Copia de TESIS-25 09 - educacion.gob.es
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INFECCIÓN POR EL VIRUS DE LA HEPATITIS C: ESTUDIO DE LOS RECEPTORES DE ENTRADA EN EL HEPATOCITO Y UTILIDAD DE LOS MÉTODOS NO INVASIVOS EN EL DIAGNÓSTICO DE LA FIBROSIS HEPÁTICA Gonzalo Crespo Conde Barcelona 2012
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INFECCIÓN POR EL VIRUS DE LA HEPATITIS C: ESTUDIO D E
LOS RECEPTORES DE ENTRADA EN EL HEPATOCITO Y
UTILIDAD DE LOS MÉTODOS NO INVASIVOS EN EL
DIAGNÓSTICO DE LA FIBROSIS HEPÁTICA
Gonzalo Crespo Conde
Barcelona 2012
I
FACULTAD DE MEDICINA
UNIVERSIDAD DE BARCELONA
______________________________________________________
INFECCIÓN POR EL VIRUS DE LA HEPATITIS C: ESTUDIO D E LOS
RECEPTORES DE ENTRADA EN EL HEPATOCITO Y UTILIDAD D E LOS
MÉTODOS NO INVASIVOS EN EL DIAGNÓSTICO DE LA FIBROS IS
HEPÁTICA
______________________________________________________
TESIS DOCTORAL presentada por GONZALO CRESPO CONDE para optar al
grado de Doctor en Medicina
Directores de la tesis: Dr. Xavier Forns Bernhardt y Dr Miquel Navasa Anadón
Barcelona, 2012
II
III
INFORME DE LOS DIRECTORES DE TESIS
Xavier Forns Bernhardt , Doctor en Medicina y Consultor del Servicio de Hepatología
del Hospital Clínic; y Miquel Navasa Anadón , Doctor en Medicina y Consultor Senior
del Servicio de Hepatología del Hospital Clínic
CERTIFICAN
que la Tesis Doctoral “INFECCIÓN POR EL VIRUS DE LA HEPATITIS C: ESTUDIO
DE LOS RECEPTORES DE ENTRADA EN EL HEPATOCITO Y UTI LIDAD DE LOS
MÉTODOS NO INVASIVOS EN EL DIAGNÓSTICO DE LA FIBROS IS HEPÁTICA”
presentada por Gonzalo Crespo Conde para optar al grado de Doctor en Medicina ha
sido realizada bajo nuestra dirección y cumple todos los requisitos necesarios para ser
defendida ante el Tribunal de evaluación correspondiente.
Dr. Xavier Forns Bernhardt Dr. Miquel Navasa Anadón
Directores de la Tesis
Barcelona, 2012
IV
V
AGRADECIMIENTOS
Esta tesis ha sido realizada gracias a la dirección sólida y al apoyo constante del
Dr. Forns y el Dr. Navasa. Sin su supervisión y su insistencia no habría podido llegar
aquí. Ambos son ejemplos de dedicación a la Medicina y de excelencia científica, y de
ambos he aprendido y continúo aprendiendo. Gracias también por su amistad y su
ánimo continuo, y por la formación que me han dado en el campo de las Hepatitis
Víricas y el Trasplante Hepático.
Buena parte de los trabajos realizados en esta tesis se deben a los compañeros
con los que he trabajado estos años, y con los que he pasado, a pesar de todo, muy
buenos ratos. Gracias a Patri González, Maire Coto-Llerena, Laura Mensa, Santse
Ramírez, Kuba Dragun, Giorgos Koutsoudakis y Sofía Pérez del Pulgar, nuestra team
leader!. Estar en el laboratorio con ellos me enseñó a admirar la investigación básica y
permitió que compartiéramos momentos muy divertidos.
Gracias al Dr. Sánchez Tapias y al Dr. Rimola por sus enseñanzas y su paciencia,
a la Dra. Rosa Miquel por tantas biopsias, y a Cupi Bartres y Gabi Ojeda por su buen
humor y por hacer con su excelente trabajo que el día a día del grupo sea mucho más
fácil. Mi reconocimiento al personal médico y de enfermería con los que he trabajado
estos años, principalmente al personal de la UCI, de la 9.3 (especialmente a Inma,
Carmen, Eva y Neus) y de consultas externas (Toñi y Ana). Todos ellos consiguen que
me siga encantando esta profesión y hacen que vaya cada día a trabajar con el mejor
ánimo.
El apoyo de los compañeros de trabajo que ahora son mis amigos ha sido
fundamental, tanto dentro como fuera del hospital: gracias por tantos ratos durante
VI
estos años a Carlos Rodríguez de Lope, Zoe Mariño, Sabela Lens, Catalina Parra,
Oriol Sendino, Enric Reverter, Juan Acevedo y Jose Carrión. Gracias muy especiales a
María Londoño.
A mis padres y a mis hermanos, por su apoyo, por su amor, por ser tan buena
gente, por darme la mejor educación, por intentar que sea una buena persona y por
promover mi curiosidad, apoyando desde el principio la decisión de venirme a
Barcelona. Esta tesis va dedicada a ellos.
A Raquel, por todo lo que hace y es, y porque ella es mi centro de todo. Esta tesis
no solamente es tan tuya como mía, sino que es para ti.
VII
ABREVIATURAS
ALT Alanino aminotransferasa
ARFI Acostic Radiation Force Impulse
ARN Ácido ribonucleico
AST Aspartato aminotransferasa
AUROC Área bajo la curva de la característica operativa del receptor
CBP Cirrosis biliar primaria
CEH Células estrelladas hepáticas
CLDN-1 Claudina 1
DDR-2 Receptor discoidin domain-2
EGF Factor de crecimiento epidérmico
EHGNA Enfermedad por hígado grado no alcohólico
ELF Enhanced Liver Fibrosis
GAG Glicosaminoglicanos
GFP Proteína verde fluorescente
GGT Gamma glutamil transpeptidasa
GPVH Gradiente de presión venosa hepática
HCVcc Virus de la hepatitis C derivado de cultivo celular
HCVpp Pseudopartícula de VHC
HDL Lipoproteínas de alta densidad
HS Heparansulfatos
HVR-1 Región hipervariable 1
IFN Interferón
IL Interleuquina
IMC Índice de masa corporal
IRES Sitio de unión de ribosomas
VIII
JFH-1 Japanese Fulminant Hepatitis 1
kPa Kilopascal
LDL Lipoproteínas de baja densidad
MCP Proteína atrayente de monocitos
MEC Matriz extracelular
MMP Metaloproteasas
mRNA Ácido ribonucleico mensajero
N/A No aplicable
OCC Ocludina
OH Alcohol
PDGF Factor de crecimiento derivado de plaquetas
PIIIP Propéptido aminoterminal de procolágeno tipo III
RIQ Rango intercuartil
ROC Característica operativa del receptor
ROS Especies reactivas de oxígeno
rtPCR Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real
SCID Inmunodeficiencia severa combinada
SR Índice de éxito
SR-BI Scavenger receptor clase B tipo I
TGF Factor de crecimiento transformante
TH Trasplante hepático
TIMP Inhibidor tisular de metaloproteasas
TNF Factor de necrosis tumoral
uPA Activador de plasminógeno uroquinasa
VHB Virus de la hepatitis B
VHC Virus de la hepatitis C
VLDL Lipoproteínas de muy baja densidad
IX
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN
· 1.1. EL VIRUS DE LA HEPATITIS C
· 1.2. EL ESTUDIO DE CICLO VITAL DEL VHC
1.2.1. El microambiente hepático del VHC: polarización celular
1.2.2. El sistema del replicon del VHC
1.2.3. El sistema de la pseudopartícula viral (HCVpp)
1.2.4. HCVcc: VHC derivado de cultivo celular
1.2.5 Problemática de los modelos actuales de estudio del VHC
· 1.3. MECANISMOS DE ENTRADA DEL VHC EN EL HEPATOCITO
1.3.1. Scavenger Receptor clase B tipo I (SR-BI)
1.3.2. CD81
1.3.3. Claudina-1
1.3.4. Occludina
1.3.5. Receptor de LDL
1.3.6. Transmisión del VHC célula a célula
1.3.7. Modificaciones en los receptores inducidas por el VHC
1.3.8. Estudios humanos de receptores del VHC
· 1.4. HISTORIA NATURAL DE LA INFECCIÓN POR VHC
· 1.5. RECURRENCIA DE LA HEPATITIS C TRAS EL TRASPLANTE HEPÁTICO
· 1.6. FIBROSIS HEPÁTICA: IMPORTANCIA Y CONCEPTO
· 1.7. BASES CELULARES Y MOLECULARES DE LA FIBROSIS HEPÁTICA 1.7.1. Células estrelladas hepáticas
1.7.2. Células inflamatorias
1.7.3. Células pluripotenciales, fibroblastos portales, colangiocitos y hepatocitos
1.7.4. Matriz extracelular
1.7.5. Reguladores de la degradación de matriz extracelular
X
· 1.8. MÉTODOS CLÁSICOS EN LA EVALUACIÓN DE LA FIBROSIS HEPÁTICA
1.8.1. La biopsia hepática
1.8.2. La medición del gradiente de presión venosa hepática
· 1.9. MÉTODOS NO INVASIVOS EN EL ESTUDIO DE LA FIBROSIS HEPÁTICA
1.9.1. Consideraciones metodológicas en los estudios de métodos no invasivos
1.9.2. Biomarcadores indirectos
1.9.3. Biomarcadores directos
1.9.4. Métodos elastográficos: Fibroscan®
1.9.5. Otros métodos elastográficos: ARFI
1.9.6. Combinaciones de métodos
2. HIPÓTESIS
3. OBJETIVOS
4. ESTUDIO 1. “ Hepatitis C Virus Receptors Claudin-1 and Occludin After Liver
Transplantation and Influence on Early Viral Kinetics”
5. ESTUDIO 2. “ARFI, Fibroscan®, ELF, and their combinations in the assessment of
liver fibrosis: a prospective study”
6. DISCUSIÓN
· 6.1. Papel de claudina, occludina y SR-BI en cinética viral precoz post trasplante e
influencia en la gravedad de la recurrencia de la hepatitis C post-trasplante.
· 6.2. ARFI, Fibroscan®, ELF y sus combinaciones en el diagnóstico no invasivo de la
fibrosis hepática.
7. CONCLUSIONES
8. ANEXOS
9. BIBLIOGRAFÍA
1. INTRODUCCIÓN
______________________________________________________
Introducción
13
1.1. EL VIRUS DE LA HEPATITIS C
El virus de la hepatitis C (VHC) es un virus que contiene una cadena simple de ARN
(ácido ribonucleico), recubierto y de doble polaridad, que pertenece a la familia
Flaviviridae y que infecta de manera predominante a las células hepáticas (1). El
genoma del virus codifica en el ribosoma de la célula huésped una poliproteína que es
procesada por proteasas virales y del huésped en tres proteínas estructurales (la
proteína de la cápside -core- y dos proteínas de la envuelta -E1 y E2-), la proteína p7,
que actúa como canal iónico (viroporina) y es esencial para el ensamblaje de la partícula
viral, y varias proteínas no estructurales (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B). La
partícula viral consiste en una nucleocápside que contiene el genoma viral y es
compactada por la proteína core. A su vez, la proteína core está rodeada de una bicapa
lipídica que alberga las dos glicoproteínas de la envuelta, las cuales forman
heterodímeros y juegan un papel principal en el ciclo vital del virus (2).
Figura 1. Estructura de la partícula de VHC
Introducción
14
La replicación del VHC es muy dinámica: la vida media de los viriones es de 2-3
horas y su producción está alrededor de 1012 viriones/24 hrs (3). Esta actividad
replicativa, junto con la incapacidad para reparar mutaciones, provoca una gran
heterogeneidad genética, responsable de la existencia de 6 genotipos diferentes (1-6)
(4). Estos genotipos difieren aproximadamente en el 30-35% en la secuencia de
nucleótidos y su prevalencia varía según la región geográfica mundial (5,6). Además,
dentro de cada genotipo existen diferentes subtipos (designados con letras), que difieren
en torno al 20-25% de los nucleótidos (7). Finalmente, existen diferentes cuasiespecies,
que son variantes con mínimas (<2%) diferencias que representan la variabilidad del
VHC dentro de cada individuo (8,9).
Para iniciar su ciclo vital, el VHC debe entrar en la célula diana (el hepatocito) para
proceder a la traducción del genoma viral en la poliproteína, que tiene lugar en el
ribosoma celular. Posteriormente, esta poliproteína será procesada en el retículo
endoplásmico y el virión se ensamblará en el citosol en partículas lipídicas, que serán
excretadas de la célula (al menos en parte) en forma de lipoviropartículas. De hecho, las
partículas del VHC se encuentran en suero en formas canónicas libres de lipoproteínas
y también como partículas asociadas con lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL),
en las llamadas lipoviropartículas (10).
Introducción
15
1.2. EL ESTUDIO DEL CICLO VITAL DEL VHC
El estudio de un virus implica disponer de modelos para investigar los procesos de
entrada y replicación en las células. El órgano diana del VHC, el hígado, es un órgano
altamente especializado con varios tipos celulares y relaciones intercelulares complejas,
extremadamente difíciles de reproducir en modelos in vitro (11). Así, los estudios del
ciclo vital del VHC se han visto dificultados durante años por la falta de modelos
adecuados y, de hecho, el reconocimiento de los receptores de entrada del VHC en el
hepatocito se inició más de 10 años después de identificar el virus.
Los primeros estudios del VHC se llevaron a cabo mediante el uso de suero de
pacientes infectados y hepatocitos humanos o de chimpancés. Si bien estas células son
capaces de permitir la replicación de varios genotipos del VHC, su nivel replicativo es
bajo y presentan problemas importantes de contaminación. El desarrollo de líneas
celulares inmortalizadas derivadas de hepatoma (Huh7, Huh7.5) ha permitido aumentar
el nivel replicativo y mejorar el estudio del ciclo vital del VHC (12).
1.2.1. Microambiente hepático del VHC: polarización celular
La célula principal del hígado y la que lleva a cabo la mayor parte de sus funciones
es el hepatocito, que constituye aproximadamente el 70-80% de la masa hepática. Los
hepatocitos son células epiteliales que presentan una estructura poligonal con varias
caras. Esta estructura, que diferencia a los hepatocitos del resto de las células
epiteliales “simples”, permite que el hepatocito esté en íntimo contacto de manera
simultánea no sólo con los hepatocitos adyacentes, sino también con los espacios
sinusoidales y los canalículos biliares (13,14). Esto requiere una compleja polarización
celular que permita separar los diferentes polos, que tienen diferentes funciones. En
general, las células epiteliales simples que se organizan en monocapas (por ejemplo
las células del epitelio intestinal) tienen un único polo apical que está localizado en el
ápex celular y un polo basocelular que corresponde a la membrana plasmática. En
Introducción
16
cambio, los hepatocitos se organizan en placas y tienen varios polos apicales y
basales (15). Los polos apicales de hepatocitos adyacentes delimitan los canalículos
biliares, a los que los hepatocitos excretan la bilis. El polo basal, en contacto con el
aporte sanguíneo, es conocido como polo sinusoidal y es responsable de la secreción
de proteínas y la absorción de sustancias del torrente sanguíneo. La estricta
separación de ambos polos es fundamental para un correcto mantenimiento de la
fisiología celular, y esto es especialmente importante en el caso de los hepatocitos. La
separación entre ambos polos es mantenida por las llamadas uniones estrechas (tight
junctions), que son las áreas de contacto entre células (16). Las uniones estrechas
sellan el espacio intercelular actuando como una barrera paracelular selectiva que
restringe el paso de solutos a través de las monocapas. Además, impiden la difusión
libre de lípidos y proteínas entre los polos basolateral y apical, asegurando de esta
manera la polaridad celular. Las uniones estrechas están compuestas por proteínas
transmembrana (claudina, occludina) y por proteínas intracitoplásmicas del
citoesqueleto ligadas a las proteínas transmembrana (17). Estas proteínas forman
redes que actúan como una verdadera barrera hepato-biliar, y el mantenimiento de la
función hepatocitaria depende en gran parte del mantenimiento de su integridad (18).
Figura 2. Estructura organizativa de los hepatocito s
Introducción
17
1.2.2. El sistema del replicón de VHC
Los replicones son fragmentos de genoma viral que, aún careciendo de parte de la
información genética contenida en el ARN del virus, mantienen todos los genes
necesarios para autoreplicarse. De esta manera, son capaces de producir nuevas
moléculas subgenómicas que a su vez pueden continuar replicándose, aunque no son
capaces de originar virus completos infecciosos (11). El establecimiento del sistema del
replicón permitió por primera vez replicar el genoma del VHC. Para generar el replicón
por primera vez se transfectó en células Huh7 un subgenoma de VHC genotipo 1b en el
que la región estructural se sustituyó por dos elementos: 1) la secuencia del gen
fosfotransferasa de neomicina que otorga resistencia al antibiótico G418 y 2) el sitio de
entrada a ribosomas (IRES) de un picornavirus (19). Tras la transfección de células
Huh7 con estos constructos se seleccionan las colonias resistentes a G418 que
permiten la replicación del ARN del VHC a niveles muy elevados. Posteriores mejoras
del sistema incluyeron la adición del gen de luciferasa y de mutaciones adaptativas al
cultivo celular, así como el desarrollo de replicones subgenómicos de otros genotipos
(20-26). El sistema del replicón ha sido fundamental para el estudio de nuevos fármacos
antivirales directos contra el VHC, aunque no permite estudiar su entrada en las células
(27,28).
1.2.3. El sistema de la pseudopartícula viral (HCVp p)
El desarrollo de pseudopartículas infecciosas de VHC (HCVpp) fue el primer hito
que permitió estudiar los mecanismos de entrada del VHC (12). Las pseudopartículas
del VHC se generan transfectando 3 plásmidos en células humanas embrionarias de
riñón (293T): 1) un gen de un retrovirus, capaz de formar la partícula retroviral, 2) un
gen de un proteína reportera, como luciferasa o GFP (green fluorescent protein), y 3)
las glicoproteínas E1 y E2 de VHC (29,30). La expresión del gen del retrovirus resulta
en la formación de partículas retrovirales que codifican el gen de luciferasa. Durante el
ensamblaje, E1 y E2 se incorporan en la pseudoenvuelta, con lo que la infección de
Introducción
18
células por parte de estas partículas es responsabilidad completa de las glicoproteínas
del VHC. La entrada en la célula concluye con la liberación de la retrocápside en el
citoplasma seguida de la transcripción inversa e incorporación del genoma viral al de
la célula huésped. El gen de luciferasa se expresa, lo que permite confirmar la entrada
del HCVpp en la célula. Este sistema fue el primero que permitió estudiar la entrada
del VHC en hepatocitos: una de las primeras evidencias vino de la utilización de
agentes neutralizantes de E1 y E2, que impiden la infección de células de hepatoma
por HCVpp (31,32).
