Desarrollo de OGMs: Biotecnología moderna y nuevas aplicaciones€¦ · Según el Convenio sobre...

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Desarrollo de OGMs: Biotecnología moderna y nuevas aplicaciones Dra. Laura Esther Tovar Castillo. Directora Técnica de Información y Fomento a la Investigación. Secretaría Ejecutiva CIBIOGEM. CONACYT

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Desarrollo de OGMs:

Biotecnología moderna y nuevas aplicaciones

Dra. Laura Esther Tovar Castillo.

Directora Técnica de Información y Fomento a la Investigación.

Secretaría Ejecutiva – CIBIOGEM.

CONACYT

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Organismo Genéticamente Modificado:

Cualquier organismo vivo que ha adquirido unacombinación genética novedosa, generada através del uso específico de técnicas de labiotecnología moderna.

Cultivos GM

(LBOGMs Artículo 3, fracción XXI)

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Según el Convenio sobre Diversidad Biológica:

Biotecnología puede definirse como "toda aplicación tecnológica que

utilice sistemas biológicos y organismos vivos o sus derivados para lacreación o modificación de productos o procesos para usos específicos".

Industria Alimentaria

Medicina y Farmacéutica

Aplicaciones Diagnósticas

Biotecnología Ambiental

Tratamiento de aguas y biorremediación

BiocombustiblesBiofertilizantes

Agrobiotecnología

Mejora de cultivos y selección de

nuevas variedades.

Ingeniería Genética

Aprovechando el conocimiento

en Biología Molecular.

BIOTECNOLOGÍA

(CBD, 1992)

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19801960 1970 1990 2000 20101950

1961Mejoramiento genético

Norman Borlaug

[Premio Nobel 1970]

1953 Estructura del ADNWatson-Crick

Wilkinson-Franklin

1976-77 Secuencia ADNSanger/Maxam-Gilbert

1982Vacunas Recombinantes

1978 Interacción Agrobacterium-PlantaSchell-Van Montagu

2002 Salmón de rápido crecimiento

1980 Ratones GM

1985Cerdos GM

1988Maíz resistente a plagas

1994Jitomate FlavrSavr

Aprobado por FDA

1999 Arroz vitaminado

1996 Algodón y Soya

(Aprobación USDA y FDA)

1995 Papa contra plagas

(Aprobación EPA)

2003 GlowFish

1985-86 Tabaco GM

Primer vegetal transgénico

Desarrollo de la Biotecnología Moderna

1972ADN RecombinanteBoyer-Cohen

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BIOTECNOLOGÍA MODERNA

(Protocolo Cartagena, 2000; LBOGMs 3, VI)

Por “biotecnología moderna” se entiende la

aplicación de:a.Técnicas in vitro de ácido nucléico, incluidos el

ácido desoxirribonucleico (ADN) recombinante y la

inyección directa de ácido nucléico en células u orgánulos,

o

b.La fusión de células más allá de la familia

taxonómica,

que superan las barreras fisiológicas naturales

de reproducción o de la recombinación y que

no son técnicas utilizadas en la reproducción y

la selección tradicional.

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Ciencias Genómicas e Información

Biológica

Respeto y Sustentabilidad del Medio Ambiente y

la Biodiversidad

Innovación Tecnológica

Acceso y potenciamiento de

la biodiversidad nacional

Biotecnología Agroecológica en el

campo mexicano

Adaptación. Academia Mexicana de Ciencias (2010) http://www.amc.unam.mx/biotecnologia/comite/tendencias.htm

Provisión de AlimentosProductos y/o materias primas para la industria

Desarrollo de nueva industria soportada en tecnología biológica más limpia

Nuevos Bioprocesos y otras aplicaciones con potencial tecnológico

Metagenómica, Caracterización, Biocatálisis

e Ingeniería Celular

ClasificaciónComparaciónDiagnósticoCertificación

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• El hombre ha

seleccionado y

modificado a las plantas.

• Más de 10,000 años.

• Fomento del avance de

la Ciencia y Tecnología.

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8

¿Reconoces esta raíz?

La influencia de la domesticación

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A través de la selección

artificial:

“favoreciendo la sobrevivencia

y reproducción de individuos

de una especie con rasgos o

atributos de interés, durante

muchos años”, se han

domesticado numerosas

plantas y animales.

La influencia de la domesticación

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Muchas de las variedades agrícolas comestibles más comunes se generaron inicialmente a través de procesos de selección

humana favoreciendo las características deseables:

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Variedades Agrícolas

Algunos resultados de años del trabajo de la humanidad...

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Selección artificial

“La cruza del mejor con

el mejor esperando lo

mejor”

Ingeniería Genética

Reduce costos e

incrementa

rendimientos

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La mutagénesis inducida se utiliza

desde mediados del siglo XX.

• Sustancias químicas o radiaciones.

• Cambios al AZAR.

• Diversas mejoras.

• Aprox. 3088 nuevas variedades

vegetales, 70% área de cultivo.

Cambios semejantes a los que ocurren

naturalmente de manera espontánea.

W. Murcott mandarin (left) and Tango (right).

Photo credit: T. Williams, UC Riverside.

