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CROMATOGRAFADE INTERCAMBIOINICOFERNANDA FUENTEALBAVALENTINA FUENTESMACARENA LOBOCARLA MORAROMINA PULVERMLLERJONATHAN RIQUELME

FACULTAD DE MEDICINAESCUELA DE MEDICINABIOQUMICADOCENTES: Dr. REGINALDO DEL POZOBQ. MIRNA MUOZMIRCOLES 30 DE JUNIO DE 2010

TCNICAS BIOQUMICAS:

CROMATOGRAFA Mtodo usado principalmente para la separacin de los componentes de una muestra, en el cual los componentes son distribuidos entre dos fases: Estacionaria Mvil

Las retenciones pueden tener su origen en dos fenmenos de interaccin entre las dos fases: Adsorcin Absorcin

CROMATOGRAFA Funciones: Separar los componentes de la mezcla. Medir las proporciones de los componentes.

Tipos: Cromatografa plana Cromatografa en columna

Mtodo de separacin que permite la separacin de molculas basada en sus propiedades de carga elctrica.

Fase Estacionaria: Insoluble, lleva en la superficie cargas electrostticas fijas que retienen contraiones mviles que pueden intercambiarse por iones de la fase mvil.

Fase Mvil: Disolucin acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgnico miscible con agua que contiene especies inicas en forma, generalmente de buffer. Los iones de la fase mvil compiten con los analitos por los sitios activos de la fase estacionaria. CROMATOGRAFA DEINTERCAMBIO INICO

Principio: las molculas cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas molculas pueden ser unidas o desunidas cambiando el ambiente inico.

La separacin mediante intercambiadores inicos se realiza por lo general, en dos fases:

Las sustancias a separar se unen al intercambiador utilizando condiciones que originan una unin fuerte y estable.

Se eluye de la columna con tampones de diferentes pH o diferente fuerza inica, compitiendo los componentes del tampn con el material, por los sitios de unin.CROMATOGRAFA DEINTERCAMBIO INICO

PROPIEDADES DE LOSINTERCAMBIADORESIntercambiador Inico: Polmero que tiene grupos cargados unidos.

Intercambiador Catinico: Si un grupo est cargado negativamente, podr intercambiar iones positivos.

Un grupo tpico que se utiliza en los intercambiadores de cationes es el grupo sulfnico, SO3-. El grupo cido sulfnico es un intercambiador de cationes fuertemente acido. Otros grupos de utilizacin corriente son el carbonilo e hidroxilo fenlico, dos intercambiadores catinicos dbilmente cidos.

PROPIEDADES DE LOSINTERCAMBIADORESIntercambiador Aninico: Si el grupo cargado es positivo, es un intercambiador de aniones. Los intercambiadores aninicos dbilmente bsicos ms corrientes son grupos aminos alifticos o aromticos.

MATERIALESColumna de vidrioMatriz de intercambio inico (Resina) Eluyente Muestra a fraccionar Colectores.

PROCEDIMIENTOEquilibrio: Toda la fase estacionaria se encuentra asociada a iones complementarios (que pueden ser cloro o sodio). Aplicacin y Lavado: Aplicar la muestra la cual queremos filtrar a travs de la columna mediante un lavado especfico. Se aplica un buffer con el mismo pH y fuerza inica que el buffer inicial para que todas las protenas cargadas se unan al intercambiador.

Elusin: Las molculas captadas por el intercambiador son eludas debido a cambios en la composicin del buffer. Regeneracin: Remover las partculas que an estn asociadas al intercambiador. Se debe generar un cambio ms drstico en el pH y la concentracin salina. La fase estacionaria puede volver a ser utilizada.

PROCEDIMIENTO

ADSORCIN/DESORCIN ADSORCIN-La fuerza de adsorcin aumenta con el aumento de carga neta.

DESORCINReducir la carga neta cambiando el pHAgregar un in que compita por las cargas del intercambiador.