1.2.4. HCVcc: VHC derivado de cultivo celular
En 2005, varios estudios reportaron el hallazgo de una cepa de VHC capaz de
replicarse y liberar partículas infecciosas en cultivo celular (VHCcc) (33-35). La cepa
se clonó de un virus genotipo 2a aislado de un paciente japonés con una infección
aguda por VHC, por que se denominó JFH-1 (por Japanese Fulminant Hepatitis 1). A
diferencia de los genomas de VHC previamente testados, la infección de células de
hepatoma (Huh7) con JFH-1 resulta en la liberación de virus infecciosos, de manera
que este descubrimiento permitió estudiar de forma completa por primera vez el ciclo
vital completo del VHC. Posteriormente, a partir de este sistema se han desarrollado
otras quimeras virales representativas de otros genotipos (36-39). Estas partículas
incluso permiten infectar chimpancés y ratones con hígados humanizados (40), con lo
que han aumentado de manera significativa nuestro conocimiento del ciclo vital del
VHC.
1.2.5. Problemática de los modelos actuales de estu dio del VHC
Pese a los enormes avances obtenidos con los modelos in vitro para conocer el
ciclo vital y los mecanismos de entrada del VHC, es importante tener en cuenta las
limitaciones de estos sistemas (12). Tanto las pseudopartículas como el VHC derivado
de cultivo celular difieren considerablemente del VHC del suero de los pacientes, que,
Introducción
19
como se ha señalado previamente, circula en forma de cuasiespecies. Igualmente, las
células en cultivo son diferentes de los hepatocitos, que están polarizados y
establecen relaciones y asociaciones con el resto de tipos celulares hepáticos. Por
esta razón, las conclusiones de las investigaciones realizadas con estos modelos
deben estimarse con cautela, e idealmente, confirmarse en modelos más fisiológicos.
En este sentido, la infección de hepatocitos primarios humanos con HCVcc podría ser
una alternativa (41), al igual que la utilización de cultivos tridimensionales en Matrigel
de Huh7, que conservan una polarización similar a los hepatocitos humanos y son
capaces de generar viriones infectantes (42).
Todos los datos de estudios in vitro deberían validarse en modelos animales, ya
que no sólo los hepatocitos, sino también las relaciones con el resto de tipos celulares
hepáticos podrían determinar los mecanismos de entrada del virus. En este sentido, la
utilización de chimpancés ha sido fundamental para los ensayos de infectividad y los
estudios de respuesta inmune, ya que la enfermedad por VHC en humanos y
chimpancés comparten numerosas características, probablemente debido a la gran
similitud genética entre ambas especies (43). Sin embargo, los experimentos con
chimpancés están limitados por cuestiones éticas, logísticas y económicas,
haciéndolos poco viables en la actualidad. Desgraciadamente, el desarrollo de un
modelo de animal pequeño en el cual se pueda reproducir la infección por VHC se ha
mostrado extremadamente complejo. Probablemente por un alto tropismo del VHC por
la especie humana, los modelos en roedores requieren trasplantes de células
humanas, así como cierto grado de inmunodeficiencia para tolerar las células
humanas injertadas. De todos los modelos murinos desarrollados, probablemente el
más útil es el del ratón uPA/SICD, consistente en una línea de ratones que
sobreexpresan el activador de plasminógeno uroquinasa (uPA) y que en un contexto
de inmunodeficiencia (SCID, inmunodeficiencia severa combinada) son trasplantados
con hepatocitos humanos, siendo capaces de desarrollar una infección persistente por
VHC con altos títulos virales cuando son inoculados con suero de donantes VHC
Introducción
20
positivos (44,45). Sin embargo, este modelo es difícil de conseguir, ya que 1) precisa
hepatocitos de alta calidad, 2) la técnica del trasplante en animales pequeños es
complicada, y 3) la eficacia del trasplante de hepatocitos humanos es variable (entre el
2 y el 90%). Además, la inmunodeficiencia requerida por el modelo impide estudiar
procesos como la respuesta inmune adaptativa, la inmunopatología o la generación de
vacunas (12). En cualquier caso, este modelo se ha utilizado con éxito en la
determinación de la eficacia y seguridad de compuestos antivirales directos, así como
en el desarrollo de moléculas capaces de bloquear alguno de los receptores del VHC,
como se verá posteriormente.
Introducción
21
1.3. MECANISMOS DE ENTRADA DEL VHC EN EL
HEPATOCITO
Gracias a los modelos previamente descritos (HCVpp y HCVcc), nuestro
conocimiento del ciclo vital del VHC, y especialmente de su primer paso, la entrada del
virus en el hepatocito, se ha incrementado significativamente en los últimos años. Sin
embargo, el modo exacto mediante el cual el VHC entra en la célula hepática es aún
desconocido. La hipótesis actual sostiene que el VHC infecta los hepatocitos de una
forma altamente compleja y coordinada, en un proceso compuesto de múltiples pasos
en los que están implicadas las glicoproteínas de la envuelta viral E1 y E2 y varias
proteínas de la superficie hepatocitaria (“receptores”) (46).
Inicialmente, el VHC circulante interacciona con ciertas moléculas de baja afinidad
llamadas factores de “adhesión”. Estas moléculas incluyen las lectinas tipo C
presentes en las células sinusoidales, cuyo papel sería captar los viriones en el
endotelio sinusoidal y traspasarlos a los hepatocitos subyacentes (47,48); y los
glicosaminoglicanos (GAGs), especialmente heparan sulfatos (HS), que sirven como
moléculas de anclaje de numerosos virus. Se estima que HS concentran los viriones
procedentes de las células sinusoidales en el polo basolateral del hepatocito, como
paso previo a la internalización de los virus por los receptores (49,50).
Tras las interacciones con los factores de “adhesión”, la captación del VHC por el
hepatocito se basa en la asociación con al menos cuatro moléculas que actúan como
receptores: SR-B1, CD81, claudina y occludina.
1.3.1. Scavenger Receptor clase B tipo I (SR-BI)
SR-BI es una glicoproteína con dos dominios transmembrana separados por un
asa extracelular larga, que actúa como receptor multiligando, y una cola C-terminal
intracitoplasmática. Se expresa ubicuamente, si bien predomina en el hígado y tejidos
esteroidogénicos como las glándulas suprarenales. Interviene en la unión y
Introducción
22
transferencia intracelular de lípidos en forma de HDL, LDL y VLDL, actuando en el
metabolismo lipídico mediante la internalización de ésteres de HDL y su incorporación
a la membrana celular. De esta manera, SR-BI participa del mantenimiento de la
homeostasis lipídica entre los hepatocitos y el plasma (51,52). Este papel fisiológico es
consistente con el hecho de que VHC circula y es excretado en forma de
lipoviropartículas.
SR-BI se expresa de manera intensa en la membrana basolateral de los
hepatocitos, lo cual apoya la hipótesis de que el VHC interacciona con moléculas
situadas en este polo celular al llegar por vía sanguínea (53). SR-BI se une de manera
eficiente con E2, y específicamente con su región HVR-1 (54): es por ello que HCVpp
en las que se elimina esta región tienen una capacidad infecciosa muy limitada (31).
Asimismo, la silenciación de SR-BI reduce la infección por VHC, al igual que la
utilización de anticuerpos monoclonales contra SR-BI, que han mostrado impedir la
infección por VHC en células Huh 7.5 y en ratones quiméricos trasplantados con
hepatocitos humanos (55-57).
Es probable que la relación entre E2 y SR-BI sea más compleja que una simple
asociación virus-receptor, ya que parece depender, al menos en parte, de la función
de intercambio lipídico de SR-BI: el tratamiento de cultivos celulares con HDL acelera
la endocitosis de partículas virales, disminuyendo así el tiempo en el que los viriones
unidos a las células (y aún no internalizados) están en contacto con anticuerpos
neutralizantes; la neutralización vuelve a niveles basales al tratar las células con BLT-
4, una molécula capaz de inhibir la función de intercambio lipídico de SR-BI (58). Por
otro lado, LDL oxidado inhibe la entrada de HCVpp y HCVcc alterando las propiedades
de los viriones y su interacción con SR-BI (59). De hecho, moléculas pequeñas que
interfieren con SR-BI a nivel del metabolismo lipídico (ITX-5061, ITX-7650) inhibiendo
el catabolismo de HDL son capaces de impedir la infección de hepatocitos primarios
por HCVpp, así como la infección de líneas celulares con HCVcc, de una manera
dosis-dependiente (60-62). Finalmente, SR-BI podría también participar en la entrada
Introducción
23
del VHC de manera independiente al metabolismo lipídico, a través de la
internalización de sus ligandos mediante la cola citoplásmica C-terminal: cambios en
esta parte de la proteína permiten la internalización de HDL pero no la entrada de
HCVpp (63,64).
1.3.2. CD81
CD81 es una tetraspanina, familia de glicoproteínas tipo III que se expresan
ubícuamente. Se organizan en redes y tienen múltiples roles en señalización celular,
influyendo en la proliferación, migración y adhesión (14,65). CD81 tiene 4 hélices
transmembrana que separan 2 dominios extracelulares (EC1 y EC2) y tiene funciones
implicadas en la activación inmune, siendo además fundamental para la entrada de
Plasmodium en los hepatocitos (66).
CD81 fue la primera molécula identificada como posible receptor de VHC (67).
CD81 se une a E2 de manera especie-específica: E2 sólo interacciona con CD81 de
origen humano, no murino (68). Tanto la silenciación de CD81 como la administración
de anticuerpos monoclonales contra CD81 impiden la infección por HCVpp o HCVcc,
incluso en modelos de ratones con ratones quiméricos con hígados humanizados (69-
72). Igualmente, la expresión de CD81 en células HepG2, no permisivas a la infección
por HCVpp, inducen la susceptibilidad a la infección (73,74).
La expresión de CD81 se observa predominantemente en la membrana basolateral
de los hepatocitos, donde parece colocalizar con SR-BI y claudina-1 (53). Ciertos
datos sugieren que CD81 interacciona y forma complejos con claudina (ver más abajo)
que parecen ser indispensables para la internalización de VHC (75). Además, el nivel
de expresión de CD81 parece ser fundamental para la infección: un dintel mínimo de
CD81 en la superficie celular es indispensable para que células Huh-7 sean
susceptibles a la infección por HCVcc (76).
Introducción
24
1.3.3. Claudina-1
Claudina-1 (CLDN-1) es parte de la familia de Claudinas, compuesta de 24
miembros, y forma parte de las uniones estrechas intercelulares. Claudina-1 tiene
cuatro dominios transmembrana y dos asas extracelulares, responsables del sellado
del espacio paracelular, la formación de canales iónicos y la correcta conformación y
posicionamiento de la proteína (77,78). Si bien claudina se expresa
predominantemente en el polo apical hepatocitario, algunos estudios han observado
también focos de expresión en el polo basocelular en forma de complejos con CD81.
En 2007, Evans et al mostraron cómo la transducción de CLDN-1 en células de
línea 293T (células embrionarias de riñón) que expresan SR-BI y CD81 hace a estas
células susceptibles a la infección por HCVpp (79). La evidencia del papel de CLDN-1
también se apoya en experimentos en los que silenció la expresión de claudina,
reduciéndose de manera marcada la infección (79,80).
El papel de claudina en la entrada, sin embargo, no está determinado
completamente, ya que no se ha demostrado ninguna asociación directa entre CLDN-1
y las glicoproteínas del VHC. De hecho, la interacción E2-CD81 parece preceder a la
intervención de CLDN-1, cuyo papel probablemente está en la internalización por
endocitosis mediada por clatrina de los complejos virus-receptores (81-84).
Otros componentes de la familia de las claudinas, claudina-1 y claudina-9, también
hacen a las células 293-T susceptibles a la infección por HCVpp, pero la expresión de
estas proteínas en el hígado y en hepatocitos primarios es escasa, por lo que su papel
en la entrada del VHC no está aclarado (80,85).
1.3.4. Occludina
Otro de los componentes fundamentales de las uniones estrechas es occludina
(OCC), que también contribuye al mantenimiento de la barrera hepato-biliar. La
identificación del papel de occludina en la entrada del VHC vino de la evidencia de que
la silenciación de la expresión de la proteína reduce la entrada de HCVpp (86,87). Casi
Introducción
25
simultáneamente se mostró que la expresión de CD81 y occludina de origen humano
en células murinas que expresan SR-BI y CLDN-1 permite la infección por VHC (88).
Occludina participa probablemente en los últimos pasos del proceso de entrada del
virus en la célula, más concretamente en el proceso de fusión de los endosomas
tempranos internalizados tras la interacción de VHC con el complejo claudina-CD81
(89).
1.3.5. Receptor de LDL
Como se ha señalado previamente, una importante parte del pool de VHC
circulante lo hace en forma de lipoviropartículas asociadas a VLDL (90). El receptor de
LDL (LDLr) se ha implicado en la entrada de estas lipoviropartículas: la endocitosis de
VHC se correlaciona con la expresión de LDLr, y la inhibición de LDLr en cultivos de
hepatocitos primarios disminuye la infectividad de VHC derivado de plasma humano
(68,91). Si bien el papel exacto de LDLr no está elucidado, es probable que actúe en
uno de los primeros pasos de la entrada, interactuando con las lipoproteínas
asociadas a la partícula viral (92).
1.3.6. Trasmisión del VHC célula a célula
Numerosos virus se han mostrado capaces de pasar a las células vecinas
mediante transferencia directa célula a célula (cell-cell transmission), evitando de este
modo la exposición a anticuerpos neutralizantes o factores del complemento en el
ambiente extracelular (93). Este modo de infección de las células también ha sido
propuesto para el VHC en algunos estudios en los que se comprobó infección de
células vecinas en presencia de anticuerpos neutralizantes (94). Esta hipótesis se
apoya también en estudios recientes que han evaluado con microscopía de doble
fotón la presencia de antígenos del VHC en biopsias hepáticas de pacientes con
hepatitis C (95). En estos pacientes, las células que contienen antígenos del VHC se
concentran en grupos, sugiriendo por tanto un paso local de célula a célula. Si bien
Introducción
26
existen pocos estudios que hayan evaluado este mecanismo de infección, CD81, SR-
BI, claudina y occludina se han implicado en la transmisión célula a célula del VHC,
que posiblemente tiene lugar en los contactos entre células a nivel de las uniones
estrechas (96).
1.3.7. Modificaciones en los receptores inducidas p or el VHC
Las proteínas previamente descritas tienen un papel fundamental en la entrada del
VHC en los hepatocitos. Sin embargo, existe también cierta evidencia de que la propia
infección por VHC podría modificar la expresión de estas moléculas, especialmente de
los componentes de las uniones estrechas. Benedicto et al observaron una disrupción
de las uniones estrechas con desaparición de claudina y occludina y aparición de
acúmulos de occludina en el retículo endoplasmático tras la infección de células Huh7
con replicones genómicos (portadores de las proteínas estructurales); de hecho, la
función de las uniones estrechas se alteraba provocando cambios en la permeabilidad
paracelular (86). Además, observaron que la retención intracitoplasmática de occludina
colocaliza con la proteína E2 del VHC, sugiriendo pues una interacción entre ambas
proteínas. Todos estos cambios se recuperaban parcialmente tras tratar las células
con interferón alfa. En un reciente estudio similar, Farquhar y colaboradores
observaron coendocitosis de CD81 y claudina tras la infección por HCVpp o HCVcc de
células Huh7.5 (83). Estos hallazgos sugerirían que el VHC podría inducir la
internalización de sus receptores, e infectaría el hepatocito al menos en parte
aprovechando el tráfico intracelular de estas proteínas.
Introducción
27
Figura 3. Modelo actual de entrada del VHC en el he patocito
1.3.8. Estudios humanos de receptores del VHC
Como se ha ido describiendo, todo el conocimiento que tenemos acerca de la
entrada del VHC en las células viene de estudios in vitro, así como algunos datos
obtenidos de animales de experimentación. En uno de los pocos estudios que han
utilizado muestras humanas, Reynolds y colaboradores estudiaron la expresión de
algunos receptores del VHC en biopsias hepáticas de pacientes cirróticos por VHC y
otras causas, además de pacientes sin hepatopatía (53). Mediante
inmunofluorescencia y microscopía confocal los autores pudieron observar expresión
de CD81 y SR-BI predominantemente en el polo basolateral de los hepatocitos,
además del endotelio sinusoidal; mientras que CLDN-1 se observó tanto en el polo
basolateral como en el apical de los hepatocitos. Además, se observó un aumento en
la expresión de CLDN-1 en el polo basolateral de las biopsias de pacientes infectados
por VHC, sugiriendo que la infección por VHC podría modular, como sucede en
modelos in vitro, la expresión de sus receptores.
Introducción
28
No existen estudios que hayan evaluado estos receptores en el trasplante
hepático, excepto un pequeño estudio realizado en Hungría con 12 pacientes en los
que se examinaron biopsias hepáticas pareadas, obtenidas en el momento del
diagnóstico de la recurrencia de la hepatitis post trasplante y tras concluir el
tratamiento antiviral de la misma (97). Este estudio mostró una disminución en la
expresión de claudina en los pacientes en los que se conseguía erradicar el VHC con
el tratamiento antiviral, asociándose también su expresión a la cantidad de fibrosis
hepática.
El trasplante hepático es un modelo clínico excelente para estudiar la entrada del
VHC en el hepatocito, ya que el momento de infección del órgano por el virus es
conocido. Además, la recurrencia de la infección sobre el injerto no solamente es
universal, sino que su historia natural es acelerada y conlleva importantes
consecuencias clínicas, como se verá a continuación. Por este motivo, puede ser
importante investigar el potencial papel clínico de estas proteínas.
Introducción
29
1.4. HISTORIA NATURAL DE LA INFECCIÓN POR VHC
La infección por VHC es la causa más frecuente de hepatopatía crónica y la primera
causa de cirrosis hepática, hepatocarcinoma y trasplante hepático (TH) en nuestro
medio. El VHC afecta aproximadamente a un 3% de la población mundial, y a un 2.5%
de la población española (98,99).
La mayor parte (65-80%) de las primoinfecciones por VHC se cronifican, con
persistencia del ARN del VHC en sangre y desarrollo de anticuerpos no neutralizantes
(100). La infección crónica por VHC produce una hepatitis crónica cuya historia natural
es lentamente progresiva. En las primeras décadas de la infección, la enfermedad cursa
asintomática o con síntomas inespecíficos, lo cual hace más complicado el diagnóstico
de la misma. Sin embargo, la lesión hepatocelular y el estímulo inflamatorio crónico que
ésta produce son responsables del progresivo depósito de fibra colágena, cuyo extremo
final es la formación de nódulos de regeneración que define la cirrosis.
La cirrosis hepática condiciona a medio plazo la presencia de hipertensión portal e
insuficiencia hepatocelular, lo cual eventualmente puede derivar en el desarrollo de
descompensaciones clínicas (ascitis, hemorragia por varices, encefalopatía hepática),
que ocurren a una tasa anual de aproximadamente 5-7% (101). El pronóstico de los
pacientes cirróticos que presentan descompensaciones clínicas es especialmente malo:
un metanálisis de 41 estudios mostró una supervivencia mediana del 50% a los 2 años
para los pacientes con descompensaciones, frente al 85% para los pacientes con
cirrosis compensada (101). Además, la acumulación de fibrosis hepática es el factor de
riesgo más importante para el desarrollo de hepatocarcinoma, cuya incidencia se estima
en el 5% y el 30% a los 5 años en pacientes con cirrosis dependiendo de la causa de la
hepatopatía y otros factores de riesgo como la edad o el grupo étnico (102).
