Cuerpo de la tesis
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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
ABREVIATURAS
- Aβ: péptido beta-Amiloide
- ApoE: Apolipoproteína E
- BSA: Albúmina Bovina Sérica
- CV: Coeficiente de Variación
- DCL: Deterioro cognitivo leve
- DSM: Manual Estadístico y Diagnóstico de los Trastornos Mentales (The
Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders)
- EA: Enfermedad de Alzheimer
- ELISA: Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay
- hk6: human Kallikrein 6
- HUCA: Hospital Universitario Central de Asturias
- Da: Daltons
- LCR: Líquido Cefalorraquídeo
- MBP: Proteína Básica de la Mielina
- NIA: Instituto Nacional del Envejecimiento, USA (National Institute on Aging)
- PARs: Receptores Activados por Proteasas (Protease-activated receptors)
- PPA: Proteína Precursora del Amiloide
- PSA: Antígeno Prostático Específico, hk3 (Prostate specific antigen)
- RM: Resonancia Magnética
- RR: Riesgo Relativo
- ROC: Curva de Rendimiento Diagnóstico (Receiver Operating Characteristic
curve)
- SNC: Sistema Nervioso Central
- STARD: Standards para la precisión diagnóstica (Standards for Reporting
Diagnostic Accuracy)
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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
I. INTRODUCCIÓN:
1. El “Síndrome Demencia”
1.1 Definición y prevalencia
Las demencia es un síndrome clínico caracterizado por deterioro cognitivo
adquirido. De acuerdo con los Criterios DSM IV [1], para su diagnóstico requiere la
presencia de deterioro mnésico y al menos otra alteración cognitiva (afasia,
apraxia, agnosia o disfunción ejecutiva) con repercusión significativa de estos
trastornos en la vida social y/o laboral del paciente. La demencia es un síndrome
común en los adultos de más edad, afectando al 10% de los individuos mayores de
65 años. Además la prevalencia se duplica cada cinco años hasta alcanzar casi al
50% de los individuos mayores de 85 años. Se estima que en la actualidad más de
24 millones de personas en el mundo padecen demencia, cifra que previsiblemente
se duplicará cada 20 años hasta superar los 80 millones en el año 2040 [2].
Este síndrome puede ser de origen secundario o neurodegenerativo. Las
demencias de origen secundario son debidas a causas metabólicas, vasculares o
estructurales. En las demencias de origen neurodegenerativo el depósito cerebral
de ciertas proteínas da lugar a pérdida neuronal y disfunción sináptica.
En muchos casos las alteraciones histológicas y fisiopatológicas comienzan
tiempo antes de la aparición de los síntomas clínicos, pero el diagnóstico en fases
presintomáticas es difícil de alcanzar. El deterioro cognitivo leve (DCL) es una
condición considerada como un estadio transicional desde el estado de salud al de
demencia, en el que el paciente presenta un mayor deterioro cognitivo que el
esperado para su edad, pero sin ser de suficiente intensidad aún como para alterar
su capacidad funcional [3].
1.2 Diagnóstico y Diagnóstico diferencial de las Demencias
La información clave para diagnosticar una demencia procede de la historia
clínica, a través de la cual se trata de determinar de si existe o no deterioro
cognitivo de intensidad tal capaz de interferir con las actividades habituales del
paciente. Ello implica evaluar detenidamente la evolución clínica del caso
basándose, además de en los síntomas referidos por el paciente, en la información
que puedan aportar los acompañantes. También es fundamental realizar una
evaluación neuropsicológica adecuada para determinar las funciones alteradas y el
grado de deterioro existente y una exploración neurológica y general completa.
Una vez alcanzado el diagnóstico de “Síndrome demencia” el siguiente
objetivo es tratar de determinar qué enfermedad o proceso es la causa del mismo.
Para ello, la fase de anamnesis y exploración debe completarse con la realización
de una serie de pruebas complementarias con el fin de descartar en primer lugar
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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
las denominadas “demencias secundarias” o “demencias tratables” que, en
ocasiones, disponen de tratamiento específico que puede resultar curativo.
La Demencia Vascular, o Demencia con Componente Vascular tal como
últimamente ha convenido en denominarse, puede considerarse una forma de
demencia secundaria, en este caso a un proceso isquémico de una o varias
regiones cerebrales que puede cursar con déficits cognitivos de muy diversa índole
por lo que a pesar de poseer unos factores de riesgo, curso evolutivo y hallazgos de
neuroimagen sugestivos suele ser causa frecuente de diagnóstico diferencial con las
demencias de origen neurodegenerativo.
También es importante identificar cuadros de origen psiquiátrico con
síntomas cognitivos. En estos pacientes los síntomas cognitivos, como pérdida de
memoria, pueden constituir el motivo de consulta. Por tanto, a este diagnóstico se
llega cuando en el contexto de un cuadro psiquiátrico se ha excluido la existencia
de un verdadero deterioro cognitivo de origen orgánico; son las denominadas
“Pseudodemencias”.
Cuando se han descartado causas secundarias el siguiente paso es tratar de
determinar qué proceso degenerativo puede ser la causa subyacente. La
Enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa de demencia más frecuente y la mejor
conocida, aunque existen otras enfermedades neurodegenerativas que pueden
causar demencia. Así, puede plantearse el diagnóstico diferencial entre las
siguientes demencias de origen neurodegenerativo: EA, Demencia por Cuerpos de
Lewy o Complejo Parkinson-Demencia, Demencia Frontotemporal, Enfermedad de
Huntington, Afasia Progresiva Primaria y Degeneración Córticobasal. Para tratar de
distinguirlas es clave la información de la historia clínica y disponer de una buena
evaluación neuropsicológica, ya que el perfil neuropsicológico de las distintas
demencias neurodegenerativas suele diferir (Tabla 1). La Enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob es una enfermedad muy infrecuente causada por priones, de
curso rápidamente progresivo y de clínica muy variada, por lo que en su inicio
también puede plantear diagnóstico diferencial con otras causas de demencia.
Para apoyar los hallazgos clínicos sería muy beneficioso poder contar con
pruebas diagnósticas que más allá de descartar causas secundarias puedan ayudar
a identificar los procesos neurodegenerativos. Estas pruebas se denominan
biomarcadores. Los marcadores biológicos o biomarcadores son por tanto
parámetros mensurables, ya sean bioquímicos, fisiológicos o morfológicos, que se
asocian a un determinado proceso mórbido y que por tanto pueden resultar de
utilidad para su diagnóstico. Aunque en el momento actual no existen aún pruebas
diagnósticas estandarizadas que se puedan aplicar en la práctica clínica rutinaria
para diferenciar fiablemente las distintas formas de demencia, en los últimos años
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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
se han multiplicado los esfuerzos por encontrar biomarcadores, tanto de
neuroimagen, como bioquímicos, para la EA y otras demencias. Destacan los
estudios de neuroimagen, tanto volumétricos como de neuroimagen funcional
mediante RM y pruebas de Medicina Nuclear, en los que se ha logrado demostrar
asociación con algunas formas de demencia. No obstante, por su complejidad
técnica o por falta de disponibilidad de equipos, su aplicación permanece aún
restringida al ámbito de la investigación.
Respecto a la búsqueda de marcadores bioquímicos, su búsqueda se ha visto
marcada por el hecho de que la neuropatología de estas enfermedades afecta
fundamentalmente al SNC, por lo que el fluido en el que se han encontrado datos
más significativos es el LCR, que si bien puede obtenerse mediante punción lumbar,
no es el fluido ideal para el estudio sistemático de los pacientes con deterioro
cognitivo. Es prioritario, por tanto, hallar una molécula cuyos niveles medidos en
fluidos periféricos (sangre u orina), se asocien con alguno de los procesos
neurodegenerativos.
De acuerdo con el Informe de Consenso del Grupo de Trabajo para la
búsqueda de biomarcadores para la EA (Molecular and Biochemical Markers of AD)
de [4], el marcador ideal de la EA debería “detectar una característica fundamental
de la neuropatología de la enfermedad, ser validado en casos confirmados mediante
estudio neuropatológico, tener una especificidad superior al 80% para detectar EA y
una especificidad superior al 80% para distinguir los casos de EA de otras
demencias. Además debería ser fiable, reproducible, no invasivo, fácil de
determinar y económico.” Algunos de estos biomarcadores ya han comenzado a
proponerse como apoyo diagnóstico para la realización de ensayos clínicos en la EA
[5] y en los criterios diagnósticos más recientes de la EA [6].
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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
Entidad clínica
Historia clínica (inicial) Exploración neurológica Exploración neuropsicológica
Alteración en la memoria reciente. Desorientación espacial.
Bradicinesia, hipertonía, mioclonías (tardío).
Demencia tipo Alzheimer
Pérdida de memoria para hechos reciente con preservación de la memoria remota.
Reflejos de liberación: prensión, palmomentoniano, glabelar... (tardío).
Lenguaje alterado por dificultad para encontrar las palabras.
Cambios en la personalidad. Síntomas psiquiátricos.
Alteración de la autoconciencia.
Síntomas conductuales.
Reflejos de liberación frontal: Alteración prominente en las pruebas atencionales y en las funciones ejecutivas que requieran planificación, secuenciación, abstracción y flexibilidad mental.
Demencia Frontal
Síntomas principales: Pérdida de la higiene y cuidado personal, transgresión de las normas sociales, conducta desinhibida, sexualidad incontrolada, esterotipias, vagabundeo, hiperoralidad, falta de flexibilidad mental, distractibilidad, impulsividad.
Signos de liberación piramidal Parkinsonismo rígido-acinético (tardío). Alteración en la mirada vertical. Apraxia de la apertura palpebral. Alteración de la
autoconciencia.
Alteración en la comprensión del significado de las palabras.
Acinesia, rigidez, temblor (tardío)
Se alteran los componentes semánticos con preservación inicial de los aspectos fonológicos y gramaticales.
Afasia Progresiva Fluente o Demencia Semántica
Lenguaje espontáneo aparentemente normal o con pausas y circunloquios. Parafasias semánticas. Agnosia visual.
Acinesia, rigidez, temblor (tardío)
Se alteran los componentes fonológicos y gramaticales con preservación inicial de los aspectos semánticos.
Suele comenzar con tartamudeos o dificultar para pronunciar alguna palabra y pausas en el lenguaje oral.
Afasia Progresiva No Fluente
Anomia y Parafasias fonémicas. Anomia.
Repetición alterada. Dificultad creciente para la lectura y escritura. Alexia, agrafia.
Mutismo tardío. Relativa preservación funcional.
Signos parkinsonianos: rigidez, bradicinesia, amimia, trastornos posturales y de la marcha. Hipofonía y temblor.
Fluctuaciones acusadas en el rendimiento cognitivo.
Complejo Demencia-Parkinson y Demencia con Cuerpos de Lewy
Déficit atencional. Lentitud de pensamiento.
Cuadros confusionales. Defectos ejecutivos. Alucinaciones (visuales), ideas de perjuicio.
Defectos visuoespaciales. Defectos visuoconstructivos.
Hipersensibilidad a neurolépticos.