No son considerados

Organismos Genéticamente Modificados (OGMs)

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Mutaciones

• Nucleasas Sitio Dirigidas (SDN)

• Mutagénesis Dirigida por Oligonucleótidos (ODM)

Producen alteraciones

en la secuencia de

nucleótidos de un gen.

• Pérdidas

• Inserciones

• Sustituciones

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La edición de genomas derefiere a un tipo deingeniería genética en elque manipulandirectamente secuencias enel genoma.

A diferencia de las técnicasprevias, esta manipulaciónse dirige a sitiosespecíficos.

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1. Endonucleasas Sitio Dirigidas (SDN) y Tecnología deDedos de Zinc2. Oligonucleotide Directed Mutagenesis (ODM)3. Cisgenesis/Intragenesis4. Metilación de DNA dirigida por RNA (RdDM)5.Reverse breeding & other "negative segregants“(reproducción inversa y otras segregantes negativas)6. Agro-infiltracion7. Injerto sobre Patrón GM

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• Las nucleases de dedos de Zinc son proteínas

quiméricas con un domino de “dedos de Zinc” (reconoce

especificamente 3 pares de bases de la secuencia de

DNA).

•La nucleasa corta la doble hebra de DNA

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• Nucleasas de dedos de zinc (ZFN)

• Nucleasas tipo activadores de transcripción (TALEN)

• Nucleasas de Secuencias Palindrómicas Repetidas Inversas (CRISPR-Cas)

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Nucleasas tipo activadores

de transcripción (TALEN)

Nucleasas tipo

activadores de

transcripción (TALEN)

son proteínas que se

unen al DNA de manera

secuencia- específica y

se transforman “tijeras de

DNA” al unirse a una

nucleasa de dominio

catalítico FokI SDN.

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Clustered Regularly Interspaced Short

Palindromic Repeats (CRISPR) and CRISPR

associated system (CRISPR-Cas9)

Los CRISPR han sido encontrados en el 40% de las

eubacterias y 90% de las arqueas secuenciadas.

Es un “sistema inmune” de las bacterias para

defenderlas del ataque de bacteriófagos

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Especificidad del sistema CRISPR / CAS9

El sistema CRISPR se compone de dos partes

1) Un componente protéico CAS9 con actividad de nucleasa

2) Un RNA guía que brinda especificidad al sistema

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USO DE CRISPR / CAS9

Al igual que en los sistemas anteriores la edición con CRISPR puede emplearse para generar mutaciones puntuales, deleciones o inserciones cortas

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• Uso de oligonucleotidos, los cuales

comparten homología con la secunecia blanco

(target) con excepción de los nucleotidos que

serán modificados.

• Oligonucleotidos “target” con secuencia

homologa en el genoma

• Crea uno o más pares de base de mismatch

que corresponde a los nucleotidos no

complementarios.

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La Cisgénesis es la introducción de genes aislados con

sus promotores nativos de las especies susceptibles

de cruzamiento o de la propia planta de cultivo

En la intragénesis, el ADN insertado puede ser una

combinación nueva de fragmentos de ADN de la

misma especie o de una especie sexualmente

compatible sujeto a recombinación homologa.

Se usa en casos en donde el ADN flanqueante o el

vector no se originan de especies sexualmente

compatibles (Holme et al. 2013).

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Cisgenesis/Intragenesis utilisa la misma base

tecnológica que la transgenesis.

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Holme et al. 2013. Intragenesis and cisgenesis as alternative to transgenic crop development. Plant

Biotechnology Journal. 1-13

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• Inserción de genes que codifican RNAs los cuáles son

homólogos al promotor de las regiones del gen blanco

• La transcripción de los genes dirige al RNAs de doble

cadena, el cual es cortado en pequeños RNAs

• sRNAs inducen la metilación de la región promotora

del gen blanco target lo que lleva al silenciamiento

transcripcional del gen (TGS)

• Los cambios en el patrón de metilación sera heredaro

aún en ausencia del transgene insertado

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Es un mecanismo en el que las moléculas

de doble cadena de ARN (dsRNA) regula

la expresión de los genes.

Silenciamiento

siRNAMolécula de RNA de doble

cadena, que tienen un tamaño

de 21-25 nucleótidos

Producida a partir de un

precursor de RNA que puede

variar de tamaño y origen

miRNAMolécula de RNA de doble

cadena, que tienen un

tamaño de 21-25

nucleótidos

Los precursores de

microARN son transcritos a

partir de genes celulares, tal

y como se producen los

RNAm

piRNA

Mediado por

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A. Cuando un virus RNA

infecta la célula, el RNAi

destruye el RNA viral,

previniendo la formación

de nuevos virus.

B. La síntesis de muchas proteínas es

controlada por genes que codifican

microRNA. Después del

procesamiento el microRNA evita la

traducción del mRNA a proteína.

C. En la investigación, Ias

moléculas de dsRNA son

diseñadas para activar el

complejo RISC para degradar el

mRNA para un gen específico.

Muchos procesos en la

célula usan RNAi

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Reproducción inversa (RB) es una técnica de fitomejoramiento

diseñada para producir directamente líneas parentales para cualquier

planta heterocigótica.

