Desarrollo de OGMs:

Biotecnología moderna y nuevas aplicaciones

Dra. Laura Esther Tovar Castillo.

Directora Técnica de Información y Fomento a la Investigación.

Secretaría Ejecutiva – CIBIOGEM.

CONACYT

Organismo Genéticamente Modificado:

Cualquier organismo vivo que ha adquirido unacombinación genética novedosa, generada através del uso específico de técnicas de labiotecnología moderna.

Cultivos GM

(LBOGMs Artículo 3, fracción XXI)

Según el Convenio sobre Diversidad Biológica:

Biotecnología puede definirse como "toda aplicación tecnológica que

utilice sistemas biológicos y organismos vivos o sus derivados para lacreación o modificación de productos o procesos para usos específicos".

Industria Alimentaria

Medicina y Farmacéutica

Aplicaciones Diagnósticas

Biotecnología Ambiental

Tratamiento de aguas y biorremediación

BiocombustiblesBiofertilizantes

Agrobiotecnología

Mejora de cultivos y selección de

nuevas variedades.

Ingeniería Genética

Aprovechando el conocimiento

en Biología Molecular.

BIOTECNOLOGÍA

(CBD, 1992)

19801960 1970 1990 2000 20101950

1961Mejoramiento genético

Norman Borlaug

[Premio Nobel 1970]

1953 Estructura del ADNWatson-Crick

Wilkinson-Franklin

1976-77 Secuencia ADNSanger/Maxam-Gilbert

1982Vacunas Recombinantes

1978 Interacción Agrobacterium-PlantaSchell-Van Montagu

2002 Salmón de rápido crecimiento

1980 Ratones GM

1985Cerdos GM

1988Maíz resistente a plagas

1994Jitomate FlavrSavr

Aprobado por FDA

1999 Arroz vitaminado

1996 Algodón y Soya

(Aprobación USDA y FDA)

1995 Papa contra plagas

(Aprobación EPA)

2003 GlowFish

1985-86 Tabaco GM

Primer vegetal transgénico

Desarrollo de la Biotecnología Moderna

1972ADN RecombinanteBoyer-Cohen

BIOTECNOLOGÍA MODERNA

(Protocolo Cartagena, 2000; LBOGMs 3, VI)

Por “biotecnología moderna” se entiende la

aplicación de:a.Técnicas in vitro de ácido nucléico, incluidos el

ácido desoxirribonucleico (ADN) recombinante y la

inyección directa de ácido nucléico en células u orgánulos,

o

b.La fusión de células más allá de la familia

taxonómica,

que superan las barreras fisiológicas naturales

de reproducción o de la recombinación y que

no son técnicas utilizadas en la reproducción y

la selección tradicional.

Ciencias Genómicas e Información

Biológica

Respeto y Sustentabilidad del Medio Ambiente y

la Biodiversidad

Innovación Tecnológica

Acceso y potenciamiento de

la biodiversidad nacional

Biotecnología Agroecológica en el

campo mexicano

Adaptación. Academia Mexicana de Ciencias (2010) http://www.amc.unam.mx/biotecnologia/comite/tendencias.htm

Provisión de AlimentosProductos y/o materias primas para la industria

Desarrollo de nueva industria soportada en tecnología biológica más limpia

Nuevos Bioprocesos y otras aplicaciones con potencial tecnológico

Metagenómica, Caracterización, Biocatálisis

e Ingeniería Celular

ClasificaciónComparaciónDiagnósticoCertificación

Mejoramiento Genético

• El hombre ha

seleccionado y

modificado a las plantas.

• Más de 10,000 años.

• Fomento del avance de

la Ciencia y Tecnología.

8

¿Reconoces esta raíz?

La influencia de la domesticación

9

A través de la selección

artificial:

“favoreciendo la sobrevivencia

y reproducción de individuos

de una especie con rasgos o

atributos de interés, durante

muchos años”, se han

domesticado numerosas

plantas y animales.

La influencia de la domesticación

Muchas de las variedades agrícolas comestibles más comunes se generaron inicialmente a través de procesos de selección

humana favoreciendo las características deseables:

Variedades Agrícolas

Algunos resultados de años del trabajo de la humanidad...