Caídas frecuentes. Hipotensión ortostática. Trastorno del sueño REM.
Variable, deterioro subcorticofrontal
Parkinsonismo rígidoacinético asimétrico.
Degeneración córticobasal
Parkinsonismo rígidoacinético con distonía y mioclonías focales. Negligencia motora Hiperflexión distónica
espontánea con negligencia motora y apraxia.
Apraxias focales Deterioro cognitivo subcortical Desinhibición cortical Escasa respuesta a levodopa. Disminución de la fluencia verbal fonológica.
Temblor de actitud Mioclonías reflejas Alteración supranuclear de la mirada. Piramidalismo Discinesias bucolinguales. Síndrome pseudobulbar
Déficit atencional Enfermedad de Huntington
Lentamente progresiva Corea Disfunción ejecutiva Autosómica dominante Alteraciones de la motilidad
ocular Alteraciones visuoespaciales
Trastorno motor Deterioro cognitivo Distonía, rigidez, bradicinesia
Bradipsiquia Alteraciones psiquiátricas: cambio de la personalidad
Alteración de la marcha. Déficits mnésicos.
Trastorno del comportamiento: apatía, mutismo.
Tabla 1. Principales demencias de origen neurodegenerativo con sus características clínicas y
hallazgos en la exploración neurológica y neuropsicológica más típicos [7].
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Biomarcador Fluido biológico Método
Factibles y Principales
Proteína Tau Fosforilada LCR ELISA
Aβ total 1-42 Plasma y LCR ELISA
Proteína C Reactiva Plasma y LCR ELISA
Factor del Complemento C1q Plasma y LCR ELISA
Complejo Receptor de la Interleukina 6 Plasma y LCR ELISA
Homocisteína Plasma ELISA
PPA LCR ELISA
Nitrotirosina LCR Cromatografía Líquida
Factibles y Secundarios
Anticuerpos anti-Aβ Plasma y LCR ELISA
Glutamina Sintetasa Plasma y LCR ELISA
Proteína Ácida Fibrilar Glial LCR ELISA
Sulfátidos LCR Espectrometría de Masas
Proteína de la Cadena Neural AD7C Plasma y LCR ELISA
Neurosina Plasma y LCR ELISA
Factibilidad incierta
Aβ 1-40 Plasma y LCR ELISA
CD59 Plasma y LCR ELISA
Melanotransferrina Plasma y LCR Inmunoblot
Isoformas plaquetarias de PPA Plaquetas Inmunoblot
Proteína S100 Plasma y LCR ELISA
Tabla 2. Clasificación de los biomarcadores bioquímicos para la EA en función del grado de evidencia propuesta para su utilización en ensayos clínicos. Se recoge el fluido fuente y el método analítico empleado. Realizada en el año 2003 por el grupo de estudio de la Agencia Americana para el Envejecimiento. La neurosina plasmática (flecha) se encuentra en el grupo de los biomarcadores “factibles secundarios”. Traducido de “Biological markers for therapeutic trials in Alzheimer’s disease Proceedings of the biological markers working group” [5].
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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
2. Neurosina
2.1 La Familia de las Kalikreínas
La Kalikreína tipo 6 (hk6), también conocida como neurosina, zyme o
proteasa M, fue identificada en el año 1997 como una nueva serín-proteasa que se
expresa principalmente en el cerebro [8,9]. Esta molécula es una de las que está
aportando datos más prometedores como biomarcador de la EA ya que se ha
demostrado que su concentración tanto en tejido cerebral, como en LCR y sangre
se encuentra alterada en pacientes con EA. No obstante los estudios realizados
hasta el momento incluyen un número escaso de pacientes y no se han incluido
pacientes con otros tipos de demencia, por lo que no se ha podido estimar la
sensibilidad y especificidad de esta prueba, ni se ha estudiado su concentración
plasmática en individuos sanos, y por tanto, es aún desconocida su utilidad como
prueba diagnóstica.
Las Kalikreínas son una familia de serín-proteasas cuyo peso molecular
oscila entre 27 y 40 kDa. cuyo locus se está situado en el brazo largo del
cromosoma 19 en la región 13.4 [Figura 1]. Se dividen en dos grupos: las
plasmáticas y las tisulares, que difieren tanto en peso molecular como en
especificidad de substrato, características inmunológicas y estructura génica. Las
Kalikreínas plasmáticas son sintetizadas exclusivamente en el hígado y están
implicadas en coagulación, fibrinolisis, regulación de la presión arterial y reacciones
inflamatorias [10] y su centro activo adopta la conformación típica de la tripsina
[11]. Las Kalikreínas tisulares son una subfamilia de 15 serín-proteasas con un alto
grado de especificidad de substrato y variada expresión en diversos tejidos y fluidos
biológicos (Figura 2).
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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
Figura 1. Características de la estructura del locus (a), gen (b) y proteína (c) de las kalikreínas. a. El locus KLK se expande ~300 kb en el brazo largo del cromosoma 19 en la región 13.4. Los genes de las Kalikreínas clásicas (KLK1, KLK2 y KLK3/PSA) están representados por flechas rojas, las Kalikreínas 4-16 por flechas azules y el pseudogen de la kalikreína 1 por una flecha amarilla. La dirección de transcripción es desde telómero a centrómero con excepción de KLK2 y KLK3. b. Los genes KLK tienen una longitud variable de entre 4 y 10 kb y en todos ellos consisten en 5 exons codificantes y 4 intrones con una fase patrón conservada (I, II, I, 0). La longitud de los exones codificantes (rectángulos amarillos) son similares en los distintos genes KLK si bien la longitud de los intrones varía considerablemente. Las posiciones de los codones para los residuos catalíticos del centro activo se encuentran muy conservadas, con el codón de la Histidina (H) próximo al final del segundo exón, el codón del ácido aspártico (D) en centro del tercer exón y el codón de la serina (S) al comienzo del quinto exón. La mayor parte de los genes KLK, con excepción de los genes de las kalikreínas clásicas, también tienen uno o dos exones no codificantes (rectángulos rojos) en la región 5’ no transcrita (UTR). La región no transcrita 3′ varía en longitud. c. Las kalikreínas son proteínas de cadena simple sintetizadas como pre-proenzimas que contienen una secuencia aminoterminal (Pre) que las dirige al retículo endoplásmico para su secreción y un propéptido (Pro) que las mantiene como precursores inactivos (zymógenos). Modificado de Borgoño [12].
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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
Figura 2. Representación esquemática de la expresión tisular de las kalikreínas en varios tejidos humanos. Los niveles más altos se señalan en negrita. Tomado de Yousef [13].
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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
2.2 Expresión de la neurosina
La neurosina es una serín-proteasa de 244 aminoácidos y un peso molecular
de 26856 Da “similar a tripsina” como demuestran los datos de cristalización [14]
[15] (Figura 3).
A B
Figura 3: Representación tridimensional de la neurosina. A. Los residuos catalíticos semuestran como bolas y barras. La histidina 57 en azul, el ácido aspártico 102 en rosa y laserina 195 en naranja. B. Regiones en bucle que rodean el sitio activo: 92–102 (azul), 141–152 (rosa) y 172–178 (verde). Tomado de Bernett [9].
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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
El gen de la neurosina se
encuentra localizado en el cromosoma
19q13.3-q13.4, y está compuesto de 7
exones de los cuales los dos primeros
no se transcriben [16]. Tiene una pauta
abierta de lectura de 732 pares de
bases que codifican una proteína de
244 aminoácidos sintetizada como pre-
pro-hK6. Una vez el péptido señal es
liberado la pro-hK6 es secretada al
medio extracelular, donde un nuevo
corte produce la forma activa de 223
aminoácidos. Se ha señalado que la
propia neurosina puede provocar su
propia activación e inactivación [14, 17,
18] (Figura 4). Sin embargo la
capacidad de la propia neurosina de ejecutar estos pasos se ha puesto en duda y es
objeto de debate [14, 18, 19].
Figura 4. Representación esquemática de los 2 pasos autoproteolíticos que llevan a la maduración de pro-hk6 (activación) y la subsecuente autoinactivación de la misma (Modificado de Bayés).
La neurosina se expresa en el sistema nervioso central, epitelio glandular de
mama, próstata, riñón, endometrio, colon, apéndice, glándulas salivares, conductos
biliares y vejiga, intestino delgado, estómago, endocervix, trompa de Falopio,
epidídimo, bronquios, tracto respiratorio superior y en células endoteliales, nervios
periféricos y algunas células neuroendocrinas (incluyendo los islotes de Langerhans,
células de la porción anterior de la hipófisis y la médula adrenal) [20, 21] (Figuras
2 y 5). El órgano donde más neurosina se expresa es el cerebro; en concreto se ha
encontrado en el epitelio del plexo coroideo, en la corteza cerebral, en el cerebelo y
en el hipocampo [20].
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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
Figura 5. Intenso inmunomarcaje de neurosina (cabezas de flecha) en el epitelio del plexocoroideo (A) y (B). Inmunoexpresión de neurosina en neuronas (C). Inmunoexpresión de neurosina en nervio periférico (D). Anticuerpo policlonal, magnificación x200. Tomado de Petraki [21].
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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
2.3 Actividad enzimática de la neurosina
Como se ha dicho, la neurosina es una de las kalikreínas tisulares y por
tanto su presencia en los fluidos biológicos se debe a difusión a éstos desde los
tejidos. La neurosina presente en liquido cefalorraquídeo corresponde a la proteína
completa (proenzima) sin procesamiento de la región pro como lo demuestra el
hecho de que su secuencia N-terminal sea Glu-Glu-Gln-Asn-Lys y por lo tanto
presumiblemente inactiva [15, 22].
Algunas de las proteínas descritas como sustratos de la neurosina son la
proteína básica de la mielina (MBP) [19], el plasminógeno [17], la α1-antitripsina,
la proteína precursora del amiloide (PPA) [19] y el receptor ionotrópico del
glutamato [23].
La neurosina posee la actividad proteolítica propia de las kalikreínas. En las
secuencias de substrato existe exclusividad para la Arginina en P1 y alta
especificidad para Serina en P1’ [23]. Las principales secuencias sustrato de la
neurosina se recogen en la Tabla 3.
Sustrato Punto de Corte
Boc-Gln-Ala-Arg-NHMec Boc-Gln-Ala-Arg+NHMec
Boc-Phe-Ser-Arg-NHMec Boc-Phe-Ser-Arg+NHMec
Boc-Val-Pro-Arg-NHMec Boc-Val-Pro-Arg+NHMec
Bz-Arg-NHMec Bz-Arg+NHMec
Tos-Gly-Pro-Arg-NHMec Tos-Gly-Pro-Arg+NHMec
Tos-Gly-Pro-Lys-NHMec Tos-Gly-Pro-Lys+NHMec
Tabla 3: Secuencias de algunos de los puntos de corte conocidos de la neurosina. Fuente: MEROPS. Identificador Peplist PL00322.
La unión al sustrato se produce en la proximidad del centro activo de la neurosina.
