CROMATOGRAFA

1. DEFINICIN

La cromatografa es una tcnica de separacin en la que los componentes que se han de separar se distribuyen en dos fases inmiscibles: una fase mvil que se desplaza en una direccin definida y otra fase fija o estacionaria.

La palabra cromatografa fue utilizada por primera vez por el botnico ruso M. Tswett en 1906 para designar una tcnica empleada por l en la separacin de pigmentos vegetales: hizo pasar un extracto de hojas verdes por una columna de vidrio rellena con carbonato de calcio adicionando un disolvente por la parte superior de la columna y obtuvo una serie de bandas horizontales coloreadas.

Mediante la cromatografa es posible separar, identificar y posteriormente cuantificar los componentes de mezclas que de otra manera slo pueden separarse con grandes dificultades o incluso no separarse. Es una tcnica utilizada tanto con fines analticos como preparativos.

2. TRMINOS DEL PROCESO CROMATOGRFICO

Fase mvil: Fluido que se desplaza a travs del lecho cromatogrfico en una direccin definida. Cuando la fase mvil abandona la columna cromatogrfica recibe el nombre de eluyente.

Fase estacionaria: Puede ser un slido, un gel o un lquido que permanece fijo en el interior de la columna cromatogrfica. Si es un lquido debe estar distribuido en un soporte slido, unido covalentemente o inmovilizado en l.

Detector: Instrumento que mide el cambio en la composicin del eluyente mediante la determinacin de sus propiedades fsicas o qumicas.

Cromatograma: Representacin de la respuesta del detector, en la que se registra la concentracin de la sustancia o de masa del componente en estudio en el eluyente respecto al volumen eludo o al tiempo.

3. TIPOS DE CROMATOGRAFA

Segn el proceso

CROMATOGRAFA FRONTAL: Si la muestra fluye de forma continua por el lecho cromatogrfico, sin requerir una fase mvil adicional.

CROMATOGRAFIA POR ELUCIN: Cuando la muestra es arrastrada por un eluyente.

CROMATOGRAFIA POR DESPLAZAMIENTO: Si la fase mvil contiene un compuesto que queda retenido con ms fuerza que el componente de la muestra a separar, de modo que ste es desplazada.

http://ocw.uc3m.es/ciencia-e-oin/caracterizacion-de-materiales/material-de-clase-1/Apuntes_Tecnicas_de_separacion_cromatografica.pdf

Explicacin de la imagen:

Para llevar a cabo el desarrollo por desplazamiento, se toma como fase mvil una solucin de una sustancia que sea retenida por el adsorbente ms fuertemente que cualquiera de los componentes de la mezcla problema. El soluto presente en el eluyente (es decir, el designado por C en la figura), desplaza a los componentes de la muestra (A y B por ejemplo) de la zona en que estn retenidos al principio de la columna. Si B es adsorbido ms fuertemente que A, B desplaza sucesivamente a A. Por tanto las zonas descienden por la columna en el orden A, B y C (parte B de la figura). Sin embargo, esta tcnica presenta el inconveniente de que las zonas no quedan separadas por regiones de disolvente puro, pudindose originar, por tanto, una superposicin considerable. En ciertos casos, este problema se resuelve introduciendo otra sustancia en el eluyente que tenga unas propiedades de adsorcin intermedias entre las de A y B.

En el anlisis frontal, una columna pequea se rellena con un peso conocido de adsorbente, y se hace pasar por ella de modo continuo la solucin que contiene la muestra problema, la cual, en este caso, se convierte en la fase mvil. Inicialmente quedan retenidos todos los solutos presentes en la muestra, pero al continuar la adicin de sta, el adsorbente alcanza la saturacin y van siendo desplazadas las sustancias retenidas ms dbilmente (por ejemplo, A), las cuales, finalmente, salen de la columna. El anlisis de la fase mvil que sale de la columna da un resultado del tipo indicado en la figura . El Primer escaln est formado exclusivamente por la sustancia A; el segundo consta principalmente de la sustancia B, aunque impurificada por la A que es aportada continuamente por la muestra. El tercer escaln contiene ya la mezcla inicial A+B+C, aunque al principio algo disminuida en B. El nmero de escalones en la curva es igual al nmero de componentes en la mezcla. La cantidad de sustancia A en la mezcla inicial se calcula a partir del volumen de disolvente que pasa por la columna hasta el momento que sale A. Los otros componentes se evalan tambin a partir de relaciones volumen-concentracin.

La cromatografa por elucin se utiliza para obtener productos biotecnolgicos con un alto grado de pureza.

Segn el estado fsico de la fase mvil

CROMATOGRAFA EN FASE GASEOSA: Si la fase mvil es un gas.

CROMATOGRAFA EN FASE LQUIDA: Si la fase mvil es un lquido.

Liquido-Liquido.

Liquido-Solido.

Liquido-Gel.

Cromatografa lquido-lquido

En la cromatografa lquido-lquido se utiliza un adsorbente slido impregnado con un lquido que funciona como fase estacionaria. La separacin de los solutos es resultado de las diferencias en los coeficientes de particin de cada uno de los solutos de la mezcla entre las fases lquidas (estacionaria y mvil).

Cromatografa por filtracin en gel

La cromatografa por filtracin en gel utiliza partculas fabricadas de geles porosas que actan como mallas moleculares que permiten separar molculas en funcin de su tamao. Este tipo de cromatografa es comnmente empleada en las ltimas etapas de los procesos de obtencin de productos biotecnolgicos.

Cromatografa por adsorcin

La cromatografa por adsorcin emplea adsorbentes en los que los solutos a separar presentan diferentes grados de retencin. Existen varias modalidades caracterizadas bsicamente por el tipo de adsorbente que emplean, llamadas cromatografa de adsorcin: fsica, de intercambio inico, de interaccin hidrofbica, de fase reversa y de afinidad.

Cromatografa de adsorcin simple

La cromatografa por adsorcin simple se caracteriza por la unin del soluto al adsorbente por fuerzas dbiles del tipo de van Der Waals. Este tipo de cromatografa es poco selectiva entonces se utiliza poco a nivel analtico, pero por su bajo costo es utilizada a nivel industrial.

Cromatografa por intercambio inico

La cromatografa por intercambio inico se basa en la interaccin electrosttica entre los grupos cargados del soluto y los grupos de carga contraria de los adsorbentes.

Cromatografa de interaccin hidrofbica y cromatografa de fase reversa

Tanto la cromatografa de interaccin hidrofbica como la de fase reversa, se basan en la interaccin entre las regiones hidrofbicas de las biomolculas y los grupos hidrofbicos de los adsorbentes empleados.

Cromatografa por afinidad

La cromatografa por afinidad est basada en interacciones altamente especficas entre el soluto de inters y el adsorbente. Este tipo de cromatografa es muy empleada en la purificacin de protenas. Los adsorbentes utilizados en esta cromatografa presentan grupos qumicos llamados ligandos que son altamente especficos para la unin con los solutos.