Selección artificial

“La cruza del mejor con

el mejor esperando lo

mejor”

Ingeniería Genética

Selección de

características

especificas aun fuera de

la población

Mejoramiento Genético

La mutagénesis inducida se utiliza

desde mediados del siglo XX.

• Sustancias químicas o radiaciones.

• Cambios al AZAR.

• Diversas mejoras.

• Aprox. 3088 nuevas variedades

vegetales, 70% área de cultivo.

Cambios semejantes a los que ocurren

naturalmente de manera espontánea.

Mutaciones Inducidas

W. Murcott mandarin (left) and Tango (right).

Photo credit: T. Williams, UC Riverside.

No son considerados

Organismos Genéticamente Modificados (OGMs)

OVM: organismo vivo modificado (= OGM)

Cualquier organismo vivo que posea una

combinación nueva de material genético que

se haya obtenido mediante la aplicación de labiotecnología moderna*

Protocolo Cartagena, 2000; LBOGM 2005

Cultivos GM

¿Qué es un gene?

GENOMA: Material genético de un organismo.

Esta en TODAS las células

Gene:

Contiene la información de un organismo y es capaz pasar sus rasgos genéticos a la siguiente generación

Región del genoma que corresponde a una unidad hereditaria asociada a regiones reguladoras

Región transcribible que codifica para un producto difusible ya sea una proteína o un RNA

¿Cómo se expresa un gene?

DNA RNA Proteína

TraducciónTranscripción

Código para llegar a las

proteínas

DNA

RNAm

Promotor

Gene

Terminador

Transcripción

Expresión Genética:

Del DNA a la Proteína

Estructura General de un Gene

Traducción

Proteína

Quienes tienen DNA

Los genes codifican para diferentes proteínas .

Quiero C EO M R algo

C EO S R

C EO C R

C RO R E R

Cambia el sentido de la oración!

Cambios en la secuencia genómica de una especie (mutaciones,

inserciones, deleciones y número de copia) se reflejan en las

características visibles (fenotipo) de los individuos que la conforman.

Estos polimorfismos permiten entender la variación genética entre individuos.

Identificar genes que confieran las características deseadas y se

integran al DNA en la bacteria, eventualmente éstas características

podrán ser transferidas a la planta…

Producción de Vitaminas

Tolerancia a sequía

Mejor absorción de

nutrientes

GA T G A CT A CT

Resistencia a plagas

Como se genera un OGM

Métodos de introducción de DNA a una célula

Electroporación

Por choque eléctrico, apertura de poros en membrana celular y se introduce DNA

Gene gun (biobalística)

Partículas de oro o tungsteno, recubiertas de DNA y disparadas a embriones o células jóvenes

Transformación con bacterias

Algunas bacterias pueden introducir DNA a plantas en proceso de infección

Métodos de Transformación Genética Convencional

Transformación mediada por Agrobacterium sp. Transformación por Biobalística

Schell, Chilton, Van Montagu, Fraley, y Horsch, 1983. Sanford, 1986.

Transformación por agrobacterium

Utilizando esta estrategia, el (los) gen(es) deseado(s) se inserta(n) en el

Genoma de las células de la planta que han sido infectada con la bacteria

modificada.

Como se genera un OGM

A) Pequeñas partículas de oro o tungsteno se recubren del ADN que contiene las características deseadas.

B) Estas partículas se “disparan” a gran velocidad sobre las células a modificar.

D) Las células modificadas sepropagan, se seleccionan, y sehacen crecer hasta formar unanueva plántula.

C) El DNA externo penetra el genoma de las células, y

De esta forma el ADN se incorpora al genomade la planta que ahora esta genéticamentemodificada pues contiene la secuencia externade DNA que codifica para las nuevascaracterísticas.

Transformación por Biobalística

Sanford, 1986.

Laboratorio

Modificado de Raymond Layton, Ph.D.