Para ello, la Arginina forma puentes de Hidrógeno con los residuos Asp189, Ser190 y Asn217
[14, 23, 24] (Figuras 6 y 7).
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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
Figura 6. Diagrama propuesto mediante simulación para la unión de la neurosina al sustrato alrededor del centro activo. A. La Arginina es responsable de realizar puentes de Hidrógenocon los residuos Asp189, Ser190 y Asn217 que constituyen el principal dominio activo de laneurosina. A. Tomado de Li [23]. B. Tomado de Bernett [9].
B A
Figura 7. Unión del péptido al sustrato en orientación standard. A, sitio activo de corte junto a un sustrato hexapeptídico (P4-Val-P3-Ala-P2-Arg-P1-Arg- -P1'-Ala-P2'-Ala). B, sitio activo de corte, representado como superficie sólida coloreada de acuerdo con lospotenciales electroestáticos de superficie (azul estremo positivo y rojo extremo negativo),junto al hexapéptido VARRAA que se une a los sitios S4 a S2'. Tomado de Debela [24]
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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
2.4 Neurosina y PARs
Recientemente se ha descubierto la relación de las Kalikreínas con los PARs
(receptores activados por proteasas). Los PARs constituyen una familia de
receptores acoplados a proteína G que funcionan a través de un mecanismo único
de activación mediante corte proteolítico de su extremo amino terminal exponiendo
así un ligando peptídico [25] (Figura 8). Se sabía que los PARs 1-4 son activados
por hidrólisis de la trombina (PAR-1 y PAR-3), de la tripsina (PAR-2) o tanto por la
tripsina como por la trombina (PAR-4) [26], pero recientemente se ha demostrado
que las kalikreínas también activan los PAR [27, 28] y por tanto deben considerarse
como importantes reguladores “hormonales” de la función tisular.
Figura 8. Estructura y mecanismo de activación de los PARs por las tripsinas cerebrales. Los PARs tienen siete dominios transmembrana en hélice y una hélice adicinal C-terminal intracelular. El corte proteolítico mediante serín-proteasas, tales como la neurosina, se expone un nuevo dominio N-Terminal que actúa como ligando proteico (segmento en caja) que puede intereactuar con el segundo bucle extracelular (línea de puntos) alterando la conformación del receptor, lo que facilita el acoplamiento de los bucles intracelulares 2 y 3 del PAR con la proteína G que transmite las señales intracelularmente. Tomado de Wang [29].
La neurosina hidroliza PAR 1 y 2 en una secuencia de su extremo amino
terminal [19] produciendo su activación o inactivación dependiendo del punto
exacto de corte [26].
Los PARs 1-4 se expresan ampliamente en el SNC y de forma similar a lo
que sucede con la neurosina, las mayores densidades de PAR-2 se encuentran en
hipocampo, córtex, amígdala, tálamo, hipotálamo y estriado [26] asociada en
ocasiones a áreas de neurodegeneración [30].
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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
La PAR2 se ha implicado en la inflamación mediante mecanismos
neurogénicos [31, 32] y contribuye a la regulación del tono vascular [32, 33]
siendo
rodegenerativas
iversos estudios han estudiado los mecanismos fisiopatológicos por los que
la neur :
de Lew
un potente mecanismo vasodilatador en las arterias cerebrales mediante la
producción endotelial de óxido nítrico [34, 35].
2.5 Implicación de la neurosina en las enfermedades neu
D
osina podría estar implicada en algunas enfermedades neurodegenerativas
Sinucleínpatías: La acumulación de agregados de alpha-sinucleína en el
cerebro es característica de la Enfermedad de Parkinson, la Demencia con cuerpos
y y la Atrofia multisistema. En estas enfermedades la neurosina parece
colocalizarse con la sinucleína (Figura 9) [36]. En condiciones basales la neurosina
se localiza intracelularmente en las mitocondrias y microsomas, siendo la
localización nuclear y citosólica baja. Se ha demostrado que cuando las células son
expuestas a estímulos estresantes se produce una liberación de fragmentos de
alpha-sinucleína y neurosina hacia el citosol [36]. Estudios in vitro muestran que la
neurosina previene la polimerización de esta proteína gracias a que reduce la
cantidad de monómeros y genera fragmentos con capacidad de inhibir la
polimerización [36, 37]. Mas interesante aún, otro estudio in vitro muestra que
ciertas formas mutantes y fosforiladas de la alpha-sinucleína que se expresan en la
Enfermedad de Parkinson son resistentes a la actividad de la neurosina [38].
Figura 9. Colocalización de inmunoreactividad para neurosina y alpha-sinucleína en el cerebro de ratón en la región azonal terminal. Las flechas señalan uno de los muchos puntos de colocalización de ambas proteínas. Bar=20 µm Tomado de Iwata [36].
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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
Amiloidopatías: Cuando el gen de la neurosina se coexpresa con el de la PPA
(Proteína Precursora del Amiloide) en células de la línea 293 (riñón de embrión
humano), se detectan fragmentos amiloidogénicos y las células liberan gran
cantidad de péptido Aβ truncado con disminución de los residuos 17-42 [8] (Figura
10).
Además, la neurosina es capaz de
cortar el dominio N-terminal de la PPA
en tres sitios distintos [18], por lo que
podría contribuir a la acumulación
cerebral de Aβ en la EA.
Parece confirmado que existe
disminución de la expresión de neurosina
en las áreas parénquima cerebral con
neuropatología EA [37, 38]. De acuerdo
con los estudios de Zhang [40] la
prekalikreína6 está aumentada en el LCR
de pacientes con EA (el doble que en
controles de la misma edad), y no así en
pacientes con PD ni con Demencia por
cuerpos de Lewy, lo que podría indicar
que en la EA puede existir una alteración
de la conversión de prehk6 a hk6 [41,
42], ya que la hk6 está disminuida en
LCR [22].
Figura 10. Detección de fragmentos amiloidogénicos en células transfectadas con fragmentos de cDNAs de PPA y neurosina. Western blot: línea a, control; línea b, neurosina; línea c, PPA 695; línea d, PPA 695 y neurosina, línea e, PPA 751 y línea f, PPA 751 y neurosina. Tomado de Little [8].
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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
3. Justificación del tema
A la luz de lo expuesto en las páginas precedentes es evidente el beneficio
que supondría poder contar con pruebas diagnósticas que puedan asistir en el
diagnóstico de alguna de las enfermedades que causa demencia y/o predecir la
progresión de DCL a demencia.
Como marcadores bioquímicos han sido muchas las moléculas ya
estudiadas, algunas con resultados favorables (Tabla 2). Sin embargo, por diversos
motivos ninguna de ellas ha sido trasladada aún del ámbito de investigación a la
práctica clínica rutinaria. Hasta el momento actual el marcador bioquímico que
mayor utilidad ha demostrado para el diagnóstico de una enfermedad causante de
demencia es la cuantificación conjunta de proteína Aβ y proteína tau fosforilada en
LCR; que ofrece una sensibilidad y especificidad próxima al 90% para el diagnóstico
de EA. Sin embargo, la necesidad de realizar una técnica cruenta como es una
punción lumbar ha condicionado que este método no sea de uso rutinario en la
práctica clínica habitual. Otras moléculas cuantificadas en plasma u orina no
disponen de estudios completos de validación como prueba diagnóstica para el
diagnóstico diferencial de las demencias, ya que no disponen de resultados en un
número suficiente de controles y de pacientes con demencias de diverso origen.
Éste era el caso de la neurosina.
El planteamiento de este estudio parte de un escenario real, en el que el
screening de los pacientes se realiza a partir de la detección de la clínica que tienen
en común todos estos ellos: la presencia síntomas cognitivos. Es a partir de la
detección de estos síntomas cuando se plantea el problema del diagnóstico
diferencial de la enfermedad subyacente y la situación donde se percibe el vacío
actual de pruebas diagnósticas que sirvan de apoyo para lograr este objetivo.
Animados por los resultados de estudios previos, nos propusimos evaluar la
utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial del
deterioro cognitivo. Como hemos visto, la neurosina es una proteasa de expresión
tisular, preferentemente cerebral, a la que tanto los estudios de investigación
básicos como los estudios clínicos iniciales adjudican un papel en las demencias
neurodegenerativas. De este modo otros grupos señalan diferencias en la
concentración de esta proteína en tejido cerebral, sangre y LCR de pacientes con EA
respecto a controles. En todo caso permanecían sin estudiar la variación con la
edad de la concentración plasmática de neurosina en individuos sanos, las
diferencias de concentración en las distintas entidades causantes de deterioro
cognitivo y la validez de la medición de concentración de neurosina como prueba
para la predicción evolutiva de pacientes con DCL y para el diagnóstico diferencial
de las demencias.
19
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
Tomando como hipótesis de trabajo que la cuantificación plasmática de
neurosina podría variar entre algunas de las enfermedades causantes de demencia
investigamos de modo prospectivo la correlación entre los niveles de esta molécula
y el diagnóstico final de un grupo de pacientes con síntomas cognitivos con diversos
diagnósticos clínicos.
Los conocimientos derivados de estas investigaciones determinarán en qué
situaciones clínicas la cuantificación plasmática de neurosina puede ser de utilidad
en el diagnóstico diferencial entre entidades causantes de deterioro cognitivo y por
tanto si puede ser una variable más a añadir en los protocolos diagnósticos del
síndrome demencia.
20
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
II. OBJETIVOS
En el presente trabajo de investigación y una vez analizado en profundidad
el estado actual del problema, nos hemos planteado los siguientes objetivos:
Objetivos generales
1. Estudiar la utilidad de la medición de la concentración plasmática de
neurosina en el diagnóstico diferencial del deterioro cognitivo de
origen vascular, degenerativo o psiquiátrico.
2. Estudiar la utilidad de la medición de la concentración plasmática de
neurosina como factor pronóstico en pacientes con Deterioro
Cognitivo Leve.
Objetivos específicos
Objetivos específicos para el objetivo general número 1
a. Determinar si la concentración plasmática de neurosina varía con la
edad en individuos sanos.
b. Determinar si la concentración plasmática de neurosina difiere entre
pacientes con deterioro cognitivo de distinto origen y controles.
c. Determinar si la concentración plasmática de neurosina difiere entre
pacientes con deterioro cognitivo de distinto origen.
d. Determinar si la concentración plasmática de neurosina varía en las
distintas fases evolutivas de la Enfermedad de Alzheimer.
e. Determinar en qué situaciones clínicas la cuantificación plasmática de
neurosina puede ser de utilidad en el diagnóstico diferencial entre
entidades distintas causantes de deterioro cognitivo.
Objetivos específicos para el objetivo general número 2
a. Determinar si una única medición de la concentración plasmática de
neurosina es de utilidad como factor pronóstico en pacientes con
Deterioro Cognitivo Leve.
b. Determinar si la evolución de la concentración plasmática de
neurosina es un parámetro de utilidad para establecer el pronóstico
de pacientes con Deterioro Cognitivo Leve.
