Variacin de la actividad enzimtica con la Temperatura y el pH El efecto de la temperatura sobre la constante de velocidad de reaccin: k = A e(-EA/RT) Donde k es la constante de velocidad de reaccin, Ea la energa de activacin y A el factor preexponencial. Ea Kd Ed La velocidad de desactivacin rd = kdEa

Variacin de la actividad enzimtica con la Temperatura y el pH En un reactor discontinuo de tanque agitado:

Dado que la velocidad es funcin directa de la concentracin de enzima se tiene:

Variacin de la actividad enzimtica con la Temperatura y el pH

Variacin de la actividad enzimtica con la Temperatura y el pH

E

-H+ +H+

E-

-H+ +H+

E2-

Cintica Microbiana

Organismos procariticos unicelulares (bacterias) Aumento de tamao ====Divisin Clula no viable incapacidad de aumentar de tamao y multiplicarse Crecimiento: aumento ordenado de todos los constituyentes qumicos de un organismo, organismos unicelulares aumento de individuos en la poblacin

Cintica Microbiana Medicin del Crecimiento. Peso Seco: Secar hasta peso constante a 105 C durante un tiempo prudencial. Puede incluir centrifugacin para celular que sedimentan fcilmente. Filtracin con membranas. Desventajas: mtodo lento, con muestras relativamente grandes. Adsorcin: celda espectrofotomtricas, adsorcin de luz, proporcional a la concentracin. 600 nm. Se puede relacionar adsorcin versus peso seco y graficar. Medios slidos causan interferencia.

Cintica Microbiana

Medicin del Crecimiento. Peso hmedo: centrifugacin o filtrado de las muestras del cultivo seguida del pesado directo . Error considerable puesto que se mide agua intracelular y extracelular. Volumen de Clulas Empacadas: centrifugacin de muestras de cultivo en tubos de centrifugas graduados determinando volumen de clulas empacadas. Inexacto cuando existen pequeos cambios en la poblacin celular.

Cintica Microbiana Medicin del Crecimiento. Nmero de Clulas: muestras de cultivo diluidas sobre porta objetos de microscopios graduados como Helber Hematocitmetros. No distingue entre clulas viables y no viables. Requiere de buena tcnica de esterilizacin, equipo costoso. Mediciones fsicas: generacin de calor funcin del crecimiento celular. Adecuado para reactores a gran escala. En cultivos aerbicos se puede medir la captacin de O2. No es adecuado para cultivos anaerbicos.

Cintica Microbiana Estequiometra del crecimiento. Las cantidades de los nutrientes pueden determinarse por estequiometra: C6H12O6+aO2+bNH3 cCHxOyNz+dCO2+eH2O Para calcular los coeficientes estequiomtricos es necesario conocer el anlisis elemental del microorganismos. En bibliografa se pueden encontrar anlisis elemental de un gran numero de microorganismos.

Cintica Microbiana Estequiometra del crecimiento.Microorganismo Aerobacter aerogenes Klebsiella aerogenes Candida utilis Glicerol Glucosa Nutriente Limitante Formula Emprica CH1,78N0,24O0,33 CH1,74N0,22O0,43 CH1,84N0,2O0,56

Candida utilisSaccharomyces cerevisiae

EtanolGlucosa

CH1,84N0,2O0,55CH1,70N0,17O0,46

Cintica Microbiana Estequiometra del crecimiento.C6H12O6+aO2+bNH3 cCHxOyNz+dCO2+eH2O En Carbono (C): 6=c+d En Hidrogeno (H): 12+3b=1,703c+2c En Oxigeno (O): 6+2a=0,459c+2d+e En Nitrgeno (N): b=0,171c Cuatro ecuaciones cinco incgnitas. Dato extra cociente respiratorio (RQ): moles CO2 formado/mol de oxigeno consumido. Se puede entonces resolver el sistema. RQ=1,033=d/a. C6H12O6+3,942O2+0,330NH3 1,928CHxOyNz +4,072CO2+4,854H2O

Cintica Microbiana Estequiometra de formacin de producto.Si el producto principal se genera del metabolismo primario puede escribirse una reaccin qumica similar al caso anterior. aCHmOn+bO2+cNH3 dCHxOyNz+eCO2+fH2O+gCHvOw No siempre se puede relacionar la formacin de producto con el consumo de substrato, crecimiento celular, es por ello que en estos casos la aplicacin de estequiometria simple no es posible.