La velocidad de progresión a cirrosis en la hepatitis crónica C es variable, y depende
del grado de lesión hepática (tanto del depósito de fibrosis como de la necrosis e
inflamación) en el momento del diagnóstico. Los factores que se han asociado a una
Introducción
30
mayor velocidad de depósito de la fibrosis son la edad avanzada en el momento de la
infección, el género masculino, el síndrome metabólico y la ingesta de alcohol (103).
Introducción
31
1.5. RECURRENCIA DE LA HEPATITIS C TRAS EL
TRASPLANTE HEPÁTICO
El trasplante hepático (TH) es el único tratamiento curativo para los pacientes con
cirrosis hepática que presentan descompensaciones clínicas o que desarrollan un
hepatocarcinoma. Sin embargo, el injerto hepático se infecta de manera universal por el
VHC circulante en sangre en el momento del trasplante (104). De hecho, la entrada del
virus en el injerto parece producirse de manera extremadamente temprana, durante la
fase de reperfusión del órgano en la cirugía de trasplante; y la replicación viral es precoz
e intensa: a la semana de la cirugía la mayoría de los pacientes presentan niveles de
ARN del VHC en sangre mucho mayores que los previos al trasplante.
El TH es un modelo único para estudiar la patogenia de la infección por VHC, ya que
el inicio de la infección viene definido por el momento del trasplante. Sin embargo, la
recurrencia de la hepatitis C tras el trasplante tiene una característica especial: la
evolución clínica de la enfermedad (el depósito de fibra colágena) es acelerada respecto
a los pacientes inmunocompetentes (105). Aproximadamente el 30% de los pacientes
trasplantados por hepatitis C desarrollarán cirrosis en el injerto antes de los 5 años tras
el trasplante (106). La utilización de hígados provenientes de donantes de edad
avanzada es el factor que más influencia tiene en el depósito acelerado de fibra
colágena. Una inmunosupresión más potente, el sexo femenino del receptor, la diabetes
post trasplante y el desarrollo de complicaciones como la infección por citomegalovirus o
patología biliar en los primeros meses post trasplante también se han relacionado con
una progresión más rápida de la enfermedad (105-108).
La evolución clínica de la recurrencia viene claramente delimitada por los eventos
que ocurren en los primeros meses tras el trasplante. Por este motivo, la evaluación
del estado del injerto al año del trasplante es fundamental: se ha mostrado que la
presencia de fibrosis significativa (F≥2) o hipertensión portal (gradiente de presión
venosa hepática -GPVH- ≥ 6 mmHg) en este punto temporal es capaz de identificar de
Introducción
32
una manera muy precisa a los pacientes con una recurrencia más grave y que tienen
más posibilidades de desarrollar descompensaciones clínicas durante el seguimiento
(109). La aparición de descompensaciones clínicas tras el trasplante es un marcador
ominoso, ya que las probabilidades de fallecer durante el año siguiente a la
descompensación están alrededor del 50-60% (110). En estos casos con altas
probabilidades de presentar una mala evolución estaría indicado el tratamiento
antiviral con interferón pegilado y ribavirina, que es capaz de eliminar el virus y curar la
infección en el 30-35% de los casos (111,112), lo cual produce una significativa
mejoría en el pronóstico de estos pacientes (113). En el resto de casos, el retrasplante
podría ser la única opción terapéutica, si bien dada la menor supervivencia del
retrasplante es necesaria la utilización de scores pronósticos para una adecuada
selección de los pacientes (114).
Introducción
33
1.6. FIBROSIS HEPÁTICA: IMPORTANCIA Y CONCEPTO
Como se ha visto, tanto los pacientes inmunocompetentes como los trasplantados
hepáticos por VHC, en los que existe un proceso fibrogénico hepático, están en riesgo
de complicaciones clínicas graves, y esto se reproduce en los pacientes con otras
causas de hepatopatía crónica, como la infección por VHB, el consumo excesivo de
alcohol, la hemocromatosis o la enfermedad por depósito graso hepático (115). Realizar
un diagnóstico de la presencia de fibrosis en estos pacientes es esencial, ya que obliga
a indicar tratamientos para eliminar la causa que perpetúa el depósito fibrótico (terapia
antiviral, abstinencia alcohólica, depleción férrica, etc). Además, el diagnóstico de
fibrosis avanzada o cirrosis permite establecer estrategias dirigidas a detectar
precozmente la presencia de varices esofágicas y hepatocarcinoma. Teniendo en
cuenta, además, que la fibrosis hepática no ocasiona síntomas hasta las fases más
avanzadas de la enfermedad, es si cabe más necesario realizar una estimación precoz
de la severidad del acúmulo de fibra en todos los pacientes con hepatopatía crónica.
En condiciones normales, el parénquima hepático está formado por una matriz
extracelular (MEC) de tejido colágeno en cuyo seno se alojan células parenquimatosas
(hepatocitos y colangiocitos) y no parenquimatosas (células endoteliales, células de
Kupffer y células estrelladas hepáticas [CEH]) (115). El porcentaje de MEC en un hígado
sano normal es bajo, y está compuesta por colágeno tipo IV, XIV, XVIII y proteoglicanos
como tenascina, laminina o heparán sulfato. La composición y características de esta
MEC normal son esenciales para mantener las características funcionales de cada tipo
celular hepático. En condiciones fisiológicas se produce un depósito continuo de MEC
compensado por una degradación permanente de dicha MEC con un resultado neto
neutro. Los principales sistemas reguladores de la degradación de la MEC son las
metaloproteasas (MMP) que a su vez están reguladas por los inhibidores tisulares de las
metaloproteasas (TIMP).
Introducción
34
En una situación de daño crónico, como el inducido por la infección por el VHC, se
produce una alteración en la regulación de los procesos de síntesis y degradación de la
MEC con la consiguiente aparición de la fibrosis hepática. La fibrosis hepática se
caracteriza por una sustitución de la MEC hepática normal por grandes cantidades de
matriz extracelular cicatricial, constituida principalmente por colágeno fibrilar tipo I,
aunque también por colágeno tipo III, proteoglicanos, fibronectina y ácido hialurónico. Se
sustituye, por tanto, una MEC escasa y mayoritariamente de baja densidad por otra
MEC de alta densidad rica en enlaces fibrilares. Además, esto se acompaña de una
disminución de la capacidad de degradación de la MEC, con disminución de la
producción de MMP e incremento de los TIMP. Por tanto, en el desarrollo de la fibrosis
hepática concurren tres elementos: incremento cuantitativo de la producción de MEC,
cambios cualitativos en la composición de la MEC y alteración de los mecanismos
reguladores de degradación. Estas alteraciones del metabolismo de la MEC vienen
conducidas de manera predominante por la activación de varios grupos celulares en un
fenotipo común, el miofibroblasto activado (115,116).
Introducción
35
1.7. BASES CELULARES Y MOLECULARES DE LA FIBROSIS
HEPÁTICA
1.7.1. Células estrelladas hepáticas
Las células estrelladas hepáticas (CEH) están consideradas como las principales
responsables del desarrollo de la fibrosis hepática, aunque el proceso de fibrogénesis
requiere la participación conjunta de prácticamente todos los tipos celulares presentes
en el hígado (117,118). En el hígado normal las CEH se localizan en el espacio de
Disse del sinusoide hepático. Presentan un fenotipo caracterizado por abundante
depósito de vitamina A, escasa o nula capacidad contráctil, y escasa capacidad de
producción de colágeno y otros componentes de la matriz extracelular. Este fenotipo
se denomina quiescente y es similar al fenotipo de los fibroblastos no estimulados
presentes en otros órganos, como el riñón, o de las células mesangiales normales.
En el contexto de daño hepático crónico se produce una transformación fenotípica
de las CEH en miofibroblastos activados. Esa transformación fenotípica a
miofibroblasto o “activación” se caracteriza por la aparición de una serie de cambios
fenotípicos y funcionales (115-119):
a) pérdida de gran parte de los gránulos citoplasmáticos de vitamina A;
b) aparición en la CEH de toda la maquinaria celular necesaria para la contracción
celular, incluidos canales de calcio voltaje-dependientes y filamentos de α-
actina y miosina citoplasmáticas;
c) expresión de receptores para factores de crecimiento transformante (TGF) β,
epidérmico (EGF), derivado de las plaquetas (PDGF), y substancias
vasoactivas (angiotensina II, endotelina-1, etc);
d) capacidad proliferativa y resistencia a la apoptosis;
e) capacidad migratoria a los focos de inflamación en respuesta a citoquinas
quimiotácticas como la proteina atrayente de monocitos tipo 1 (MCP-1);
Introducción
36
f) producción de substancias inflamatorias (MCP-1, factor de necrosis tumoral
(TNF) tipo α, IL-8, proteina inflamatoria de los macrófagos tipo 2,
antiinflamatorias (IL-10) y moléculas de adhesión;
g) síntesis de grandes cantidades de componentes fibrilares de la MEC,
especialmente colágeno tipo I, pero también glicoproteinas, proteoglicanos y
glicosaminoglicanos;
h) alteración en la regulación de la producción de sustancias involucradas en la
degradación de la matriz extracelular (p.ej. MMP-2 y TIMP-1).
1.7.2. Células inflamatorias
La infiltración del parénquima hepático por células inflamatorias precede a la
activación de las CEH, que a su vez producen substancias pro-inflamatorias y moléculas
de adhesión que perpetúan la respuesta inflamatoria. La activación de las células de
Kupffer, los macrófagos residentes en el hígado, juega un papel muy importante en la
fibrosis hepática. En respuesta a la llegada de estímulos inflamatorios (p.ej. VHC), estas
células se activan, proliferan y producen estrés oxidativo, gran cantidad de citoquinas
inflamatorias y factores de crecimiento (TNF-α, MCP-1, IL-6, PDGF, etc.), que
contribuyen a la amplificación y mantenimiento de la activación de las CEH (120-122).
La infiltración leucocitaria juega un papel clave en la activación y perpetuación de la
activación de las CEH. Los neutrófilos producen radicales libres de oxígeno que
estimulan la producción de colágeno por las CEH. Por otro lado, los linfocitos modulan la
síntesis de colágeno mediante la producción de substancias profibrogénicas (p.e.j. TNF-
α, IL-1, IL-4, TGF-β, etc.) y otras antifibrogénicas (p.ej. IL-10, interferón (IFN) α y γ)
(123).
Introducción
37
1.7.3. Células pluripotenciales, fibroblastos porta les, colangiocitos y
hepatocitos
A raíz de estudios que evaluaron la capacidad de las células madre derivadas de la
médula ósea para diferenciarse hacia células epiteliales, más concretamente en el
hígado hacia colangiocitos y hepatocitos, se observó que algunos miofibroblastos
expresaban marcadores pluripotenciales derivados de médula ósea (124). Así, varios
estudios en diferentes modelos han mostrado un incremento en la cantidad de
miofibroblastos derivados de médula ósea en situaciones de aumento de la lesión
hepática (125,126). Sin embargo, estudios en humanos sugieren que los miofibroblastos
derivados de médula ósea representan una cantidad muy pequeña de las células
fibrogénicas presentes en el hígado ; de hecho se ha cuestionado si estas células
derivadas de médula ósea contribuyen de manera significativa a la síntesis colágena
(127).
El tejido conectivo periportal está constituido en parte por fibroblastos portales, que
probablemente derivan de los vasos portales y expresan marcadores diferentes a las
células hepáticas estrelladas (128). Existe evidencia de que estos fibroblastos se activan
a miofibroblastos con propiedades fibrogénicas en ciertas circunstancias, que se
corresponden en general con situaciones de patología biliar: la proliferación de
colangiocitos induce proliferación de fibroblastos portal que adquieren fenotipo de
miofibroblasto de una manera similar al proceso que sufren las CEH (128-130).
Los colangiocitos producen radicales libres, factores de crecimiento y sustancias
inflamatorias en respuesta a la presencia de un exceso de ácidos biliares. La liberación
de estos productos contribuye a la activación de los miofibroblastos portales y por tanto
a la consiguiente síntesis de MEC, como se ha indicado previamente (128). Además,
existen ciertos datos que sugieren que colangiocitos y hepatocitos podrían sufrir una
transición epitelio-mesenquimal y transformarse en células mesenquimales que
expresan vimentina o α-actina (131,132). Si bien los datos en estudios in vitro son
Introducción
38
interesantes, es difícil asegurar que la transición epitelio-mesenquimal juega un papel
relevante en la fibrogénesis hepática (133,134).
Finalmente, los hepatocitos dañados por infección viral (p.ej. virus hepatitis C),
tóxicos (p.ej. moléculas derivadas del metabolismo del alcohol) u otras noxas (p.ej.
ácidos biliares o citoquinas) producen radicales libres, factores de crecimiento y
citoquinas inflamatorias, capaces de activar a las CEH (115,135). Además, la apoptosis
hepatocitaria también activa a las CEH e incrementa su capacidad fibrogénica (136).
1.7.4. Matriz extracelular
Como ya se ha mencionado, en la fibrogénesis hepática se produce un cambio
cualitativo y cuantitativo en la MEC inducido por los miofibroblastos, derivados
principalmente de las CEH y en menor medida de los fibroblastos portales y de células
pluripotenciales. Estas células tienen una enorme capacidad de sintetizar y secretar un
gran número de moléculas de MEC. Entre todas las moléculas que componen la MEC,
destaca el colágeno tipo I, y en menor medida el colágeno III (115). La activación de las
vías fibrogénicas no sólo da lugar a un incremento en la expresión de ácido ribonucleico
mensajero (mRNA) de colágeno I, sino también a un incremento de su estabilidad, todo
lo cual induce un aumento de la efectividad de su expresión génica y por tanto de su
producción, conduciendo por tanto a un aumento de la fibra colágena (137-139). Por
otro lado, los cambios en la MEC estimulan múltiples receptores de membranas sobre
las células inflamatorias y fibrogénicas, en particular integrinas, que amplifican la
respuesta fibrogénica (140). Por tanto, la MEC no es un componente inerte sino una
estructura dinámica y biológicamente activa de gran importancia en la modulación,
activación y amplificación de la fibrogénesis.
1.7.5. Reguladores de la degradación de matriz extr acelular
La matriz extracelular está sujeta a un proceso constante de síntesis y degradación
cuyo equilibrio es fundamental para mantener un remodelado eficiente de la MEC. Las
Introducción
39
metaloproteasas (MMP) son enzimas responsables de degradar la MEC, mientras que
los inhibidores tisulares (TIMP) tienen propiedades regulatorias de las MMP (137). La
activación de miofibroblastos conduce a un descenso en la síntesis de MMP-1 y MMP-
13, mientras que existe un incremento en la producción de MMP-2, que podría tener
un papel profibrogénico: la degradación parcial de MEC anómala activaría sustancias
latentes ancladas en dicha matriz, como factores de crecimiento y sustancias con
actividad fibrogénica. Por otro lado, MMP-2 deja expuestos fragmentos de colágeno
tipo I, que estimula la proliferación de la CEH e induce mayor depósito de MEC (141-
143).
El aumento en la producción de TIMP-1 y TIMP-2 es también uno de los procesos
más relevantes en la alteración en la regulación de la degradación de la MEC. TIMP-1
dificulta la apoptosis de las CEH activadas, aparte de impedir la acción de las
metaloproteasas y con ello la degradación de la MEC (144-146). Así, el resultado neto
es el depósito de fibra colágena en el espacio de Disse y la consecuente alteración de
la arquitectura hepática.
Figura 4. Mecanismos celulares y moleculares de la fibrogénesis hepática.
Adaptado de Friedman (137).
Introducción
40
1.8. MÉTODOS CLÁSICOS EN LA EVALUACIÓN DE LA
FIBROSIS HEPÁTICA
1.8.1 La biopsia hepática.
Como se ha señalado previamente, evaluar el estado de depósito de fibrosis en
las enfermedades hepáticas permite establecer el pronóstico de las mismas e indicar
tratamientos específicos. El método más utilizado en la evaluación de la fibrosis es la
biopsia hepática, que consiste en la obtención mediante punción hepática guiada por
ecografía o bien por vía transyugular de una muestra de tejido hepático para su
análisis histológico. Aparte de valorar la cantidad de fibrosis, la biopsia hepática tiene
otras ventajas, ya que puede determinar la causa de la enfermedad hepática y aportar
información sobre otros procesos patológicos que tienen lugar en el hígado, como la
presencia de esteatosis o depósito de hierro o determinar el grado de inflamación
(147-149).
Pese a la importancia de la biopsia hepática, ésta presenta también algunas
desventajas significativas. La primera de ellas se basa en el carácter invasivo de la
misma: se recomiendan varias horas de observación hospitalaria tras su realización
ante la posibilidad de complicaciones: hasta el 20% de los pacientes presentan dolor, y
el 0.6% de los pacientes pueden sufrir complicaciones potencialmente mortales, como
hemoperitoneo, coleperitoneo o hemobilia (150,151).
Por otra parte, una biopsia de tamaño habitual (10-20 mm de longitud, 1-2 mm de
grosor) representa únicamente 1/50000 partes del volumen hepático, por lo que es
esperable una importante tasa de error debido al tamaño de la muestra. En un estudio
realizado con biopsias quirúrgicas que se convertían digitalmente en muestras
histológicas de diferente tamaño, se mostró que solo el 65% de las muestras de 15
mm de longitud (la medida que habitualmente se acepta como válida en la mayoría de
los estudios) estaban correctamente estadificadas, y esta proporción aumentaba
Introducción
41
únicamente al 75% cuando la muestra era de 25 mm, un tamaño raramente obtenido
en la práctica clínica diaria (152).
La interpretación de la biopsia está además sujeta a variabilidad, tanto intra como
interobservador: en un estudio de 46 biopsias evaluadas por 5 patólogos, los
coeficientes de concordancia (kappa) entre observadores fueron de 0.49 y 0.51 para
las clasificaciones de Knodell y Ishak, aunque la concordancia era mejor cuando se
trataba de diferenciar la presencia de cirrosis (kappa = 0.69 y 0.72) (153).
Otro problema viene derivado de la manera de graduar la acumulación de fibra
colágena. Debido a la dificultad para cuantificar de manera objetiva la cantidad de fibra
se han desarrollado diversos sistemas o clasificaciones que gradúan la fibrosis y la
necroinflamación en varios estadíos. En general, estos sistemas categorizan la
cantidad de fibrosis en varios niveles ordinales (0-4, o 0-6) que se incrementan en
función de la cantidad y localización del depósito de fibra según la estimación subjetiva
del observador (147). Por tanto, estos sistemas únicamente permiten una descripción
semicuantitativa de la fibrosis, que además depende de la interpretación subjetiva del
observador y del sistema o clasificación que se utilice.