21
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
METODOLOGÍA
1. Diseño:
No experimental (observacional), prospectivo, cuantitativo, casos y controles
no pareados. Se han seguido los estándares y recomendaciones de la iniciativa
STARD [43, 44] para la validación de pruebas diagnósticas.
2. Sujetos de estudio:
2.1 Muestreo, reclutamiento y selección de pacientes:
Se siguió un método de muestreo y reclutamiento consecutivo; en el que a
partir de la fecha de inicio del estudio (Enero 2003) a todos los pacientes
estudiados por Unidad de Demencias del Hospital Universitario Central de Asturias
(HUCA) que cumplían el criterio de screening y ningún criterio de exclusión se les
propuso participar en el estudio (Tabla 4). El periodo de reclutamiento fue de 36
meses.
2.2 Criterio de screening:
Pacientes con síntomas cognitivos en los que se sospecha origen vascular,
degenerativo o psiquiátrico.
2.3 Criterios de inclusión:
Se incluyeron directamente tras el screening todos los pacientes con
Deterioro Cognitivo Leve sin criterios de exclusión. Pacientes en los que tras al
menos un año de seguimiento se establece el diagnóstico de EA, Demencia por
Cuerpos de Lewy o Parkinson-Demencia, Demencia Frontotemporal, Enfermedad de
Huntington, Afasia Progresiva Primaria, Degeneración Córticobasal, Enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob o Enfermedad Psiquiátrica con síntomas cognitivos.
2.4 Criterios diagnósticos y de estadiaje:
El diagnóstico de las enfermedades se estableció según los siguientes
criterios: Criterios NINCDS-ADRDA [45] para la enfermedad de Alzheimer, criterios
del Consortium on Dementia with Lewy Bodies [46] para la demencia por cuerpos
de Lewy, criterios de Manchester y Lund [47] para la demencia frontotemporal,
Criterios NINCDS-AIREN [48] para el diagnostico de Demencia Vascular (Demencia
con Componente Vascular), criterios de la OMS para Enfermedad de Creutzfeldt-
Jakob [49], Criterios DSM-IV para el diagnóstico de los cuadros psiquiátricos con
síntomas cognitivos (Pseudodemencia) [1], criterios de Petersen para DCL [3]. El
diagnóstico de enfermedad de Huntington se realizó por confirmación genética.
22
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
El estadiaje de la enfermedad de Alzheimer (1-6) se realizó según los
criterios GDS-FAST-BCRS [50]. Controles: GDS1, DCL: GDS3, EA leve: GDS4, EA
moderada: GDS5, EA severa: GDS6.
2.5 Criterios de exclusión:
• Pacientes con algún tipo de “demencia tratable” (tumoral,
hidrocefalia, carencial, tóxica o asociada a otras enfermedades).
• Pacientes con enfermedad oncológica conocida.
• Pacientes con alteración de la función hepática o renal (en los que
puede alterarse la metabolización o aclaramiento de proteínas
plasmáticas).
• No obtención del consentimiento informado por el paciente o tutor del
mismo.
2.6 Muestras procedentes de otros centros:
Ante la previsión de reclutar un número muy escaso de muestras de
Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, y conscientes de que se trata de un
procedimiento de reclutamiento con menor validez metodológica ya que estos
sujetos no siguieron el protocolo general del estudio, solicitamos a un centro de
referencia (Hospital Clinic i Universitari de Barcelona) muestras de sujetos con esta
enfermedad, de las que nos facilitaron 29 muestras procedentes de pacientes que
habían sido diagnosticados con Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob probable (n=11) o
definitiva (n=18).
2.7 Fuentes de controles
Los controles se obtuvieron de dos fuentes distintas: a) individuos sanos o
pacientes estudiados en consulta de Neurología del HUCA por patología del sistema
nervioso periférico, sin evidencia de patología del sistema nervioso central o
acompañantes sanos (esposos) de los pacientes de edad superior a 60 años, b)
muestras procedentes del Centro Comunitario de Sangre y Tejidos (HUCA), de edad
entre 18 y 60 años.
23
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
Controles Consulta de Neurología (HUCA) (> 60 años) 70 Centro Comunitario de Sangre (< 60 años) 158
Total de controles incluidos 228 Pacientes Screening en consulta de neurología (HUCA) 633
- Perdidos / No reclutables 186 Pacientes incluidos desde consulta (HUCA) 418 Muestras del Hospital Clinic 29
Total de pacientes incluidos 447 Tabla 4. Resumen de las fuentes y número de controles y pacientes reclutados.
24
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
3. Metodología clínica:
Para el estudio de pacientes con deterioro cognitivo se siguieron las
recomendaciones de la Academia Americana de Neurología [51]. El diagnóstico se
estableció en todos los casos, excepto en los pacientes con DCL, a los 12 meses de
la inclusión del sujeto en el estudio. En los pacientes con DCL el diagnóstico se
estableció en cuanto se realizó la evaluación y las pruebas complementarias.
3.1 Estudio clínico de los pacientes
Se empleó un protocolo que incluye: anamnesis completa, exploración física
general y neurológica, evaluación neuropsicológica con Test Generales (MMSE de
Folstein [52], Subtest de Memoria del Test Barcelona Abreviado [53]) y específicos
(orientados en función de la sospecha diagnóstica); evaluación funcional: Escala de
Blessed [54]; test de despistaje de enfermedad psiquiátrica: Inventario
Neuropsiquiátrico de Cummings [55] y Escala de depresión geriátrica de Yesavage
[56].
3.2 Pruebas complementarias realizadas
A todos los pacientes se les realizaron las siguientes pruebas
complementarias: hemograma, bioquímica general, TSH, acido fólico, vitamina B12,
serología lúes y Lyme (realizados en los servicios de Bioquímica, Microbiología del
HUCA) y prueba de neuroimagen: Tomografía computerizada y/o Resonancia
Magnética Craneal (en el Servicio de Radiología del HUCA).
En casos seleccionados se realizaron otras pruebas que se consideraron
necesarias para alcanzar el diagnóstico, tales como genética para Enfermedad de
Huntington, medición de niveles de homocisteína, vitamina A, ceruloplasmina y
electroencefalografía.
A todos los pacientes con el diagnóstico de EA se les determinó el genotipo
ApoE en el laboratorio de Genética Molecular del HUCA.
3.3 Seguimiento de pacientes con DCL
Los pacientes con DCL fueron seguidos durante 18 meses con visitas cada 6
meses en las que se realizaba una reevaluación funcional. Al final del seguimiento
se repitió el estudio de neuroimagen y evaluación neuropsicológica completa. Con
todos estos datos, junto a la valoración clínica, se reconsideró el diagnóstico del
paciente.
25
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
4. Obtención de muestras y metodología de laboratorio para la
cuantificación de neurosina:
La obtención de las muestras de sangre y las condiciones de
almacenamiento fueron idénticas para todos los sujetos incluidos en el estudio
excepto para las muestras remitidas desde el Hospital Clinic de Barcelona. Las
muestras de sangre se obtuvieron en el servicio de extracciones del Hospital
Universitario Central de Asturias, en tubo de tapón rojo (sangre coagulada) y en
cantidad de 10 ml. Las muestras se procesaron para obtener el suero en el
laboratorio de nuestro hospital del modo siguiente: se permitió la coagulación
durante 30 minutos, se centrifugó la muestra durante 10 minutos a 3,500 g. Se
recogió el sobrenadante y se hicieron varias alícuotas de la muestra de 5 ml que se
congelaron a -80º C. Se obtuvo una segunda muestra a los 18 meses de la primera
en 36 pacientes con DCL de los 66 a los que se les realizó seguimiento.
La determinación de las concentraciones séricas de neurosina se realizó en el
Servicio de Inmunología del HUCA. Se utilizó un inmunoensayo comercializado (Kit
para hk6) de IBEX (human kallikrein 6 research ELISA, IBEX, Canada) con dos
anticuerpos monoclonales de ratón siguiendo las instrucciones del proveedor. Este
inmunoensayo no presenta inmunoreactividad cruzada con otras kallikreínas y tiene
una precisión con un margen de error inferior al 4%. El kit está basado en un
inmunoensayo previamente descrito por Diamandis y cols. [57]. Consiste en un
inmunoensayo tipo “sandwich” en el que se utiliza neurosina recombinante
standard, un anticuerpo monoclonal antineurosina de ratón y un segundo
anticuerpo monoclonal antineurosina conjugado con biotina; ambos dentro de una
matriz estabilizante con BSA. La unión del anticuerpo biotinilado se detectó
mediante la unión de un conjugado de estreptavidina con el enzima peroxidasa y la
adición de tetrametilbenzidina. Los dos anticuerpos monoclonales de neurosina de
ratón usados en este inmunoensayo son específicos para la neurosina y no
muestran inmunoreactividad cruzada contra las kalikreínas recombinantes humanas
purificadas 2, 3 (PSA), 5, 8, 10 y 13. La precisión intra-ensayo de este ELISA es
CV<3.97 y la precisión interensayo es CV< 7.22. La curva standard se generó con
diluciones standard de neurosina recombinante entre 0.2 y 20 ng/ml.
5. Recogida de Datos y Variables
Los datos de los pacientes se ordenaron consecutivamente por orden de
inclusión en forma de doble registro anonimizado mediante bases de datos
disociadas: una con número de historia y código y otra con código y datos.
26
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
Los datos de los resultados de laboratorio se recogieron inicialmente en cuaderno y
posteriormente se introdujeron en el programa informático SPSS 14.1 junto al
código del paciente.
5.1 Variables Primarias:
• Diagnóstico: para todos los individuos incluidos en el estudio se
realizó un diagnóstico (único y excluyente) que representa una
variable cualitativa nominal que se codificó numéricamente. En los
pacientes con DCL además del diagnóstico inicial se recogió el
diagnóstico a los 18 meses de seguimiento.
• Valor de la concentración sérica de neurosina: variable cuantitativa
continua. Se ha recogido su valor incluyendo dos decimales
5.2 Variables Secundarias:
• Edad: variable cuantitativa discontinua, su valor se ha recogido en
números enteros (sin decimales ni fracciones).
• Sexo: variable dicotómica que se codificó: 1:hombres, 2:mujeres
• Genotipo ApoE: es el genotipo Apo E, que representa una variable
cualitativa nominal que permite 6 posibilidades genotípicas como
combinación de 2 alelos de 3 tipos, se codificó: 1:2,2; 2:2,3; 3:2,4;
4:3,3; 5:3,4 y 6:4,4
6. Análisis estadístico
Para el análisis estadístico se ha utilizado el programa informático SPSS,
versión 14.1 bajo el asesoramiento de la unidad de investigación y estadística de la
Oficina de Investigación Biosanitaria del Principado de Asturias.
Mediante T de Student para comparación de medias se comparó la edad
media de controles y pacientes con EA. Se realizaron test Chi-cuadrado para
evaluar las diferencias en la distribución por sexo en controles y pacientes con EA.
Mediante el test de Kolmogorov-Smirnov se comprobó que la concentración
plasmática de neurosina sigue una distribución normal en pacientes y controles.
