DEFINICIÓN

• Técnica mediante la cual un explante se cultiva asépticamente en un medio de composición química definida

• El cultivo se desarrolla en condiciones de temperatura, humedad, fotoperíodo e irradiancia controlados

• La manipulación se realiza en cabinas de flujo laminar

• Importante en la propagación de especies de interés agroforestal

• Producen innumerables productos de importancia en la industria farmacéutica, cosmética y alimentaria

• Los cultivos in vitro permiten obviar los inconvenientes derivados de condiciones geográficas, climáticas y de tiempo de produccion.

APLICACIONES

• PRODUCCIÓN COMERCIAL• SANEAMIENTO DE CULTIVARES• CONSERVACIÓN DE GERMOPLASMA• OBTENCIÓN DE VARIACIÓN SOMACLONAL• RESCATE DE EMBRIONES• OBTENCIÓN DE HÍBRIDOS SOMÁTICOS• OBTENCIÓN DE HAPLOIDES• TRANSFORMACIÓN DE PLANTAS

CLASES DE CULTIVOS

CULTIVO DE CÉLULAS CULTIVO DE TEJIDOS CULTIVOS DE

ÓRGANOS

PLASTICIDAD

TOTIPOTENCIALIDAD

• Es la capacidad de una célula vegetal de dar lugar al desarrollo de una planta completa

• Las células totipotentes son células somáticas que han retenido su capacidad de dividirse y diferenciarse en una planta madura si se coloca en el medio adecuado

TERMINOLOGÍA Y TÉCNICAS1. EXPLANTEPorción de tejido u órgano que se separa de la planta para iniciar el cultivo

2. ESTERILIZACIÓNprocedimiento para la eliminación de microorganismos

3.AUTOCLAVE: Aparato en el que el medio, material de vidrio, instrumental, etc., Es esterilizado por vapor bajo presión (121ºc, 15 psi, 10-20 min)

REQUERIMIENTOS DE ASEPSIA

DESINFECCIÓN DE SUPERFICIE DEL EXPLANTO:

Generalmente usando HIPOCLORITO COMERCIAL diluido para evitar el desarrollo de microorganismos

CABINA DE FLUJO LAMINAR: Área de trabajo, mantenida estéril por el flujo continuo, no turbulento de aire estéril

CÁMARAS DE CULTIVO

• Es un receptáculo diseñado para permitir el control de algunas variables del ambiente físico

• Habitualmente se pueden controlar la temperatura, la iluminación y el fotoperíodo y en algunos casos, menos frecuentes, la humedad del aire y su composición

Control de la temperatura

• La Temperatura Se Afecta Por La Temperatura Ambiente De La Sala Donde Se Sitúe Y El Calor Generado Por Las Fuentes De Luz De Que Dispone

• El control de la temperatura se efectúa mediante un sistema de

refrigeración-calefacción controlado a través termostato

• Subcultivo: pasaje de células, tejidos, órganos, etc. Desde un medio de cultivo agotado a otro medio fresco

• Micropropagación: propagación vegetativa in vitro de plantas

• Diferenciación: desarrollo de células o tejidos con una función específica y/o regeneración de órganos, estructuras tipo órganos (raíces, tallos) o embriones

• Adventicios: Desarrollo de órganos (raíces, yemas, tallos, Flores, etc.) O embriones (embryo-like structures) Desde puntos de origen No usuales, incluyendo Callos

CULTIVOS in vitro

• CULTIVOS DIFERENCIADOS ( RAÍCES, TALLOS, EMBRIONES, RAÍCES Y TALLOS TRANSFORMADOS)

• CULTIVOS INDIFERENCIADOS ( CALLOS, SUSPENSIONES)

• Mezcla de sustancias en las que las células, tejidos y órganos pueden crecer y desarrollarse

• Sustancias inorgánicas, como: N, P, K, Ca, Mg, Cl, Na, Cu, Zn, Mn, Fe, Bo, Mo, Co, I

• Suplementos orgánicos complejos, como: leche de coco, extracto de levadura

• Reguladores de crecimiento (hormonas)

• Fuente de carbono (sacarosa) ya que no son completamente autotróficas

• Con o sin agar (medio semi -sólido o líquido)

• Sin agua y nutrientes minerales una planta no puede vivir in vitro e in vivo.

