity). The pBC1 rep-licon proved to be functional in several Bifidobacterium species, including B. animalis, B. longum, and B. pseudocatenula-
tum. Hybridization experiments showed the replicon was uncommon among bifidobacteria. The relative copy number ofpBC1 was estimated to be 30.9 ± 4.62 by quantitative real-time polymerase chain reaction. 2006 Elsevier Inc. All rights reserved.
Keywords: Plasmids; Bifidobacterium catenulatum; Bifidobacteria; Probiotics; Cloning vectors; Sequencing
1. Introduction
Bifidobacteria are among the dominant microbialpopulations in the gastrointestinal tract (GIT) of
0147-619X/$ - see front matter 2006 Elsevier Inc. All rights reserved
doi:10.1016/j.plasmid.2006.07.004
* Corresponding author. Fax: +34 985 89 2233.E-mail address: [email protected] (B. Mayo).
humans and other animals (Ventura et al., 2004),where they are thought to exert health-promotingbenefits, including stimulation of the immuneresponse (Lee et al., 1993), protection against viralinfections (Saavedra et al., 1994), and anticarcino-genic activity (Reddy and Rivenson, 1993). Theseproperties could be enhanced by either ingestionof high numbers of bifidobacteria (probiotics) or
.
166 P. Alvarez-Martın et al. / Plasmid 57 (2007) 165–174
by the selective stimulation of their growth byspecific compounds (prebiotics) (Reid et al., 2003;Tuohy et al., 2003). These two approaches are beingfollowed at present, and a myriad of prebiotic- andprobiotic-containing products are already on themarket (Kullen and Klaenhammer, 2000; Tuohyet al., 2003). However, our understanding of thespecies and strain composition of bifidobacteria inthe human GIT ecosystem is still limited (Tannock,1999). More frustrating is the fact that the mecha-nistic details underlying the beneficial effects aresimply not known (Vaughan et al., 1999). Thisunderstanding is essential to scientifically supportthe contribution of these bacteria to human healthand well-being and their rationale inclusion inprobiotics and functional foods (Kullen andKlaenhammer, 2000).
Considering the commercial potential of bifido-bacteria (Stanton et al., 2001), the genetic technolo-gies for these microbes are poorly developed(Ventura et al., 2004). Analyses of bifidobacteriastrains have indicated that extrachromosomal ele-ments are rarer than in other intestinal species(Sgorbati et al., 1982; Iwata and Morishita, 1989;Park et al., 1997), and where present, they are smallin size. In spite of this, 11 plasmids from Bifidobac-
terium longum have been completely sequenced todate: pMB1 (Rossi et al., 1996), pKJ36 and pKJ50(Park et al., 1997, 1999), pBLO1 (Schell et al.,2002), pNAC1, pNAC2 and pNAC3 (Corneauet al., 2004), pTB6 (Tanaka et al., 2005),pDOJH10L and pDOJH10S (Lee and O’Sullivan,2006), and pB44 (GenBank Accession No.NC004443). Furthermore, five plasmids from otherBifidobacterium species have also been sequenced:pVS809 from Bifidobacterium globosum (Mattarelliet al., 1994), pCIBb1 (O’Riordan and Fitzgerald,1999) and pNBb1 (GenBank Accession No.E17316) from Bifidobacterium breve, pAP1 fromBifidobacterium asteroides (GenBank AccessionNo. Y11549), and p4M from Bifidobacterium pseud-
ocatenulatum (GenBank Accession No. NC003527).The significance of these autonomously replicatingDNA elements in Bifidobacterium remains unclear,since no obvious phenotypic trait has been associat-ed to such molecules. However, many genetic toolsand processes are still needed to undertake basicresearch on activity and interaction of bifidobacte-ria within the GIT. Thus, from basic and appliedviewpoints an increased knowledge of bifidobacteri-al plasmids and their molecular characterization isrequired.
This paper reports on the screening for plasmidsfrom a series of human isolates and on the sequenc-ing and analysis of plasmid pBC1 from B. catenula-
tum L48. To our knowledge, this is the first plasmididentified and characterized from this species. Thephylogenetic relationship of the pBC1 replicon withreplicons from bifidobacteria and other bacterialgroups is also reported.
2. Material and methods
2.1. Bacterial strains and growth media
Bifidobacterium strains had been previously isolatedas part of the dominant intestinal populations fromhealthy Spanish adults (Delgado et al., 2006). Cells weregrown under anaerobic conditions at 37 C in MRSbroth (Merck; VWR International, Darmstad, Germa-ny), supplemented with 0.25% cysteine (MRSC) tomaintain a low redox potential in the medium. Esche-
richia coli DH5a was cultured at 37 C in Luria–Bertani(LB) broth (Sambrook et al., 1989) with vigorous shak-ing, and used as a transformation host for cloning.Ampicillin (Sigma Aldrich Co., St. Louis, Miss., USA)was used to select for E. coli transformants at100 lg ml1. Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) and5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-thiogalactopyranoside(X-gal) (both from Sigma) were incorporated into theagar medium at concentrations of 50 lg ml1 and40 lg ml1, respectively.
2.2. Plasmid isolation and analysis
Plasmid DNA from bifidobacteria was isolated by themethod of O’Sullivan and Klaenhammer (1993) with thefollowing modification: pellets were suspended in TSEbuffer (sucrose 25%, 50 mM Tris–HCl pH 8.0 and10 mM EDTA pH 8.0) and incubated with lysozyme(30 mg/ml) at 37 C for 30 min. Plasmid DNA from E.
coli was isolated using a Plasmid Miniprep kit (EppendorfAG, Hamburg, Germany) as recommended by the manu-facturer. Plasmids were electrophoresed in TBE (89 mMTris–HCl, 89 mM boric acid, and 2 mM EDTA, pH 8.0)in 0.75–1.2% agarose gels (FMC Bioproducts, Philadel-phia PA, USA), stained with ethidium bromide(0.5 lg ml1) and photographed.
2.3. Restriction endonuclease digestion and molecular
cloning
Restriction endonucleases and Taq DNA polymerasewere purchased from Takara (Takara, Otsu, Shiga,Japan), and the Klenow fragment of polymerase I fromRoche (Roche Applied Sciences, Basel, Switzerland). Allwere used according to the manufacturers’ instructions.
P. Alvarez-Martın et al. / Plasmid 57 (2007) 165–174 167
Vector pUC18 was used for cloning of the Sau3AI gener-ated restriction fragments of pBC1 in E. coli, andpUC19E, a pUC derivative which does not replicate inGram-positive bacteria but contains an erythromycinresistance gene allowing selection (Leenhouts et al.,1991), for cloning the whole pBC1 plasmid. Ligation mix-tures were transformed into E. coli DH5a competent cellsby electrotransformation (electroporation) using a Gene-Pulser apparatus according to the manufacturers instruc-tions manual (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA,USA). Selection of recombinant E. coli DH5a cells har-boring pUC18–pBC1 derivates was performed by blue/white screening on LB agar supplemented with X-gal,IPTG and ampicillin. Bifidobacteria species were madeelectrocompetent following the protocol of Rossi et al.(1997) and transformed accordingly. Transformants ofBifidobacterium species were selected in MRSC agar platessupplemented with 0.3 mM sucrose (Sigma) and erythro-mycin (5 lg ml1) (Sigma).
2.4. Sequencing and DNA sequence analysis
DNA sequence determination was performed with a377 Automated DNA Sequencer (Applied Biosystems,Foster City, CA, USA), using synthetic oligonucleotides(318A DNA Synthesizer, Applied Biosystems) as prim-ers. The complete pBC1 sequence was obtained bysequencing cloned plasmid DNA fragments and primerwalking along the pBC1 sequence using the polymerasechain reaction technique (PCR). Sequence assembly wasaccomplished using the sequence analysis softwarepackage available from the EMBL Spanish node(CNB, CSIC, Spain). DNA and deduced proteinsequences of the different open reading frames (ORFs)encountered were searched for homology against non-redundant DNA and protein databases, using FASTA(Pearson and Lipman, 1988), BLASTN and BLASTP(Altschul et al., 1997) programs. The databasessearched were those of SWISSPROT (release 30);NBRF-PIR (release 42); GenBank translated (release86), and EMBL (release 38). Sequence alignments wereperformed using the CLUSTAL W algorithm (Thomp-son et al., 1994).
The distance matrix of a multiple alignment, betweenthe deduced RepA protein of pBC1 and those of severalprototype plasmids of different plasmid families fromGram-positive and Gram-negative bacteria, was used toset up a phylogenetic tree by the neighbor-joining methodof Saitou and Nei (1987) and a bootstrapping number of1000.
2.5. DNA hybridization
After electrophoresis, plasmid DNA was transferredto Hybond-N nylon membranes (GE Heath Care Bio-Sciences, Little Chalfont, UK) and hybridized using
high-stringency standard conditions (hybridization at68 C and two final washing steps in 0.5 · SSC, 0.1%SDS at 68 C for 15 min) (Sambrook et al., 1989) withan internal segment of the repB gene obtained byPCR. Labeling and detection was performed using theNon-Radioactive Digoxigenin Labeling and Detectionkit (Roche).
2.6. Relative copy number determination
The pBC1 copy number was assessed by quantitativereal-time PCR (QPCR), following culture and PCR con-ditions reported elsewhere (Lee et al., 2006). Amplifica-tion and detection were carried out in a Fast Real-TimePCR system (Applied Biosystems) using a PowerSYBER Green PCR Master Mix (Applied Biosystems).PCR primers were designed using Primer Express soft-ware (Applied Biosystems) based on repB sequences 113base pairs (bp) apart (FrepB 5 0-GCCACGTTCGTCGCCATCCA-3 0; RrepB 5 0-CCGACCAGCTCTGCCTTTTG-3 0). The xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphatephosphoketolase (xfp) gene of B. catenulatum ATCC27539 (GenBank Accession No. AY377401) was used asthe reporter gene, in the assumption that this is a chromo-somally encoded single-copy gene. A segment of 109 bp ofthe xfp gene was amplified with primers Fxfp (5 0-GACGTCACCAACAAGCGTG-3 0) and Rxfp (5 0-CTTCCATCTGGTGCTCGGAG-3 0). The relative copy number ofpBC1 in relation to the chromosomal copy number wascalculated with the formula N relative ¼ ð1þ EÞDCT (Leeet al., 2006), where E is the PCR amplification efficiencyof target and reference sequences, and DCT is the differ-ence between the threshold cycle number (CT) of the xfp
reaction and that of repB. The experiment was performedin triplicate and average results are reported.
2.7. Nucleotide sequence accession number
The 2540 nucleotide (nt) sequence of pBC1 is availableunder the GenBank Accession No. NC007068.