Mediante el coeficiente de correlación de Pearson se estudió la correlación de la
concentración plasmática de neurosina y la edad de pacientes y controles. Mediante
test T de Student se comparó si existen diferencias en la concentración media de
neurosina entre controles mayores y menores de 60 años y entre sexo masculino y
femenino tanto en controles como en pacientes con EA, también se comparó la
media en pacientes con EA portadores de un alelo E4 con los no portadores de alelo
27
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
E4. Mediante test ANOVA y corrección de Bonferroni se compararon las medias de
las concentraciones plasmáticas de neurosina entre todos los grupos.
Se calculó la sensibilidad, especificidad y valores predictivo positivo y
negativo de la prueba en el diagnóstico diferencial entre aquellos grupos
diagnósticos cuyas medias mostraron diferencias significativas. El valor de corte
óptimo se ha determinado hallando el punto con mejor valor promedio de
sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de EA. Se crearon curvas ROC con
ayuda del programa Rockit 09.1beta y se calculó el área bajo la curva de esta
prueba para la EA.
Mediante test ANOVA y corrección de Bonferroni se compararon las medias
de concentración de neurosina entre los distintos grupos de DCL tras el
seguimiento. Se realizaron tests Chi-cuadrado con dos grados de libertad para
determinar si hay relación entre la existencia de progresión clínica y los niveles
plasmáticos de neurosina dicotomizados en “altos” y “bajos”. Se realizó un análisis
de regresión logística para determinar la probabilidad de cada diagnóstico en
función de los niveles dicotomizados de neurosina corrigiendo los resultados para
las variables demográficas sexo y edad.
Finalmente se correlacionó, mediante el coeficiente de correlación de
Pearson, los niveles de neurosina con el estadio evolutivo de EA.
7. Consideraciones éticas y legales
Este proyecto de investigación fue aprobado por los Comités de
Investigación y Ético del Hospital Universitario Central de Asturias (HUCA).
Este estudio se ha regido por las bases éticas del Convenio de Oviedo
siguiendo sus normas de información y consentimiento informado, y por los
principios de la Declaración de Helsinki, del Consejo de Europa relativo a los
derechos humanos y la biomedicina, de la Declaración Universal de la UNESCO
sobre los derechos humanos y los requisitos de la legislación española incluyendo la
“Ley de investigación con seres humanos”.
Los datos se han tratado con carácter confidencial. La identidad de los
pacientes se ha salvaguardado mediante la creación de un registro disociado y se
ha cumplido la normativa de la Ley de Protección de Datos.
28
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
29
II. RESULTADOS
1. Descripción de la muestra
1.1 Características de los individuos incluidos
Inicialmente se incluyeron 633 individuos en el screening del estudio, de los
cuales 186 no cumplieron finalmente los criterios de inclusión o fueron perdidos
durante el seguimiento inicial (Tabla 4). Además se incluyeron las muestras de 228
controles y muestras de 27 pacientes con Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
procedentes del Hospital Clínico de Barcelona. Por lo tanto se estudiaron muestras
de 675 individuos, 423 mujeres y 252 hombres repartidos en los grupos
diagnósticos descritos en la Tabla 5.
Tabla 5. Distribución de la muestra en grupos diagnósticos y variables demográficas.
En el grupo “otras” se incluyen 6 pacientes en los que inicialmente se había
diagnosticado enfermedad psiquiátrica pero cuyo curso evolutivo fue hacia
demencia que no se ha podido clasificar en el momento de finalizar el estudio.
Frecuencia Edad Sexo
Femenino Masculino N % Media
Desviación
Standard N % N %
Controles 228 33.8 50.24 17.77 143 21.18 85 12.59
• Mayores de 60 años 70 10,3 77,84 7,88 41 6,07 29 4,29
• Menores de 60 años 158 23,4 38,05 21,54 102 15,11 56 8,29
Enfermedad de Alzheimer 199 29.4 80.01 6.76 130 19.25 69 10.22
• EA leve 84 12.4 79.02 6.99 48 7.11 36 5.33
• EA moderada 79 11.7 80.50 6.57 58 8.59 21 3.11
• EA severa 36 5.3 81.25 6.50 24 3.55 12 1.77
Deterioro Cognitivo Leve 68 10.1 76.30 8.30 47 6.96 21 3.11
Demencia con comp. Vasc. 80 11.8 75,36 8,67 38 5,62 42 6,22
• Demencia mixta 28 4.1 77.14 7.97 18 2.66 10 1.48
• Demencia vasc. 52 7.7 74.40 10.72 20 2.96 32 4.74
Demencia Frontotemporal 20 3.0 75.00 9.52 10 1.48 10 1.48
Pseudodemencia 18 2.7 73.11 9.00 13 1.92 5 0.74
Afasia Progresiva Primaria 6 0.9 73.83 6.79 4 0.59 2 0.29
Demencia con C. de Lewy 18 2.7 75.72 12.56 11 1.62 7 1.03
Enfer. de Creutzfeldt-Jakob 29 4.3 64.89 10.89 21 3.11 8 1.18
Degeneración Corticobasal 2 0.3 74.00 15.55 1 0.14 1 0.14
Enfermedad de Huntington 1 0.1 70.00 0 1 0.14 0 0
Otras 6 0.8 80.33 6.47 4 0.59 2 0.29
Total 675 100.0 67.85 17.92 423 62.66 252 37.33
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
1.2 Diferencias de edad y sexo entre controles y pacientes
Para evaluar si existen diferencias en la edad y el sexo de pacientes con EA
y controles comparamos en ellos la distribución de estas variables. Los resultados
demuestran que no hay diferencias significativas en el sexo entre controles y
ningún tipo de demencia (para grupos diagnósticos con n≥25). Sin embargo, sí hay
diferencias significativas en la edad entre controles y todos los grupos de pacientes
(p=0.014) lo que podría ser fuente de sesgos. Por ello, para las comparaciones de
niveles de neurosina entre casos y controles, se tomaron como controles el grupo
de controles mayores de 60 años.
1.3 Evolución diagnóstica de los pacientes con DCL
De los 68 pacientes con DCL incluidos se consiguió seguir a 66 hasta 18
meses tras el diagnóstico. Se mantuvieron estables 30 casos (45,4%). Veintitrés
pacientes (34,8%) desarrollaron EA (de acuerdo con los criterios NINCDS-ADRDA
[45]) y 13 (19,7%) desarrollaron Demencia con Componente Vascular (de acuerdo
con los criterios NINCDS-AIREN [48]). Por tanto, la tasa global de conversión anual
(porcentaje de pacientes que evolucionan de DCL a demencia en un año) fue
36,4%.
2. Neurosina en controles
2.1 Correlación de los niveles de neurosina con la edad en controles
El valor medio de neurosina en el grupo control fue 4,44 ng/ml. Dado que las
demencias son un trastorno asociado a la edad, valoramos si en los sujetos sanos
la concentración de neurosina también variaba con la edad. Efectivamente, existe
una correlación positiva entre estas variables (Factor de correlación de Pearson:
0,362, RSQ= 0,131, significación bilateral p<0,001). Tal como se muestra en la
Figura 12, a mayor edad de los controles, mayor nivel de neurosina. Las diferencias
en los niveles de neurosina en los controles mayores de 60 años (valor medio de
neurosina 5,52 ng/ml) y en los menores de 60 años (valor medio 3,97 ng/ml)
difieren significativamente (p=0,027) (Figura 11).
30
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
Figura 11. Diagrama de cajas representando la comparación de valores medios de neurosina entre el grupo de controles menores de 60 años y el de controles mayores de 60 años. Existen diferencias significativas (p=0,027).
2.2 Influencia del sexo sobre los niveles de neurosina
Los valores medios de neurosina en controles, tanto en mayores como en
menores de 60 años fueron muy similares en hombres y mujeres (Tabla 6) y no
existieron diferencias significativas (p=0,681 para menores de 60 años y p=0,772
para mayores de 60 años), por lo que el sexo no es una variable que influya sobre
los niveles de neurosina en controles en ningún rango de edad.
Menores de 60 años Mayores de 60 años Sexo n media Desv. Std. n media Desv. Std. Masculino 56 4,01 2,06 29 5,55 1,01 Femenino 102 3,95 2,01 41 5,48 1,23
Total 158 3,97 2,02 70 5,52 1,21 Tabla 6. Valores medios de neurosina en los controles en función del sexo.
31
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
Figura 12. Correlación entre los niveles de neurosina y la edad en controles. Correlación significativamente positiva con (Correlación de Pearson= 0,362 RSQ=0,131).
Figura 13. Correlación entre los niveles de neurosina y la edad en pacientes con Enfermedad de Alzheimer. No hay correlación significativa (Correlación de Pearson = 0,137, RSQ=0,019).
32
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
3. Neurosina en pacientes con EA
3.1 Correlación de los niveles de neurosina con la edad en pacientes con EA
Al contrario de lo que sucede en controles, en los pacientes con EA no hay
correlación entre los niveles de neurosina y la edad. Factor de correlación de
Pearson= 0,137, RSQ=0,019, significación bilateral=0,231 (Figura 13). Este dato
puede interpretarse como que la natural tendencia ascendente de los niveles
plasmáticos de neurosina se rompe en caso de iniciarse un proceso
neurodegenerativo tipo EA.
3.2 Influencia del sexo sobre los niveles de neurosina en pacientes con EA
Tal como cabía esperar, dado que se sabe que la incidencia de EA es
superior en mujeres que en hombres, nosotros también encontramos diferencias
significativas en el número de pacientes de cada sexo: 69 hombres, 130 mujeres
(p=0,017). Sin embargo, el valor medio de neurosina en cada grupo no difiere
significativamente: 4,93 en mujeres y 4,87 en hombres (p=0,834) por lo que el
sexo no es una variable que influya sobre los niveles de neurosina en pacientes con
EA.
3.3 Influencia del genotipo ApoE en los niveles de neurosina en pacientes
con EA
Dado que la presencia genotipo ApoE4 es un conocido factor de riesgo de la
EA determinamos si el genotipo ApoE es un factor que pueda influir sobre los
niveles plasmáticos de neurosina en pacientes con EA. Todos los pacientes con EA
fueron genotipados y divididos en a) portadores de 1 o 2 alelos ApoE4 y b) no
portadores del alelo E4. Ochenta y seis pacientes (43,21%) eran portadores de al
menos un alelo E4. La media en el grupo a) fue 5,04 ng/ml, mientras que en grupo
b) fue 4,76 ng/ml. La comparación de medias no resultó significativa (p=0,453),
con lo que puede concluirse que el genotipo ApoE no afecta los niveles plasmáticos
de neurosina en pacientes con EA.
33
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
4. Valor diagnóstico de la cuantificación plasmática de neurosina
4.1 Diferencias de los niveles de neurosina entre los distintos grupos
diagnósticos
Una vez conocidos los valores de neurosina en los dos grupos más
importantes –controles y EA-. El paso siguiente fue evaluar las diferencias en la
concentración plasmática de neurosina entre grupos diagnósticos (Tabla 7).
Diagnóstico Media Des. Std.