Cintica MicrobianaRendimientos. Se puede tener una relacin directa entre substrato consumido y biomasa obtenida, definido como rendimiento biomasasubstrato.

El rendimiento global depende de la fuente de carbono y de las condiciones de operacin, ya que dentro de estos valores se engloban utilizaciones del substrato que no esta directamente relacionado a la produccin de biomasa.

Cintica MicrobianaRendimientos.

el primer termino corresponde al crecimiento propiamente dicho, el segundo al substrato consumido como fuente de energa, y el tercero a lo que respecta a mantenimiento del cultivo. Pueden definirse otros tipos de rendimientos los cuales pueden relacionarse con las velocidades de aparicin y desaparicin de las diferentes especies, de manera una vez caracterizado el comportamiento de una de ellas, se puedan obtener las demas:

Cintica MicrobianaRendimientos.

rs representa velocidad de desaparicin de substrato, rx, rp y rc las de aparicin de biomasa, producto y CO2 respectivamente.Smbolo YX/S Definicin g de biomasa seca por g de substrato consumido Tasa de crecimiento molar: g de biomasa seca por mol de substrato consumido g de biomasa seca por g de oxigeno consumido o por mol de oxigeno consumido g o mol de producto por g o mol de substrato consumido mol de CO2 producido por mol de substrato consumido

YX/O YP/S YC/S

Cintica MicrobianaCada Clula individual es un sistema multicomponente con distribucin interna no homognea. Numero de reacciones individuales que tiene en la clula es elevado. La clula tiene capacidad de adaptarse a cambios en la composicin del medio. Ocurren mutaciones (modificaciones genticas de la clula) Clulas en crecimiento (distintas edades) Variacin de la actividad metablica. En el medio las condiciones pueden ser variables. Modelo cintico que contemple todos los factores !!!!Complejo!!!!!

Cintica MicrobianaLas aproximacin mas comn es asumir que todas las clulas de la poblacin son iguales y se comportan de la misma forma (clulas promedio). Datos cinticos se obtienen de dos maneras, en un reactor continuo agitado o en un reactor discontinuo de tanque agitado.X2 X1

Fases del crecimiento celular en discontinuoI Lag

Log X

II AceleracinIII ExponencialX2 X0

IV Desaceleracin

It0

II IIIt1

IVt2 t3

Vt4

VI

V Estacionaria VI Declive

Tiempo (hr)

Cintica MicrobianaFASE LAGEs la expresin de un perodo de adaptacin para iniciar el crecimiento. Su presencia y su extensin depende de: Inculo Estado fisiolgico Fase de crecimiento Tamao Tipo de microorganismos

Composicin del medio en el que se inocula Condiciones fisicoqumicas del medio Fase Lag aparente: con inculos pequeos

Cintica MicrobianaFASE LAG

Cintica (dX/dt) = 0 X = Concentracin de clulas X = X0 t = Tiempo X0 = Biomasa inicial Incidencia Industrial Costo del tiempo de fermentacin Tamao del fermentador Riesgo de contaminacin

Cintica MicrobianaFase de AceleracinParte de las clulas comienzan a dividirse (dX/dt) = X

X = Biomasa microbiana = Constante especifica del crecimiento microbiano en hr-1. t = Tiempo en hrs.