Invernadero Cultivo ComercialPruebas de

campo

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Primeros Organismos Modificados

Bacterias recombinantes productoras de Somatostatina[péptido neurotransmisor de 14 aminoácidos] (1976)

PRODUCTOS RECOMBINANTES

UTILIDAD

Insulina Humana Diabetes

Interferón (a, b) Leucemia, Cáncer

Hormona del Crecimiento Enanismo

Eritropoyetina Anemia y Fallas Renales

Interleucina-2 Inmunoterapia

Lipasas Detergentes

Vacuna Hepatitis B Programas Salud Humana

Vacuna Poliomielitis Programas Salud Humana

Anticuerpos Pruebas Diagnósticas

Resis

tencia

a P

lagas

Tolerancia a herbicidas

OGMs de 1era Generación

Incremento de la Productividad debido al

mejoramiento de las características

agronómicas del cultivo.

OGMs de 2nda Generación

Tolerancia a condiciones adversas:

• Sequía

• Heladas

• Suelos salinos

OGMs de 3era Generación

Oleaginosas con contenidos grasos

de mejor calidad (Omega-3)

Vegetales (biofortificados) con mayor

contenido de aminoácidos esenciales,

minerales, vitaminas o modificados para

la mejor absorción de

nutrientes.

IRRM, 2009

CIAT, 2009

OGMs de 4ta Generación

Acercamiento a la Bioseguridad y a la Biotecnología

Vacunas recombinantes

Peces de Ornato

Ganado para la Producción de leche maternizada

Modelos de investigación

Enviro-pig

Productos lácteos biofortificados

Peces de crecimiento rápido

Mosquitos modificados para controlar enfermedades de relevancia epidemiológica

OTROS TIPOS DE OGMs…

El Protocolo de Cartagena sobre Seguridad de laBiotecnología del Convenio sobre la Diversidad

Biológica (2000) define a la biotecnologíamoderna como la aplicación de:

a)Técnicas in vitro de ácido nucléico, incluidos el ácidodesoxirribonucleico (ADN)recombinante y la inyección directa deácido nucléico en células u orgánulos, o

b) La fusión de células más allá de la familia taxonómica,

que superan las barreras fisiológicas naturales de la reproduccióno de la recombinación y que no son técnicas utilizadas en lareproducción y selección tradicional.

BIOTECNOLOGÍA MODERNA

(PCB, 2000)

¿Qué es la edición de genomas?

La edición de genomas derefiere a un tipo deingeniería genética en elque manipulandirectamente secuencias enel genoma.

A diferencia de las técnicasprevias, esta manipulaciónse dirige a sitiosespecíficos.

Mutaciones

• Nucleasas Sitio Dirigidas (SDN)

• Mutagénesis Dirigida por Oligonucleótidos (ODM)

Nuevas Técnicas de Mejoramiento Genético

Producen alteraciones

en la secuencia de

nucleótidos de un gen.

• Pérdidas

• Inserciones

• Sustituciones

Nuevas técnicas de mejoramiento de Plantas.New Plant Breeding Techniques (NPBT)

1. Endonucleasas Sitio Dirigidas (SDN) y Tecnología deDedos de Zinc2. Oligonucleotide Directed Mutagenesis (ODM)3. Cisgenesis/Intragenesis4. Metilación de DNA dirigida por RNA (RdDM)5.Reverse breeding & other "negative segregants“(reproducción inversa y otras segregantes negativas)6. Agro-infiltracion7. Injerto sobre Patrón GM

1. Endonucleasas Sitio Dirigidas (SDN) y TeCNOLOGÍA DE DEDOS DE ZINC

• Las nucleases de dedos de Zinc son proteínas

quiméricas con un domino de “dedos de Zinc” (reconoce

especificamente 3 pares de bases de la secuencia de

DNA).

•La nucleasa corta la doble hebra de DNA

Nucleasas de dedos de zinc (ZFN)

Nucleasas tipo activadores de transcripción (TALEN)

Nucleasas de Secuencias Palindrómicas Repetidas

Inversas (CRISPR-Cas)

Especificidad del sistema CRISPR / CAS9

El sistema CRISPR se compone de dos partes

1) Un componente protéico CAS9 con actividad de nucleasa

2) Un RNA guía que brinda especificidad al sistema

2. OLIGONUCLEOTIDE DIRECTED MUTAGENESIS

• Uso de oligonucleotidos, los cuales

comparten homología con la secuencia blanco

(target) con excepción de los nucleotidos que

serán modificados.