Controles 4,450 1,630
• Controles mayores de 60 años 5,523 1,215
• Controles menores de 60 años 3,972 2,020
Deterioro Cognitivo Leve 5,965 1,890
Enfermedad de Alzheimer 4,909 2,011
• EA leve 5,191 2,252
• EA moderada 5,082 1,858
• EA severa 3,882 1,786
Demencia con componente vascular 5,772 2,453
• Demencia mixta 5,721 2,886
• Demencia vascular 5,806 1,713
Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob 4,779 1,494
Pseudodemencia 6,517 2,833
Otras demencias neurodegenerativas 5,704 1,253
• Demencia frontotemporal 5,342 2,348
• Afasia Progresiva Primaria 4,975 1,813
• Demencia con Cuerpos de Lewy 6,039 1,116
• Enfermedad de Huntington 0,486 0
• Degeneración Córticobasal 8,818 3,132
Tabla 7. Valores medios de la neurosina y desviación standard por grupo diagnóstico. Unidades: ng/ml.
Los niveles más altos fueron encontrados en pacientes diagnosticados de
Degeneración corticobasal (8,818 ng/ml), Pseudodemencia (6,517 ng/ml), y
demencia con cuerpos de Lewy (6,039 ng/ml). Resulta interesante que en el único
paciente diagnosticado con Enfermedad de Huntington, la concentración de
neurosina resultó muy disminuida (unas 10 veces) respecto a los controles (0.486
ng/ml respecto a 4.44 ng/ml), si bien este dato no puede tomarse en consideración
por proceder de un único paciente.
La comparación de las medias de concentración de neurosina entre los
distintos grupos arrojó varios resultados remarcables. La ANOVA muestra que
existen diferencias significativas entre algunos de los grupos (p=0,042). Las
34
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
significaciones estadísticas recogidas en la Tabla 8 muestran que hay diferencias
estadísticamente significativas entre los niveles de neurosina encontrados en
pacientes con EA respecto a controles mayores de > 60 años (p=0.042). Sin
embargo la comparación de los datos procedentes de otros tipos de demencia o
deterioro cognitivo con el grupo control (mayor de 60 años) no mostraron
diferencias significativas. Sí se encontraron diferencias significativas entre los
pacientes con EA y Pseudodemencia (p=0.039) y entre los pacientes con EA y
Demencia con Componente Vascular (p=0.040). No hubo diferencias significativas
entre los controles mayores de 60 años y la Demencia con Componente Vascular
(p=0,277) ni entre los controles mayores de 60 años (p=0,140) la
Pseudodemencia. No hubo diferencias significativas entre DCL y controles o entre
DCL y cualquier tipo de demencia.
DCL EA EA leve
Controles 0,461 0,359 0,512
Controles >60 años 0,348 0,042 0,372
DCL 0,724 0,212
Demencia Frontotemporal 0,313 0,197 0,497
Demencia con Cuerpos de Lewy 0,157 0,097 0,251
Afasia Progresiva Primaria 0,462 0,308 0,652
Pseudodemencia 0,092 0,039 0,241
Demencia Mixta 0,452 0,143 0,351
Demencia con componente
vascular 0,451 0,040 0,244
Enfermedad de Creutzfeldt-
Jakob 0,234 0,245 0,292
Tabla 8. Diferencias entre grupos (con n>25) en la media de concentración plasmática de neurosina. Los datos indican el valor p. Se han incluido los grupos diagnósticos con más de 25 individuos. En negrita los valores significativos.
Las muestras de pacientes con Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob,
procedentes de otro centro, tampoco mostraron diferencias significativas con
controles (p=0,241), pacientes con DCL (0,341) o EA (0,195).
Para la Degeneración Córticobasal aunque las diferencias parecen
importantes, el bajo número de individuos en estos grupos no permite hacer
comparaciones estadísticas.
Cuando se comparó selectivamente el grupo de pacientes con EA en grado
leve no se encontraron diferencias significativas entre los niveles de neurosina en
estos pacientes respecto a controles o respecto a cualquier otro tipo de demencia
(Tabla 8). Como se aprecia en la Figura 14, las diferencias entre controles y el
conjunto global de pacientes con EA se debe a las diferencias existentes entre los
35
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
primeros y los pacientes con EA en estadio severo (p=0,022). Sin embargo, como
se muestra mejor en el apartado 5.4 de los resultados, los niveles de neurosina sí
presentan una clara tendencia descendente a lo largo de toda la evolución de la
enfermedad.
Figura 14. Diagrama de cajas con la comparación de valores medios de neurosina entre el grupo de controles mayores de 60 años y los tres estadios de la EA. Las diferencias sólo son significativas entre controles y EA en estadio severo (p=0,022).
4.2 Evaluación de la cuantificación de neurosina como prueba para el
diagnóstico diferencial de la Enfermedad de Alzheimer
Dado que existen diferencias en la concentración plasmática de neurosina
entre pacientes con EA y controles mayores de 60 años, pacientes con
Pseudodemencia y Pacientes con Demencia con Componente Vascular; tratamos de
evaluar la validez de este parámetro como prueba para el diagnóstico diferencial de
la EA con estas entidades.
Para ello, en primer lugar determinamos el mejor punto de corte de
neurosina para detectar EA. Calculamos la sensibilidad y la especificidad de la
prueba en varios puntos y seleccionamos el que ofrecía mejor valor promedio, que
resultó 5,25 ng/ml (Tabla 9).
36
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
Punto de corte Sensibilidad Especificidad Sens. + Espe.
5,21 0,62 0,65 1,27
5,23 0,66 0,62 1,28
5,25 0,70 0,59 1,29
5,27 0,73 0,54 1,27
5,29 0,75 0,52 1,27
Tabla 9. Valores de sensibilidad y especificidad de la prueba en varios puntos para el diagnóstico de EA y suma de ambos valores.
A continuación clasificamos los sujetos como “bajos” cuando tenían valores
≤5,25 ng/ml o como “altos” cuando eran >5,25 ng/ml. El paso siguiente fue
calcular la sensibilidad, especificidad, valor predictivo negativo (aceptando la
prueba como negativa cuando resulta >5,25) y valor predictivo positivo (aceptando
la prueba como positiva cuando es ≤5,25) en el diagnóstico diferencial entre los
grupos que mostraron diferencias significativas (EA frente a controles,
Pseudodemencia y Demencia con Componente Vascular) (Tabla 10). En todos los
casos la sensibilidad y especificidad mostró datos modestos (entre 0,59 y 0,70) y
los valores predictivos negativos fueron bajos en todos los casos. Sin embargo, los
valores predictivos positivos fueron altos (entre 0,85 y 0,95). Estos resultados
sugieren que en casos de duda en la práctica clínica, la obtención de un resultado
positivo (≤5,25 ng/ml) ante un paciente que consulta por deterioro cognitivo orienta
el diagnóstico más hacia EA que hacia Pseudodemencia o Demencia con
Componente Vascular.
EA frente a controles
mayores de 60 años
EA frente a
Pseudodemencia
EA frente a Demencia
con Comp. Vascular
Valor
estimado
Intervalo
confianza
del 95 %
Valor
estimado
Intervalo
confianza
del 95 %
Valor
estimado
Intervalo
confianza
del 95 %
Sensibilidad 0,59 0,53-0,65 0,59 0,53-0,65 0,59 0,53-0,65
Especificidad 0,70 0,65-0,75 0,66 0,59-0,73 0,59 0,52-0,66
VPP 0,85 0,80-0,90 0,95 0,92-0,98 0,85 0,79-0,91
VPN 0,38 0,30-0,46 0,13 0,09-0,17 0,28 0,22-0,34
Tabla 10. Valores de sensibilidad, especificidad y predictivos para el diagnóstico de EA frente a controles mayores de 60 años (tomando el resultado como positivo si ≤5,25 ng/ml), EA frente a Pseudodemencia (tomando el resultado a favor de EA si ≤5,25) y de EA frente a Demencia con componente vascular (tomando el resultado a favor de EA si ≤5,25). VPP: valor predictivo positivo. VPN: valor predictivo negativo.
37
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
Finalmente, para proporcionar información dirigida a la toma de decisiones,
se obtuvieron curvas ROC de los niveles plasmáticos de neurosina en el diagnóstico
de EA frente a controles, Pseudodemencia y Demencia Vascular (Figura 15).
Figura 15. Curvas ROC para la determinación de la neurosina plasmática como prueba en el diagnóstico diferencial de EA frente a controles, Pseudodemencia y Demencia con Componente Vascular.
Las áreas bajo las curvas fueron: 0,677 (con un intervalo de confianza
0,582-0,719 para una probabilidad del 95%) en EA frente a controles, 0.703
(0,591-0,799) para EA frente a Pseudodemencia y 0,691 (0,583-0,752) para EA
frente a Demencia con Componente Vascular.
38
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
5. Valor pronóstico de la cuantificación de neurosina
5.1 Diferencias de los niveles de neurosina en pacientes con DCL en función
de la evolución diagnóstica.
El análisis retrospectivo de datos del grupo de pacientes con DCL (n=66) en
el que se realizó seguimiento durante 18 meses muestra resultados de interés
(Tabla 12). Existen diferencias significativas entre los grupos (p=0,024). Los
valores iniciales de neurosina plasmática fueron significativamente distintos en el
grupo de DCL que convirtió a Demencia con Componente Vascular (media: 7,17
ng/ml, intervalo de confianza 95%: 6,12-8,22) respecto al grupo que convirtió a EA
(media: 4,96 ng/ml, intervalo de confianza 95%: 4,08-5,84) (p=0,015) y al del
grupo que se mantuvo en el diagnóstico DCL (media: 5,03 ng/ml, intervalo de
confianza 95%:4,06-6,00) (p=0,036) (Figura 16). No hubo diferencias entre los que
se mantuvieron en DCL y los que convirtieron a EA (p=0,617). Dicho de otro modo,
en función de los intervalos de confianza, los pacientes con DCL que presentan un
valor de neurosina superior a 6,1 probablemente evolucionarán a Demencia con
Componente Vascular, mientras que los que presentan niveles entre 4 y 6 pueden
no convertir a demencia o convertir a EA.
Figura 16. Diagrama de cajas representando la comparación de valores iniciales de neurosina en los grupos diagnósticos de pacientes con DCL tras el seguimiento.
39
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
5.2 Valor pronóstico de los niveles neurosina en pacientes con DCL
Para calcular el riesgo de conversión de pacientes con DCL en función de su
concentración plasmática inicial de neurosina clasificamos a los pacientes en
aquellos con concentración baja (≤5,25) o alta (>5,25) (Tabla 11) y calculamos si
existe asociación entre los grupos por niveles y los grupos diagnósticos así como la
probabilidad de cada diagnóstico en función de los niveles de neurosina.
P (χ2 test) ≤5.25 >5.25 DCL 12 (40%) 18 (60%) 0.437 EA 7 (30%) 16 (70%) 0.004
DCV 12 (93%) 1 (7%) <0.001 Tabla 11. Asociación entre los niveles dicotomizados de neurosina en pacientes con DCL y su diagnóstico a los 18 meses.