3. Results
3.1. Detection of plasmid DNA in Bifidobacterium
species
A total of 72 strains of bifidobacterial isolates,belonging to the species B. longum (37), B. pseudo-catenulatum (16), B. bifidum (11), B. adolescentis
(3), B. catenulatum (3), B. animalis (1), and B. den-
tium (1) were screened by a small-scale lysis proce-dure for the presence of extrachromosomalelements. In 19 isolates of B. longum, B. catenulatum
and B. bifidum plasmids of different sizes (rangingfrom 1.5 to 15 kbp) were found. Six different
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plasmid profiles were obtained in total, which aredepicted in Fig. 1A (lanes 1–7). One profile consist-ing of a single plasmid was observed in extractsfrom the B. catenulatum and B. bifidum isolates. Incontrast, four different profiles containing at leasttwo plasmids were displayed by the B. longum
isolates.Plasmids do not seem to be widely distributed
among Bifidobacterium isolates (Sgorbati et al.,1982; Iwata and Morishita, 1989; Park et al.,1997), and relatively few have been characterizedby cloning and sequence analysis (Rossi et al.,1996; O’Riordan and Fitzgerald, 1999; Park et al.,1999; Corneau et al., 2004; Tanaka et al., 2005;Lee and O’Sullivan, 2006; and the GenBank nucle-otide entries referenced in Section 1). The fact thatall plasmids analyzed are of small size and thatthe method we used produced relatively large plas-mids in lactococci and lactobacilli (O’Sullivan andKlaenhammer, 1993) suggests that large plasmidsare rare in bifidobacteria.
A plasmid of around 2.5-kbp in size, designatedpBC1, was observed in the three B. catenulatum iso-lates examined: two shown in Fig. 1A (lanes 1 and2) and a third isolate from the same individual,which proved to be replicates by random amplifica-tion of polymorphic DNA (RAPD) analysis (datanot shown). pBC1 was selected for further charac-terization because of its small size and stability (cellswere never shown to segregate the plasmid), and thefact that plasmids from B. catenulatum have not yetbeen characterized in spite of this being among thedominant species in the human GIT (Reuter,2001; Requena et al., 2002; Matsuki et al., 2004).The L48 strain was chosen as a source of plasmidDNA.
A BM M1 2 3 4 76 8 9 10115
Fig. 1. (A) Agarose gel electrophoretogram of the plasmid profiles foun1–7). Plasmid DNA from several lactic acid bacteria species was include2, B. catenulatum L48; lane 3, B. bifidum L71; lane 4, B. longum C63; lanlane 8, L. lactis subsp.lactis 1AA22; lane 9, L. lactis subsp. cremori
DIG-labelled lambda DNA digested with EcoRI and HindIII. (B) Autoderived segment of pBC1.
3.2. Cloning and sequencing of pBC1
Isolated pBC1 DNA was digested with Sau3AIand cloned into the BamHI site of pUC18. Afterelectroporation of competent E. coli DH5a cells,several recombinant clones were double-strandsequenced. Where sequence was not available,oligonucleotide primers were designed and usedto amplify uncloned regions of pBC1 by PCR.In this manner, the entire plasmid was bidirec-tionally sequenced, revealing a circular moleculeof 2540 bp, which was arbitrarily numbered start-ing at the first A of the unique BglII site. Aphysical and genetic map of pBC1 is depictedin Fig. 2.
3.3. General organization of pBC1
Analysis of the sequence showed a G + C aver-age composition of 64%, and predicted three ORFsencoding peptides larger than 50 amino acids: repB,possibly encoding a replicase, a transcriptionallycoupled gene (orfX-like) bearing some homologyto the transcriptionally coupled orfX of theta-repli-cating plasmids of lactococci, and a third ORF onthe complementary strand, (copG-like), showing aconserved domain present in proteins of the CopGfamily.
3.4. The repB gene and its deduced replication protein
The presumed repB gene starts at position 574(ATG) of the pBC1 sequence and extends 945 bpwith a calculated GC content of 67%. It couldencode a putative Rep protein of 315 amino acidswith a predicted size of 35.6 kDa. No sequence
M 1 2 3 4 5 76 8 9 10 11M
d in the different bifidobacteria strains analyzed in this work (lanesd as a control (lanes 8–11). Order: lane 1, B. catenulatum L21; lanee 5, B. longum C72; lane 6, B. longum M44; lane 7, B. longum M62;s C2; lane 10, L. plantarum C3.8; L. plantarum BE1. Lane M,radiogram of the gel in (A) hybridized with a DIG-labelled repB-
pBC1
2540 bp
repBorfX-like
copG-like
Fig. 2. Physical and genetic map of pBC1. Coloured arrows indicate the direction and approximate length of the different ORFs. Directrepeats (DRs) and inverted repeats (IRs), are indicated by black arrowheads and faced black arrowheads, respectively. The position ofsome key-restriction enzymes is also indicated.
P. Alvarez-Martın et al. / Plasmid 57 (2007) 165–174 169
resembling the canonical ribosome-binding site(RBS) sequence (GGAGG) was identified immedi-ately upstream of repB. It is worth noting that asimilar sequence (AAGGAG) was found 86 ntupstream of repB start triplet at position 483,upstream of a small ORF having the capability ofencoding a 28 amino acid peptide (not shown inFig. 2). However, this ORF was not in frame withrepB.
Comparison of the deduced RepB protein to oth-ers in databases identified pBM1 from B. longum
B2577 (Rossi et al., 1996) as the closest relative topBC1. In fact, the pBC1 Rep protein exhibits 81%amino acid identity to that of pMB1. Furthermore,the Rep protein of pBC1 showed 56% identity withthe so-called Rep protein of pDOJH10S from B.
longum DJO10A (Lee and O’Sullivan, 2006). Moresurprisingly, the pBC1 Rep protein also displayedhomology (although with an identity of lower than50%) with replication proteins from plasmidsbelonging to different species such as Propionibacte-
rium acidipropionici (plasmid pRG01, 45%;GenBank Accession No. NC002611.1), Propioni-
bacterium jensenii (plasmid pLME106, 45%;GenBank Accession No. NC005705.1), Rhodococ-
cus rubber (plasmid pNC903, 49%, GenBank Acces-sion No. AB218986.1), Brevibacterium linens
(plasmid pRBL1, 46%; GenBank Accession No.AAB03568), and Mycobacterium fortuitum (plasmid
pAL5000, 47%; GenBank Accession No.NC001381.1).
The putative Rep protein of pBC1 was found tocontain an amino acid sequence showing a Pfamconserved domain (Accession No. Pfam PF03090)which is characteristic of a family of bacterial plas-mid DNA replication initiator proteins (Batemanet al., 2004). A similar family of replication proteinsis that of Pfam PF01651. Proteins belonging tothese families are usually found in an equilibriumbetween monomer and dimer forms, which are bothactive in the replication process (del Solar et al.,1998); monomers bind to DR DNA sequences (iter-ons) and, by doing so, they activate replication; incontrast, dimers repress the transcription of the rep-lication protein by binding to IR DNA sequences(usually called operators) in the neighborhood ofthe iterons. Dissociation of dimers can occur spon-taneously or may be mediated by Hsp70 chaperones(del Solar et al., 1998).
In order to establish the relationship betweenpBC1, other bifidobacterial plasmids and plasmidsfrom different families of Gram-positive andGram-negative bacteria, an alignment of 24 Repproteins was done and a phylogenetic tree whichincluded all these sequences was generated(Fig. 3). The pBC1 Rep protein grouped with Repproteins of pMB1 and pDOJH10S plasmids, bothfrom B. longum, but it also merged with Rep
pMB1 Bifidobacterium longum
pBC1
pDOJH10S Bifidobacterium longum
*pXZ10142 Corynebacterium glutamicum
*ColE2 Escherichia coli
*pCG1 Corynebacterium glutamicum
pDOJH10L-Rep Bifidobacterium longum
pNAC3 Bifidobacterium longum
pAP1 Bifidobacterium asteroides
*pCRY4 Corynebacterium glutamicum
*pT181 Staphylococcus aureus
pKJ50 Bifidobacterium longum
pDOJH10L-RepA Bifidobacterium longum
pNAC1 Bifidobacterium longum
pKJ36 Bifidobacterium longum
pB44 Bifidobacterium longum
pDOJH10L-RepB Bifidobacterium longum
pNAC2 Bifidobacterium longum
pBLO1 Bifidobacterium longum
pCIBb1 Bifidobacterium breve
pNBb1 Bifidobacterium breve
*pWV02 Lactococcus lactis
p4M Bifidobacterium pseudocatenulatum
*pC194 Staphylococcus aureus
Fig. 3. Phylogenetic relationships of Rep proteins from all sequenced bifidobacterial plasmids and several prototype plasmids (marked byasterisks) of different plasmid families of Gram-positive and Gram-negative bacteria. The unrooted phylogenetic tree was calculated by thesequence distance method using the neighbor-joining algorithm. The black arrow points to pBC1.
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proteins of the theta-replicating plasmids ColE2(Hiraga et al., 1994) and pXZ10142 (GenBankAccession No. NC002099) from E. coli andCorynebacterium glutamicum, respectively.
3.5. The orfX-like gene, translationally coupled to
repB
Downstream of repB, a second ORF was encoun-tered that could potentially encode a 96 amino acidpeptide with a predicted size of 11.2 kDa (orfX-like).The start codon of orfX-like (ATG at position 1518)overlapped the stop codon of repB, suggesting thesetwo genes are translationally coupled. Eleven bpupstream of the start codon a plausible RBSsequence was found (AAGGAGA).
A gene similarly arranged to orfX-like has alsobeen found in pMB1 from B. longum (Rossi et al.,1996). In the sequence of pDOJH10S an equivalentORF was not observed (Lee and O’Sullivan, 2006),
but nucleotide sequence comparisons revealed a67% identity between orfX-like of pBC1 and bases875–1172 in pDOJH10S. The orfX-like gene ofpDOJH10S shows a similar overlapping organiza-tion with its corresponding repB. The repB genefrom pBC1 shared more than 81% nucleotide iden-tity to the repB sequence from pMB1, whereas theircorresponding orfX-like products share only 62%identity. In contrast, the nucleotide identity betweenorfX-like from pBC1 and the equivalent sequencefrom pDOJH10S was higher than that of theirrespective repB genes (56%).
Downstream of the essential repB, a similar ORFhas been identified in many lactococcal theta-repli-cating plasmids. Lactococcal orfX genes have beenshown to be dispensable for plasmid replication(Frere et al., 1993; Sanchez et al., 2000). Indeed, sev-eral plasmids present naturally interrupted orfX
genes and some others completely lack this ORF,as is the case of pWVO2 (Kiewiet et al., 1993) and
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pNZ4000 repB1 and repB2 (van Kranenburg and deVos, 1998). The precise function of the orfX productremains mostly unknown, but in some plasmids itparticipates in copy number, stability, or both(Frere et al., 1993; Kiewiet et al., 1993; Sanchezet al., 2000). Experiments are in progress to checkthe functionality of orfX-like in the pBC1replication.
3.6. The copG-like gene
In the complementary strand of pBC1, a thirdORF starting with an ATG at position 2284 andpotentially encoding a 94 amino acid peptide witha predicted size of 10.7 kDa was observed.Upstream of this ORF, a putative RBS (AAGGAG) was noted 6 bp away from the putative startcodon. The gene was called copG-like because itsdeduced product showed a Pfam HTH_4 Ribbon-helix-helix conserved domain (Accession No.PF01402), which is present in proteins of theCopG family (Bateman et al., 2004). However,homology to other CopG sequences at eithernucleotide or protein levels was not significant.CopG proteins of this family were first identifiedin plasmids that use the rolling-circle replicatingmechanism (del Solar et al., 1998). These smallproteins also have a functional homodimericarrangement (through their HTH motif) and arethought to act by binding to sequences within therepB promoter, thus regulating copy number (delSolar et al., 1998).