Tabla 1 Sistemas de estadificación de la fibrosis h epática más utilizados en hepatitis crónicas virales.
Score 0 1 2 3 4 5 6 METAVIR No fibrosis Expansión
fibrosa portal
Algunos puentes o septos
Numerosos puentes o septos
Cirrosis N/A N/A
Knodell No fibrosis Expansión fibrosa portal
N/A Fibrosis en puentes
Cirrosis N/A N/A
Ishak No fibrosis Expansión fibrosa de algunos espacios porta, con o sin puentes cortos
Expansión fibrosa de la mayoría de espacios porta, con o sin puentes cortos
Expansión fibrosa de la mayoría de espacios porta, con puentes porto-portales ocasionales
Expansión fibrosa de los espacios porta, con puentes marcados, porto-portales o porto-centrales
Puentes marcados porto-portales y/o porto-centrales con nódulos ocasionales
Cirrosis, probable o definitiva
Scheuer No fibrosis Espacios porta fibróticos
Septos periportales o porto-portales con arquitectura intacta
Distorsión arquitectura sin cirrosis obvia
Cirrosis, probable o definitiva
N/A N/A
Introducción
42
Con el fin de homogeneizar el estadiaje de la fibrosis, algunos estudios han
propuesto la llamada morfometría automatizada, que consiste en cuantificar la
cantidad de fibra y calcular digitalmente la proporción de área colágena en la biopsia
(154). Sin embargo, esta técnica, que permite obtener una puntuación cuantitativa y
por tanto obvia la subjetividad y la variabilidad intra e interobservador, sigue
presentando las limitaciones del error de muestra y de la dificultad de diferenciar el
colágeno asociado al depósito anómalo de fibra del colágeno fisiológicamente
asociado a estructuras vasculares. Por otra parte, la simple cuantificación de la MEC
no refleje completamente las consecuencias del depósito de fibra, ya que también su
distribución y la distorsión arquitectural que ocasiona determinan el pronóstico y la
alteración funcional de las hepatopatías crónicas.
Las limitaciones descritas han provocado que la biopsia hepática sea considerada
actualmente el mejor método “disponible” para estadificar la acumulación de fibrosis en
las hepatopatías crónicas, más que el método de referencia o patrón oro (155).
1.8.2. La medición del gradiente de presión venosa hepática
El otro gran método para evaluar la gravedad de las hepatopatías crónicas es la
estimación de la presión portal, que se realiza mediante la medición del gradiente de
presión venosa hepática (GPVH) (156,157). El GPVH se obtiene generalmente por vía
transyugular y consiste en la diferencia entre la presión venosa hepática enclavada y
la libre. Refleja la presión en el sinusoide hepático, que en ausencia de una
obstrucción presinusoidal es equivalente a la presión portal. La presión sinusoidal está
determinada por la resistencia vascular hepática y también por el flujo portal y la
resistencia de las colaterales, por lo que cambios en la presión portal pueden venir
dados por aumento de la resistencia, tanto mecánicos (fibrosis, trombosis) como
dinámicos (cambios en el tono vascular), o por cambios en el flujo hepático portal. Así,
el GPVH no solamente evalúa la fibrosis hepática, sino que permite integrar en una
sola prueba la evaluación de diferentes eventos que tienen lugar en las enfermedades
Introducción
43
hepáticas, además evalúa todo un lóbulo hepático al utilizar el enclavamiento en una
vena hepática principal (158). La mayor utilidad del GPVH está en la confirmación de
la presencia de hipertensión portal, habitualmente asociada a la cirrosis, que viene
definida por un GPVH superior a 5 mmHg. Además, un GPVH superior a 10 mmHg es
el dintel a partir del cual se desarrollan complicaciones derivadas de la hipertensión
portal, es por ello que este umbral define la llamada hipertensión portal clínicamente
significativa (159).
Las limitaciones del GPVH son bien conocidas: no es una técnica fácil (requiere un
período de entrenamiento importante) ni completamente estandarizada, y no está
disponible en la mayoría de los centros. Además, si bien su capacidad pronóstica es
evidente en pacientes con hipertensión portal, no está clara su utilidad en pacientes
con hepatopatías en estadíos menos avanzados, en los que el objetivo es evitar la
progresión a cirrosis. Finalmente, no deja de ser un método invasivo que requiere la
punción de una vena yugular, con las potenciales complicaciones derivadas de la
técnica (160).
.
Introducción
44
1.9. MÉTODOS NO INVASIVOS EN EL ESTUDIO DE LA
FIBROSIS HEPÁTICA
Dadas las limitaciones de estos métodos “clásicos”, en los últimos años se están
desarrollando otros métodos no invasivos que permitan mejorar el rendimiento
diagnóstico de la biopsia o el GPVH sin presentar sus limitaciones. Existen dos tipos
de métodos no invasivos, en función del enfoque fisiopatológico que utilicen: los
métodos “biológicos”, basados en biomarcadores serológicos; y los métodos “físicos”,
que utilizan la estimación de la rigidez hepática (161)
1.9.1. Consideraciones metodológicas en los estudio s de métodos no
invasivos
La manera fundamental de evaluar un método no invasivo es validarlo contra el
método de referencia (en nuestro caso, la biopsia hepática) para determinar su
capacidad diagnóstica, definida por los valores de sensibilidad (capacidad de detectar
la enfermedad en los sujetos enfermos), especificidad (capacidad de detectar la
ausencia de enfermedad en los sanos), valor predictivo positivo (probabilidad de
presentar la enfermedad cuando el resultado de la prueba es positivo) y valor
predictivo negativo (probabilidad de estar sano cuando el resultado es negativo) (162).
En general, la validez diagnóstica de una prueba se estudia mediante el cálculo del
área bajo la curva ROC (AUROC), que representa en el eje de ordenadas los valores
de sensibilidad (fracción de verdaderos positivos) y en el eje de abscisas la fracción de
falsos positivos (1-especificidad) para cada posible valor de la prueba a testar.
Mediante esta representación de los pares (1-especificidad, sensibilidad) obtenidos al
considerar todos los posibles valores de corte de la prueba, la curva ROC proporciona
una representación global de la exactitud diagnóstica (163). La curva ROC es
necesariamente creciente, propiedad que refleja el compromiso existente entre
sensibilidad y especificidad: si se modifica el valor de corte para obtener mayor
Introducción
45
sensibilidad, sólo puede hacerse a expensas de disminuir al mismo tiempo la
especificidad. Si la prueba no permitiera discriminar entre grupos, la curva ROC sería
la diagonal que une los vértices inferior izquierdo y superior derecho (AUROC=0.5). La
exactitud de la prueba aumenta a medida que la curva se desplaza desde la diagonal
hacia el vértice superior izquierdo. Si la discriminación fuera perfecta (100% de
sensibilidad y 100% de especificidad) pasaría por dicho punto (AUROC=1). En
general, se considera un método excelente cuando el AUROC es ≥ 0.9 y bueno si es ≥
0.8.
En resumen, la curva ROC representaría la probabilidad de que una prueba
clasifique correctamente un sano y un enfermo, de acuerdo con el sistema
clasificatorio de referencia. En este sentido, es importante recordar que en el caso de
la fibrosis hepática, el sistema clasificatorio de referencia -la biopsia- es un sistema
imperfecto, sujeto a varias limitaciones (previamente descritas) que van a condicionar
la validez del diagnóstico contra el que vamos a comparar nuestro método a estudio.
De hecho, teniendo en cuenta las probabilidades de “acierto” de la biopsia y las
potenciales prevalencias del parámetro a estudiar (fibrosis significativa o cirrosis, en
general), es prácticamente imposible que un marcador “perfecto” alcance un valor
máximo de AUROC (164). Es importante, pues, tener en cuenta estas consideraciones
al evaluar técnicas no invasivas en Hepatología.
1.9.2. Biomarcadores indirectos
La manera más sencilla de evaluar la presencia de fibrosis es utilizar los
marcadores serológicos indirectos (161). Éstos son parámetros bioquímicos o
hematológicos que evalúan alteraciones funcionales hepáticas que no necesariamente
reflejan cambios en la matriz extracelular ni en las células implicadas en su recambio.
En general, estos biomarcadores se han desarrollado evaluando en análisis
multivariados las variables analíticas “estándar” asociadas con la presencia de cierto
grado de fibrosis. Con estas variables se construyen algoritmos cuyo valor diagnóstico
Introducción
46
es testado mediante el cálculo del AUROC. Entre estos marcadores, las
transaminasas, las plaquetas, el colesterol, la haptoglobina o la birrubina han sido los
parámetros más frecuentemente asociados a la presencia de fibrosis hepática. En
general, los algoritmos basados en marcadores indirectos son útiles para diferenciar la
presencia de cirrosis, aunque su capacidad para distinguir pacientes con fibrosis leve
en riesgo de progresión es moderada.
1.9.3. Biomarcadores directos
Otra opción para evaluar con métodos serológicos la presencia de fibrosis consiste
en medir niveles sanguíneos de productos de la síntesis o degradación de la matriz
extracelular (colágeno, TGF-β, ácido hialurónico), o bien niveles de las enzimas que
regulan estos procesos (metaloproteasas o sus inhibidores). Estos biomarcadores
directos, individualmente o en algoritmos combinados con marcadores indirectos,
permiten distinguir o descartar la presencia de fibrosis avanzada en una significativa
proporción de pacientes, evitando potencialmente hasta el 30-40% de las biopsias
hepáticas. Como desventaja presentan la falta de especificidad, ya que pueden estar
aumentados en procesos fibrogénicos de otros órganos o en alteraciones orgánicas
funcionales, como la insuficiencia renal; y la falta de disponibilidad de los reactivos
necesarios en la práctica clínica habitual, desventaja que podrá ser superada ya que
varios de estos algoritmos han sido patentados y pueden ser comercializados (161).
Introducción
47
Tabla 2. Algoritmos basados en marcadores serológic os más utilizados. Modificado de Martínez et al (160).
Score Componentes Etiología AUC F2 AUC F4 Fibrotest (165) Αlfa-2-macroglobulina,
apoliproproteína A1, haptoglonina, bilirrubina, GGT
VHC, VHB, OH, EHGNA
0.74-0.89 0.82-0.92
APRI (166) AST, plaquetas VHC, VHB, OH 0.69-0.88 0.61-0.94 Forns (167) Edad, GGT, colesterol,
plaquetas VHC, VHB 0.77-0.85 0-76-0.87
FIB-4 (168) Edad, ALT, AST, plaquetas VHC (VIH), VHB
0.74-0.86 0.8-0.93
ELF (169) Propéptido N-terminal procolágeno III, ácido hialurónico, TIMP-1
VHC, OH, EHGNA, CBP
0.77-0.87 0.87-0.9
Hepascore (170)
Edad, sexo, alfa-2-, macroglobulina, ácido hialurónico, bilirrubina, GGT
VHC, OH 0.74-0.86 0.8-0.94
Fibrometer (171)
Plaquetas, tiempo de protrombina, macroglobulina, AST, ácido hialurónico, edad, urea
VHC, VHB, OH 0.78-0.89 0.94
BARD (172) AST/ALT, índice de masa corporal (IMC), diabetes
EHGNA 0.61-0.81 N/A
NAFLD score (173)
Edad, IMC, plaquetas, albúmina, AST/ALT, hiperglicemia/diabetes
EHGNA 0.68-0.88 N/A
Entre los algoritmos que se basan en los marcadores directos destaca ELF (por
Enhanced Liver Fibrosis, Siemens), que incluye dos componentes de la matriz
extracelular (ácido hialurónico, y propéptido aminoterminal de procolágeno tipo III
[PIIIP]) y una enzima que está incrementada en procesos fibróticos (TIMP-1). ELF fue
desarrollado en una cohorte de más de 1000 pacientes con hepatopatías de diversa
etiología, obteniendo AUROCs para el diagnóstico de fibrosis avanzada en torno a 0.8,
y un valor predictivo negativo mayor al 90% para descartar la presencia de fibrosis
avanzada (169). El algoritmo original contenía también la edad del paciente, sin
embargo, una modificación posterior permitió descartar este componente manteniendo
la misma precisión diagnóstica (174). Los resultados fueron especialmente buenos en
los pacientes con hepatopatía alcohólica y enfermedad por depósito graso no
alcohólico. Posteriormente, este algoritmo se testó también en cohortes de pacientes
con hepatitis crónica C (175) y CBP (176), así como en pacientes trasplantados con
recidiva de la hepatitis C tras el trasplante hepático (177). En general, se puede
Introducción
48
concluir que este algoritmo permite identificar correctamente aproximadamente al 30-
40% de los pacientes, especialmente a aquellos con cirrosis o sin fibrosis significativa.
Quizá más importante es el hecho de que ELF ha mostrado una importante
capacidad predictiva de eventos clínicos. En un estudio realizado en una cohorte de
pacientes con CBP seguidos durante una mediana de casi 8 años, el nivel basal de
ELF fue el mejor predictor de eventos clínicos (incluyendo descompensaciones
clínicas, hepatocarcinoma, trasplante hepático o muerte) durante el seguimiento,
siendo su capacidad predictiva significativamente mejor que la de otros parámetros
como la bilirrubina, el MELD o el índice Mayo y equivalente a la del estadiaje
histológico (176). En un estudio similar, Carrión y colaboradores mostraron que los
valores de un score (3-M-ALG) que incluye los mismos parámetros que ELF medidos
al año del trasplante hepático en una cohorte de 133 pacientes trasplantados por
hepatitis C discriminaban de manera muy precisa a los pacientes que durante el
seguimiento presentarían descompensaciones clínicas o fallecerían (177).
1.9.4. Elastografía de transición: Fibroscan®
El otro gran método no invasivo para la estimación de la fibrosis hepática es la
elastografía de transición (Fibroscan®, Echosens) (178). El aparato de Fibroscan®
dispone de una sonda emisor-receptor, que se coloca entre las costillas a la altura del
hígado, en la intersección entre la línea medioaxilar y una línea perpendicular al
apéndice xifoides. Esta sonda genera una onda vibratoria de corta amplitud y baja
frecuencia, la cual se transmite dentro del parénquima hepático generando un onda
elástica cuya velocidad depende de la rigidez del tejido: más rápida cuanto más rígido
es el tejido. La velocidad de la onda elástica es detectada por ultrasonidos por la
misma sonda, y se expresa convertida en un valor de presión o “rigidez” (kPa). El
volumen hepático en el cual se evalúa la rigidez es un cilindro de 4 cm de profundidad
por 1 cm de ancho, entre 25 y 65 mm de profundidad desde la piel. El volumen
hepático explorado es aproximadamente 100 veces mayor que el de una biopsia
Introducción
49
hepática, siendo más representativo del parénquima hepático, con lo cual se
disminuye el error de muestra respecto a la biopsia. La elastografía de transición es un
método rápido (aproximadamente 5 minutos), indoloro, y se puede realizar en ámbito
ambulatorio, obteniendo los resultados de manera inmediata. El resultado es la
mediana de 10 mediciones válidas, y como criterios de calidad de la exploración el
fabricante recomienda utilizar el índice de éxito (success rate, % de mediciones
válidas, que debería ser > 60%), y el ratio entre el rango intercuartil (RIQ) y la mediana
(RIQ/M), que se recomienda debe ser menor a 0.3. El rango de resultados va de 3 a
75 kPa. Se estima que es necesario un entrenamiento de unas 100-500 exploraciones
para considerar a un operador suficientemente entrenado (179).
Varios estudios han evaluado la reproducibilidad de Fibroscan®. En general, el
grado de acuerdo intra e interobservador es excelente, con coeficientes de correlación
por encima de 0.9. Los factores que pueden influir en una mayor variabilidad son la
experiencia del operador, la presencia de esteatosis y un índice de masa corporal
(IMC) elevado. En este sentido, es importante recordar también que los pacientes
obesos, y aquellos con espacios intercostales estrechos, presentan más
probabilidades de no obtener resultados fiables (es decir, que no cumplan los criterios
previamente reseñados: SR > 60%, ratio RIQ/M < 0.3), además de los pacientes con
ascitis, en los que no es posible realizar la medición (180-182). Finalmente, es
importante conocer las situaciones que conducen a un aumento de la rigidez hepática
no relacionado con la presencia de fibrosis: el hígado está envuelto por la cápsula de
Glisson, que es distensible pero no elástica, por lo que circunstancias que produzcan
un aumento de la presión en el hígado podrían interferir con la elasticidad hepática sin
modificar el contenido de fibra. Así, varios estudios han mostrado que la insuficiencia
cardíaca congestiva, la colestasis extrahepática y especialmente el grado de actividad
necroinflamatoria en hepatitis agudas o agudizaciones de hepatitis crónicas pueden
sobreestimar el valor de Fibroscan® (183-185). Todas estas limitaciones subrayan que
la interpretación del resultado de la estimación de la elasticidad hepática y su relación
Introducción
50
con la fibrosis se ha de realizar con cautela por un facultativo con experiencia y
conocimiento de las características y limitaciones de la técnica.
La validez de la estimación de la elasticidad hepática para el diagnóstico de la
fibrosis hepática ha sido evaluada en múltiples estudios, la mayor parte de los cuales
se han realizado en poblaciones con hepatitis crónica C, sin embargo, también existen
estudios en cohortes de pacientes con hepatitis B, enfermedad hepática por depósito
graso, hepatopatía alcohólica, enfermedades colestásicas y recurrencia de la hepatitis
C post-trasplante hepático (186-190). En un metaanálisis que incluyó 50 estudios se
obtuvo un AUROC de 0.84 para el diagnóstico de fibrosis significativa y de 0.94 para el
diagnóstico de cirrosis, con unos valores diagnósticos óptimos de 7.6 y 13 kPa,
respectivamente (191). La técnica permite identificar con bastante fiabilidad a los
pacientes con formas más avanzadas de la enfermedad (fibrosis significativa y
especialmente cirrosis), pero existe un considerable solapamiento en los valores de
Fibroscan en los estadíos menos avanzados de fibrosis.
Figura 5. Imagen de Fibroscan.
Introducción
51
Por otra parte, se ha estudiado la validez de Fibroscan® para el diagnóstico de
otras entidades clínicas, tales como la presencia de hipertensión portal o varices
esofágicas (192,193). Si bien parece claro que existe una asociación clara entre el
gradiente de presión venosa hepática y la rigidez hepática, los puntos de corte óptimos
para determinar la presencia de hipertensión portal clínicamente significativa o varices
esofágicas no están claros y la utilización de Fibroscan® para estimar la presión
venosa hepática o sus complicaciones aún no está validada y requiere más estudios
(194).