GRADIENTE DE NaCl

Resina de intercambio catinico antes de aadir la muestra. Se aade la muestra, una mezcla de Asp, Ser y Lys. Se aade Na+ (NaCl), el Asp, el aminocido con menos carga positiva eluye el primero. Se aumenta el Na+, a continuacin eluye la Ser. Se aumenta el Na+, la Lys, el que posee ms carga positiva eluye el ltimo.(A) (B) (C) (D) (E)

VENTAJAS/DESVENTAJASVentajas: Alta capacidadAlta resolucinPaso concentrador: Se puede sembrar un gran volumen para luego eluirlo en un menor volumen.Con una misma columna se puede utilizar a diferentes pH y obtener diversos perfiles de elucin.

Desventajas:Las muestras deben estar desalinizadas antes de ser aplicadas a este tipo de cromatografa

TIEMPO DERETENCIN

Tiempo que un compuesto tarda en salir de la columna.

Se basa en la atraccin entre iones del soluto y la carga complementaria de la fase estacionaria. Los intercambiadores inicos favorecen la unin de iones de mayor carga y radio inferior. Cuando la retencin de los compuestos se ve afectada, se favorece la elusin de ellos para ser recolectados en una serie de fracciones.

pH Los intercambiadores inicos se clasifican en cidos o bsicos, fuertes o dbiles.

Las resinas cidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy cidas, en cambio las resinas cidas dbiles se protonan a un pH prximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio catinico, reducindose as, el tiempo de retencin.

Los grupos muy bsicos de amonio cuaternario siguen siendo catinicos a cualquier valor de pH. Los bsicos dbiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente bsicas y pierden entonces su capacidad, reducindose tambin el tiempo de retencin.

CARGAS

La fuerza de enlace de la muestra depende de la magnitud de la carga. La fuerza de retencin es mayor y, por consiguiente la de elusin es menor, mientras ms cargado se encuentre el compuesto, ya sea negativa (aniones) o positivamente (cationes).

CARGAS Los iones polivalentes se unen con mayor fuerza a la fase estacionaria que los monovalentes.

GRADIENTE Aumentando la concentracin de la fase mvil, los iones compiten cada vez ms favorablemente con la muestra por los sitios activos cargados de la fase estacionaria.

POROSIDAD En membranas cuyo tamao de poro es pequeo no hay espacio suficiente para unir el in dentro de dichos poros por lo que la cantidad de intercambiador por unidad de superficie es menor.

En membranas con tamao de poro mayor, se puede unir el compuesto mvil dentro de dichos poros, con lo que se incrementa la cantidad de intercambiador por unidad de superficie. La porosidad busca una mayor superficie de intercambio.

poro pequeo (menor de 600)

poro grande (mayor de 600)

SUPRESORESDE IONES La conductividad de la fase mvil se hace muy elevada debido a la alta concentracin inica necesaria para eluir a la mayora de los iones; esto hace muy difcil la deteccin de pequeas concentraciones de analito.

Este problema se resolvi mediante un sistema supresor de conductibilidad colocado a la salida de la columna cromatogrfica.

Los primeros supresores fueron columnas de intercambio inico que convierten los iones del disolvente en especies moleculares poco ionizadas y por lo tanto poco conductoras.

CROMATOGRAMA El cromatograma es el resultado grfico de la cromatografa. En el caso de separacin ptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden a los componentes de la mezcla separada.

La posicin de los mximos nos indica el in presente (carcter Cualitativo) y su rea nos indica la cantidad existente de dicho in (carcter Cuantitativo).

CROMATGRAFOUna vez separada, la muestra pasa a travs del detector donde se registra la seal obtenida respecto al tiempo de retencin.

Registran los cromatogramas.

Se emplean en la determinacin de fluoruros, cloruros, nitritos, nitratos, bromuros fosfatos y sulfatos.

APLICACIONES MEDICIN DE LA HEMOGLOBINA GLICOSILADA.

DETERMINACIN DE PBG Y ALA EN LA ORINA.

HEMOGLOBINAGLICOSILADA El porcentaje de protena unida a la glucosa es lo que se denomina hemoglobina glicosilada (HbA1). Cuanto mayor es la cantidad de glucosa en la sangre, ms se une a las protenas y su porcentaje de unin indica cual ha sido la cantidad media de glucosa circulante durante el tiempo de vida de la hemoglobina.