El mejoramiento reverso genera líneas perfectamente

complementarias de parentales homocigotos mediante ingeniería

meiótica.

El método se basa en la reducción de la recombinación genética en el

heterocigoto seleccionado mediante la eliminación del cruzamiento

meiótico. Las esporas femeninas o masculinas obtenidas de tales

plantas contienen combinaciones no recombinantes de los

cromosomas parentales que pueden ser cultivadas in vitro para

generar plantas homocigotas doble haploides (DHS).

A partir de estos DHS, los padres complementarios pueden ser

seleccionados y utilizados para reconstituir el heterocigoto a

perpetuidad.

Dirks et al. 2009

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• El transgene que codifíca para una secuencia

de RNAi es liberado en el explante del material

• La planta transgenica se regenera en cultivo de

tejido

• El silenciamiento de genes dirige a la supresión

meiotica

• Las microsporas haploides son producidas de

de flores de plantas transgenicas.

• Las Microsporas son desarrolladas en plantas

diploides homocigas (tecnología de dobles

haploides)

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Reproducción con línea inductora transgénica

(“segregantes negativas")

• El transgene codificador de un constructo de

RNAi o una proteína dominante-negativa es

insertado en el genoma de la línea inductora.

• La expresión del transgene permite la inhibición

de la expresión genica o la función de la

proteína.

• El efecto del transgene es usado durante uno o

varios ciclos de reproducción.

• El transgene inductor finalmente es segregado

o eliminado.

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REVERSE BREEDING

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• El injerto en sí es un método de cultivo clásico en el que dos

plantas con diferentes fenotipos se combinan físicamente

adjuntándose.

• Cuando se toma la parte inferior, el patrón, de una planta

transgénica y la parte superior, el vástago, de una planta

convencional, las hojas resultantes, tallos, semillas y frutos no

llevan el ADN transgénico.

• Como un ejemplo, este método puede ser utilizado para la

expresión de ARN de interferencia (o RdDM) en el patrón; estos

son sistémicamente transportados y puede llevar al

silenciamiento transitorio o heredable de los genes en el

vástago.

• Las semillas resultantes, frutas o descendencia de un vástago

no contienen ADN de origen transgénico, mientras que la

regeneración de brotes adventicios a partir de callos o

portainjerto puede llevar ADN transgénico.

Stegemann y Bock, 2009; Nagel et al, 2010;. Lusser et al., 2011

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ADN

ARN

ARNmi

Proteína

Una planta quimérica se produce mediante el

injerto de un vástago no genéticamente

modificado en un patrón modificado

genéticamente.

En consecuencia, los frutos de la planta no

contienen la secuencia de ADN insertada.

El patrón puede ser modificado para mejorar su

capacidad de enraizamiento o resistencia a

las enfermedades transmitidas por el suelo,

resultando en un aumento sustancial en el

rendimiento de los componentes

cosechables.

El patrón también puede ser modificado para

obtener el silenciamiento de genes a través

de la técnica de ARN interferencia (ARNi). En

las plantas injertadas, los ARN pequeños

pueden moverse a través del injerto de modo

que la señal de silenciamiento puede afectar

a la expresión génica en el vástago.

Raíz GM

Injerto No GM

Fuente: Lusser et al 2012

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• La expresión transitoria de genes en plantas implica la

expresión de proteínas recombinantes sin necesidad de

transformación del material genético de la planta.

• El ADN recombinante no se inserta en el genoma, sino

que mediante distintos métodos se consigue producir

grandes cantidades de ARN mensajero, que se traduce

a proteínas en el citoplasma de parte de las células de

la planta.

• Una vez que el mensajero es traducido a proteínas la

planta lo degrada, no se transmite a la descendencia.

http://icono.fecyt.es/informesypublicaciones/Documents/2005-

Plantas%20biofactor%C3%ADa_d.pdf

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La expresión transitoria de genes generalmente se utiliza para evaluar la

funcionalidad de las construcciones que se usan para transformar plantas de

manera estable, y para evaluar la calidad del producto que se obtiene.

También es posible la expresión transitoria en plastos.

Ventajas de la expresión transitoria

• Expresión rápida y flexible• No está influida por efectos de posición• Puede producirse en plantas adultas, previniendo cualquier

efecto negativo que la proteína recombinante pudiese tener en el desarrollo de la planta

• No es una modificación genética permanente, lo que desde el punto de vista de la seguridad es una ventaja

• Ideal para obtener pequeñas cantidades de proteínas “a medida” en pocas semanas

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Agroinfeccion

• Infiltración con

suspención de

Agrobacterium sp.

Conteniendo el gen de

interés insertado en un

vector viral de tamano

completo

• Facilita la

diseminación y

expresión del gen

blanco en la planta

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Floral dip

• Transformación

de gametocitos

femeninos

• Se obtienen

semillas GM

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(Lusser M, 2012)

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(Lusser M, 2012)

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(Lusser M, 2012)

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Dra. Laura Esther Tovar Castillo

Secretaría Ejecutiva-CIBIOGEM

Tel. 55756878

e-mail: [email protected]