3.7. Untranslated sequences at the ori region
Besides the translated sequences, several untrans-lated sequences were also observed in the pBC1sequence. While translated sequences function intrans, untranslated sequences are thought to act incis, being involved in initiation of replication or inits control (del Solar et al., 1998). The DNAsequence of this region from pBC1 is shown inFig. 4. The regions upstream of repB containA + T-rich stretches (notably, the sequence fromposition 421–481 shows a G + C content of only46%) interspersed with C + G-rich boxes. FourIRs of variable length and with small or no loops,numbered consecutively in Fig. 4 (IR1 to IR4), wereobserved immediately upstream of an imperfect DRof 24 nt ( ; Fig. 4)that was repeated three and a half times (the lastsequence being truncated ).
Several IRs can also be observed within the DRs.Upstream of the start codon of repB a further IRwas detected (IR5 in Fig. 4). A sequence resemblingthat of the oriV origin of replication of the lambdaphage (Grosschedl and Hobom, 1979) was notedoverlapping at the 3 0 end of IR3 (AGGAGG) (dou-ble underlined in Fig. 4). This kind of organizationresembles the so-called DNA iteron structureobserved in the ori region of some theta plasmids(del Solar et al., 1998; Khan, 1997). For instance,DRs repeated three and a half times have been iden-tified in replicons of theta-type plasmids of thepCI305/pWV02 family from Lactococcus lactis
(Frere et al., 1993; Kiewiet et al., 1993). The tandemrepeat organization is similar in all plasmids butsequences of the repeats are very variable, thus con-ferring the specificity for interaction of Rep proteinson DNA sequences (Seegers et al., 1994).
Although the replication mechanism has not beendemonstrated experimentally for pBC1, the sequencecomparison suggests a theta-type mechanism. More-over, plasmids replicating by the rolling-circle mech-anism also contain iterons at the ori, although theyused to be shorter and appear accompanied by someother well-conserved structures with strong dyadsymmetry (the double-stranded origin of replicationor dso, and the single-stranded origin of replicationor sso) (del Solar et al., 1998; Khan, 1997) that werenot observed in pBC1.
It is also worth noting that downstream of thestop codon of the orfX-like gene three IRs werefound, with DG between 4.40 kcal/mol and30.20 kcal/mol, any of which could function as aRho-independent transcription terminator. TheIRs flanking repB and orfX-like genes suggest thereplication region being separated from the rest ofthe plasmid. In this way, the copG-like gene wouldbe situated outside of the replicating block, andmight consist on a remnant from a composite theta-and rolling-circle replicating plasmid, as has beenfound in one plasmid from Bacillus subtilis (Oskmanet al., 1992).
3.8. Functionality of the pBC1 replicon
pBC1-1 was digested with BglII and cloned intothe unique BamHI site of pUC19E. Recombinantplasmids, called pAM1, were recovered in E. coli
and subsequently electroporated into plasmid-freeB. animalis, B. longum, and B. pseudocatenulatum
strains, in which the construct was found to be fullyfunctional. The pUC part of pAM1 was removed by
Fig. 4. Detailed DNA sequence of the ori region of pBC1 and the initial part of its corresponding repB gene. The numbering of thesequence and the position of relevant restriction enzyme sites are also indicated. The presumed start codon (SC) is depicted in bold and thepredicted amino acid sequence of the N-terminal part of RepB is displayed below the DNA sequence. Direct (DR) and inverted (IR)repeats are indicated by coincident and divergent arrows, respectively, and numbered consecutively (except for the IRs within the DRs).The sequence resembling the oriV of lambda phage is double underlined.
172 P. Alvarez-Martın et al. / Plasmid 57 (2007) 165–174
double digestion with EcoRI and HindIII enzymes,of which no sites are found in the pBC1 sequence,filling-in with Klenow enzyme and ligation of theresulting blunt ends with T4 DNA ligase. The newconstruct, pAM2, could be recovered in a B. pseud-ocatenulatum strain, from which it was transferredto all other species. Lysis of the species in similarconditions showed no differences in copy number.Furthermore, around 95–98% of the cells retainedboth constructs in the absence of antibiotic selectionafter approximately 80 generations, showing a rath-er high segregational stability.
3.9. Hybridization of plasmid DNA from different
bifidobacteria species with pBC1
To check how common the replicon of pBC1 wasamong the bifidobacterial plasmids of this work,
plasmid DNA of the six profiles was hybridized usingas a probe an internal segment of the pBC1 repB geneobtained by PCR. As can be seen in Fig. 1B positivehybridization signals were only observed in the twoB. catenulatum isolates (L42 and L48; lanes 1 and2). In this hybridization, theta-replicating and rollingcircle-replicating plasmids from L. lactis and Lacto-
bacillus plantarum strains were introduced as con-trols (lanes 8–11 in Fig. 1A and B).
3.10. pBC1 copy number
The relative copy number of pBC1 was deter-mined on exponentially growing cells by QPCR asstated in the Material and Methods section. A 10-fold serial dilution of total DNA from B. catenula-
tum L48 was used to construct standard curves forboth repB and xfp. Theoretically, for a 10-fold
P. Alvarez-Martın et al. / Plasmid 57 (2007) 165–174 173
dilution in template DNA, a CT value of 3.322cycles should be expected (Lee et al., 2006). Thestandard curves obtained for repB and xfp geneswere linear (R2 > 0.99) in the range tested and theslopes were 3.02 and 3.23, respectively, resulting ina small difference from the theoretical value. Analy-sis of the results revealed that the copy number ofpBC1 was 30.9 ± 4.62.
4. Conclusion
Plasmids of a rather small size were observed inaround 25% of the bifidobacteria isolates. Of these,the complete nucleotide sequence of pBC1 from B.
catenulatum L48 was determined and showed thatthe replicating block was composed of untranslatedsequences (one DR repeated three and a half timesand five IRs) and two genes (repB and orfX-like).The physical structure at the ori flanked by severalIRs suggests the region is well separated from therest of the plasmid. Around 30 copies of pBC1 arepresent per chromosome equivalent in B. catenula-
tum. The pBC1 replicon proved to be functional instrains of dominant bifidobacteria species in thehuman GIT, which will allow the development ofversatile genetic tools for Bifidobacterium. Analysisof the mode of replication of pBC1 is currentlyunderway, as is the dissection of the severalsequences found in its replicon.
Acknowledgments
P. Alvarez-Martın was supported by a contractwith the CSIC under the I3P Program of theEuropean Social Fund. Jose A. Gil, Departmentof Ecology, Genetics, and Microbiology, Universityof Leon, Spain, and Mary O’Connell-Motherway,Department of Microbiology and AlimentaryPharmabiotic Centre, University College Cork,Ireland, are greatly acknowledged for the criticalreading of the manuscript.
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APPLIED GENETICS AND MOLECULAR BIOTECHNOLOGY
Functional analysis of the pBC1 repliconfrom Bifidobacterium catenulatum L48
Pablo Álvarez-Martín & Mary O’Connell-Motherway &
Douwe van Sinderen & Baltasar Mayo
Received: 31 May 2007 /Revised: 6 July 2007 /Accepted: 7 July 2007# Springer-Verlag 2007
Abstract To determine the minimal replicon of pBC1 (a2.5-kb cryptic plasmid of Bifidobacterium catenulatumL48) and to check the functionality of its identified openreading frames (ORFs) and surrounding sequences, differ-ent segments of pBC1 were amplified by polymerase chainreaction (PCR) and cloned into pBif, a replication probevector for bifidobacteria. The largest fragment tested in thismanner encompassed most of the pBC1 sequence, while theshortest just included the repB gene and its immediateupstream sequences. Derivatives were all shown to allowreplication in bifidobacteria. Surprisingly, both the trans-formation frequency and segregational stability in theabsence of antibiotic selection decreased with reducingplasmid length. The relative copy number of the constructs(ranging from around 3 to 23 copies per chromosomeequivalent, as compared to 30 copies for the original pBC1)was shown to be strain dependent and to decrease withreducing plasmid length. These results suggest that,although not essential, the copG-like and orfX-like genesof pBC1 play important roles in pBC1 replication.Interruption of repB produced a construct incapable ofreplicating in bifidobacteria. The analysis of pBC1 willallow its use in the construction of general and specificcloning vectors.
Keywords Plasmid . Bifidobacteria . Probiotics .
Bifidobacterium catenulatum . Cloning vectors
Introduction
Starting soon after birth and during most of their live,bifidobacterial species form some of the most dominantbacterial populations of the human and animal gastroin-testinal tract (GIT; Ventura et al. 2004). These bacteria arethought to contribute to health maintenance via beneficialmetabolic (production of organic acids), protective (inhi-bition or exclusion of harmful bacteria, anti-toxin activity)and trophic (stimulation of the immune system) activities(Guarner and Malagelada 2003). Evidence of thesebeneficial effects is rapidly accumulating, and not surpris-ingly, bifidobacteria are major components of manycommercial probiotic products (Tuohy et al. 2003; Leahayet al. 2005). However, fundamental knowledge is stillscarce relating to the exact mechanisms by whichbifidobacteria contribute to host health and well-being.Such knowledge is essential for any scientific support oftheir purported health benefits and consequent inclusion asprobiotics in functional foods (Kullen and Klaenhammer2000). Basic research on the interactions of bifidobacteriawith the cells of the GIT and other bacteria is also needed(Vaughan et al. 1999). Recently, bifidobacteria have beeninvestigated for novel biotechnological applications, suchas the expression of genes encoding detoxifying activities(cholesterol oxidase, bile salt hydrolase; Rossi et al. 1996a)and tumor-suppressing factors (Li et al. 2003; Xu et al.2007).
Molecular studies of Bifidobacterium strains and theirmodification by genetic engineering rely on the scant
Appl Microbiol BiotechnolDOI 10.1007/s00253-007-1115-5
P. Álvarez-Martín : B. Mayo (*)Departamento de Microbiología y Bioquímica de ProductosLácteos, Instituto de Productos Lácteos de Asturias (CSIC),Carretera de Infiesto s/n,33300 Villaviciosa, Asturias, Spaine-mail: [email protected]
P. Álvarez-Martín :M. O’Connell-Motherway :D. van SinderenAlimentary Pharmabiotic Centre, Department of Microbiology,University College Cork,Cork, Ireland
availability of suitable cloning, expression, and/or integra-tive vectors that permit the efficient transformation,integration, and maintenance of DNA. The genomesequences of Bifidobacterium longum NCC 2705 (Schellet al. 2002), B. longum DJO10A (NZ_AABM00000000),Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 (NC_008618),and B. adolescentis L2–32 (NZ_AXD02000000) haverecently been released, strengthening the need for generaland purpose-specific cloning vectors for retrieving genesand operons for molecular analysis. However, the geneticsof these microbes is poorly understood compared to othersof industrial importance (Ventura et al. 2004)—bifidobacteriaare fastidious, requiring rich media, and strict anaerobicconditions for growth (Scardovi 1986), and are thereforedifficult to study in the laboratory. Further, genetic studieshave been hampered by a lack of appropriate bacterialreplicons (of either plasmid or phage origin). Indeed, thedata available on the phages that infect this genus are scarceand fragmentary (Sgorbati et al. 1983; Ventura et al. 2005).Plasmids seem to be less abundant as compared to otherintestinal species (Sgorbati et al. 1982; Iwata and Morishita1989), although around 17–20 cryptic plasmid moleculeshave now been fully sequenced (reviewed in Álvarez-Martín et al. 2007; Guglielmetti et al. 2007; Sangrador-Vegas et al. 2007) and some Bifidobacterium–Escherichiacoli shuttle vectors have been constructed. None of these,however, has been experimentally dissected, and in only afew has the mode of replication been analyzed (O’Riordanand Fitzgerald 1999; Park et al. 1999; Corneau et al. 2004;Tanaka et al. 2005; Lee and O’Sullivan, 2006). Therefore,basic knowledge of the biology of plasmids in bifidobacteriais still needed for the development of robust and efficientmolecular tools. In particular, translated and untranslatedplasmid sequences involved in structural and segregationalstability need to be identified and characterized.