Como los eritrocitos son fcilmente permeables a la glucosa, el nivel de la HbA1 en una muestra de sangre facilita la historia glicmica de los 120 das anteriores, que corresponde a la vida media de estas clulas.

HEMOGLOBINAGLICOSILADAHbA1c (%)Promedio de Glicemias (mg/dl)Calificacin5-680-120Excelente6-7120-150Muy Bueno7-8150-180Bueno8-9180-210Regular9-10210-240Problemtico10-11240-270Malo11-12270-300Muy Malo

HEMOGLOBINAGLICOSILADA

HEMOGLOBINAGLICOSILADA

El mtodo de cromatografa de intercambio inico se basa en la elusin diferencial de la hemoglobina glicosilada por el cambio de carga que se produce en la molcula debido a la glicacin del grupo amino terminal de la cadena. Para realizar el procedimiento se utiliza carboximetil celulosa cargada (-).

PBG Y ALAEN ORINA Porfirias: grupo de enfermedades de origen gentico o adquirido. Existe alteracin en la actividad de una o varias enzimas de la va metablica delgrupo HEM, lo que ocasiona niveles anormalmente elevados de porfirinas o sus precursores (cido delta-aminolevulnico [ALA] y porfobilingeno [PBG]).

Estos se acumulan en los tejidos y se excretan en la orina y las heces. Las manifestaciones patolgicas son producidas casi en su totalidad por los efectos sobre el sistema nervioso y la piel.

PBG Y ALAEN ORINA La Porfiria Intermitente Aguda (PAI) es un desorden autosmico dominante, que causa deficiencia parcial de la actividad de la porfobilingeno desaminasa (PBGD), tercera enzima de la ruta de sntesis del grupo HEM.

Cuando los pacientes con PAI presentan una crisis aguda, disminuye la actividad de la PBGD y, como consecuencia los niveles de BPG y/o ALA en la orina se incrementan significativamente.

Durante la crisis aguda, el PBG urinario aumenta de 20 a 200 mg/da, cuyos valores de referencia son de 0-4 mg/da, y la excrecin de ALA se eleva aproximadamente a la mitad, 10-100 mg/da, cuando sus valores de referencia son 0-7mg/da.

PBG Y ALAEN ORINA El mtodo de Mauzerall-Granick es el ms usados para la cuantificacin de estos dos precursores. Se basa en la tcnica de cromatografa de intercambio inico, en la cual se utilizan columnas con resinas aninicas y catinicas.

El PBG se queda retenido en la aninica y el ALA en la catinica. En la columna con PBG, se utiliza cido actico 1M para que ste eluya y pueda ser cuantificado. En la columna con ALA, se le agrega acetato de sodio 1M para que ste eluya y sea cuantificado. Luego, el eluido de cada columna reacciona con Reactivo de Ehrlich, formando un producto rojo intenso. Este reactivo est conformado por 4-dimetilbenceno diluido en cido actico y cido perclrico.

El producto es medido espectrofotomtricamente a 553 nm, y a partir de esta medicin se puede calcular la concentracin de estos intermediarios.

OTRAS APLICACIONESExtraccin y purificacin de cidos nucleicosPurificacin de aguaPurificacin del fibringeno de la lecheDeterminacin de anticonvulsantes en el suero despus de la extraccin de la fase slida.Anlisis de antibiticos de politerDeterminacin de pesticidas.Identificacin de cidos orgnicos en la fruta y en el jugo.Deteccin de derivacin-fluorescencia post-columna para anlisis para varios tipos de pesticidas agrcolas .Determinacin de metabolitos de Triptofan en el suero umbilical.

CONCLUSIONESExtraccin y purificacin de cidos nucleicosPurificacin de aguaPurificacin del fibringeno de la lecheDeterminacin de anticonvulsantes en el suero despus de la extraccin de la fase slida.Anlisis de antibiticos de politerDeterminacin de pesticidas.Identificacin de cidos orgnicos en la fruta y en el jugo.Deteccin de derivacin-fluorescencia post-columna para anlisis para varios tipos de pesticidas agrcolas .Determinacin de metabolitos de Triptofan en el suero umbilical.