Mezclas de sustancias poco definidas:Extracto de levaduraLeche de cocoExtractos vegetalesHidrolizados de caseínaPeptona y triptona

FeZnB

MnCuNiCoAlMo

I

NPKCaMgS

Azúcares AminoácidosAuxinasCitoquininasGiberelinasAcido abcísico

elementos

MicroMacro Sustancias orgánicas

Agua

Necesidades nutricionales y hormonales de los cultivos de órganos y tejidos vegetales

• El medio MS, o Murashige y Skoog (1962), es el mas usado, particularmente si el objetivo es regenerar plantas

• El medio B5 o de Gamborg et al. (1968), o sus varios derivados, ha sido de un gran valor en el cultivo de células y protoplastos, y también es utilizado eficazmente en regeneración de plantas

FORMACIÓN DE TALLOS, RAÍCES, FLORES, ETC.

Explanto

Organogénesis

Formación de tallos Formación de raíces

Enraizamiento Tallos

Planta completa

REGULADORES DE CRECIMIENTO

HORMONAS/ FITOHORMONAS

AUXINAS: GRUPO DE HORMONAS VEGETALES (NATURALES O SINTÉTICAS) QUE INDUCEN LA ELONGACIÓN, O EN ALGUNOS CASOS LA DIVISIÓN CELULARFRECUENTEMENTE INDUCEN RAÍCES ADVENTICIAS E INHIBEN LA FORMACIÓN DE TALLOS ADVENTICIOS

CITOKININAS: GRUPO DE HORMONAS VEGETALES (NATURALES O SINTÉTICAS) QUE INDUCEN DIVISIÓN CELULAR Y FRECUENTEMENTE TALLOS ADVENTICIOS Y EN MUCHOS CASOS INHIBEN LA FORMACIÓN DE RAÍCES ADVENTICIAS

REGLAS GENERALES PARA LA ACCIÓN HORMONAL:

• AUXINA : CYTOKININA = ~1 CALLO• AUXINA : CYTOKININA < 1 TALLO• AUXINA : CYTOKININA > 1 RAÍCES

CULTIVOS INDIFERENCIADOS

CALLOS

• En medio sólido, crecimiento lento, gran heterogeneidad celular• Tejidos no diferenciados ( a veces diferenciados), en división activa• Frecuentemente se desarrollan a partir de heridas

CULTIVOS EN SUSPENSIÓN

• Derivan de los anteriores, en medio líquido de composición adecuada, crecimiento más rápido y homogéneo

• Composición del medio de cultivo. Fuente de carbono, minerales, vitaminas, fitohormonas (auxinas, citoquininas)

EMBRIOGENESIS

Proceso mediante el cual se desarrolla un embrión a partir de una célula o huevo fertilizada o asexualmente desde un grupo de células somáticas (embriogénesis somática)

PROCEDIMIENTO PARA LA REGENERACIÓN VÍA EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA

1. INICIACIÓN: • CALLOS EMBRIOGÉNICOS

2. PROLIFERACIÓN: • CALLOS EMBRIOGÉNICOS, MASAS PROEMBRIOGÉNICAS (PEM)

3. DESARROLLO Y MADURACIÓN DE EMBRIONES: • EMBRIONES

4. GERMINACIÓN DE EMBRIONES (REGENERACIÓN)ESTADÍOS DE DESARROLLO EN DICOTILEDÓNEAS:• MASAS PROEMBRIOGÉNICAS• ESTADÍO GLOBULAR• TORPEDO• EMBRIÓN SOMÁTICO

MICROPROPAGACIÓN

Es el proceso de multiplicar plantas in vitro, a partir de un fragmento (explanto) de una planta madre, se obtiene una descedencia uniforme en condiciones de asepsia.

Este proceso incluye varias fases:FASE 0 : Preparacion de la planta madre FASE I : Establecimiento del cultivo en condiciones de asepsia FASE II : Multiplicación de brotes FASE III : Enraizamiento FASE IV: Aclimatación

CULTIVO DE MERISTEMOS

Es un método efectivo para la eliminación de infecciones virales y es el material preferido para la conservación de germoplasma

La razón principal por la cual las células meristemáticas son indemnes a los virus es que el meristemo carece de tejidos vasculares, que es por donde se propagan los virus que van contaminando a la planta

Existen otros factores: • El meristemo apical tiene una mayor

velocidad de crecimiento y en consecuencia el virus "no alcanza" al meristemo

• En una célula meristemática el virus tiene mayor dificultad de acoplamiento con los ribosomas, debido a que estás células tienen un código de trabajo muy definido