The aims of the present work were to identify theminimal replicon of plasmid pBC1 of Bifidobacteriumcatenulatum L48 (Álvarez-Martín et al. 2007) and to studythe functionality of the different open reading frames(ORFs) and associated structures in its nucleotide sequenceplus their effect on stability and copy number. Suchknowledge will be very important for the design andconstruction of novel vectors for Bifidobacterium speciesderived from the pBC1 replicon.
Materials and methods
Bacterial strains, plasmids, and growth conditions
Table 1 shows the bacterial strains and plasmids used. B.catenulatum and Bifidobacterium pseudocatenulatum
strains were currently grown in MRS broth (Merck; VWRInternational, Darmstad, Germany) supplemented with0.25% cysteine, while Bifidobacterium breve was usuallygrown in RCM broth (Merck). When required, bacterio-logical agar (Merck) was added to the media at 15 g l−1. Allincubations were performed at 37°C in an anaerobicchamber (Mac500, Down Whitley Scientific, West York-shire, UK; atmosphere: 10% H2, 10% CO2, and 80% N2).E. coli One Shot® chemically competent cells (Invitrogen,Carlsbad, Ca., USA), used as a transformation host forcloning, were cultured at 37°C in Luria Bertani (LB) broth(Sambrook and Russell, 2001) with vigorous shaking.Isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-thiogalactopyranoside (X-gal) wereincorporated into the LB agar at concentrations of 50 μgml−1 and 40 μg ml−1, respectively. Ampicillin, chloram-phenicol, and tetracycline (all from Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA), at 100, 10, and 5 μg ml−1, respectively,were used to select for E. coli transformants; erythromycin(Sigma), chloramphenicol and tetracycline, at 5, 2, and5 μg ml−1, respectively, were used for bifidobacterialselection.
Plasmid isolation and analysis
Plasmid DNA from bifidobacteria was isolated according tothe method of O’Sullivan and Klaenhammer (1993) withthe following modification: pellets were suspended in TSEbuffer (sucrose 25%, 50 mM Tris–HCl pH 8.0, and 10 mMEDTA pH 8.0) and incubated with lysozyme (30 mg ml−1)at 37°C for 30 min. E. coli plasmid DNA was isolatedusing the Jet-Quick Plasmid Miniprep Kit (Genomed,Lohne, Germany) as recommended by the manufacturer.Plasmids were all analyzed by electrophoresis in TBE(89 mM Tris–HCl, 89 mM boric acid, and 2 mM EDTA,pH 8.0) on 0.75–1.2% agarose gels (FMC Bioproducts,Philadelphia, PA, USA), followed by staining withethidium bromide (0.5 μg ml−1).
DNA manipulations and molecular cloning
The general procedures used for DNA manipulation wereessentially those described by Sambrook and Russell(2001). Restriction endonucleases (Fermentas GMBH, St.Leon-Rot, Germany) and T4 DNA ligase (Roche, Mann-heim, Germany) were used according to the manufac-turers’ instructions. The chemical transformation ofplasmid DNA into E. coli was performed as described bySambrook and Russell (2001), and electrotransformation(electroporation) of the plasmid DNA into Bifidobacte-rium performed as described by Rossi et al. (1996b) usinga GenePulser apparatus (Bio-Rad Laboratories, Richmond,Ca., USA).
Appl Microbiol Biotechnol
Construction of pBC1 derivatives
Derivatives of pBC1 (pBC1.2, pBC1.3, pBC1.4, andpBC1.5) were constructed as outlined in Fig. 1. PurifiedDNA from pBC1 was used as a template in PCR reactionsinvolving the Extensor Hi-Fidelity PCR Enzyme Mix(ABgene, Epsom, UK) and the synthetic oligonucleotidepairs shown in Table 1. All oligonucleotides were designedwith a site for the SphI restriction enzyme at their 5′ ends toallow direct cloning of amplicons after digestion with thisenzyme into the unique SphI site of the E. coli replicationprobe vector pBif (Table 1). pBif consists of a pBluescriptII KS vector containing a chloramphenicol resistancecassette from plasmid pC194 (Sangrador-Vegas et al.2007). Ligation mixtures were transferred into E. coli asdescribed above; the selection of recombinant cells harbor-ing pBC1-pBif derivatives was performed by blue-whitescreening on LB agar supplemented with X-gal, IPTG, andchloramphenicol. Derivatives selected in E. coli andverified by sequencing were then electrotransferred into B.breve UCC2003 and B. pseudocatenulatum M115.
Disruption of the repB gene
Two restriction enzymes were found to have unique recogni-tion sites in pBC1within the coding sequence of repB, namelyMluI (at position 1,011) and AarI (at position 1256), while nosuch recognition sites were found in the pUC19E or pBifvectors. The pBC1-pUC19E derivative pAM1 (Álvarez-Martínet al. 2007) was digested with bothMluI and AarI, the resultingfragment ends were filled in with the Klenow fragment ofDNA polymerase I (Roche), and self ligated using T4 DNAligase. Ligation mixtures were electrotransformed into E. coli,in which plasmids were analyzed for loss of theMluI restrictionsite. The expected construct was verified by sequencing andthen used for transformation of B. pseudocatenulatum M115.
Segregational stability of the different constructs
The stability of the constructs was assayed by growing cellsin non-selective media for approximately 100 generations.Cultures were plated on a daily basis onto non-selectiveagar plates, and plasmid maintenance of the resulting
Table 1 Bacterial strains, plasmids and oligonucleotides utilized in this work
Item Relevant genotype or phenotype Source or reference
StrainsEscherichia coli TOP10 F-, mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), F80lacZΔM15, ΔlacX74, recA1, deoR,
araD139, Δ(ara-leu)7697, galU, galK, rspL (Strr), endA1, nupGInvitrogen (La Jolla,Ca., USA)
Bifidobacterium breveUCC2003
Human intestinal plasmid-free strain APC-UniversityCollege Cork
Bifidobacteriumcatenulatum L48
Human intestinal strain, containing pBC1 Álvarez-Martín et al. (2007)
Bifidobacteriumpseudocatenulatum M115
Human intestinal plasmid-free strain IPLA Laboratory Collection
PlasmidpBC1 Cryptic plasmid of 2.5 kbp Álvarez-Martín et al. (2007)pBif Apr, Cmr, 6.5 kbp APC-University College CorkpAM1 pBC1-pUC19E Emr Álvarez-Martín et al. (2007)pAM5 pBC1-pUC19 Tetr [tet(W)] This workpBC1.2 Segment of pBC1 in pBif lacking the putative promoter of copG-like This workpBC1.3 Segment of pBC1 in pBif lacking copG-like This workpBC1.4 Segment of pBC1 in pBif lacking copG-like and an IR after orfX-like This workpBC1.5 Segment of pBC1 in pBif lacking copG-like and orfX-like This workOligonucleotides (5′-3′)pBC1-Ori GTCACTGCATGCCCAGAGTAACACCACGGTCACAC This workpBC1-Orfx1 CGTCATGCATGCCGTCATTGCCCCATCATCTCCTTG This workpBC1-Orfx2 CTGATGGCATGCCACTTGCTACTCCGGCCTTGC This workpBC1-CopG1 CTGACTGCATGCTCGCCGGAGCCGTCTGAC This workpBC1-CopG2 GACTCAGCATGCGTGGAGATGGTCTACGAGCAGCG This workFdxs ACTCATTCCCCCGACTCAGG This workRdxs TCGCGGCATAGCTCATTCAG This workFrepB GCCACGTTCGTCGCCATCCA This workRrepB CCGACCAGCTCTGCCTTTTG This workFxfp GACGTCACCAACAAGCAGTG This workRxfp CTTCCATCTGGTGCTCGGAG This work
Apr , Cmr , Str , and Tetr , resistance to ampicillin, chloramphenicol, streptomycin, and tetracycline, respectively
Appl Microbiol Biotechnol
colonies was monitored by transfer colonies to antibiotic-containing agar plates. Plasmid content was then checkedby electrophoresis of plasmid preparations.
Determination of the relative copy number
The copy number of the pAM5, a pBC1-pUC19E deriva-tive in which the erythromycin resistance gene wassubstituted by a recently described bifidobacterial tet(W)gene (Flórez et al. 2006), and pBC1-pBif derivatives wasassessed by quantitative real-time PCR (QPCR), using theculture and PCR conditions reported by Lee et al. (2006).Amplification and detection were performed in a Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, Ca.,USA) using Power SYBER® Green PCR Master Mix(Applied Biosystems). The FrepB and RrepB primers(Table 1) were designed based on the pBC1 repB sequence(in which their oligonucleotide sequences were 113 bpapart). The 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase (dxs)gene of B. breve UCC2003 was used as the comparatorgene for copy number determination in this bacterium,assuming a copy number of one for this chromosomally
encoded gene. A 119-bp segment of the dxs gene wasamplified with primers Fdxs and Rdxs (Table 1). For B.pseudocatenulatum M115, a segment of 120 bp of thexylulose-5-phophate-fructose-6-phosphate-phosphoketolasegene (xfp) (GenBank Accession No. AY377401), amplifiedwith primers Fxfp and Rxfp (Table 1), was used as thecomparator gene. The relative copy number of the derivativeswas calculated using the formula Nrelative ¼ 1þ Eð ÞΔCT(Leeet al. 2006), where E is the amplification efficiency of thetarget and reference genes, andΔCT is the difference betweenthe threshold cycle number (CT) of the dxs reaction and thatof repB. Experiments were performed in triplicate; meanresults are provided.
Antibiotic resistance of the constructs
The antibiotic resistance of the constructs to chloramphen-icol was measured using the Etest method, according to themanufacturer’s instructions (AB Biodisk, Solna, Sweden).This was performed in LSM medium (90% Isosensitest,10% MRS; both from Oxoid, Oxoid Ltd., Basingstoke,Hampshire, UK; Klare et al. 2005) with cysteine (0.3 g l−1).
a
b
pBif6.5 kb
SphI
SphI
pBC1 fragment
1.5
1.4
1.3
1.2 pBC1-pBif-derived
vectors
pBC1.5
pBC1.4
pBC1.3
pBC1.2Apr
Cmr
pBC1
repB OrfX-like copG-like
IRIR DR
1.2
1.3
1.4
1.5
repB OrfX-like copG-like
IRIR DR
repB OrfX-like
IRIR DR
repB OrfX-like
IR DR
repB
SphI SphI
SphI SphI
SphI SphI
SphI SphI
BglII BglIIFig. 1 a Physical and genetic mapof pBC1 from Bifidobacteriumcatenulatum L48 and the pBC1derivatives utilized in this work.Position of key features of pBC1are indicated. The BglII site wasarbitrarily taken as the numberingstarting point of pBC1 sequence.The SphI sites were introducedwith the oligonucleotide primersused for amplification, as indicatedon ‘Materials and methods.”Arrows denote direction and ap-proximate length of the differentORFs; thought figures are notdrawn to scale. Facing blackarrowheads indicate invertedrepeats (IRs), and arrowheads withthe same orientation indicate directrepeats (DRs). b Diagram showingthe cloning strategy of the pBC1-derived amplicons into thereplication-probe vector pBif
Appl Microbiol Biotechnol
Results
Functionality of the different ORFs of pBC1
To check the functionality of the identified ORFs and someof the surrounding sequences of pBC1, several segments ofthis plasmid were amplified by PCR and cloned into thepBif vector (Fig. 1). pBif is based on the E. coli pUC vectorand does not replicate in bifidobacteria. However, itcontains a chloramphenicol resistance gene allowing selectionto be performed in both Gram-negative and Gram-positiveorganisms, including bifidobacteria (Sangrador-Vegas et al.2007). Constructions were all performed and checked in E.coli, after which each of the construct was introduced into B.breve and B. pseudocatenulatum by electroporation.