Finalmente, la estimación de la rigidez hepática con Fibroscan® permite predecir
eventos clínicos de importancia capital en los pacientes con hepatopatía crónica. En
un estudio realizado en Japón en una cohorte de casi 1000 pacientes con hepatitis
crónica C se mostró que las probabilidades de desarrollar hepatocarcinoma están
directamente relacionadas con el grado de rigidez hepática estimada con Fibroscan®
(195), en otro estudio con pacientes con hepatitis crónica B se obtuvieron resultados
muy similares (196). Recientemente se han publicado varios estudios que muestran
que la capacidad pronóstica de Fibroscan® no se limita a la predicción de
hepatocarcinoma, sino que la estimación de la rigidez hepática permite identificar
pacientes con más riesgo de presentar complicaciones derivadas de la hipertensión
portal e incluso predecir la supervivencia en pacientes con hepatitis crónica C
(197,198).
1.9.5. Otros métodos elastográficos: ARFI
ARFI (Acoustic Radiation Force Impulse) es una nueva tecnología desarrollada por
Siemens que permite estimar la rigidez de los tejidos a la vez que se realiza un estudio
ecográfico estándar, ya que está incorporada en un ecógrafo convencional. El
transductor ecográfico genera pulsos acústicos longitudinales de baja frecuencia y
corta amplitud que provocan desplazamientos en el tejido hepático. Estos
desplazamientos resultan en una onda elástica de pulso que se desplaza por el tejido
Introducción
52
y cuya velocidad, que es proporcional a la rigidez del tejido, es medida (en m/s)
mediante pulsos ecográficos de detección adyacentes a la onda acústica (199).
Figura 6. Mecanismo físico de ARFI. Adaptado de Bou rsier et al (200).
El hecho de formar parte de un aparato de ultrasonidos podría constituir una
ventaja significativa de ARFI: aparte de poder realizar en la misma exploración una
ecografía abdominal y la medición de la velocidad de la onda de pulso, que estima la
rigidez tisular; la guía ecográfica permite elegir el área del hígado donde se va a
estimar la velocidad de la onda, evitando por tanto los grandes vasos, las lesiones
ocupantes de espacio o las áreas de esteatosis parcheada.
En el primer estudio piloto que evaluó ARFI en el diagnóstico de la fibrosis
hepática, Friedrich-Rust et al incluyeron 81 pacientes con hepatitis crónica viral (17
hepatitis B y 64 hepatitis C) a los que se les había realizado una biopsia hepática en
los 15 meses previos, y a los que se les realizó una elastografía de transición y una
medición de ARFI, además de calcularse dos algoritmos serológicos, APRI y Fibrotest
(199). Los autores mostraron una correlación estadísticamente significativa entre los
valores de ARFI y el estadio de fibrosis, con un rango de resultados entre 0.84 y 3.23
m/s y unos valores óptimos de corte para el diagnóstico de fibrosis significativa y
Introducción
53
cirrosis de 1.37 y 1.75 m/s, respectivamente. Los valores de AUROC de ARFI y
Fibroscan para el diagnóstico de fibrosis significativa fueron de 0.82 y 0.84,
respectivamente; y de 0.91 en los dos casos para el diagnóstico de cirrosis, y se
observó asimismo una excelente correlación interobservador. La reproducibilidad y
aplicabilidad de ARFI fueron estudiadas por Boursier y colaboradores en un estudio
posterior con 101 pacientes a los que 2 investigadores (experto y novel) realizaron
ARFI (en ambos lóbulos hepáticos) y Fibroscan (200). ARFI se pudo realizar en todos
los pacientes, mientras que Fibroscan no obtuvo resultado válido en 6, siendo ambas
técnicas equiparables en términos de AUROC. La correlación entre observadores fue
excelente, sin observarse curva de aprendizaje significativa. Posteriormente se han
reportado varios estudios con menor número de pacientes, en ellos se han obtenido
resultados similares, con precisión diagnóstica en general muy parecida a la de
Fibroscan® (201-204).
Figura 7. Imagen de ARFI.
Introducción
54
1.9.6. Combinaciones de métodos
Con la intención de mejorar la capacidad diagnóstica, se ha propuesto otro tipo de
enfoque de los métodos no invasivos, consistente en la combinación de varios de
ellos, ya sea de manera simultánea como secuencial. En 2005, Castera et al
mostraron que combinar sincrónicamente los resultados de Fibroscan® y FibroTest
permitía evitar aproximadamente el 75% de las biopsias hepáticas en un estudio con
pacientes con hepatitis crónica C (205). Este abordaje contrasta con el propuesto por
otros grupos, consistente en realizar primero un score serológico (APRI) y
posteriormente, en caso de resultado no clasificatorio, aplicar otro algoritmo
serológico, FibroTest (206). Las dos propuestas se evaluaron en la misma población,
consiguiéndose evitar más biopsias mediante el enfoque consistente en aplicar
simultáneamente Fibroscan® y Fibrotest (207). De hecho, a priori, combinar dos
métodos “no relacionados” o “complementarios” (un método elastográfico y un
marcador serológico) tendría ciertas ventajas respecto a utilizar dos marcadores
serológicos, ya que la elastografía permite evaluar más fidedignamente la estructura
hepática. Además, ambos tipos de métodos utilizan bases fisiopatológicas diferentes y
los factores que condicionan la validez de la elastografía son diferentes de los que
limitan la aplicación de los marcadores serológicos, por lo que la utilización de 2
métodos con las mismas limitaciones podría tener una menor aplicabilidad que el uso
de dos métodos diferentes.
2. HIPÓTESIS
_____________________________________________________
Hipótesis
57
Dado que la unión y posterior entrada del VHC en los hepatocitos es un factor
limitante para el inicio de su ciclo vital, las variaciones en la expresión de los receptores
del VHC podrían influir en la cinética de la infección por el VHC del injerto, que ocurre de
manera universal en el trasplante hepático por VHC. Asimismo, teniendo en cuenta que
la cinética de la infección del injerto podría tener influencia sobre la progresión de la
recidiva, es posible que la expresión de receptores repercuta en la gravedad y rapidez
del depósito de fibra colágena que tiene lugar tras la infección del injerto por el VHC.
El diagnóstico del depósito de fibra hepática es clave, tanto en los pacientes
trasplantados hepáticos como en los inmunocompetentes. En este sentido, la
utilización de una nueva tecnología como ARFI permitiría mejorar la aplicabilidad de la
elastografía en el diagnóstico no invasivo de la fibrosis hepática. Teniendo en cuenta
los diferentes mecanismos fisiopatológicos de los métodos, la utilización combinada de
biomarcadores directos de fibrogénesis, como el algoritmo ELF, con métodos de
imagen basados en la elastografía (ARFI o Fibroscan®) podría ser capaz de aumentar
la precisión diagnóstica en el estadiaje de la fibrosis hepática.
58
3. OBJETIVOS
_____________________________________________________
Objetivos
61
1.- Evaluar si las diferencias en la expresión de receptores de entrada del VHC en
el injerto en el momento del TH influyen en la cinética precoz de infección del injerto.
2.- Analizar si las diferencias en la expresión de receptores del VHC influyen en la
rapidez y gravedad de la hepatitis aguda que se produce en las primeras semanas
post-trasplante.
3.- Estudiar si la infección por VHC induce cambios en la expresión de receptores
del VHC en el injerto hepático.
4.- Comparar la aplicabilidad de dos métodos elastográficos (ARFI y Fibroscan®)
en la evaluación de la fibrosis hepática.
5.- Evaluar la capacidad diagnóstica de ELF, ARFI y Fibroscan® para diagnosticar
la presencia de fibrosis significativa y cirrosis, utilizando la biopsia hepática como
método de referencia.
6.- Estudiar si la combinación un marcador serológico (ELF) con métodos
elastográficos (ARFI y Fibroscan®) permite un mejor diagnóstico de la fibrosis hepática
que los métodos individuales.
62
4. ESTUDIO 1
______________________________________________________
Estudio·1
65
“Hepatitis C virus receptors claudin-1 and occludin after liver
transplantation and influence on early viral kineti cs”
Laura Mensa*, Gonzalo Crespo* , Matthew J Gastinger, Juraj Kabat, Sofía Pérez-del-
Pulgar, Rosa Miquel, Suzanne U Emerson, Robert H Purcell, Xavier Forns
Hepatology 2011;53:1436-1445
66
VIRAL HEPATITIS
Hepatitis C Virus Receptors Claudin-1 and OccludinAfter Liver Transplantation and Influence on Early Viral
KineticsLaura Mensa,1* Gonzalo Crespo,1* Matthew J. Gastinger,3 Juraj Kabat,3 Sofıa Perez-del-Pulgar,1
Rosa Miquel,2 Suzanne U. Emerson,4 Robert H. Purcell,4 and Xavier Forns1
Liver transplantation (LT) is a unique model to study hepatitis C virus (HCV) entry into hepa-tocytes. Recent in vitro studies suggest significant changes in the expression of the HCV recep-tors claudin-1 and occludin after HCV infection. Our aims were: (1) to characterize claudin-1and occludin expression in grafts from LT recipients and (2) to explore their potential influ-ence on early HCV kinetics and their changes after HCV infection. We included 42 HCV-infected LT recipients and 19 uninfected controls. Claudin-1 and occludin were detected inparaffin-embedded liver biopsies obtained during reperfusion and 3 and 12 months after LT.HCVreceptors were characterized by confocal immunofluorescence microscopy; quantificationand colocalization studies were performed with dedicated software. Claudin-1 and occludinexpression were restricted to the apical pole of hepatocytes. There was a significant correlationbetween the amount of scavenger receptor B1 at the time of reperfusion and the HCV-RNAdecay during the first 24 hours following LT (r5 0.55, P5 0.007). Similarly, there was a sig-nificant correlation between the levels of claudin and occludin and the slope of HCV-RNAincrease during the first week after LT (r 5 0.63, P 5 0.005). Occludin and claudin-1 levelsincreased significantly 12 months after LT (P5 0.03 and P5 0.007, respectively). The expres-sion pattern of both proteins, however, remained unchanged, colocalizing strongly (60%-94%) at the apical membrane of hepatocytes. Conclusions. HCV receptor levels at the time ofLT seem to modulate early HCV kinetics. Hepatitis C recurrence after LTwas associated withincreased levels of claudin-1 and occludin in the hepatocyte cell membrane, although it didnot alter their localization within the tight junctions. (HEPATOLOGY 2011;53:1436-1445)
Hepatitis C virus (HCV) is the leading cause ofchronic liver disease in many regions of theworld. Chronic hepatitis C progresses to cirrho-
sis and endstage liver failure in a significant proportion of
patients over the years and is the main indication for livertransplantation (LT) in the Western world and Japan.1
Major advances have been achieved in the last fewyears towards a better understanding of the HCV life
Abbreviations: CH, cholestatic hepatitis; CMV, cytomegalovirus; CyA, cyclosporine A; DDLT, deceased donor liver transplantation; FFPE, formalin-fixed andparaffin-embedded; FK, tacrolimus; HCV, hepatitis C virus; HCVpp, HCV pseudoparticle; HVPG: hepatic venous pressure gradient; LDLT, living donor livertransplantation; LT, liver transplantation; MR, mild hepatitis C recurrence; SR-B1, scavenger receptor B1.From the 1Liver Unit, Hospital Clinic, IDIBAPS, Ciberehd, Barcelona, Spain; 2Pathology Department, Hospital Clinic, IDIBAPS, Ciberehd, Barcelona, Spain;
3Biological Imaging Facility/Research Technologies Branch, National Institute of Allergy and Infectious Disease, National Institutes of Health, Bethesda, MD; and4Hepatitis Viruses Section, Laboratory of Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Disease, National Institutes of Health, Bethesda, MD.Received June 15, 2010; accepted November 29, 2010.X. Forns received support in part by a grant from Instituto de Salud Carlos III (PI080239), cofunded by the European Regional Development Fund (ERDF),
and by the Spanish Association for the Study of Liver Diseases (AEEH, Beca Hernandez-Guıo). G. Crespo was supported by Hospital Clinic (Ajut a la RecercaJosep Font) and Fundacion BBVA. L. Mensa was supported by Instituto de Salud Carlos III (PFIS). This study was supported in part by the Intramural ResearchProgram of the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health.*LM and GC contributed equally to this study and both should be considered first authors.Address reprint requests to: Xavier Forns, Liver Unit, Institut de Malalties Digestives, Hospital Clinic, IDIBAPS, Ciberehd, Villarroel 170, 08036 Barcelona,
Spain. E-mail: [email protected] 2011 by the American Association for the Study of Liver Diseases.View this article online at wileyonlinelibrary.com.DOI 10.1002/hep.24110Potential conflicts of interest: X.F. received an unrestricted grant support from Schering and Roche. M.G. is currently employed by Bitplane but his affiliation
was the one stated above during the period of study design, laboratory work, and article preparation.Additional Supporting Information may be found in the online version of this article.
1436
cycle. The development of a retroviral pseudoparticlesystem (HCVpp)2 and the ability of an HCV strain(JFH-1)3 to replicate and release infectious particles incell culture have been very relevant to the study ofHCV entry into hepatocytes. Virus entry is commonlya complex event that requires sequential interactionsbetween viral surface proteins and cellular factors.4-10
The exact mechanisms by which HCV reaches thecytoplasm of liver cells and initiates replication are notyet completely understood. The fact that HCV needsseveral receptors with different membrane distributionsfavors the hypothesis of a coordinated entry process,such as what occurs with other viruses (i.e., Coxackievirus B).7,10,11 Ploss et al.10 recently proposed thatHCV may initially interact with the luminal (sinusoi-dal) surface of the hepatocyte by contact with scav-enger receptor B1 (SR-B1) and CD81. Thereafter a vi-rus-receptor complex might migrate to the biliary pole(apical membrane), where the virus-receptor complexreaches the tight junctions and uptake into the cyto-plasm would occur. The recent discovery that the tightjunction proteins claudin-1 and occludin are essentialfactors for HCV entry into cells suggests a role forthese proteins in HCV cell-cell transmission, a routeof spread that is still under investigation.7
Recent studies have analyzed the potential role ofHCV infection in the regulation of its putative recep-tors, particularly those located in the tight junctions.In one study, HCV infection appeared to down-regu-late claudin-1 and occludin in Huh7 cells.12 Inanother study, expression of HCV structural proteinsin Huh7 cells was not associated with changes in clau-din-1 and occludin levels, but these proteins accumu-lated in the endoplasmic reticulum and their alteredlocalization disrupted the tight junction barrier func-tion.13 These differences between studies reflect thecomplexity of the HCV entry mechanisms and the factthat current in vitro systems may not completelyreproduce the virus life cycle in a human liver.14
Liver transplant patients undergo frequent liverbiopsies, allowing in vivo assessment of the potentialchanges in the expression of such HCV receptors overtime. The aim of this study was to evaluate the poten-tial changes in tight junction proteins claudin-1 andoccludin following HCV graft infection and to analyzeif their expression could influence early HCV kinetics.
Patients and Methods
Patients. Forty-two HCV-infected patients under-going LT from January 2000 to January 2008 wereincluded in the study. Selection of patients was based on
the type of hepatitis C recurrence and individuals at bothextremes of the disease spectrum (mild and severe) wereselected. Mild disease recurrence was defined as absent(F0) or mild (F1) fibrosis 1 year after transplantation,and a normal hepatic venous pressure gradient (HVPG).Severe disease recurrence was defined as the presence ofadvanced fibrosis (F�3) and/or clinically significant por-tal hypertension (HVPG�10 mmHg) 1 year after trans-plantation. Nineteen HCV-negative liver transplantrecipients served as controls.15,16
All patients were followed in our Liver Unit andunderwent standard immunosuppression protocols.15
Induction immunosuppression consisted of cyclospo-rine A or tacrolimus and prednisone. After hospitaldischarge patients visited the outpatient clinic monthlyfor 3 months for complete recording of clinical andanalytical data and every 2 or 3 months thereafter.Liver biopsies were obtained after graft reperfusion (re-vascularization of the graft during the surgical proce-dure) and at 3 and 12 months after LT in accordancewith the standard protocol. Patients whose liver diseasewas likely caused by another reason (rejection, cyto-megalovirus [CMV] infection) were excluded. Thestudy was previously approved by the Investigationand Ethics Committee of the Hospital Clinic of Barce-lona following the ethical guidelines of the 1975 Dec-laration of Helsinki. We obtained informed consentfrom all patients included in the study.Liver Biopsies. Percutaneous liver biopsies were per-
formed by expert radiologists. HVPG measurementsand transjugular liver biopsies were performed at theHepatic Hemodynamics Laboratory as described.16
Liver samples were processed by the Pathology Depart-ment. All tissue samples were formalin-fixed and paraf-fin-embedded (FFPE). For diagnostic purposes, sam-ples were stained with hematoxylin-eosin and Masson’strichromic. All histological samples were examined byan expert pathologist (R.M.). Fibrosis stage was scoredusing the Scheuer classification.Immunofluorescence Protocols. Representative 5-10
lm sections were cut from paraffin blocks andmounted on charged slides. Slides were heated over-night at 37�C and thereafter deparaffinized by treatingthe slides with xylene 3 times (10 minutes each) fol-lowed by ethanol rehydration.Antigen retrieval was performed by treating the tissue
with heat using a pressure cooker (Pascal, Dako, Carpin-teria, CA). When the temperature reached 80�C the sec-tions were placed on metal racks and submerged in a1 mM EDTA solution (pH 8). The pressure cooker wasset to reach 125�C (21 psi) for 2 minutes. Thereafter, thesections were blocked for 30 minutes with phosphate-
HEPATOLOGY, Vol. 53, No. 5, 2011 MENSA ET AL. 1437
buffered saline (PBS) / 10% goat serum (Jackson Immu-noResearch, West Grove, PA), followed by incubationfor 2 hours at room temperature with the primary anti-body: 2.5 lg/mL rabbit polyclonal antihuman claudin-1(Zymed, Invitrogen, Carlsbad, CA), 5 lg/mL mousemonoclonal antihuman occludin (Zymed, Invitrogen),2.5 lg/mL mouse monoclonal antihuman SR-B1 (BDTransduction Laboratories, San Jose, CA), or 2 lg/mLrat antihuman CD10 (Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA). After three washes with PBS (10 minuteseach), sections were incubated with the secondary anti-body for 1 hour at room temperature. Secondary anti-bodies were: Alexa Fluor 488 goat antirabbit immuno-globulin G (IgG), Alexa Fluor 568 F(ab’)2 fragment ofgoat antimouse IgG (HþL), and Alexa Fluor 647 goatantirat IgG (Invitrogen). Slides were washed three timeswith PBS (10 minutes each); after the second wash slideswere incubated for 2 minutes with DAPI (Sigma Aldrich,St. Louis, MO). Slides were then mounted with HardMounting Media (Vector Laboratories, Burlingame, CA)and kept overnight at room temperature in the dark.Analysis of Receptor Expression by Confocal
Microscopy. Images were acquired on a Leica SP5 con-focal microscope (Leica Microsystems, Exton, PA)using 488 nm, 561 nm, or 633 nm laser lines. Hoechstdye was excited using a 364 nm Enterprise II UV laser(Coherent, Santa Clara, CA). Sequential frame aver-aged scans were set up for each fluorophore to elimi-nate emission crosstalk. All images were saved in a 12bit TIFF format at 512 � 512 or 1024 � 1024 pixels.Surface rendering and colocalization analysis were per-formed using Imaris (v. 6.2.2, Bitplane, Zurich, Swit-zerland). For each channel an individual threshold wasselected and maintained for all processed samples. Sumof intensities (representing the sum of the intensitiesobtained in each voxel above the threshold) and num-ber of positive voxels (those with intensity above theestablished threshold) were calculated for each individ-ual sample. In order to correctly sample the entire liverbiopsy, 10 different image acquisitions were obtainedfor each liver section. The sum of intensities and thenumber of positive voxels for each biopsy was calcu-lated as the geometrical mean of the individual valuesobtained in the different acquisitions.A detailed colocalization study for claudin-1 and
occludin was performed in 20 selected specimens.For this purpose, triple staining was carried out withrabbit anti-claudin-1, mouse anti-occludin, and ratanti-CD10 (a commonly used marker of the biliarycanalicula). Sequential sections of stained sampleswere acquired with the 63�-oil immersion objective(NA 1.4) at a zoom of 5 to 7 with a Z-step of
0.20-0.25 lm through the entire volume of the par-affin section (�7-10 lm section thickness). All col-lected images for 3D analyses were deconvolved byHuygens Essential software (v. 3.4, Scientific VolumeImaging, Hilversum, The Netherlands). A 3D imagevolume was reconstructed from sequential z-sectionsand colocalization analyses were performed in Imarissoftware. Surface rendering and channel masking wasused in conjunction with manual thresholding to cal-culate protein colocalization statistics in a 3D envi-ronment. The same level of thresholding was appliedto each dataset; unlabeled regions were not includedin this analysis (masking). The level of colocalizationin the 3D volume was measured as percent of vol-ume of the channel above threshold colocalized (thetotal number of colocalized voxels divided by thetotal number of voxels in each channel that are abovethe threshold). A second measure of the intensity ofcolocalization between claudin-1 and occludin wasobtained by calculating the correlation between theintensities of the colocalized voxels (Pearsoncorrelation).Positive (strongly positive samples) and negative
controls (samples stained with an irrelevant primaryantibody) were included in each experiment. In orderto ensure that differences in the expression of receptorswere not due to methodological issues, 20 randomliver biopsies were processed in triplicate on differentdays following the same protocols. Sum of intensitiesfor SR-B1 and claudin-1 as well as the number of pos-itive voxels for each channel were compared for eachindependent experiment. Samples were always proc-essed blindly. This applied both to the immunofluores-cence protocol and for image processing. Coding ofslides allowed the staining of samples belonging to thesame patient in the same experiment.Quantitation of Claudin-1 and Occludin Messen-
ger RNA (mRNA) by Real-Time Polymerase ChainReaction (PCR). Total RNA was extracted from 5 lmFFPE liver sections (five sections for each sample)using the RNeasy FFPE Kit (Qiagen, Hilden, Ger-many) and then stored at �80�C in 66 available sam-ples. Reverse transcription was performed with theArchive High Capacity complementary DNA (cDNA)Synthesis Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA).Levels of claudin-1 and occludin were measured withTaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems).Ribosomal protein L13a (RPL13a) was chosen as anendogenous control for mRNA normalization. Relativequantitation was carried out using the standard curvemethod. Data are expressed as the fold change relativeto an arbitrary calibrator.