En pacientes inicialmente diagnosticados de DCL existe asociación
significativa entre el desarrollo de Demencia con Componente Vascular y la
presencia de concentración plasmática de neurosina superior a 5,25 ng/ml
(p<0,001) así como entre el desarrollo de EA y una concentración plasmática
inferior a 5,25 ng/ml (p=0,004). La “no conversión” no se asocia significativamente
con ninguno de los grupos de niveles dicotomizados de neurosina.
La probabilidad o riesgo (Odds Ratio) de desarrollar Demencia con
Componente Vascular en pacientes con neurosina superiores a 5,25 ng/ml es 13,10
(con un intervalo de confianza 12,75-14,87 para una probabilidad del 95%) (Tabla
12).
Diagnóstico final Riesgo neurosina DC Vascular otros OR (95%CI) p ≤5.25 1 (7%) 34 (64 %) 1 >5.25 12 (93 %) 19 (36 %) 13.10 (11.92-14.32) 0.001 Tabla 12. Riesgo de desarrollar DCV en pacientes con DCL que presentan niveles altos de neurosina. La OR está corregida por sexo y edad.
El riesgo (Odds Ratio) de desarrollar EA en pacientes con DCL y niveles de
neurosina menores de 5,25 ng/ml fue 2,1 (con un intervalo de confianza 1,32-2,92
para una probabilidad del 95%) (Tabla 13).
Diagnóstico final Riesgo
neurosina EA otros OR (95%CI) p >5.25 7 (30%) 24 (56%) 1 ≤5.25 16 (70%) 19 (44%) 2.10 (1.32 -2.92) 0.013
Tabla 13. Riesgo de desarrollar EA en pacientes con DCL que presentan niveles bajos (≤5.25) de neurosina. La OR está corregida por sexo y edad.
40
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
5.3 Variación temporal de los niveles de neurosina en pacientes con DCL
durante el seguimiento.
Para determinar si existe variación en el tiempo de los niveles plasmáticos
de neurosina en pacientes diagnosticados con DCL y si tal variación tiene valor
predictivo del diagnóstico final, también se midió la concentración plasmática de
neurosina en 36 pacientes con DCL al final del periodo de seguimiento (Tabla 14).
Los resultados muestran que en tan sólo 18 meses los niveles de neurosina se
elevaron significativamente (desde 7,17 ng/ml a 8,79 ng/ml) en los pacientes que
progresaron a Demencia con Componente Vascular (p=0,043) mientras que el
descenso observado en este periodo en los pacientes que evolucionaron a EA (de
4,96 ng/ml a 4,87 ng/ml) no fue significativo (p=0,747). Por tanto, la elevación de
los niveles de neurosina en un paciente con DCL orienta a progresión hacia
Demencia con Componente Vascular.
Valor inicial (ng/ml) Valor final (ng/ml) Diagnóstico final
N media intervalo de N media intervalo de
confianza 95% confianza 95%
DCL 30 5,03 (4,06-6,00) 6 5,56 (4,69-6,43)
EA 23 4,96 (4,08-5,84) 19 4,87 (4,42-5,32)
Demencia con 13 7,17 (6,12-8,22) 11 8,79 (8,28-9,30)
Componente Vascular
Tabla 14: Valores (medios e intervalo de confianza) iniciales y tras el seguimiento en pacientes con DCL desglosados por diagnóstico tras el seguimiento.
5.4 Correlación entre el estadio evolutivo en Enfermedad de Alzheimer y los
niveles de neurosina
Finalmente nos propusimos hacer una estimación de cuál podría ser la
evolución teórica que seguirían los niveles de neurosina a lo largo de la evolución
de la EA, partiendo del estado de salud (controles) hasta la fase más avanzada de
la enfermedad. Para ello se tomaron los valores medios de neurosina en controles
mayores de 60 años (GDS 1), retrospectivamente se seleccionaron los pacientes
con DCL (GDS 3) que evolucionaron a EA (valor medio de neurosina 4,96) y se
añadieron los de la EA en sus distintos estadios evolutivos (GDS 4, 5 y 6) (Figura
17). Existe correlación significativa entre el grado de severidad y la concentración
de neurosina. (Factor de correlación de Pearson: -0,362, RSQ= 0,381, significación
bilateral p=0,041). Así puede decirse que a mayor severidad de la enfermedad,
menor concentración plasmática de neurosina. Como ya habíamos visto en el
apartado 4.1, la mayor caída en la concentración se produce en el estadio final
(GDS 6) de la enfermedad.
41
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
Por otro lado, en la Figura 17 puede observarse cómo el punto 5,25, que
previamente había sido seleccionado como el mejor punto de corte para el
diagnóstico de EA efectivamente parece separar los individuos aún sanos de los ya
enfermos.
Figura 17. Evolución de los niveles plasmáticos de neurosina en pacientes con EA a lo largo de los distintos estadios evolutivos. Se han tomado los valores medios de controles mayores de 60 años, pacientes con DCL que evolucionaron a EA y pacientes con EA en los distintos estadios. La línea discontinua en azul representa la correlación entre los niveles y el estadio evolutivo. La línea roja de puntos indica el nivel 5,25 ng/ml que previamente había sido seleccionado como el mejor punto de corte para el diagnóstico de EA.
42
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
V. DISCUSIÓN
Como hemos visto, la neurosina es una proteasa de expresión tisular,
preferentemente cerebral, a la que tanto los estudios de investigación básicos como
los estudios clínicos iniciales adjudican un papel en las demencias
neurodegenerativas. En todo caso permanecían sin estudiar la variación de la
concentración plasmática de neurosina en individuos sanos con la edad, las
diferencias de concentración en las distintas entidades causantes de deterioro
cognitivo y el comportamiento de la medición de neurosina en plasma como prueba
para la predicción evolutiva de pacientes con DCL y para el diagnóstico diferencial
de las demencias. Nuestro estudio abordó todos estos aspectos. Discutimos a
continuación los resultados más importantes.
La concentración plasmática de neurosina aumenta con la edad en individuos
sanos.
Si bien ya se había señalado que la expresión cerebral de neurosina
aumenta de forma fisiológica con la edad [40] se desconocía cuál era su
comportamiento en plasma. Nuestro estudio confirma que paralelamente a lo que
ocurre en el cerebro, la concentración plasmática de neurosina aumenta con la
edad en individuos sanos. Así, en números redondos, a los 20 años los valores son
próximos a 2 ng/ml mientras que a los 80 años tienden a situarse por encima de de
6 ng/ml.
La concentración plasmática de neurosina disminuye en pacientes con EA
Al contrario de lo que sucede en controles, en los pacientes con EA no hay
correlación entre los niveles plasmáticos de neurosina y la edad. De hecho, nuestro
estudio confirma que los niveles plasmáticos de neurosina descienden en pacientes
con EA paralelamente a lo que sucede en el cerebro de estos pacientes [39]. Este
resultado coincide con el resultado encontrado por otros grupos en plasma y LCR
[22, 58, 59] y parece indicar que la tendencia natural al aumento con la edad se
rompe en caso de aparición de EA.
Este hecho podría interpretarse como una de las causas -o una de las
consecuencias- de la fisiopatología de la EA. Si bien los mecanismos por los que la
neurosina puede estar implicada en la EA son desconocidos, la relación más directa
podría ser mediante la facilitación directa de formación de Aβ ya que a). en
condiciones normales el Aβ estimula la expresión de kalikreínas [22] y b) la
neurosina es una proteasa capaz de hidrolizar este péptido [32] favoreciendo su
eliminación. Así, un descenso en la expresión de neurosina podría contribuir a la
acumulación de Aβ en la EA.
43
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
La concentración plasmática de neurosina no difiere entre pacientes con EA y
pacientes con otras demencias neurodegenerativas, pero sí difiere entre EA y
demencia no neurodegenerativa.
Los pacientes con demencia de origen no neurodegenerativo
(Pseudodemencia o Demencia con Componente Vascular) tienen niveles más altos
de neurosina que los encontrados en pacientes con EA. Así, la medición de niveles
de neurosina puede resultar útil para diferenciar tanto entre individuos sanos y EA
como entre EA y pacientes con Pseudodemencia o Demencia con Componente
Vascular. No obstante, las curvas ROC de la neurosina plasmática revelan que la EA
puede ser distinguida de la Demencia Vascular y de la Pseudodemencia con una
precisión “regular” en términos generales aunque el valor predictivo positivo
alcanza cifras de 85-95%, por lo que una concentración plasmática disminuida en
un paciente con demencia apoya la opción de EA frente a Demencia con
Componente Vascular o Pseudodemencia (Tablas 15 y 16).
Los pacientes con enfermedad psiquiátrica pueden presentar clínica cognitiva
y trastorno del comportamiento similar al presente en pacientes con diversas
formas de demencia, como la Frontotemporal o la EA. En ocasiones resulta difícil
discernir si un paciente con quejas cognitivas y clínica psiquiátrica incluyendo
trastorno del comportamiento presentan una enfermedad puramente psiquiátrica o
una demencia con clínica psiquiátrica. La evaluación neuropsicológica suele arrojar
luz sobre este dilema. Como vemos, la determinación de la concentración de
neurosina también puede ser de utilidad, ya que en los pacientes con enfermedad
psiquiátrica (Pseudodemencia) la concentración es más elevada que en los
pacientes con EA.
En la Demencia con Componente Vascular, un daño isquémico, único o
múltiple, da lugar a los déficits neuropsicológicos. Si bien puede coexistir con un
proceso neurodegenerativo, detectar el componente vascular es importante dado
que supone una oportunidad de poder actuar sobre los factores de riesgo y permite
instaurar tratamientos farmacológicos dirigidos a la profilaxis secundaria. El
mecanismo fisiopatológico por el que la Demencia con Componente Vascular se
asocia con incremento de la concentración plasmática de neurosina tampoco es
conocido. Una posible explicación es la interacción de la neurosina con los PARs
(Receptores Activados por Proteasas). Los PARs comprenden una familia de
receptores acoplados a la proteína G que se activan por la trombina u otros factores
de la coagulación o proteasas inflamatorias liberadas en los puntos de daño tisular
[60]. Los PARs están ampliamente distribuidos en el SNC, y de forma similar a la
neurosina las densidades más importantes se encuentran en el hipocampo, córtex,
amígdala, tálamo, hipotálamo y estriado [26]. El PAR2 puede ser activado por la
44
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
neurosina [19, 27]. Entre otras acciones, PAR2 induce dilatación arterial y venosa
favoreciendo la desregulación de la presión arterial, que a su vez puede contribuir
de forma importante al desarrollo del daño vascular asociado a la Demencia con
Componente Vascular [61, 62].
Existe una clara superposición en la concentración de neurosina entre la EA
y otras demencias degenerativas (Demencia Frontotempolar, Demencia con
Cuerpos de Lewy y Afasia progresiva), lo que sugiere que la neurosina podría
participar en algún mecanismo común a varios procesos neurodegenerativos. Por
tanto, la medición de la concentración plasmática de neurosina no es un buen
parámetro para ayudar a discernir entre estos procesos (Tabla 15).