Cintica MicrobianaFase Exponencial El cultivo esta en estado autocataltico Es un perodo relativamente corto Se cumple que: Xo 2Xo 4 Xo 8Xo nXo N = N0 * 2n Cintica de crecimiento Se caracteriza por ser una fase de crecimiento constante (dX/dt) = X X = Biomasa microbiana = Constante especifica del crecimiento microbiano en hr-1. t = Tiempo en hrs. (t = td = tiempo de duplicacin)

Cintica MicrobianaFase Exponencial(dX/dt) = X ; expresin general para el crecimiento microbiano (dX/X) = dt ; integrando en el periodo exponencial para un cambio de tiempo en el que la concentracin celular se duplique, se tiene entonces que:

= ln2/tdDonde td representa el tiempo de duplicacin. = 0.693/td

td queda entonces como:td = 0.693/

Cintica MicrobianaConstante especfica de velocidad de crecimiento (La constante especifica de la velocidad de crecimiento microbiano () se utiliza para caracterizar el comportamiento de una poblacin microbiana.

Su valor depende de las condiciones ambientales en que se encuentra el microorganismo. Existe una gran dependencia de la fuente de carbono y energa tanto en calidad como en cantidad.

Cintica MicrobianaFase de declinacin o retardoRepresenta el fin del perodo exponencial Esta dado por: Agotamiento de un sustrato

Acumulacin de un inhibidorOtras causas ajenas al crecimiento Cintica:

(dx/dt) = (Xm X)Xm = Concentracin de biomasa mxima

Cintica MicrobianaFase estacionariaNo existe crecimiento neto . Puede ocurrir crecimiento pero estar equilibrado por la rapidez de muerte.

Fase de declinacinDurante la fase estacionaria la rapidez de desaparicin (muerte) puede volverse ms alta que la rapidez de crecimiento, en cuyo caso disminuye la densidad de clulas.

Cintica MicrobianaEl crecimiento de la clula es un fenmeno muy complejo, se puede tener una descripcin del mismo de manera sencilla. La ecuacin comnmente usada es la de Monod: Substrato (S) + clulas (X) ms clulas (X) + producto (P)

Otras ecuaciones:

Moser:

Contois:

Cintica MicrobianaOtras ecuaciones en las cuales se toma en cuenta inhibiciones por substrato o por producto: Andrews y Noack

Tipo TeissierDagley y Hinshelwood Levenspiel

Cultivo ContinuoClasificacin de los Sistemas de Cultivo Continuo. Tres criterios son comnmente usados : Recirculacin de Clulas Sistema Abierto: clulas en el efluente; no recirculacin solo parcial. Sistema Cerrado: sin clulas en el efluente; 100% de clulas recirculadas al reactor quasi continuo Mezclado Homogneo: tanque agitado (clulas homogneamente dispersas en una mezcla de fase liquida y gaseosa) Heterogneo: reactor tubular. Tanque de particin (los organismos son retenidos por sedimentacin). Pelcula adherida a alguna superficie.

Numero de Etapas Una sola etapa: no se puede tener una serie de sistemas cerrados. Se pueden combinar sistemas cerrados con un reactor abierto. (acta como tanque de siembra)Multietapas: se pueden combinar sistemas abiertos para formar cadenas de 2 o mas reactores; la alimentacin de sustrato se hace total o parcialmente en el primer reactor

Cultivo Continuo: Quimiostato

Un Quimiostato en un sistema abierto, homogneo y de una sola etapa.

Cultivo Continuo: Quimiostato

Cultivo continuo, no hay cambios de [S], numero de clulas y concentracin intracelular de metabolitos (estado estacionario)

Cultivo Continuo: QuimiostatoAcumulacin de clulas= ent clulas-sal clulas+estado-muerte

Cultivo Continuo: QuimiostatoAcumulacin de nutriente= ent nutriente-salida-consumo-mantenimiento-formacin de producto

Cultivo Continuo. Rapidez Crtica de Dilucin (Dc)Cuando S= So, se tiene entonces que Dc=g. Sustituyendo en la expresin de Monod:

Dc

So m Ks So

En general Dc es aproximadamente igual m. Dc es el valor mas bajo de D al cual ocurre el agotamiento .