1438 MENSA ET AL. HEPATOLOGY, May 2011
HCV-RNA Determination. To study early HCVkinetics, serum samples were obtained immediatelybefore LT and daily during the first week following LT.Thereafter, samples were collected weekly during thefirst month and at months 3, 6, and 12. Viral load inserum specimens was determined by real-time PCR(m2000rt, Abbott, with a detection limit of 30 IU/mL), as reported.15 Samples belonging to the samepatient were assayed in the same run.Statistical Analysis. Quantitative variables are
expressed as medians (range) and depicted in thefigures as boxplots. Differences between qualitativevariables were assessed with the Fisher exact test.Differences between quantitative variables were ana-lyzed with a nonparametric test (Mann-Whitney orKruskal-Wallis for unpaired samples, Wilcoxon forpaired samples). Correlations between quantitativevariables were expressed by the Pearson coefficient.The software used for statistical analysis was SPSS16.0 (Chicago IL).
Results
Patient Characteristics. Forty-two HCV-infectedpatients and 19 HCV-negative controls were includedin the study. The baseline characteristics of the patientsare summarized in Table 1. Hepatitis C recurrence wasmild in 23 individuals and severe in 19. A liver biopsyobtained at time of liver reperfusion and 12 monthsafter LT was available for all 42 patients; a 3-monthbiopsy was available in 36. For the 19 HCV-negativecontrols, liver biopsies were available for all individualsat the three timepoints. The indication for LT in thecontrols was alcoholic cirrhosis (14), hepatitis B (1),primary sclerosing cholangitis (1), NASH (2), and fa-miliar amyloidotic polyneuropathy (1).Quantitative Expression of HCV Receptors:
Reproducibility. Twenty random liver biopsies werestained for claudin-1 and SR-B1 in three independentexperiments using slices from the same biopsy. Forclaudin-1 the correlation coefficients between the sumof intensities obtained in the three independent
Table 1. Baseline Characteristics of Patients Included in the Study
HCV-Infected Patients
n542
Controls
n519
HCV-Infected Patients
n542 P
Mild Recurrence
n523
Severe Recurrence
n519 P
Age (years) 58 (42-68) 57 (36-69) 0.51 55 (39-66) 62 (36-69) 0.22
Sex, males (%) 15 (79) 22 (52) 0.09 13 (57) 9 (47) 0.8
Donor age (years) 47 (25-76) 45 (13-77) 0.59 34 (13-76) 53 (18-77) 0.005
Ischemia time (min) 458 (275-900) 342 (60-720) 0.007 322 (60-720) 362 (85-485) 0.5
Genotype (%)
1 37 (88) 20 (87) 17 (90) 0.3
2/3 3 (7) 2 (9) 1 (5)
Unknown 2 (5) 1 (4) 1 (5)
Pre-LT viral load (log10IU/mL) 5 (2-6.6) 4.5 (2-6.6) 5.32 (2.9-6.56) 0.47
Viral load 1 month (log10IU/mL) 6.4 (4-7.03) 5.9 (4.9-7.8) 6.8 (4.7-9) 0.03
Viral load 3 month (log10IU/mL) 6.6 (4.7-8.5) 6.2 (4.7-7.9) 6.7 (5.8-8.5) 0.02
Viral load 12 month (log10IU/mL)* 6.3 (3.9-7.5) 6.3 (4-7) 6.3 (3.9-7.5) 0.32†
Type of transplantation DDLT vs. LDLT 15 (79)/4 (21) 37 (88)/5 (12) 0.44 21 (91)/2 (9) 16 (84)/ 3 (16) 0.6
Immunosuppression
CyA 6 (32) 23 (55) 0.4 13 (57) 10 (53) 1
FK 13 (68) 19 (45) 10 (43) 9 (47)
Acute rejection 8 (42) 11 (26) 0.24 7 (30) 4 (21) 0.49
Corticosteroid bolus 3 (16) 7 (17) 1 5 (28) 2 (11) 0.33
CMV disease‡ 0 5 (12) 0.14 2 (9) 3 (16) 0.48
Biliary complications 3 (16) 14 (33) 0.22 7 (30) 7 (37) 0.75
Fibrosis stage (1y)
F0 16 (38) 16 (70) —
F1 7 (17) 7 (30) —
F3 13 (31) — 13 (68)
F4 5 (12) — 5 (26)
HVPG (1 y)§
<6 mmHg 21 (52) 21 —
�10 mmHg 19 (48) — 19
Abbreviations: DDLT: deceased donor liver transplantation; LDLT: living donor liver transplantation; CyA; cyclosporine A; FK: tacrolimus, CMV: cytomegalovirus; y: year.
*There were no differences in viral load between patients treated with CyA and FK at any timepoint.
†Patients who were under antiviral treatment are excluded.
‡Detection of CMV (antigen, DNA) in the presence of symptoms.
§Available in 40 patients.
HEPATOLOGY, Vol. 53, No. 5, 2011 MENSA ET AL. 1439
Fig. 1. Immunostaining of claudin-1 and SR-B1 in a representative liver biopsy. Claudin-1 is depicted in green, SR-B1 is shown in red.The expression of claudin-1 is restricted to the apical membrane of the hepatocytes, whereas SR-B1 is expressed in the sinusoidal pole ofliver cells.
Fig. 2. (A) Confocal images (xy and xz sections) obtained from a liver biopsy of an HCV-infected patient. Claudin-1 (green) and occludin (red)localization is restricted to the apical membrane of hepatocytes following a typical tram track (tight junction) pattern; CD10 (a biliary canalicularmarker) is depicted in white. (B) High-resolution 3D image. CD10 (white) localized within the bile canaliculi, which is most likely explained by itsexpression in the microvilli of adjacent hepatocytes. Claudin-1 (green) and occludin (red) distribution followed the apical membrane of adjacenthepatocytes.
1440 MENSA ET AL. HEPATOLOGY, May 2011
experiments ranged from 0.72 to 0.75 (P < 0.01 inall cases). For SR-B1 the comparable values rangedfrom 0.89 to 0.91 (P < 0.01 in all cases). These datasupport the excellent reproducibility of receptor quan-tification using our methodology.Localization of HCV Receptors Claudin-1 and
Occludin in Hepatocytes. Immunostaining of claudin-1 and occludin in liver biopsies demonstrated theexpression of both tight junction proteins in the apicalmembrane of the hepatocytes, whereas SR-B1 wasexpressed in the sinusoidal pole of liver cells (Fig. 1).To confirm that expression of claudin-1 and occludinwas restricted to the apical pole of hepatocytes, we per-formed a triple staining, including CD10 in 20 repre-sentative samples. CD10, also known as commonALLantigen (CALLA) is a cell membrane metallopepti-dase that is expressed in the canaliculi of normal orneoplastic liver. As shown in Fig. 2A, claudin-1, occlu-din, and CD10 were localized in the apical pole of he-patocytes. We were unable to detect significantamounts of claudin-1 and occludin in the basolateral/
sinusoidal membrane of liver cells in any of the stud-ied samples. High-resolution 3D images were obtainedin the 20 selected liver biopsies. As shown in Fig. 2B,CD10 was localized within the biliary canalicula,which is most likely explained by its distribution alongthe surface of the microvilli of the liver cells.17 Clau-din-1 and occludin distribution followed the apicalmembrane of adjacent hepatocytes, corresponding toproteins localized in tight junctions.We also used the high-resolution images to study
the colocalization pattern of the two HCV receptors.Our results indicate that overall, claudin-1 and occlu-din colocalized strongly in all studied samples: 60% to94% of claudin-1 volume colocalized with occludin.The coefficients of correlation between colocalized vox-els, however, varied significantly from sample to sam-ple and ranged from 0.20 to 0.86 and correlatedstrongly with the amount of expressed claudin-1 (r ¼0.8, P < 0.001).Viral Kinetics and Receptor Expression. We
wished to determine if SR-B1 and tight junction
Fig. 3. Influence of HCV receptor abundance and early viral kinetics. (A) HCV early viral kinetics in a representative patient: HCV-RNA concen-tration is depicted on the y axis (logarithmic scale, IU/mL) and time (in hours) is shown on the x axis. (B) Correlation between SR-B1 levels inthe graft and the HCV-RNA decline (in log10) during the first 24 hours after LT. (C) Correlation between the abundance of claudin-1 and occludinin the graft and the HCV-RNA increase slope during the first 7 days following LT. Levels of SR-B1, claudin-1, and occludin are represented asthe sum of intensities (x axis log10). SI: sum of intensities.
HEPATOLOGY, Vol. 53, No. 5, 2011 MENSA ET AL. 1441
proteins claudin-1 and occludin (which most likelyrepresent the final step in HCV entry into hepatocytes)influenced early HCV kinetics. For this purpose, wedivided early viral kinetics into two different compo-nents: (1) the initial viral load decay, which occursduring the first 24 hours following graft reperfusionand (2) the viral load increase the first week followingLT (Fig. 3A).18 The first viral load decline may repre-sent massive viral uptake by the liver, whereas the viralload increase during the first week indicates HCV rep-lication in the newly infected liver. There was a signifi-cant correlation between the viral load decay and thelevels of SR-B1 in the graft at the time of reperfusion(r ¼ 0.55, P ¼ 0.007) (Fig. 3B). Interestingly, therewas a significant relationship between the levels ofoccludin and claudin-1 in the graft at the time ofreperfusion and the slope of HCV-RNA increase dur-ing the first week after LT (r ¼ 0.63; P ¼ 0.005) (Fig.3C), suggesting a potential role of these receptors inregulating early HCV kinetics.Changes of Claudin-1 and Occludin Expression
Levels and Pattern Following HCV Infection. We an-alyzed if the expression pattern of these proteinschanged following HCV infection after LT. For thispurpose we compared the patterns of claudin-1 andoccludin expression in liver samples obtained duringgraft reperfusion (before HCV replication starts in theliver) and at 3 and 12 months after LT. Localization ofclaudin-1 and occludin was limited to the apical poleof the hepatocyte membrane at all timepoints, inde-pendently of the severity of hepatitis C recurrence(Fig. 4A,B). Reconstruction of 3D images in xz sec-tions supported the absence of significant amounts ofthese proteins in the basolateral/sinusoidal membraneof the hepatocytes. Moreover, we did not observe cyto-plasmic retention of claudin-1 or occludin after HCVinfection, as described in vitro.19 We observed a signif-icant increase in the levels of occludin and claudin-1 1year after LT (P ¼ 0.03 and P ¼ 0.007, respectively),both in patients with mild and severe disease recur-rence (Supporting Table 1 and Supporting Fig. 1). Inthe HCV-negative controls the levels of claudin-1 andoccludin remained unchanged after transplantation(Supporting Fig. 1).The amount of claudin-1 was higher in liver sam-
ples from patients with severe hepatitis C recurrence(particularly 12 months after LT) compared to thosewith mild recurrence, but the differences did notreach statistical significance (Supporting Table 1).Interestingly, in the subgroup of patients with severecholestatic hepatitis (n ¼ 12) the amount of clau-din-1 12 months after LT was significantly higher
compared to the remaining patients (P ¼ 0.005)(Fig. 5). Claudin-1 levels did not correlate with anyof the biochemical markers of cholestasis (gammaglutamyl transpeptidase, alkaline phosphatase, biliru-bin) or HCV-RNA concentration obtained at thesame timepoints.With regard to mRNA quantification, we found no
correlation between mRNA and protein abundancelevels (as quantified by confocal microscopy) either forclaudin-1 (r ¼ 0.2, not significant [ns]) or for occlu-din (r ¼ 0.1, ns). Indeed, claudin-1 mRNA levelsremained stable over time in HCV-infected patients;occludin mRNA levels increased, although the differ-ence did not reach statistical significance (SupportingFig. 1). Similarly, we did not detect significant differ-ences in the mRNA levels of these two proteins inindividuals with mild or severe disease recurrence.
Discussion
HCV entry is a complex process involving severalreceptors. It is believed that HCV particles are con-secutively bound by a complex formed by SR-B1 andCD81. Virus associated with CD81 would then betransferred into tight junctions, where HCV wouldinteract with claudin-1 and occludin to enter the cellby clathrin-dependent endocytosis.4-10 Another hy-pothesis suggests that internalization of HCV is notlimited to tight junctions and that the virus mightuse claudin-CD81 complexes in the basolateral sur-face of hepatocytes to enter into the cell.20 Tightjunctions are multiprotein complexes that seal thespace between adjacent cells. In fact, hepatocyteplasma membranes are separated by tight junctionsinto sinusoidal-basolateral and apical domains.21
These two domains are very important for hepato-cytes to perform diverse functions, such as canalicularbile secretion and simultaneous sinusoidal secretion ofserum proteins into blood.Because the tight-junction proteins claudin-1 and
occludin are thought to be a relevant part of HCVentry into hepatocytes, our goal was to characterize (1)the expression pattern of these proteins in liver tissueof patients undergoing LT, (2) their influence on earlyHCV kinetics following recurrent hepatitis C and theirpotential changes following HCV infection of thegraft.We used the LT model for several reasons: (1) tissue
samples can be obtained before and after HCV infec-tion; (2) infection can be monitored from the begin-ning and thus, it is possible to obtain data on earlyHCV kinetics; (3) hepatitis C recurrence after LT is a
1442 MENSA ET AL. HEPATOLOGY, May 2011
rapidly progressive disease and patients with mild orvery severe hepatitis recurrence can be well character-ized; (4) finally, expression of HCV receptors has notbeen characterized in this model so far.
Several reports based on in vitro experiments have sug-gested major changes in the expression of these proteinsafter HCV infection of liver cells. Using the replicon sys-tem Benedicto et al.13 explored the effect of HCV on
Fig. 4. Confocal xy and xz sections of liver biopsies from a representative patient with severe hepatitis C recurrence. Immunostaining was per-formed with CD10, claudin-1, and occludin. We did not find significant differences in the staining pattern of the three proteins when comparingsamples obtained at time of reperfusion (A) and 3 months after transplantation (B). Claudin-1 and occludin staining was restricted to the apicalpole of hepatocytes with no abnormal retention in the cell cytoplasm.
Fig. 5. Sum of intensities of SR-B1, occludin, and claudin-1 1 yearafter transplantation in patientswith mild hepatitis C recurrence(MR) and cholestatic hepatitis(CH). Median values are depictedas a line.
HEPATOLOGY, Vol. 53, No. 5, 2011 MENSA ET AL. 1443
tight junction organization, demonstrating that in Huh7cells containing a genomic replicon, occludin and clau-din-1 accumulated in the cytoplasm of the cells as dot-like structures (and were not detected in the tight junc-tion). Colocalization studies suggested that the envelopeprotein E2 could play a role in the mislocalization oftight junction-associated proteins. Our results show that,in vivo, HCV infection is not associated with retention ofclaudin-1 and occludin in the cytoplasm of hepatocytes.We found that claudin-1 and occludin remained in theapical pole of hepatocytes even in cases with severe cho-lestatic hepatitis. In the latter cases, the only structuralchange observed was a slight dilation of the biliary canali-culi. The absence of mislocalized claudin-1 and occludinwas verified by using additional antibodies directed to dis-tinct protein epitopes (data not shown). A potential limi-tation of our findings is the possibility that only a smallproportion of hepatocytes are infected with HCV and,thus, that morphological changes are restricted to areas ofinfected cells.22 Nevertheless, we analyzed a large numberof liver cells per biopsy (>3,000). Moreover, changes intight junction proteins affecting a very small proportionof hepatocytes would not explain the significant clinicalexpression (cholestasis) found in hepatitis C recurrence.Because tight junctions are multiprotein complexes highlyregulated by cytokines and interleukins,23,24 we cannotexclude that alterations in permeability or function maybe explained by changes in protein composition during astrong inflammatory event such as hepatitis C.Despite the absence of structural changes in the tight
junctions, we observed an increased expression of clau-din-1 and occludin over time in HCV-infected patients.The increase in claudin-1 was particularly significant inindividuals with cholestatic hepatitis. Enhanced apicalexpression of claudin-1 and occludin after HCV infectioncould represent a mechanism favoring cell-to cell trans-mission of HCV within the liver.7 We did not find acorrelation between claudin-1 and occludin mRNA andprotein levels, although the association between levels ofRNA and protein products can vary greatly.25,26 Whatour results may indicate is that HCV proteins influenceclaudin-1 and occludin expression either by affectingthem at a posttranscriptional level or by altering the com-plex membrane traffic of tight-junction proteins. Theseproteins are recycled by way of various mechanisms suchas by clathrin-mediated and caveolae-mediated endocyto-sis, as well as by macropinocytosis; these pathways maybe altered by HCV infection, particularly in cases withhigh HCV replication. Our data, however, are based on asmall number of samples and, more important, do notallow for a functional analysis of tight junctions. Thus,we must be cautious with our conclusions.