• Oligonucleotidos “target” con secuencia

homologa en el genoma

• Crea uno o más pares de base de mismatch

que corresponde a los nucleotidos no

complementarios.

3. Cisgénesis/Intragénesis (genes/ADNc de especies sexualmente compatibles.

La Cisgénesis es la introducción de genes aislados con

sus promotores nativos de las especies susceptibles

de cruzamiento o de la propia planta de cultivo

En la intragénesis, el ADN insertado puede ser una

combinación nueva de fragmentos de ADN de la

misma especie o de una especie sexualmente

compatible sujeto a recombinación homologa.

Se usa en casos en donde el ADN flanqueante o el

vector no se originan de especies sexualmente

compatibles (Holme et al. 2013).

4. Metilación de DNA dirigida por RNA (miRNA, RNAi y horquilla de RNA para inducir metilación de DNA)”. (RdDM)

• Inserción de genes que codifican RNAs los cuáles son

homólogos al promotor de las regiones del gen blanco

• La transcripción de los genes dirige al RNAs de doble

cadena, el cual es cortado en pequeños RNAs

• sRNAs inducen la metilación de la región promotora

del gen blanco target lo que lleva al silenciamiento

transcripcional del gen (TGS)

• Los cambios en el patrón de metilación sera heredaro

aún en ausencia del transgene insertado

Reproducción inversa (RB) es una técnica de fitomejoramiento

diseñada para producir líneas parentales para cualquier planta

heterocigótica.

• El transgene que codifíca para una secuencia de RNAi es liberado

en el material y la planta transgenica se regenera en cultivo de tejido

• El silenciamiento de genes dirige a la supresión meiotica

• El transgene codificador de un constructo de RNAi o una proteína

dominante-negativa es insertado en el genoma de la línea inductora.

• La expresión del transgene permite la inhibición de la expresión

genica o la función de la proteína.

• El efecto del transgene es usado durante uno o varios ciclos de

reproducción.

• El transgene inductor finalmente es segregado o eliminado.

Dirks et al. 2009

5. REVERSE BREEDING(Reproducción inversa)

6. GRAFTING ON GM ROOTSTOCK (injerto sobre

patrón GM)

• El injerto en sí es un método de cultivo clásico en el que dos

plantas con diferentes fenotipos se combinan físicamente

adjuntándose.

• Se toma la parte inferior, el patrón, de una planta

transgénica y la parte superior, el vástago, de una planta

convencional.

• Este método puede ser utilizado para la expresión de ARN

de interferencia (o RdDM) en el patrón; estos son

sistémicamente transportados y puede llevar al

silenciamiento transitorio o heredable de los genes en el

vástago.

• Las semillas resultantes, frutas o descendencia de un

vástago no contienen ADN de origen transgénico, mientras

que la regeneración de brotes adventicios a partir de callos o

portainjerto puede llevar ADN transgénico.

Stegemann y Bock, 2009; Nagel et al, 2010;. Lusser et al., 2011

• La expresión transitoria de genes en plantas implica la

expresión de proteínas recombinantes sin necesidad de

transformación del material genético de la planta.

• El ADN recombinante no se inserta en el genoma, sino

que mediante distintos métodos se consigue producir

grandes cantidades de ARN mensajero, que se traduce

a proteínas en el citoplasma de parte de las células de

la planta.

• Una vez que el mensajero es traducido a proteínas la

planta lo degrada, no se transmite a la descendencia.

http://icono.fecyt.es/informesypublicaciones/Documents/2005-

Plantas%20biofactor%C3%ADa_d.pdf

7. Agro-infiltración (Expresión transitoria por transformación de

Agrobacterium)”.

(Lusser M, 2012)

Dra. Laura Esther Tovar Castillo

Secretaría Ejecutiva-CIBIOGEM

Tel. 55756878

e-mail: ltovar@conacyt.mx