Cultivo Continuo: QuimiostatoLa productividad se define como: PX=DXX Yx/s So KsD m D X Yx/s So KsD m D

Sabiendo queX

Yx/s So

KsD m DKsD m D

SustituyendoPXX Yx/s So KsD m D

DYx/s So

Derivando la expresin anterior para hallar el mximoDm Ks Dc 1 Ks S1/ 2

Cultivo Continuo: Quimiostato en serie

Sistema en Serie

Cultivo Continuo: Quimiostato en serieSist. Serie

Ec.1 Ec.2

Ec.3

Ec.4

Cultivo Continuo: Quimiostato en serieSist. Serie

Ec.5

Ec.6

Ec.7

Cultivo Continuo. Usos

Algunos productos qumicos obtenidos por fermentacin continua Acetona Acido actico Acido ctrico Acido glucnico Acido itacnico Acido lctico Butano Butanodiol Celulasa Cloramfenicol Etanol Estreptomicina Glucosa isomerasa Glicgeno Penicilina Penicilinasa Protena Unicelular Vitaminas B12

Cultivo Continuo. Ventajas1. 2. 3. 4. La rapidez de crecimiento se puede controlar y mantener indefinidamente Se puede examinar el efecto de cambios en los parmetros fsicos o qumicos, sobre el crecimiento y la formacin del producto La concentracin de biomasa se puede mantener constante variando la tasa de dilucin Se puede mantener el crecimiento limitado por un substrato y estudiar los cambios en la composicin y actividad metablica celular modificando el nutriente limitante del crecimiento Permite la determinacin exacta de las constantes cinticas, energa de mantenimiento y rendimientos del crecimiento reales Los resultados del medio de cultivo con frecuencia son mas confiables y reproducibles Mayores productividades, menor perdida de tiempo por limpieza, preparacin, esterilizacin del medio.

5.6. 7.

Cultivo Continuo. Desventajas1. 2. 3. 4. 5. No siempre se puede lograr la produccin de algunos productos no relacionados con el crecimiento El crecimiento en las paredes y la agregacin de clulas puede causar desgaste o evitar el crecimiento en rgimen permanente real El crecimiento continuo por largos periodos de tiempo puede ocasionar la perdida de la cepa original, debido a la adopcin de una cepa que crece mas rpido El crecimiento de organismos filamentosos es difcil debido a la viscosidad y naturaleza heterognea del cultivo que evita el crecimiento en rgimen permanente Crecimiento por periodos largos puede causar problemas de contaminacin Periodos largos de crecimiento se traducen en planta y equipos auxiliares confiables y de la mejor calidad para evitar interrupciones mecnicas.

6.

Cultivo Continuo. Problemas1.En un biorreactor continuo de mezcla completa se realiza un proceso de fermentacin de un substrato con concentracin 143 g/l , mediante un microorganismo que tiene una m = 1 h-1 y una Ks = 1,1 10-3 g l-1. Calcular: a.La velocidad de dilucin que proporciona la mxima productividad celular b.Si la concentracin de producto para el valor de Dm es de 10 g/l, Cul es la productividad mxima? c.Si la concentracin de biomasa para la velocidad de dilucin del apartado a es de 4 g/l . Cul es la velocidad de formacin de biomasa? 2. Calcular las concentraciones de substrato y biomasa en estado estacionario en un fermentador continuo de tanque agitado de 25 l, cuando la concentracin de susbtrato limitante en la alimentacin es de 2 g/l y el caudal 8 l/h. Los valores de Ks y m son 10,5 mg/l y 0,45 h-1, respectivamente y el rendimiento YX/S = 0,48

Bibliografa Scragg A.(2000) Biotecnologa para Ingenieros (Sistemas Biolgicos en Procesos Tecnolgicos). Editorial Limusa. Mxico Casas et al.(2005) Ingeniera Bioqumica. Primera Edicin. Editorial Gdia y Lopez. Espaa