Up to a certain extent, our findings are in agreementwith Reynolds et al.,27 who reported a significantincrease in claudin-1 expression after infecting Huh7cells with HCVcc. The latter was also observed in tissuefrom HCV-infected patients as compared to samplesfrom uninfected livers, with focal regions of basolater-ally expressed claudin-1. The increase in both HCVreceptors found in our study was not attributable, how-ever, to the presence of of claudin-1 or occludin in thebasolateral/sinusoidal membrane, but rather to anincreased presence of these proteins in the apical mem-brane of hepatocytes. We showed that claudin-1 andoccludin localization followed a similar pattern to thatof CD10 and confirmed the findings in high resolutionimages. The discrepancies between our results and thoseby Reynolds et al. may be explained by the differentmethodology (we used imaging software that allowedprecise and reproducible quantification of these pro-teins) and the different patient population (they usedlivers from patients with end-stage cirrhosis).We studied early HCV kinetics by assessing daily
HCV-RNA concentrations in a subgroup of patients.Because SR-B1 may be the first putative HCV receptorwhich contacts the virus, we explored if its levels ofexpression at the time of LT influenced the initial viraldecay immediately following graft reperfusion. In vitro,SR-B1 surface expression has been reported to affectHCV infection: SR-B1 overexpression enhances HCVinternalization whereas SR-B1 silencing reduces infec-tivity of cell culture-produced HCV (HCVcc) andHCVpp.28-30 We found a significant correlationbetween the levels of expression of SR-B1 in the graft(at the time of LT) and the magnitude of the viraldecrease (during the first 24 hours following transplan-tation). This supports a massive uptake of HCV by theliver immediately after graft reperfusion. It is obviousthat other variables may play a role in early viral decay,such as the amount of blood loss or transfusion require-ments during the surgical procedure.18 We were partic-ularly interested in exploring the potential effect ofclaudin-1 and occludin expression in early HCVkinetics after graft reperfusion. We observed that the vi-ral load increase slope during the first 7 days followinggraft reperfusion was significantly greater in the patientswith high claudin-1 and occludin levels, showing a sig-nificant correlation between their expression in the graftand the slope of viral increase. Timpe et al.31 recentlysuggested that HCV can be transmitted directlybetween cells, most likely using the HCV receptorsfound in tight junctions. Data obtained after visualiza-tion of HCV antigens in human livers by two-photonmicroscopy indicate that infected hepatocytes are found
1444 MENSA ET AL. HEPATOLOGY, May 2011
in clusters, further supporting the spread of HCV fromcell to cell.22 Our results would also suggest a role ofcell-to-cell transmission during the first days followinggraft infection: the presence of high levels of claudin-1and occludin might facilitate HCV spread within theliver, resulting in a faster increase in HCV-RNA con-centrations. It is clear that other variables not analyzedin this study (such as HCV fitness, quasispecies evolu-tion) may also play a role in early HCV kinetics.Our study has some limitations. First, the study is ret-
rospective in its design and preservation of liver samplesmay not have been completely homogeneous across thestudy period. Second, liver tissue obtained before HCVinfection (reperfusion liver biopsies) cannot be consid-ered normal, because samples are obtained from the liverof a deceased donor after treatment of the organ with apreservation solution. Finally, patients undergoing LT aretreated with immunosuppression drugs, which mayinfluence the expression of HCV receptors.In summary, hepatitis C recurrence after LT is asso-
ciated with increased levels of claudin-1 and occludinin hepatocyte membranes, although this does not altertheir localization or expression pattern within the tightjunctions. HCV receptor levels at the time of LT seemto modulate early HCV kinetics, which may be rele-vant when designing strategies to prevent HCV infec-tion in the graft.
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HEPATOLOGY, Vol. 53, No. 5, 2011 MENSA ET AL. 1445
5. ESTUDIO 2
__________________________________________________
Estudio·2
79
“ARFI, Fibroscan®, ELF, and their combinations in t he
assessment of liver fibrosis: a prospective study”
Gonzalo Crespo , Guillermo Martínez-Varo, Zoe Mariño, Gregori Casals, Rosa Miquel,
Stella M Martínez, Rosa Gilabert, Xavier Forns, Wladimiro Jiménez, Miquel Navasa
Journal of Hepatology 2012;57:281-287
80
Research Article
ARFI, FibroScan�, ELF, and their combinations in the assessmentof liver fibrosis: A prospective study
Gonzalo Crespo1, Guillermo Fernández-Varo2, Zoe Mariño1, Gregori Casals2, Rosa Miquel3,Stella M. Martínez1, Rosa Gilabert4, Xavier Forns1, Wladimiro Jiménez2,5, Miquel Navasa1,⇑
1Liver Unit, Hospital Clínic, CIBERehd, IDIBAPS, Barcelona, Spain; 2Department of Biochemistry and Molecular Genetics, Hospital Clínic, CIBERehd,IDIBAPS, Barcelona, Spain; 3Department of Pathology, Hospital Clínic, CIBERehd, IDIBAPS, Barcelona, Spain; 4Department of Radiology, Hospital
Clínic, CIBERehd, IDIBAPS, Barcelona, Spain; 5Department of Physiology, University of Barcelona, CIBERehd, IDIBAPS, Barcelona, Spain
Background & Aims: Our aim was to evaluate a serologic marker tine clinical practice. The combination of ARFI or FibroScan� with
(ELF) and two ultrasound-based methods (FibroScan� and ARFI),as well as their combinations, in the assessment of liver fibrosis.Methods: One-hundred and forty-six patients (87 liver trans-plant recipients, 59 non-transplant patients) who underwentliver biopsy were prospectively included. We evaluated the diag-nostic accuracy of FibroScan�, ARFI, ELF and the combination ofELF with either ARFI or FibroScan�. After analyzing in separatetransplant and non-transplant patients, the whole cohort wasdivided into a training set and a validation set.Results: ARFI imaging was successfully performed across thewhole cohort, while FibroScan� failed in 16 (11%) patients. Thethree methods showed similar AUROCs and best cut-off valuesin transplant and non-transplant patients. In the training set, dif-ferences between the AUROCs of ARFI, FibroScan� and ELF todiagnose F P2 (0.879, 0.861, and 0.764, respectively) and cirrho-sis (0.936, 0.918, and 0.841) were not statistically significant,although both ultrasound-based methods showed higher accu-racy than ELF. The combination of ELF with ARFI or FibroScan�increased the negative and positive predictive values of singletests for the diagnosis of F P2 and cirrhosis. Similar results wereobtained when the methods were tested in the validation set.Conclusions: ARFI is as effective as either FibroScan� or ELF inthe non-invasive assessment of liver fibrosis, and its inclusionin an ultrasound device could facilitate its incorporation into rou-
Journal of Hepatology 20
Keywords: Acoustic radiation force impulse; Transient elastography; Enhancedliver fibrosis; Liver transplantation.Received 7 June 2011; received in revised form 1 March 2012; accepted 12 March2012; available online 17 April 2012⇑ Corresponding author. Address: Liver Unit, Institut de Malaties Digestives,Hospital Clínic, CIBERehd, IDIBAPS, University of Barcelona, Villarroel, 170 08036Barcelona, Spain. Tel.: +34 93 227 54 00x4406.E-mail address: [email protected] (M. Navasa).Abbreviations: LSM, liver stiffness measurement; TE, transient elastography; TI-MP-1, tissue inhibitor of matrix metalloproteinase type-1; HA, hyaluronic acid;PIIINP, aminoterminal propeptide of type III procollagen; ELF, enhanced liver fi-brosis; ARFI, acoustic radiation force impulse; SWV, shear wave velocity; ROI,region of interest; LT, liver transplantation; BMI, body mass index; kPa, kilopas-cals; IQR, interquantile range; SD, standard deviation; VC, variation coefficient;AUROC, area under the receiver-operating characteristic curve; Se, sensitivity; Sp,specificity; PPV, positive predictive value; NPV, negative predictive value; LR+,likelihood ratio positive; LR�, likelihood ratio negative; DOR, diagnostic oddsratio.
ELF may help better identify patients with or without significantfibrosis or cirrhosis.� 2012 European Association for the Study of the Liver. Publishedby Elsevier B.V. All rights reserved.
Introduction
Evaluation of fibrosis is crucial in the assessment of chronic liverdisease. Currently, histological assessment based on semi-quanti-tative scores is considered the best method for evaluating fibro-sis, although biopsy has also some drawbacks that have led tothe development of techniques geared towards a non-invasiveassessment of liver fibrosis [1,2].
Liver stiffness measurement (LSM) using transient elastogra-phy (TE, FibroScan�) is accurate in identifying significant fibrosisand especially cirrhosis in several liver diseases including livertransplant recipients [3–7]. Nevertheless, FibroScan� has somelimitations, such as LSM failure in patients with narrow intercos-tal spaces or high body mass index [8] and increased stiffness val-ues in patients with acute hepatitis [9] or extrahepatic cholestasis[10].
Another approach for evaluating liver fibrosis involves the useof serologic markers [2,11–15]. Among them, the Original Euro-pean Liver Fibrosis panel, that combines tissue inhibitor of matrixmetalloproteinase type 1 (TIMP-1), hyaluronic acid (HA), amino-terminal propeptide of type III procollagen (PIIINP), and age,showed good diagnostic accuracy in detecting fibrosis in a largecohort of patients with chronic liver disease [16]. Subsequentstudies have evaluated this panel, as well as its simplified modi-fication, ELF (Enhanced Liver Fibrosis), in patients with differentliver diseases [16–18]. Not less importantly, ELF has been shownto predict disease progression in several clinical settings [19–21].
Acoustic radiation force impulse (ARFI) is an ultrasound-basedtechnology that uses short-duration, high intensity acousticpulses to mechanically excite the tissue [22]. These radiationforce excitations generate localized tissue displacements thatresult in shear waves, whose velocity (SWV) of propagation canbe assessed in a region of interest (ROI) corresponding to a cylin-der, 0.5 cm long and 0.4 cm wide, that can be targeted up to
12 vol. 57 j 281–287
Research Article
5.5 cm below the skin. Both the high-energy pulse and the con-ventional ultrasound pulse are generated by the same ultrasoundprobe, and results are expressed in m/s. Several studies have ana-lysed the performance of ARFI [22–32], although some of thesereports were heterogeneous, with small cohorts of patients and,in some cases, without the inclusion of liver biopsies. Moreover,no study has thus far attempted to combine ARFI with serologicmarkers in order to improve overall accuracy.The aim of our study was to prospectively assess ARFI, Fibro-Scan, and ELF and to explore their combined effectiveness in eval-uating liver fibrosis, with biopsy serving as the reference standard.
Patients and methods
Patients and study design
One-hundred and seventy-five patients consecutively admitted to our Unit toundergo a liver biopsy in two periods (April 2009–April 2010 and June–November2011) were prospectively considered for this study. Exclusion criteria includedthe presence of ascites, chronic kidney failure, and acute or chronic graft rejectionin the case of liver transplant (LT) recipients. Only biopsies longer than 15 mmwith at least six portal tracts were considered. In addition, we included 10healthy volunteers who underwent liver stiffness measurement via FibroScan�
(Echosens, France) and shear wave velocity measurement with ARFI (VirtualTouch™, ACUSON S2000; Siemens Medical Solutions, USA) on the same day.Our study had been previously approved by the Ethics Committee of HospitalClinic Barcelona in accordance with the 1975 Declaration of Helsinki. Informedconsent was obtained from all patients enrolled in the study. Waist perimeter,as well as height and weight in order to calculate body mass index (BMI), wererecorded for all patients.
The design of the study was two-folded: first, we analyzed the performance ofthe three non-invasive methods and their combinations to assess the presence ofliver fibrosis in non-transplant and transplant patients separately. Then, thewhole cohort was divided into a training set (patients included between April2009 and April 2010) and a validation set (patients included in 2011), both setsincluding transplant and immunocompetent patients.
Liver histology
Biopsies were obtained percutaneously or by transjugular approach, as previouslydescribed [33]. Liver specimens were fixed in formalin and embedded in paraffin.Two microns sections were stained with hematoxylin-eosin and Masson’s tri-chrome for histological assessment. A single expert pathologist, blinded to clinicaldata, examined the samples, and the Scheuer classification was used to estimatethe fibrosis stage [34]. Significant fibrosis was defined as F P2. As stated above,only biopsies >15 mm in length with P6 portal tracts were analyzed.
ELF panel
The same day of the liver biopsy, 20 ml of blood were obtained in a fasting status.Serum was stored at �80 �C, and PIIINP, HA, and TIMP-1 were measured in allpatients by a CE-marked random-access automated clinical immunochemistryanalyzer that performs magnetic separation enzyme immunoassay tests (ADVIACentaur™, Siemens Healthcare Diagnostics, Tarrytown, NY, USA). The ELF scorewas calculated using the algorithm recommended in the CE-marked assay[ELF = 2.278 + 0.851 ln(HA) + 0.751 ln(PIIINP) + 0.394 ln(TIMP-1)].
Transient elastography
Patients underwent FibroScan� within 15 days of the liver biopsy by a technicianwho had performed more than 1000 LSMs in patients with chronic liver diseaseand LT and who was unaware of the result of the biopsy. Liver stiffness was deter-mined on the right lobe of the liver as previously described [6]. The results wereexpressed in kilopascals (kPa) and the median value of 10 acquisitions was con-sidered for analysis, including only those cases with a success rate higher than60% and an IQR/result ratio <0.3.
282 Journal of Hepatology 201
ARFI imaging
Immediately after FibroScan�, the same technician performed a SWV measure-ment with ARFI imaging. The right lobe of the liver was localized with conven-tional B-mode ultrasound guidance and ten valid acquisitions were obtained inthe ROI placed 2.5 cm below the capsule. All measurements were obtained inthe same intercostal space, avoiding large vessels and ribs. The mean, standarddeviation (SD), and variation coefficient (SD/mean, VC) of each exploration wererecorded for statistical analysis.
Statistical analysis
Quantitative variables are expressed in medians (range) and qualitative variablesin (%). Pearson’s coefficient was used to evaluate any correlations between Fibro-Scan and ARFI. The relationship between the stages of fibrosis and the non-inva-sive tests were assessed with a non-parametric test (Kruskal–Wallis analysis).The diagnostic values of ARFI, FibroScan�, and ELF in predicting significant fibro-sis and cirrhosis were assessed by calculating the areas under the receiver oper-ator characteristic curve (AUROC). Comparisons of AUROCs were performedaccording to DeLong method [35]. Best cut-off values were determined by optimi-zation of the Younden index, and sensitivity (Se), specificity (Sp), and positive andnegative predictive values (PPV, NPV) were calculated from these same data. Posi-tive and negative likelihood ratios (LR+: Se/(100 – Sp); LR�: (100 � Se)/Sp) werecalculated based on the respective sensitivity and specificity values. The diagnos-tic odds ratio (DOR), which measures the overall accuracy of a diagnostic test[36], was calculated by dividing the LR+ by the LR�. Statistical analyses were per-formed with SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago IL), except for AUROC comparisons,which were performed with EPIDAT 3.1.
Results
Patient characteristics
Twenty-nine patients met exclusion criteria, including 20 biop-sies shorter than 15 mm or with less than six portal tracts, sothe final cohort comprised 146 patients (87 transplant and 59non-transplant patients). Patients’ characteristics are summa-rized in Table 1.
Applicability and correlation of ARFI and FibroScan� in non-transplantand transplant patients
ARFI imaging was successfully performed in all patients, whereasFibroScan� failed in 16 cases (11%), 8 transplants (9%) and 8 non-transplants (14%). FibroScan� failure was significantly associatedwith higher BMI and longer abdominal perimeter in the twogroups (p <0.02).
ARFI significantly correlated with FibroScan� in non-trans-plant patients (r = 0.826, p <0.001, Fig. 1A), as well as in trans-plant recipients (r = 0.887, p <0.001, Fig. 1B).
Relationship between fibrosis staging and non-invasive methods innon-transplant and transplant patients
In non-transplant patients, we found a significant associationbetween fibrosis stages and ARFI, FibroScan�, and ELF (Kruskal–Wallis p <0.001 for all comparisons). Median values of ARFIaccording to fibrosis stages were 1.17 (F0), 1.4 (F1), 1.46 (F2),1.77 (F3), and 2.6 m/s (F4), while median FibroScan� measure-ments were 4.8, 7.5, 8.4, 13.3, and 22.3 kPa, respectively, andmedian values of ELF panel were 8.7, 8.9, 9.4, 10.6, and 11.
In transplant patients, the relationships between the differentnon-invasive methods and fibrosis staging were also statisticallysignificant (p <0.001 for all methods). Median ARFI measure-
2 vol. 57 j 281–287
Table 1. Baseline characteristics of the patients included in the study.Qualitative variables are shown in n (%) and quantitative variables in median(range).
Non-transplant (n = 59)
Transplant(n = 87)
p value
Age (yr) 48 (20-73) 60 (35-76) 0.001
Gender (male) 30 (51) 60 (69) 0.027
Etiology 0.001
HCV 24 (41) 63 (72)
NASH 8 (14) 2 (2)
OH 4 (7) 11 (13)
Cholestatic disease 7 (12) 2 (2)
HBV 2 (3) 8 (9)
Others 14 (23) 1 (1)
BMI (kg/m2) 25.1 (18.5-44.4) 25.8 (19.3-39.4) 0.32
Abdominal perimeter, cm 90 (65-125) 94 (67-130) 0.1
Transjugular biopsies, number 15 (27) 27 (31) 0.46
Biopsy length, mm 19 (15-40) 20 (15-32) 0.66
Portal tracts, number 9 (6-20) 9 (6-16) 0.89
Time from transplant, mo n.a. 43 (6-250)
ALT (IU/ml) 65 (10-768) 62 (9-501)
Fibrosis stage
F ≥2 33 (56) 37 (42) 0.1
F4 15 (25) 9 (10) 0.016
HCV, hepatitis C virus; NASH, non-alcoholic steatohepatitits; OH, alcoholic liverdisease; HBV, hepatitis B virus; BMI, body mass index; ALT, alanineaminotransferase.