La concentración plasmática de neurosina no difiere entre pacientes con DCL
y pacientes con demencia.
No se encontraron diferencias entre ninguna forma de demencia y el DCL,
por lo que este parámetro no resulta de ayuda para clasificar a los individuos en
sanos/DCL/demencia (Tabla 15).
Actualmente el DCL se entiende como un estado transicional, de duración
variable –varios años en general-, por el que pasan algunos pacientes al comienzo
de su enfermedad que finalmente les llevará a sufrir demencia, bien degenerativa
bien de otro origen como la vascular; aunque también incluye pacientes que no
padecen ninguna enfermedad progresiva y que por tanto nunca desarrollarán una
demencia. El paciente muestra alteraciones cognitivas de intensidad leve, no
suficientes para alterar su funcionamiento global [3]. Es lógico, por tanto, que la
media de neurosina en este grupo no difiera significativamente de la de controles ni
pacientes con EA leve.
La concentración plasmática de neurosina tiene valor pronóstico
Aún más interesantes fueron los resultados del seguimiento de un subgrupo
de pacientes con DCL durante un periodo de 18 meses, al final del cual se volvió a
medir la concentración plasmática de neurosina en alguno de ellos. El valor medio
de neurosina plasmática difiere significativamente entre los pacientes que
evolucionaron a Demencia con Componente Vascular y los pacientes que
evolucionaron a EA o que se mantuvieron en DCL, por lo que el valor de neurosina
en pacientes con DCL tiene valor pronóstico (Tablas 15 y 16). Además hemos
podido estimar el riesgo de conversión hacia los distintos trastornos en función de
los niveles de neurosina: así unos niveles inferiores a 5,25 ng/ml hacen muy
improbable la evolución hacia Demencia con Componente Vascular mientras que el
riesgo relativo de evolucionar a EA es 2; y viceversa, unos niveles superiores a 5,25
45
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
ng/ml elevan de forma muy importante la probabilidad de evolucionar a Demencia
con Componente Vascular (Odds ratio de 13). Por último, las mediciones seriadas
de la concentración plasmática de neurosina también son un buen indicador de la
evolución de la enfermedad, ya que un ascenso en las mismas se asocia con
evolución hacia Demencia con Componente vascular.
Estos resultados pronósticos tienen gran trascendencia clínica, ya que
ofrecen una oportunidad para instaurar medidas preventivas dirigidas a tratar de
limitar la evolución natural de la enfermedad. Por ejemplo, ante un paciente con
DCL y neurosina superior a 5,25 sería razonable indicar un control estricto de los
factores de riesgo vascular y quizás podría indicarse también profilaxis
farmacológica con antiagregantes.
Por otro lado, el hecho de que la concentración de neurosina se correlacione
con el grado de severidad en pacientes con EA supone que su determinación
seriada podría resultar de utilidad para ayudar a monitorizar la progresión de la
enfermedad, lo que a su vez podría ayudar a valorar, junto a los parámetros
clínicos, la respuesta a los medicamentos “anti-Alzheimer”.
La medición de la concentración plasmática de neurosina...:
srve para ayudar a: no sirve para:
Diferenciar entre demencia por EA e individuos sanos.
Diferenciar entre EA leve / individuos sanos / pacientes con DCL.
Diferenciar entre demencia por EA y Demencia con componente vascular.
Diferenciar entre demencias de origen neurodegenerativo.
Diferenciar entre demencia por EA y Pseudodemencia.
Diferenciar entre EA y Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
Monitorizar la progresión de la enfermedad en pacientes con EA y pacientes con DCL.
Predecir la evolución de pacientes con DCL.
Estimar el riesgo de conversión a demencia en pacientes con DCL.
Tabla 15. Situaciones para las que puede resultar de utilidad la medición de la concentración plasmática de neurosina y situaciones para las que no es de utilidad.
46
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
En caso de Un valor de neurosina... Orienta a Valor estadístico
Duda entre EA – individuo sano
Menor de 5,25 ng/ml EA VPP: 0,85
Duda entre EA- Pseudodemencia
Menor de 5,25 ng/ml EA VPP: 0,95
Tabla 16. Resumen de las principales situaciones clínicas de utilidad de la prueba y orientación diagnóstica en función del resultado.
Así pues, se puede concluir afirmando que la determinación plasmática de
neurosina no ofrece rendimiento en el diagnóstico diferencial de las distintas formas
de demencia de origen neurodegenerativo –incluyendo la Enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob- pero sí es útil para diferenciar la EA de otras entidades no
degenerativas que también cursan con síntomas cognitivos –Demencia con
Componente Vascular y Pseudodemencia- y para estimar el riesgo de evolución a
algunas formas de demencia desde la fase de DCL. Se confirma, por tanto, la
utilidad de la prueba como parámetro de ayuda ante determinados diagnósticos
diferenciales en la práctica clínica habitual.
Duda entre EA- Demencia con componente vascular
Menor de 5,25 ng/ml EA VPP: 0,85
Probabilidad 95%
DCL Mayor de 6,1 ng/ml Evolución a Demencia Comp. Vasc.
DCL Menor de 6 ng/ml Evolución a EA o No Conversión
Probabilidad 95%
DCL Elevación de los niveles respecto a valor previo
Evolución a Demencia Comp. Vasc.
p=0,043
Estimación de Riesgo de conversión en pacientes con DCL
Menor de 5,25 ng/ml conversión a EA
OR: 2,1
OR: 13,1 Estimación del Riesgo de conversión en pacientes con DCL
Mayor de 5,25 ng/ml Conversión a Demencia con Componente Vascular
47
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
VI. CONCLUSIONES
• Paralelamente a lo que ocurre en el tejido cerebral, los resultados de este
estudio demuestran que la concentración plasmática de neurosina se
incrementa de forma fisiológica con la edad.
• La concentración plasmática de neurosina disminuye significativamente en
pacientes con Enfermedad de Alzheimer respecto a controles.
• La disminución más importante en la Enfermedad de Alzheimer se produce
en fases avanzadas mientras que los niveles en fase leve no difieren
significativamente de los controles o de los individuos con Deterioro
Cognitivo Leve.
• La cuantificación de la concentración plasmática de neurosina puede resultar
de utilizad para ayudar a diferenciar entre demencia por Enfermedad de
Alzheimer y Demencia con Componente Vascular.
• La cuantificación de la concentración plasmática de neurosina puede resultar
de utilizad para ayudar a diferenciar entre demencia por Enfermedad de
Alzheimer y Pseudodemencia.
• La concentración plasmática de neurosina en pacientes con Deterioro
Cognitivo Leve es útil para estimar el riesgo de conversión a distintas formas
de demencia: un nivel alto (superior a 5,25 ng/ml) aumenta de forma
importante el riesgo de evolución a Demencia con Componente Vascular
(Odds Ratio: 13) mientras que un nivel bajo (inferior a 5,25) aumenta
moderadamente el riesgo de evolución a EA (Odds Ratio: 2).
• El seguimiento de los niveles de neurosina en un paciente con Deterioro
Cognitivo Leve tiene valor pronóstico: una elevación de los mismos orienta
la evolución hacia Demencia con Componente vascular.
48
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
VII. BIBLIOGRAFÍA
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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
VIII. ENGLISH SUMMARY
Dementia is one of the most common causes of institutionalization,
morbidity, and mortality among the elderly. As life expectancy increases, the
number of people affected by dementia also increases. The diagnosis of the
different causes of dementia remains based on clinical criteria which allow a
“probabilistic” diagnosis once other causes of cognitive impairment have been
discarded. Furthermore, symptoms of different dementias overlap with each other
and even with some psychiatric disorders with cognitive symptoms thus
complicating differential diagnosis. It is estimated that by the time a patient is
diagnosed with any neurodegenerative dementia, the disease has been progressing
for many years. Mild Cognitive Impairment (MCI) is a disorder considered to be a
transitional stage from health to dementia. Diagnosis of dementias at these early
stages is always troublesome because the pathophysiologic events leading to
dementia precede clinical symptoms. For these reasons the search for molecular
biomarkers that allow classifying different types of dementias is of high importance.
During recent years the number of studies that describe the potential value
of several proteins to diagnose or predict outcome of different types of dementias
have increased exponentially. One of such markers is neurosin (Kallikrein 6).
Neurosin is a “trypsin like” serine-protease expressed mainly in the brain. Previous
studies suggested that neurosin is a potential biomarker for Alzheimer’s disease
(AD) since its levels in brain tissue, CSF, and blood appear to be altered in AD.
However, the sensitivity and specificity of plasmatic neurosin in AD and other
dementias remain to be determined.
To address this gap in knowledge and test the value of measuring the levels
of neurosin as a diagnosis tool for MCI, AD and other dementias, we investigated
the correlation between plasmatic levels of neurosin and the final diagnosis of
patients with cognitive symptoms. Thus we measured plasmatic levels of neurosin
in healthy individuals and patients with cognitive symptoms independently of what
the final diagnosis was.
We collected plasma samples from 228 controls and 447 patients diagnosed
with either AD, Mild Cognitive Impairment MCI), Dementia with Lewy Bodies or
Parkinson-Dementia, Frontotemporal Dementia, Huntington’s disease, Primary
Progressive Aphasia, Corticobasal degeneration, Creutzfeldt-Jakob’s disease and
Pseudodementia. Sixty six MCI patients were observed for 18 months and then
plasmatic neurosin was measured again in 36.
Plasmatic levels of neurosin increase with age in healthy individuals and
decrease in patients with AD. Plasmatic levels of neurosin differ significantly
between AD and Dementia with Vascular Component, Pseudodementia and the
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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
control group. Analyses comparing any other form of neurodegenerative dementia
to the AD group did not show significant differences. The mean value of plasmatic
neurosin concentration differs significantly between MCI patients who converted to
Dementia with Vascular Component, those who converted to AD, and those who
remained at MCI stage. The risk of developing Dementia with Vascular Component
when neurosin levels are higher than 5.25 ng/ml is very high (Odds ratio 13) while
the risk of developing mild AD when neurosin levels are lower than 5.25 ng/ml is 2.
Increases in the levels of neurosin suggest progression to Dementia with Vascular
Component.
In conclusion, the measurement of plasmatic levels of neurosin is a useful
diagnostic tool to assist in distinguishing AD patients from subjects without
neurodegenerative dementia (either Pseudodementia, Vascular Dementia or
controls) although it is not useful to distinguish different types of
neurodegenerative dementias. The measurement of plasmatic neurosin
concentration in patients diagnosed with MCI may predict conversion from MCI to
Dementia with Vascular Component. A single measurement may be useful to
estimate the risk of developing AD and Dementia with vascular component. Finally,
repeated measurement of plasmatic neurosin might be a useful test to predict
outcome in patients with MCI.
58
Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias
IX. ANEXO
Los estudios de esta tesis doctoral han dado lugar a la publicación de dos
artículos científicos en revistas internacionales, centrados en las entidades donde
los resultados han mostrado mayor utilidad: la Enfermedad de Alzheimer y el
Deterioro Cognitivo Leve. Las referencias se citan a continuación:
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