The first construct, pBC1.2, harbors the completesequence of the original plasmid, except for some 300nucleotides (nt) around the single BglII site of pBC1, whichis expected to contain the promoter of the copG-like gene.The second construct, pBC1.3, has a deletion of around600 nt as compared to pBC1.2, including the completecopG-like gene. The third construct, pBC1.4, harbors therepB and the orfX-like genes but lacks the inverted repeat(IR) located downstream of the orfX stop codon. Theposition and sequence of this IR suggests that it mayfunction as a Rho-independent transcription terminator.This structure seems to be well conserved in otherbifidobacterial plasmids, such as in plasmid pMB1 fromB. longum (Rossi et al. 1996a; although no function hasbeen attributed to it). Finally, the smallest construct,pBC1.5, only harbors the repB gene and its upstreamsequences, a region rich in secondary structures resemblingthe origin of replication of some theta-replicating plasmids(Álvarez-Martín et al. 2007). To exclude polar effects
influencing copy number or antibiotic resistance, theselected constructs had the same relative orientation respectto the pBif molecule.
The recombinant plasmids pBC1.2, pBC1.3, pBC1.4, andpBC1.5 were then introduced into B. breve UCC2003 and B.pseudocatenulatum M115 by electroporation. In all cases,transformants were obtained, indicating that each of theseconstructs was capable of replication in these two differentbifidobacterial strains. Surprisingly, the transformation fre-quency of the constructs increased with construct length: thelowest transformation efficiency (1.0×101 cfu μg−1) corre-sponded to the pBC1.5 plasmid, which only carries the repBgene, while the highest (1.2×103 cfu μg−1) to pBC1.2, aconstruct carrying an almost complete version of the pBC1molecule (Table 2). The transformation frequency of this lastconstruct was comparable to that of pAM5, 1.6×103 μg−1,which includes the whole pBC1 in a pUC-derived vector.
Disruption of the ORF encoding repB by digestion of thepAM1 with MluI and AarI, filling in with Klenow andligation resulted in a plasmid that did not allow transfor-mation of the bifidobacteial strains used in this study (incontrast to pAM1). This indicates that this pMA1 derivativeis unable to replicate in bifidobacteria, and that a functionalRepB is essential for pBC1 replication.
Plasmid stability
Stability of each construct was analyzed twice and countswere done in duplicate. Average results are presented inFig. 2. In the absence of selective pressure, nearly 100% ofthe cells retain pAM5, which contains the complete pBC1sequence, after 100 generations in the two bifidobacterialstrains. However, notable variability was observed in termsof the segregational stability of the different derivative
Table 2 Plasmid copy number and chloramphenicol resistance level of pBC1-derivatives in Bifidobacterium breve UCC2003 andBifidobacterium pseudocatenulatum M115
pBC1-derived vectors B. breve UCC2003 B. pseudocatenulatum M115
Relative copynumbera
Transformationefficiency (ufc μg-1)b
MIC (μg ml−1) tochloramphenicol
Relativecopy number
MIC (μg ml−1) tochloramphenicol
pAM5(pBC1-pUC19E)
28±2.94 1.6×103 1c 31±4.28 0.75c
pBC1.2 3±0.18 1.2×103 48 23±3.52 24pBC1.3 7±1.56 8.5×102 64 17±5.35 24pBC1.4 8±0.98 2.5×102 48 11±2.17 16pBC1.5 8±0.92 1.0×101 48 5±2.08 16
a The copy number of pBC1 per chromosome equivalent in its original host Bifidobacterium catenulatum L48 was determined to be 30.90±4.62(Álvarez-Martín et al. 2007).b Results are average of three independent transformations. The same tendency was observed for the Bifidobacterium pseudocatenulatum M115,although only one transformation experiment was done (data not shown).c pAM5 harbors a tet(W) gene and, consequently, the minimum inhibitory concentration (MIC) to chloramphenicol of strains carrying this vectoris identical to the plasmid-free strains.
Appl Microbiol Biotechnol
constructs (Fig. 2). In most cases, a particular pBC1-derivative exhibited different segregational stability behav-ior in B. pseudocatenulatum as compared to B. breve, witha higher stability in the latter strain for all constructs duringthe first 60 generations; with the exception of pBC1.2(showing identical stability to that of pAM5 in B.pseudocatenulatum). In general, plasmid length positivelycorrelated with plasmid stability and constructs lacking thecopG-like and/or orfX-like showed decreased stability ascompared to the constructs that did contain these genes.
Relative copy number
The relative copy number of pAM5 and the constructspBC1.2, pBC1.3, pBC1.4, and pBC1.5 was measured usingexponentially growing cells by QPCR as outlined in the“Materials and methods.” A tenfold serial dilution of totalDNA from B. breve UCC2003 and B. pseudocatenulatumM115 was used to determine standard curves for the repB,dxs, and xfp genes. Theoretically, for a tenfold dilution intemplate DNA, a Ct value of 3.322 cycles should beexpected (Lee et al. 2006). The standard curves obtained forrepB, dxs, and xfp genes were linear (R2>0.99) over therange tested; the slopes were 3.67 and 3.76, respectively,slightly higher than their theoretical values.
Table 2 shows the copy number results for B. breve andB. pseudocatenulatum. The copy number of the originalplasmid pBC1 was determined to be around 30±4.62copies per chromosome (Álvarez-Martín et al. 2007), anda similar value was obtained for pAM5 in each of these strains(Table 2). The copy number obtained for the pBC1constructs was strongly reduced in B. breve, while the copynumber in B. pseudocatenulatum was shown to decrease asthe plasmid size decreased. Constructs lacking the copG-likeand orfX-like genes showed the lowest copy numbers (exceptfor the very low value obtained for pBC1.2 in B. breve).
Resistance to chloramphenicol appeared to be correlatedto copy number in B. pseudocatenulatum M115 (Table 2)but not in B. breve UCC2003. In the latter, most pBC1-derivatives conferred a higher chloramphenicol resistancethan in B. pseudocatenulatum; although the copy numberwas significantly lower. Influence of the culture medium ofthe inocula (MRS vs RCM) or differential growth kineticsof the strains may also account for the observed MICdifferences. Nevertheless, the level of resistance allowed forthe efficient selection of the vector in all cases.
Discussion
Genetic engineering projects involving Bifidobacteriumspecies and strains require general and specialized cloningand expression vectors of small molecular size that arestructurally stable, that allow efficient cloning, that permitthe maintenance of homologous and heterologous DNAfragments, and that allow the expression of homologousand heterologous genes. A number of shuttle vectors havealready been constructed, which can replicate in Bifido-bacterium spp. and E. coli (Álvarez-Martín et al. 2007; Leeand O’Sullivan, 2006; Matsumura et al. 1997; Missich et al.1994; Park et al. 1999; Rossi et al. 1996a, 1998). Many ofthese vectors are a result of cloning of complete bifido-bacterial plasmids into an E. coli vector containing anantibiotic selection marker. However, the basic biology ofbifidobacterial plasmids has remained largely unexplored.Furthermore, the functionality of the various ORFs andassociated secondary structures on such plasmids and theirminimal replicon have yet to be determined.
In this work, sequential deletions were used to study thefunctionality of two ORFs (copG-like and orfX-like)present in the pBC1 sequence and associated structuresand to analyze their effect on stability and copy number.
0
20
40
60
80
100
120
20 40 60 80 100
Generations
% a
nti
bio
tic
re
sis
tan
t
co
lon
ies
pBC1.5
pBC1.4
pBC1.3
pBC1.2
pAM5
a b
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pBC1.3
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Fig. 2 Segregational stability of pBC1 derivatives in B. pseudocate-nulatum M115 (a) and in B. breve UCC 2003 (b). Average results oftwo independent experiments for each construct are represented.Strains harboring the different constructs were cultured in the absenceof selective pressure, plated under the same conditions, and assayed
for plasmid maintenance by replica-plating onto antibiotic-containingmedia at, approximately, 20-, 40-, 60-, 80-, and 100-generationintervals. The presence of plasmids was finally checked by gelelectrophoresis of plasmid preparations
Appl Microbiol Biotechnol
Genes homologous to orfX-like genes (and with similarorganization) have been identified in many lactococcaltheta-replicating plasmids downstream of the essential repBgene (Frère et al. 1993; Gravesen et al. 1995; Hayes et al.1991; Sánchez et al. 2000). Although their precise functionremains unclear, some have been shown to participate in theregulation of plasmid copy number, plasmid stability, orboth (Frère et al. 1993; Gravesen et al. 1995; Hayes et al.1991; Sánchez et al. 2000). However, naturally occurringplasmids that carry interrupted orfX genes or even com-pletely lack this ORF, have also been reported, e.g., pWVO2(Kiewiet et al. 1993) and pNZ4000 (involving the genesrepB1 and repB2; van Kranenburg and de Vos 1998).
The deduced product of the copG-like gene of pBC1contains a conserved domain found in proteins of the CopGfamily (Álvarez-Martín et al. 2007). This family of proteins isthought to be involved in the replication of plasmids that makeuse of the RC replicating mechanism (del Solar et al. 1998).For example, the minimal replicon of plasmid pMB02 fromLactococcus lactis subsp. cremoris was shown to includecopG (Sánchez and Mayo 2003), whereas the minimalreplicon of pMB1 from B. longum (Rossi et al. 1996a) andpBM300 from Bacillus megaterium (Kunnimalaiyaan andVary 2005) was reported to include a orfX-like gene. In thelatter two plasmids, constructs lacking either the copG or theorfX-like gene were shown to exhibit decreased stability(Kunnimalaiyaan and Vary, 2005). Still in some others, e.g.,pGA1 and pXZ608, both from Corynebacterium glutamicum(Lei et al. 2002; Nesvera et al. 1997), the minimal replicononly includes the gene encoding their replication protein.
From our results, we conclude that neither the orfX-likenor copG-like genes are essential for the replication ofpBC1, although the observed differences in transformationfrequency, plasmid stability, and copy number indicates thatthey may play important roles in the replication process.Although unlikely, as pUC19E and pBif share an identicalE. coli replicon, the different vectors used to clone thecomplete pBC1 sequence and its deleted derivatives mighthave affected copy number. The maintenance of small,functional, indigenous RC plasmids in Gram-positivebacteria is usually achieved by their having a large copynumber, with no need for dedicated partitioning mecha-nisms (del Solar et al. 1998). Consequently, these twovariables are usually strongly related. Indeed, segregationalinstability has often been observed in plasmids withreplication defects, resulting in a reduction in plasmid copynumber. In pBC1, a clear correlation was observed betweena reduction in copy number and segregational instability,although it was not absolute. The differential behavior ofpBC1.2 and pBC1.3 in stability might additionally be dueto a read through of copG in pBC1.2. Nevertheless, itshould also be noted that pBC1 may be a theta-replicatingplasmid (Álvarez-Martín et al. 2007), and it may therefore
behave differently from RC plasmids (del Solar et al. 1998).Also worth noting is the strong effect that the geneticbackground of the host cell has on stability, copy number,and the antibiotic resistance afforded by the constructs(Fig. 2; Table 2). Genetic background may includeinterference with plasmid-integrated remnants in particularstrains (Schell et al. 2002). However, given the equal stabilityof pAM5 and pBC1.2 and their similar copy number in thetwo Bifidobacterium species, the observed differences in thestability of the smaller constructs must be due to varying host-specific replication interactions within the missing segments.
The functionality of repB was addressed by introducing adeletion into its ORF, which was shown to cause the loss ofreplication ability in bifidobacteria. This is not surprising, asplasmids that replicate by either the RC mechanism or thetheta mode need specific replication proteins to recognize(bind) and cut the double-stranded origin of replication (sdo)for the process to begin (del Solar et al. 1998).
In conclusion, the present results show that the replica-tion of pBC1 relies on a 1.5-kbp segment harboring therepB gene and its putative promoter sequence. Althoughnot essential, the presence of both the orfX-like and copG-like genes and their surrounding sequences profoundlyaffects the transformation efficiency of the constructs, aswell as their copy number and their segregational stability.Whether any of these two genes directly determinesstability or whether this decreased stability is due to other,perhaps structural causes, remains to be determined. Theconstruction of stable, multi-copy number vectors based onthe pBC1 replicon should therefore include all threeidentified genes. However, the reduced copy number ofseveral constructs could be exploited to develop low-copynumber plasmids, best suited for studying and fine-tuningsingle-copy chromosomally encoded genes, as well as theconstruction of unstable vectors, which may be very usefulif final curing of such a plasmid is required.
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Appl Microbiol Biotechnol
Development and use of cloning vectors for bifidobacteria based on the pBC1
replicon from Bifidobacterium catenulatum
Pablo Álvarez-Martín1, Ana Belén Flórez1, Abelardo Margolles1, Gloria del Solar2, and Baltasar Mayo1
Departamento de Microbiología y Bioquímica de Productos Lácteos, Instituto de Productos Lácteos de Asturias (CSIC), 33300-Villaviciosa, Asturias, Spain1, and Departamento de Ciencia de Proteínas, Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC), Ramiro de Maetzu, 9, 28040-Madrid, Spain2
ABSTRACT
This study reports the development of several cloning vectors for bifidobacteria based on the replicon of pBC1, a cryptic plasmid from Bifidobacterium catenulatum L48 thought to replicate via the theta mode. Escherichia coli-Bifidobacterium shuttle vectors and vectors replicating only in bifidobacteria were both constructed. These vectors, in which antibiotic resistance genes encoding either erythromycin or tetracycline resistance acted as selection markers, were able to replicate in a series of eight Bifidobacterium species at frequencies ranging from 4.0x101 to 1.0x105
transformants µg-1, but not in Lactococcus lactis or Lactobacillus casei. They showed a relative copy number of around 30 molecules per chromosome equivalent, and a good segregational stability, with more than 95% of the cells retaining these vectors after 80-100 generations in the absence of selection. The functionality of the vectors for engineering Bifidobacterium strains was assessed by cloning and examining the expression of an α-L-arabinofuranosidase gene belonging to Bifidobacterium longum. Escherichia coli and Bifidobacterium pseudocatenulatum recombinant clones were stable and showed an increase in α-arabinofuranosidase activity of over 100-fold compared to the untransformed hosts.
Bifidobacterium species are among the dominant microbial populations of the gastrointestinal tract (GIT) of humans and other mammals (46), where they are considered to exert many beneficial health effects (for a review see 18) including the establishment of a healthy microbiota in infants, the development of a competent immune system, the production of short chain fatty acids, and the inhibition of pathogens (18, 42). Not surprisingly, bifidobacteria are major components of many commercial probiotic products that have been shown effective in
alleviating constipation, reducing the symptoms of lactose intolerance, enhancing immune functions, reducing cholesterol levels, and in the suppression of tumorigenesis (18, 27).
Unfortunately, our basic knowledge of the mechanisms by which bifidobacteria interact and communicate with other bacteria and host cells remains poor. Such knowledge is essential for the scientific support of their purported health benefits and their rational inclusion as probiotics in functional foods (18), but the study of these organisms’ probiotic properties
and their contribution to host health and well-being has been hampered by a lack of molecular tools (46). In addition, the study of the variables affecting the transformation of plasmid DNA in Bifidobacterium species, and the optimization of the transformation process, have only rarely been addressed (3, 33, 34). Moreover, bifidobacteria belong to the phylum Actinomycetaceae -Gram-positive microorganisms with high G+C contents that have complex nutritional requirements and which are very sensitive to oxygen (38); these characteristics may also have limited the study of their genetics.
Recently, the genome sequences of Bifidobacterium longum NCC 2705 (39), B. longum DJO10A (NZ_AABM00000000), B. adolescentis ATCC 15703 (NC_008618) and B. adolescentis L2–32 (NZ_AXD02000000) have been released, providing a vast array of genetic data which may help us better understand the mode of action behind their probiotic properties (14). However, the genomic data available cannot be fully exploited due to the limitations of our current molecular tools for the analysis of gene function and regulation; new, improved vectors for cloning, integration, knockout and gene expression studies etc. are therefore required. Molecular studies are also required for the future improvement of Bifidobacterium strains by genetic engineering, i.e., the construction of strains with enhanced probiotic characteristics and/or that better retain their viability during storage. Bifidobacteria are also thought to be promising systems for the delivery of therapeutic agents, such as antigens (for live vaccine development) and tumor-suppressing substances (9, 48), and as a means of increasing detoxifying activity (29).
Until recently, only fragmentary information on the bacteriophages infecting Bifidobacterium species was available (41), and only a single prophage-like element has been identified in the genomes of the sequenced strains B. breve UCC 2003 (not yet released), B. longum NCC 2705 and B. longum DJO10A (47). Thus, vectors from bifidobacterial plasmids are required for this genus. Although extrachromosomal elements seem not to be very common among Bifidobacterium strains (40), 14 fully-sequenced plasmids from eight bifidobacterial species are reported in the GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez). Nonetheless, the basic biology of bifidobacterial plasmids remains poorly understood; indeed, in only a few has the mode of replication been analyzed (4, 20, 25, 28, 30). Further, the dissection of the open reading frames (ORFs) and the analysis of untranslated sequences and structures has been undertaken in only a couple of plasmids (2, 5). In spite of this, the reporter vector pMDY23, which carries the gusA gene of E. coli, has been constructed (17), as have the expression vectors pBES2, which has been used to express the α-amylase gene of B. adolescentis in B. longum (31), pBLES100 (23), which has been used in tumor suppressor studies (49) and for the expression of the flagellum protein gene(s) of Salmonella (for mucosal immunization purposes) (43), and pBV22210, which has been used to express and deliver the anti-cancer protein endostatin in cancer gene therapy (48).
The present study reports the further characterization of plasmid pBC1 from B. catenulatum L48 (1, 2) and the construction of a series of E. coli-Bifidobacterium shuttle vectors introduced by electrotransformation into eight different bifidobacterial species.
To check the functionality of these vectors, an α-L-arabinofuranosidase gene from B. longum B667 was cloned and overexpressed in both E. coli and Bifidobacterium strains. MATERIAL AND METHODS
Bacterial strains, plasmids and growth conditions. The bacterial strains and plasmids used in this study are listed in Table 1. Bifidobacterial strains were routinely cultivated under anaerobic conditions at 37ºC in MRS broth (Merck; VWR International, Darmstad, Germany) or in RCM broth (Merck; VWR International, Darmstad, Germany), supplemented with 0.25% (w/v) L-cysteine (MRSC) to maintain a low redox potential in the medium. Escherichia coli strains were grown at 37ºC in Luria Bertani (LB) broth (35) with vigorous shaking.
Antibiotics (supplied by Sigma, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) were added to the appropriate media at the following concentrations: ampicillin 100 µg ml-1, erythromycin 250 µg ml-1 and tetracycline 5 µg ml-1 for E. coli; erythromycin 5 µg ml-1, tetracycline 5 µg ml-1 and chloramphenicol 2 µg ml-1 for bifidobacteria.
DNA isolation and analysis. Plasmid DNA from bifidobacteria was isolated by the method of O’Sullivan and Klaenhammer (26) with the following modification: pellets were suspended in TSE buffer (sucrose 25%, 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0) and incubated with lysozyme (30 mg/ml) at 37ºC for 30 min. Plasmid DNA from E. coli was isolated using the commercial Plasmid Miniprep Kit (Eppendorf AG, Hamburg, Germany), following the manufacturer’s recommendations. Plasmids were analyzed by electrophoresis in TBE (89 mM Tris-HCl, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.0) on 0.75-1.2% agarose gels (FMC Bioproducts, Philadelphia,
PA), and then stained with ethidium bromide (0.5 µg ml-1) and photographed.
Total DNA from the B. longum B667 was prepared according to the procedure of Tanaka et al. (44), and analyzed as above.
DNA manipulation and molecular techniques. The general procedures used for DNA manipulation were essentially those described by Sambrook and Russell (35). Restriction endonucleases and Taq DNA polymerase came from Takara (Takara, Otsu, Shiga, Japan), T4 DNA ligase from Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA), and the Klenow fragment of E. coli polymerase I from Roche (Roche Applied Sciences, Basel, Switzerland). All were used according to the manufacturers’ instructions.
Plasmid transfer. Plasmids were introduced into E. coli DH5α and DH11S electrocompetent cells by electroporation (35) using a Gene-Pulser Apparatus (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) according to the manufacturer’s instructions. Electrocompetent Bifidobacterium cells were prepared as follows: fresh MRSC broth (50 ml) was inoculated with an overnight culture (8% inoculum) of the bifidobacterial strain and incubated at 37ºC for 3-4 h until the culture reached an OD600 nm of 0.5-0.7. The cells were then chilled for 20 min, washed twice in ice-cold sucrose-citrate buffer (0.5 M sucrose, 1 mM ammonium citrate, pH 5.8) and suspended in 100 µl of the same buffer. The cell suspension was stored on ice for 20 min. Electroporation was performed under the following conditions: 25 µF, 200 Ω and 10 kV. The cells were immediately diluted in 950 µl of RCM and incubated for 2.5 h before plating onto the same agarified medium with the appropriate antibiotic. Plates were incubated for 2-3 days at 37ºC under anaerobic conditions.
Detection of ssDNA intermediates by hybridization. Total DNA from Bifidobacterium and E. coli cells grown in the presence or absence of chloramphenicol and rifampicin was isolated essentially as described by te Riele et al. (45). The DNA was electrophoresed in a 0.7% agarose gel, and transferred under denaturing and non-denaturing conditions to Hybond-N nylon membranes (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden). ssDNA intermediates were detected by hybridization using pBM02-derived and pBC1-derived DNA probes internally labeled with [α-32P]dCTP (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).
Segregation stability of vectors in bifidobacteria. The stability of the constructs was assayed by growing the cells in non-selective media for approximately 100 generations and plating daily onto non-selective agar plates. Plasmid maintenance of the resulting colonies was monitored by transference to antibiotic-containing agar plates. Finally, the plasmid content was monitored by plasmid isolation and electrophoresis as above.
Antibiotic resistance of the vectors. The minimum inhibitory concentration (MIC) of erythromycin and tetracycline supported by the constructs in different hosts was measured by the Etest method, according to the manufacturer’s instructions (AB Biodisk, Solna, Sweden). MIC assays were performed in LSM medium (90% Isosensitest, 10% MRS; both from Oxoid, Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, UK) with cysteine (0.3 g l−1) as previously reported (16).
Determination of the relative plasmid copy number. The relative copy number of the pBC1-derived vectors was assessed by quantitative real-time PCR (QPCR), using the culture and PCR conditions reported by Lee et al. (19). Amplification and
detection were performed in a Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA) using Power SYBER® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). The FrepB and RrepB primers (Table 1) were designed based on the pBC1 repB sequence (in which their oligonucleotide sequences were 113 bp apart). The xylulose-5-phosphate-fructose-6-phosphate-phosphoketolase gene (xfp) (GenBank Accession No. AY377401) of B. pseudocatenulatum M115 was used as the single-copy reference gene. A 120 bp segment of the xfp gene was amplified with primers Fxfp and Rxfp (Table 1). The relative copy number of the derivatives was calculated using the formula Nrelativa=(1+E)-∆CT (19), where E is the amplification efficiency of the target and reference genes, and ∆CT is the difference between the threshold cycle number (CT) of the xfp reaction and that of repB. Experiments were performed in triplicate; mean results are provided.
Cloning and expression of an α-L-arabinofuranosidase gene from B. longum. The α-L-arabinofuranosidase gene (abfB) in the B. longum B667 strain has been characterized by Margolles and de los Reyes-Gavilán (22). Amplification of the abfB gene was accomplished with primers abfBF and abfBR, in which SphI and PstI sites were inserted, using genomic DNA from B. longum B667 as a template. The PCR product was purified using the GFX PCR DNA and Gel Band Purification kit (GE Healthcare Biosciences), digested with SphI and PstI, cloned into pAM1 digested with these two enzymes, and ligated overnight at 12ºC. The ligation mixture was electrotransfomed into E. coli DH11S, in which the construct (pAM-abfB) was obtained (it proved to be not viable in E. coli TOP10) and verified by the use of restriction enzymes and sequencing. pAM-abfB was then
transferred by electroporation into B. pseudocatenulatum M115 cells.
Determination of α-L-arabinofuranosidase activity. α-L-arabinofuranosidase activity in the cloning hosts and recombinant cells was determined according to Gueimonde et
al. (10). Briefly, pellets were suspended in 2 ml of potassium phosphate buffer (pH 6.8) and the cells disrupted with a Cell Disruptor (Constant Systems Ltd., Daventry, Northants, UK). Activity was measured in triplicate using independent cell-free extracts.
Table 1.- Bacterial strains, plasmids and oligonucleotide primers utilized in this work.
RESULTS
Construction of vectors based on the pBC1 replicon. Soon after sequencing, pBC1 was digested with BglII, for which a single site at position 1 is present, and cloned entirely in pUC19E (1), a pUC derivative with a functional erythromycin resistance gene active in Gram-positive organisms (Leenhouts et al., 1991). This allowed its selection in bifidobacteria (Fig. 1). The construct, named pAM1, replicated
in both E. coli and B. pseudocatenulatum M115. In order to exclude the pUC part as responsible for driving the replication of the construct in this latter species, pAM1 was double digested with EcoRI and HindIII. Blunt ends were generated with the Klenow fragment of E. coli polymerase, ligated, and the mixture electroporated into B. pseudocatenulatum M115.
pAM23.6 kpb
repB
orfX-like
copG-like
Emr
SacIKpnISalIXbaISalIPstISphI
DigestionBamHI
DigestionBglII
Digestion EcoRI+HindIIITreatment with Klenow
Ligation
DigestionSacI
Partial SalI digestionLigation
tet(W) SacISacI
repB
BglII
orfX-like
copG-like
pBC12.5 kpb
Ligation
Ligation
DigestionSacI
pAM1
repB
orfX-like
copG-like
Emr
XbaISalIPstISphIHindIII
EcoRISacIKpnISalI
6.1 kpb
ori pUC
Apr
pAM38.6 kpb
repBorfX-like
copG-like
Emr
tet(W)
KpnISalI
EcoRI
XbaISalIPstISphI
HindIIISalI
ori pUC
Apr
pAM47.6 kpb
tet(W)
repB
orfX-like copG-like
EcoRI
KpnISalI
XbaISalIPstISphI
HindIII
ori pUC
Apr
EcoRISacIKpnISalI
BamHIXbaISalIPstISphIHindIII
pUC19EApr
Emr
3.7 kpb
ori pUC
pAM23.6 kpb
repB
orfX-like
copG-like
Emr
SacIKpnISalIXbaISalIPstISphI
DigestionBamHI
DigestionBglII
Digestion EcoRI+HindIIITreatment with Klenow
Ligation
DigestionSacI
Partial SalI digestionLigation
tet(W) SacISacI
repB
BglII
orfX-like
copG-like
pBC12.5 kpb
LigationLigation
Ligation
DigestionSacI
pAM1
repB
orfX-like
copG-like
Emr
XbaISalIPstISphIHindIII
EcoRISacIKpnISalI
6.1 kpb
ori pUC
Apr
pAM38.6 kpb
repBorfX-like
copG-like
Emr
tet(W)
KpnISalI
EcoRI
XbaISalIPstISphI
HindIIISalI
ori pUC
Apr
pAM47.6 kpb
tet(W)
repB
orfX-like copG-like
EcoRI
KpnISalI
XbaISalIPstISphI
HindIII
ori pUC
Apr
EcoRISacIKpnISalI
BamHIXbaISalIPstISphIHindIII
pUC19EApr
Emr
3.7 kpb
ori pUC
Figure 1. Physical maps of the plasmids utilized and the constructs obtained in this
work from the pBC1 replicon. The color key tracks the origin, length and direction of the open reading frames (ORFs) and other structures, as indicated. Only relevant restriction enzyme sites are indicated. Molecules are proportional but not drawn to scale.
The new construct, named pAM2, was able to replicate in bifidobacteria, demonstrating that the necessary replicating elements were all within the pBC1 DNA. Other constructs were previously developed during the characterization of the pBC1 replicon (1) which can be considered true cloning vectors because they have several unique restriction enzyme sites at non-essential positions in their sequences (Fig. 1), as well as antibiotic resistance genes that allow their selection in bifidobacteria (pAM2) or in both E. coli and bifidobacteria (pAM1). To invest these vectors with more versatility, the heterologous erythromycin resistance gene in pAM1, originally isolated from the Staphylococcus aureus plasmid pE194 (13), was replaced by a recently characterized tet(W) gene identified in an intestinal isolate of B. longum (8). A 2467 bp segment of DNA including the tet(W) gene and its upstream promoter sequences was amplified by PCR with specific primers, into which the SacI sites were incorporated. The tet(W) gene was inserted into the unique SacI site of pAM1. The new construct, pAM3 (Fig. 1), was recovered in E. coli and then transformed into B. pseudocatenulatum. The erythromycin resistance gene of pAM3 was finally removed (to give pAM4, Fig. 1) by partial digestion with SalI, isolation of the right fragment from an agarose gel, intramolecular ligation and electroporation of the ligation mixture into E. coli and B. pseudocatenulatum. Construct host range, antibiotic resistance and stability. To study the host range of the pBC1 derivatives, competent cells belonging to strains of eight different Bifidobacterium species (B. adolescentis, B. animalis, B. breve, B. dentium, B. longum, B. pseudolongum, B. pseudocatenulatum, and B. thermophilum) were
electrotransformed with one µg of a unique DNA sample from the pAM4 construct. Transformants were recovered for all eight species, although the frequencies ranged from 4.0x101 µg-
1 in B. animalis LMG 10508 to 1.0x105 in B. pseudocatenulatum M115. Transformation was found to be strain-dependent rather than species-dependent, as different strains of the same species showed dissimilar transformation frequencies of more than two log10 units (data not shown). Further, the same amount of DNA from pAM2 (lacking the pUC part) was used to transform electrocompetent cells of Lactococcus lactis, Lactobacillus casei, Enterococcus durans and E. coli. No transformants were recovered in any of these species, therefore the pBC1 replicon was assumed incapable of replicating in these bacteria. The MIC resistance values (obtained by the Etest method) for erythromycin and tetracycline conferred upon B. pseudocatenulatum M115 by the vectors were 8-12 µg ml-1 and 48 µg ml-
1 respectively. These values contrast with the high susceptibility shown by the original plasmid-free M115 strain (0.064 and 0.125 µg ml-1 respectively). Constructs pAM2 and pAM4 were both checked for stability under non-selective conditions in B. pseudocatenulatum M115. After five overnight transfers (approximately 80-100 generations), more than 96% and 98% of the colonies retained the pAM2 and pAM4 constructs respectively. Analysis of the intracellular presence of pBC1 ssDNA. Comparisons of pBC1 translated and untranslated sequences with those in databases suggests that pBC1 might replicate by a theta type mechanism, although elements of both the theta and rolling circle (RC) type mechanisms have been reported for pBC1 (1). To gain further insight into its mode of replication, and on the
involvement of the RNA polymerase in this process, the whole pBC1 plasmid and its derivatives pBC1.5 (lacking the putative promoter region of a copG-like gene) and pBC1.2 (lacking both copG-like and orfX-like genes; 1) were analyzed by hybridization using an internal segment of repB from pBC1 (obtained by PCR) as a probe. As a positive control of RC replication (in which ssDNA appears as a replication intermediate), a derivative of plasmid pBM02 from Lactococcus lactis -p210-
(36) was run under the same conditions. The results obtained are presented in Figure 2. Comparison of the hybridization results of gels transferred under denaturing and not-denaturing conditions are shown as supplementary material (Supplement Fig. 1). As expected, ssDNA accumulated in the samples corresponding to p210 treated with both chloramphenicol and rifampicin (Fig. 2, line 8), but no such DNA was seen in samples involving pBC1 or its derivatives.
ssDNA
AM 1 2 3 4 5 6 7 8
N RN N N R R R
1 2 3 4 5 6 7 8
N RN N N R R R
B
10.08.06.05.0
4.0
3.0
2.5
2.0ssDNA
AM 1 2 3 4 5 6 7 8
N RN N N R R R
1 2 3 4 5 6 7 8
N RN N N R R R
B
10.08.06.05.0
4.0
3.0
2.5
2.0
Figure 2.- Hybridization aimed to analyze pBC1 replication intermediates using as probes internal segments of repB genes from pBC1 from B. catenulatum and pBM02 from Lactococcus lactis (positive control for the detection of ssDNA). Panel A. Photography of a ethidium bromide stained gel showing total DNA preparations from B. pseudocatenulatum M115 harboring construct pBC1.2 (8.0 kbp) (lanes 1 and 5); B. pseudocatenulatum M115 carrying construct pBC1.5 (8.7 kbp) (lanes 2 and 6); B. catenulatum L48 containing the original pBC1 plasmid (2.5 kbp) (lanes 3 and 7); E. coli DH5α carrying construct p210 from L. lactis (3.8 kbp) (lanes 4 and 8). M, molecular weight marker (linear DNA). Plasmids were isolated before (N) and after incubation of the cells for one h with rifampicin and chloramphenicol or erythromycin (R). Panel B. Autoradiogram after hybridization of a gel transferred under not-denaturing conditions (which favors the transference of ssDNA). The position of ssDNA of plasmid p210 from L. lactis in the sample treated with rifampicin and chloramphenicol (lane 8) is indicated.
Cloning and expression of a α-L-arabinofuranosidase gene from B. longum. To demonstrate the functionality of pBC1-derived vectors, the abfB gene encoding an α-L-arabinofuranosidase from B. longum B667 (22) was cloned in both B. pseudocatenulatum and E. coli and its expression assessed. The abfB gene from this strain and its regulatory sequences were amplified from purified total DNA of B. longum B667 using two primers with added SphI and PstI sites (Table 1). This allowed directional cloning in pAM1 digested with these two enzymes (Supplement Fig. 2). The construct, pAM-abfB, was obtained in E. coli DH11S and was subjected to restriction enzyme analysis and sequencing before its electrotransformation into B. pseudocatenulatum M115. These two strains might have equivalent genes to abfB, but they show negligible expression (< 0.12 specific activity units [SAU; min-1µg protein-1]). In contrast, in the E. coli and B. pseudocatenulatum clones harboring the abfB gene of B. longum B667, the α-arabinofuranosidase activity ranged from 9.45 to 16.15 SAUs (average 12.95), an increase of more than 100-fold. Moreover, no segregant lost this activity after a week of daily transferring the B. pseudocatenulatum strain to non-selective conditions (25 colonies examined). The construct was therefore considered stable in this host. DISCUSSION The lack of suitable tools for use in cloning, integration, gene expression analysis and gene disruption etc. in bifidobacteria is delaying the analysis of their gene-related functions and the molecular mechanisms underlying their probiotic properties – and such tools will be necessary if we are to exploit the potential of the vast array of data
provided by genome sequencing projects. In this work, the entire pBC1 plasmid identified in B. catenulatum L48 (1) was used for the construction of E. coli-Bifidobacterium shuttle vectors and vectors that only replicate in bifidobacteria. The use of the whole plasmid was based on the observation that, although repB is the only gene considered essential for pBC1 replication, orfX-like and copG-like genes influence the stability and copy number of the constructs in at least some strains (1, 2). At present, several Bifidobacterium-E. coli shuttle vectors have been constructed that exploit cryptic plasmids in a procedure similar to that followed in this study. These included, among others, general E. coli-Bifidobacterium shuttle vectors (1, 5, 17, 20, 23, 24, 28, 32, 34), replicon screening vectors (11), and expression vectors (37). However, the majority of these are based on poorly characterized replicons since the mode of replication has only been investigated in a small number of plasmids (4, 20, 25, 30). Indeed, apart from pBC1 (2), only the recently reported plasmid pCIBA089 from B. asteroides has been dissected at the molecular level (5). One of the key factors in vector development is the plasmid host range. A broad host range is necessary if genes are to be transferred among different species and genera, but a narrow host range is preferred to ensure the confinement of plasmid-engineered traits (i.e., to prevent the dissemination of genes among competitors and harmful microorganisms inhabiting the same environment [6]). The ability of the pBC1 replicon to replicate in a large number of bifidobacterial species renders pBC1-derivatives easily transferable among species of this genus, in which they were found to show rather high segregation stability. Differences in the transformation efficiency among strains may be a result
of different genetic backgrounds, and may be related to interference with integrated plasmid remnants (e.g., in B. longum NCC 2075) (39) or to the presence of restriction/modification systems (as in B. breve UCC 2003) (D. van Sinderen, personal communication). In fact, the transformation efficiency is better when the DNA of the constructs is isolated from bifidobacteria (1). However, higher transformation frequencies are needed for most genetic purposes, and the improvement of current gene transfer systems or the development of new transformation strategies remains a necessity. The high relative copy number of pBC1 and its derived vectors (around 30 copies per chromosome equivalent) could complement pCIBA089-derivatives (approximately 4 copies per cell) (5), allowing the fine tuning of gene expression through gene dosage. Further, the pBC1 replicon has proven to be non-functional in bacteria other than bifidobacteria, a prerequisite for the future development of food grade vectors involving antibiotic resistance elements for genes encoding essential or easily selectable metabolic functions (6). The number of useful restriction enzymes in the vectors developed in this study are certainly limited (XbaI, SalI, PstI, SphI and HindIII in most of them), but the availability of several complete genome sequences allows the easy cloning of PCR-amplified DNA fragments to which desired restriction enzyme sites can be added. The use of ligase-independent cloning methods, such as the recently developed PCR In-fusionTM technique (Clontech Lab. Inc., Palo Alto, CA) (12), would further allow the cloning of DNA fragments without the need of a large multi-cloning site (MCS). Nevertheless, efforts are being made to incorporate the αlacZ gene and the pUC MCS into pBC1-derived vectors for the more
convenient color screening (blue-white) of recombinant constructs in E. coli. The mode of replication is another key factor since it affects the structural stability, the host range, and the size of the DNA fragments that can successfully be cloned. In general, vectors that follow a theta type replication mechanism are preferred over those replicating by the RC mode; they are usually more stable, accept larger DNA fragments and have a narrower host range (usually species-specific) (7, 15). As mentioned, sequence comparisons and phylogenetic analyses have indicated that pBC1 might replicate via a theta-type mechanism. Based on sequence similarities, this mode of replication has only been suggested for the bifidobacterial plasmids pMB1 (32) and pDOJH10S (20) from B. longum, and more recently for pCIBAO89 and pCIBA43 from B. asteroides (5). The present study provides further indications that pBC1 may use the theta mode of replication since no ssDNA intermediates were detected during plasmid replication. Arabinofuranosidases are involved in the breakdown of many non-digestible (i.e., by humans) dietary carbohydrates by bifidobacteria (22). Therefore, this enzymatic activity is related to the utilization of non-digestible carbohydrates as fermentative prebiotic substrates for bifidobacteria. Engineering of probiotic strains with greater arabinofuranosidase activity might lead to a better competition of probiotic strains in the human GIT ecosystem and/or allow the future use of strain-specific prebiotics. With the pBC1-derived vector the specific activity of this enzyme was increased more than 100-fold, demonstrating the viability of these vectors for cloning and expressing desirable genes, and the feasibility of modifying strains of this
commercially and medically important intestinal organism. ACKNOWLEDGEMENTS This work was partially supported by a project from the Spanish Ministry of Education and Science (Ref. AGL2007-61869-ALI). The B. breve UCC 2003 was provided by Douwe van Sinderen, Department of Microbiology, University College Cork, Cork, Ireland. LMG strains were obtained from the Belgium Co-ordinated Collections of Microorganisms (BCCMTM), Universiteit Gent, Gent, Belgium. REFERENCES 1. Álvarez-Martín, P., A. B. Flórez, and B. Mayo. 2007. Screening for plasmids among human bifidobacteria species: Sequencing and analysis of pBC1 from Bifidobacterium catenulatum L48. Plasmid 57:165-174. 2. Álvarez-Martín, P., A. B. Flórez, and B. Mayo. 2007. Screening for plasmids among human bifidobacteria species: Sequencing and analysis of pBC1 from Bifidobacterium catenulatum L48. Plasmid 57:165-174. 3. Argnani, A., R. J. Leer, N. van Luijk, and P. H. Pouwels. 1996. A convenient and reproducible method to genetically transform bacteria of the genus Bifidobacterium. Microbiology 142:109-114. 4. Corneau, N., E. Emond, and G. LaPointe. 2004. Molecular characterization of three plasmids from Bifidobacterium longum. Plasmid 51:87-100. 5. Cronin, M., M. Knobel, M. O’Connell-Motherway, G. F. Fitzgerald, D. van Sinderen. 2007. Molecular dissection of a bifidobacterial replicon. Appl. Environ. Microbiol. 73:7858-7866. 6. de Vos, W.M. 1999. Safe and sustainable systems for foodgrade
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Supplement Figure 1.- Hybridization experiments aimed to analyze pBC1 replication intermediates using as probes internal segments of repB genes from pBC1 from B. catenulatum and pBM02 from Lactococcus lactis (positive control for the detection of ssDNA) (36). Panels A and C. Ethidium bromide stained gels showing total DNA preparations from B. pseudocatenulatum M115 harboring construct pBC1.2 (8.0 kpb) (lanes 1 and 5); B. pseudocatenulatum M115 carrying construct pBC1.5 (8.7 kpb) (lanes 2 and 6); B. catenulatum L48 containing the original pBC1 plasmid (2.5 kbp) (lanes 3 and 7); E. coli DH5α carrying construct p210 from L. lactis (3.8 kbp) (lanes 4 and 8). M, molecular weight marker. Plasmids were isolated before (N) and after incubation of the cells for one h with rifampicin and chloramphenicol or erythromycin (R). Panel B. Autoradiogram after hybridization of a gel transferred under not-denaturing conditions (which favors the transference of ssDNA). Panel D. Autoradiogram after hybridization of a gel transferred under denaturing conditions. The position of ssDNA of plasmid p210 from L. lactis in the sample treated with rifampicin and chloramphenicol (Panels B and D, lane 8) is indicated.
1 2 3 4 5 6 7 8
N RN N N R R R
A
1 2 3 4 5 6 7 8
N RN N N R R R
C
1 2 3 4 5 6 7 8
N RN N N R R R
B
1 2 3 4 5 6 7 8
N RN N N R R R
D
M
M
ssDNA
ssDNA
10.08.06.05.0
4.0
3.0
2.5
2.0
1.5
10.08.06.05.0
4.0
3.0
2.5
2.0
1.5
1 2 3 4 5 6 7 8
N RN N N R R R
A
1 2 3 4 5 6 7 8
N RN N N R R RN RN N N R R R
C
1 2 3 4 5 6 7 8
N RN N N R R RN RN N N R R R
B
1 2 3 4 5 6 7 8
N RN N N R R RN RN N N R R R
D
M
M
ssDNA
ssDNA
10.08.06.05.0
4.0
3.0
2.5
2.0
1.5
10.08.06.05.0
4.0
3.0
2.5
2.0
1.5
10.08.06.05.0
4.0
3.0
2.5
2.0
1.5
10.08.06.05.0
4.0
3.0
2.5
2.0
1.5
Apr
Emr
repB
orfX-like
copG-like
abfB
pAM-abfB8.4 kpb
EcoRISacIKpnI
pAM1
repB
orfX-like
copG-likeApr
Emr
XbaISalIPstISphIHindIII
EcoRISacIKpnI
6.1 kpb
abfBSphI PstI
2.3 kpb
abfB
PCR amplification
Digestion SphI+PstILigation
XbaISalIPstI
HindIIISphI
ori pUC
ori pUC
Supplement Figure 2. Schematic representation of the amplification of the α-L. arabinofuranosidase gene abfB from B. longum B667 and its cloning in pAM1 to obtain pAM-abfB. Molecules are proportional but not drawn to scale.
Apr
Emr
repB
orfX-like
copG-like
abfB
pAM-abfB8.4 kpb
EcoRISacIKpnI
pAM1
repB
orfX-like
copG-likeApr
Emr
XbaISalIPstISphIHindIII
EcoRISacIKpnI
6.1 kpb
abfBSphI PstI
2.3 kpb
abfB
PCR amplification
Digestion SphI+PstILigation
XbaISalIPstI
HindIIISphI
ori pUC
ori pUC
Supplement Figure 2. Schematic representation of the amplification of the α-L. arabinofuranosidase gene abfB from B. longum B667 and its cloning in pAM1 to obtain pAM-abfB. Molecules are proportional but not drawn to scale.