A B r= 0.887, p < 0.001
Fibr
oSca
n® (k
Pa)
ARFI (m/s)
40
30
20
10
0
40
30
20
10
00 1 2 3 4
ARFI (m/s)0 1 2 3 4
r= 0.826, p < 0.001 r = 0.826p <0.001
r = 0.887p <0.001
Fibr
oSca
n® (k
Pa)
Fig. 1. Correlation between ARFI and FibroScan� in (A) non-transplant and (B)transplant patients.
JOURNAL OF HEPATOLOGY
ments according to fibrosis stages were 1.16, 1.29, 1.51, 2.21, and2.25 m/s; median FibroScan� measurements were 5.2, 7.9, 10,17.6, and 22.9 kPa; and median ELF values were 8.85, 9.2, 10.5,11.5, and 13.
In the 10 healthy volunteers, median values for ARFI andFibroScan� were 1.06 m/s and 4.4 kPa, respectively.
Diagnosis of F P2 and cirrhosis in non-transplant and transplantpatients
In non-transplant patients, differences between the AUROCs ofthe three methods for the diagnosis of F P2 were not signifi-cantly different (Fig. 2A), while ARFI was significantly better thanELF to diagnose cirrhosis (p = 0.05) (Fig. 2B). The diagnostic per-formance of the three methods is detailed in Table 2.
Fig. 2C and D depict the AUROCs of ARFI, FibroScan�, and ELFfor the diagnosis of F P2 and cirrhosis in transplant recipients.Again, while the three methods were comparable to diagnoseF P2, ARFI performed significantly better than ELF for cirrhosis(p = 0.05). The diagnostic performance of ARFI, FibroScan�, andELF in transplant patients is shown in Table 2.
Combination of complementary methods in non-transplant andtransplant patients
We then aimed at combining the serum marker, ELF, with eitherARFI or FibroScan� using the thresholds shown in Table 2. In non-transplant patients, the combination of ARFI and ELF yielded aPPV of 78% and NPV of 85% for the diagnosis of F P2, avoiding
Journal of Hepatology 201
88% biopsies, and correctly classifying 71% of patients. Thecombination of FibroScan� and ELF showed a PPV of 85% andNPV of 90%, correctly classifying 59% of patients, and avoiding68% biopsies. For the diagnosis of cirrhosis, the combination ofELF with ARFI or FibroScan� showed PPV of 93% and 70%, respec-tively, and NPV of 97% and 97%, respectively. The proportion ofcorrectly classified patients and avoided biopsies was 81% and85% for the combination of ARFI and ELF and 68% and 74% forthe combination of FibroScan� and ELF.
In transplant patients, PPV and NPV of the combination ofARFI and ELF for F P2 were 86% and 88%, avoiding 71% biopsies,and correctly classifying 62% of patients. PPV and NPV of thecombination of FibroScan� and ELF were 79% and 87%, avoiding66% biopsies, and correctly classifying 55% of patients. For thediagnosis of cirrhosis, ARFI and ELF showed PPV and NPV of50% and 99%, while figures for the combination of FibroScan�
and ELF were 46% and 99%, respectively. The proportion of cor-rectly classified patients and avoided biopsies was 71% and 80%for the combination of ARFI and ELF and 62% and 71% for thecombination of FibroScan� and ELF.
Diagnosis of F P2 and cirrhosis and combinations of methods in thewhole cohort: training and validation sets
As shown in Table 2 and Fig. 2, the three methods exhibited sim-ilar cut-off values and high diagnostic accuracy in transplant andnon-transplant patients. For this reason, we aimed at simplifyingthe approach by analysing the entire population with single cut-off values. To this end, the whole cohort was divided into a train-ing set (patients included in 2009–2010, n = 88, 60% of the totalpopulation), in which cut-off values were developed, and a vali-dation set (patients included in 2011, n = 58, 40%). Table 3 showsthe baseline characteristics of the two groups. Fig. 3A and Bdepict the AUROCs of the three methods in the training cohortfor the diagnosis of F P2 and cirrhosis, respectively; and theirdiagnostic performance is shown in Table 4. We did not find sig-nificant differences between the AUROCs of the three methods forthe diagnosis of F P2 or cirrhosis.
When we combined the methods using the cut-offs shown inTable 4 in the training set, the PPV for the tandem use of ELF andARFI for the diagnosis of F P2 (Fig. 4A) was 89%, while NPV was82%. The combination correctly classified 54/88 (61%) patientsand avoided 63/88 (72%) biopsies. Similarly, the PPV and NPVof the combination of FibroScan� and ELF (Fig. 4B) were 86%and 83% for F P2 in this cohort. Thus, 49/88 patients (56%) werecorrectly classified avoiding 66% biopsies (58/88).
2 vol. 57 j 281–287 283
Table 3. Baseline characteristics of the training and validation sets. Qualitativevariables are shown in n (%) and quantitative variables in median (range).
Training (n = 88)
Validation (n = 58)
p value
Age, yr 55 (20-75) 59 (20-76) 0.26
Gender (male) 49 (56) 41 (71) 0.07
Etiology 0.48
HCV 55 (62) 32 (55)
NASH 4 (4) 6 (10)
OH 8 (9) 7 (12)
Cholestatic disease 7 (8) 2 (3)
HBV 7 (8) 3 (5)
Others 7 (8) 8 (14)
BMI (kg/m2) 25.6 (18.5-44.4) 26.5 (20.2-39.6) 0.27
Abdominal perimeter, cm 90 (67-128) 96 (65-130) 0.06
Transjugular biopsies, number 27 (31) 15 (26) 0.53
Biopsy length, mm 19 (15-32) 18 (15-40) 0.72
Portal tracts, number 9 (6-20) 9 (6-16) 0.89
Transplant, % 52 (59) 35 (60) 0.81
ALT (IU/ml) 56 (9-768) 69 (9-501)
Fibrosis stage
F ≥2 44 (50) 26 (45) 0.48
F4 13 (15) 11 (19) 0.5
HCV, hepatitis C virus; NASH, non-alcoholic steatohepatitits; OH, alcoholic liverdisease; HBV, hepatitis B virus; BMI, body mass index; ALT, alanineaminotransferase.
ARFI: 0.902 FibroScan®: 0.867 ELF score: 0.811
A B
C D
ARFI: 0.89 FibroScan®: 0.897 ELF score: 0.801
Sen
sitiv
ity
1-Specificity
1.0
1.0
0.8
0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.20.0
0.0
ARFI: 0.979*
ELF score: 0.894
1-SpecificityS
ensi
tivity
1.0
1.0
0.8
0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.20.0
0.0
ARFI: 0.947*
ELF score: 0.834
1-Specificity
Sen
sitiv
ity
1.0
1.0
0.8
0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.20.0
0.01-Specificity
Sen
sitiv
ity
1.0
1.0
0.8
0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.20.0
0.0
FibroScan®: 0.961
FibroScan®: 0.938
Fig. 2. AUROCs for the diagnosis of F P2 and cirrhosis for ARFI, FibroScan�
and ELF, in (A and B) non-transplant and (C and D) transplant patients.⁄p <0.05 vs. ELF.
Research Article
The combination of ELF and ARFI had a PPV and NPV of 60%and 98% for the presence of cirrhosis, while figures for the com-bination of FibroScan� and ELF were 54% and 100%, respectively.
AUROCs for the diagnosis of F P2 and cirrhosis in the validationset are shown in Supplementary Fig. 1. The three methods werecomparable to diagnose F P2, while ARFI and FibroScan� were sig-nificantly better than ELF to diagnose cirrhosis. In the validationset, for the diagnosis of F P2, the combination of ARFI and ELFusing the cut-offs developed in the training set had a PPV andNPV of 88% and 95%, respectively, correctly identifying 40/58patients (69%) and avoiding 44/58 (76%) biopsies. Similarly, the
Table 2. Diagnostic performance of ARFI, FibroScan� and ELF for the diagnosis of F
Non-transplant, (n = 59) Cut-off for F ≥2 Se (%) Sp (%
ARFI 1.43 m/s 88 73
FibroScan® 8.25 kPa 85 81
ELF 9.3 79 77
Cut-off for F4
ARFI 2.05 m/s 93 95
FibroScan® 16.5 kPa 87 89
ELF 10.4 93 79
Transplant, (n = 87) Cut-off for F ≥2 Se (%) Sp (%
ARFI 1.39 m/s 89 80
FibroScan® 8.4 kPa 82 80
ELF 9.4 86 56
Cut-off for F4
ARFI 1.92 m/s 89 90
FibroScan® 15.1 kPa 87 89
ELF 10.3 78 72Se, sensitivity; Sp, specificity; PPV, positive predictive value; NPV, negative predictive vaodds ratio.
284 Journal of Hepatology 201
combination of FibroScan� and ELF had a PPV and NPV of 79%and 100%, respectively, correctly classifying 34/58 (59%) patientsand avoiding 39/59 (67%) biopsies. For the diagnosis of cirrhosis,PPV and NPV of ARFI plus ELF were 73% and 100%, and figures for
P2 and cirrhosis.
) PPV (%) NPV (%) LR+ LR- DOR
81 83 3.26 0.16 20.4
81 84 4.47 0.19 23.5
81 74 3.43 0.27 12.7
87 98 18.6 0.07 265.7
59 97 7.91 0.15 54.7
61 97 4.43 0.09 49.2
) PPV (%) NPV (%) LR+ LR- DOR
77 91 4.45 0.14 31.8
76 86 4.1 0.22 18.6
59 85 1.95 0.25 7.8
50 99 8.9 0.12 74.1
47 99 7.91 0.15 52.7
24 96 2.78 0.3 9.3lue; LR+, likelihood ratio positive; LR�, likelihood ratio negative; DOR, diagnostic
2 vol. 57 j 281–287
A BSe
nsiti
vity
1-Specificity
1.0
1.0
0.8
0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.20.0
0.01-Specificity
Sens
itivi
ty
1.0
1.0
0.8
0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.20.0
0.0
ARFI: 0.879FibroScan®: 0.861 ELF score: 0.764
ARFI: 0.936FibroScan®: 0.918ELF score: 0.841
Fig. 3. AUROCs of ARFI, FibroScan� and ELF for the diagnosis of (A) F P2 and(B) cirrhosis in the training set.
JOURNAL OF HEPATOLOGY
the combination of FibroScan� and ELF were 64% and 100%,respectively.
Discussion
In the current prospective study, we have shown that the estima-tion of shear wave velocity with ARFI can provide a diagnosis ofsignificant fibrosis and cirrhosis as accurate as FibroScan� orELF, both in transplant recipients and immunocompetentpatients with liver disease of varied aetiologies. Not less impor-tantly, the combination of either ARFI or FibroScan� with ELFseems to increase the diagnostic accuracy of single tests, permit-ting to more confidently discard or confirm the presence of signif-icant fibrosis or cirrhosis.
ARFI software is included in an ultrasound device. Ultrasoundguidance is particularly helpful for ensuring that the ROI is placedin such a way that it avoids nearby vessels and ribs. Thisrepresents a significant advantage, especially when the regionof interest measured by ARFI is smaller than it is for FibroScan�.Consistent with other reports [8], FibroScan� failed in 11% ofpatients. In contrast, we could measure shear wave velocity withARFI in all of these same individuals. Most likely, ultrasoundguidance helps facilitate the identification of a suitable placefor elastographic measurements, thereby resulting in a highernumber of patients with valid results. Moreover, ultrasound per-mits the evaluation of other features such as portal diameter,splenomegaly, and liver surface, which has recently been shownto be highly accurate in the diagnosis of early cirrhosis and seemsto provide complementary information to that of liver stiffness[37]. Thus, the ability to perform ARFI and liver surface ultra-sound examination during the same procedure offers a significantadvantage and may facilitate the early diagnosis of cirrhosis.
Table 4. Diagnostic performance of ARFI, FibroScan� and ELF for the diagnosis of F
Cut-off for F ≥2 Se (%) Sp (%ARFI 1.44 m/s 85 76FibroScan® 8.3 kPa 77 83ELF 9.4 75 68
Cut-off for F4ARFI 1.9 m/s 92 87FibroScan® 14.8 kPa 89 84ELF 10.3 92 72
Se, sensitivity; Sp, specificity; PPV, positive predictive value; NPV, negative predictive vaodds ratio.
Journal of Hepatology 201
Recent studies have suggested that the combination of serummarkers with FibroScan� is highly accurate in the identification ofliver fibrosis [38,39]. In our population, the combined use of ELFwith either FibroScan� or ARFI increased the PPV and NPV of singletests, still offering reliable identification of significant fibrosis andcirrhosis in a large proportion of patients. An important numberof patients could thus have avoided liver biopsy, and had their dis-ease staged with a high level of confidence. While this approachseems logical, as it uses ‘‘complementary’’ methods, our resultsare based on a relatively low number of patients, thus larger, multi-center studies should be encouraged to confirm our findings.
It is important to acknowledge that the heterogeneous natureof the cohort is a significant limitation of our study, which includedboth transplant and non-transplant patients with liver disease ofvaried aetiologies. The combination of transplant and non-trans-plant patients in the same group may be particularly difficult tointerpret, as fibrosis deposition and staging may be different inthese groups of patients, and indeed a large number of transplantpatients in our cohort did not have significant fibrosis. To try tosolve in part this drawback, we first studied separately transplantand non-transplant patients, being able to show similar results interms of diagnostic accuracy and best cut-off values in the twogroups. This allowed us to analyze the entire cohort splitting thewhole population into a training set and a validation set, whichwere comparable in terms of transplant patients proportion andprevalence of significant fibrosis and cirrhosis. Regarding the dif-ferent aetiologies of the liver diseases, although our findings wouldanyway require further confirmation in single-etiology studies, itshould be kept in mind that daily clinical work includes patientswith liver disease of different aetiologies, and perhaps the resultsof the current study are more representative of what is typicallyseen in routine clinical practice.
In summary, ARFI, FibroScan� and ELF are reliable methods forassessing fibrosis in patients with varying forms of liver disease,including liver transplant recipients. Indeed, the combined use ofELF with either ARFI or FibroScan� seems a promising approachthat may increase the diagnostic accuracy of these tests. The incor-poration of ARFI in conventional ultrasound devices may facilitatethe introduction of elastography into surveillance programs.
Conflict of interest
The authors who have taken part in this study declared that theydo not have anything to disclose regarding funding or conflict ofinterest with respect to this manuscript.
P2 and cirrhosis in the training set (n = 88).
) PPV (%) NPV (%) LR+ LR- DOR77 82 3.54 0.19 18.681 79 4.53 0.28 16.270 73 2.32 0.37 6.3
54 98 7.07 0.09 78.540 98 5.56 0.13 42.736 98 3.28 0.11 29.8
lue; LR+, likelihood ratio positive; LR�, likelihood ratio negative; DOR, diagnostic
2 vol. 57 j 281–287 285
ARFI + ELF (n = 88)
Discordant (n = 25)
Concordant (n = 28)ARFI <1.44 m/s
ELF <9.4
Concordant (n = 35)ARFI ≥1.44 m/s
ELF ≥9.4
NPV 82% PPV 89%
F ≥2 (n = 5) F <2 (n = 4) F ≥2 (n = 31)F <2 (n = 23)
Discordant/invalid results (n = 30)
NPV 83% PPV 86%
F <2 (n = 25) F ≥2 (n = 5) F <2 (n = 4) F ≥2 (n = 24)
A
B
Concordant (n = 28)
FS ≥8.3 kPa ELF ≥9.4
Concordant (n = 30)FS <8.3 kPa
ELF <9.4
FibroScan® + ELF (n = 88)
Fig. 4. Flowchart of the synchronous application of ELF with either (A) ARFI or (B) FibroScan� for the diagnosis of F P2 in the training set.
Research Article
Financial support
G. Crespo is supported by Grants from Hospital Clínic (Ajut a laRecerca Josep Font) and the Fundación BBVA, and Z. Mariño bythe Fundación BBVA and CIBERehd. Dr. W. Jiménez has receivedresearch funding from the Dirección General de InvestigaciónCientífica y Técnica (SAF-08839) and from the Agència de Gestiód’Ajuts Universitaris i de Recerca (SGR 2009/1496). Dr. Navasareceived support, in part, from the Instituto de Salud Carlos III(PI 10/01551), co-funded by the European Regional DevelopmentFund (ERDF). CIBERehd is funded by the Instituto de Salud CarlosIII, the Ministerio de Ciencia e Innovación, Spain. The authorsthank Siemens Healthcare Diagnostics (Tarrytown, NY, USA) forgenerously supplying the reagents to measure the fibrosismarkers.
Supplementary data
Supplementary data associated with this article can be found, inthe online version, at http://dx.doi.org/10.1016/j.jhep.2012.03.016.
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2 vol. 57 j 281–287 287
6. DISCUSIÓN
______________________________________________________
Discusión
91
6.1. Estudio 1: Papel de claudina, occludina y SR-B I en cinética
viral precoz post trasplante e influencia en la gra vedad de la
recurrencia de la hepatitis C post-trasplante.
En este estudio se evaluó el rol de los receptores del VHC en la entrada del virus
en el hepatocito en muestras humanas, para lo cual se utilizó una cohorte de pacientes
trasplantados hepáticos por VHC. El modelo del trasplante hepático es
extremadamente útil para este tipo de estudios, ya que se controla el momento de la
infección del hígado. Además, a estos pacientes se les realizan múltiples biopsias
hepáticas de seguimiento, lo que facilita disponer de abundante material histológico
para analizar la expresión de estas proteínas. Por otra parte, la rápida progresión de la
recurrencia permite una clara caracterización clínica de estos pacientes, lo cual
contribuye a definir correctamente los eventos clínicos y permite disminuir sesgos.
El estudio de la expresión de receptores del VHC en el contexto del trasplante
hepático y su papel en la forma clínica de la recurrencia post-trasplante es novedoso y
no ha sido evaluado en ningún otro estudio. Podría tener una importancia clínica
capital, ya que la recurrencia de la hepatitis C sobre el injerto es universal y además
tiene una progresión acelerada (105). De hecho, la recurrencia de la hepatitis C post
trasplante es el problema principal de los programas de trasplante hepático en nuestro
medio, ya que es responsable de la mayoría de las pérdidas de injertos que tienen
lugar post-trasplante. Teniendo en cuenta esto, así como la insuficiente tasa de
respuesta al tratamiento antiviral, tanto en lista de trasplante como post trasplante
(111,208), una estrategia potencial para evitar la recurrencia de la infección en el
injerto podría consistir en bloquear la entrada del virus en el injerto mediante
anticuerpos o pequeñas moléculas dirigidas contra estos receptores.
Discusión
92
Así, se seleccionó una muestra de pacientes trasplantados por VHC en función de
la gravedad de la recurrencia de la infección en el injerto: 19 pacientes con recidiva
extremadamente severa (fibrosis avanzada e hipertensión portal clínicamente
significativa al año del trasplante) y 23 con recidiva leve, definida como F0-F1 y
ausencia de hipertensión portal en la evaluación realizada al primer año del TOH,
además de 19 pacientes trasplantados por otras causas diferentes a la hepatitis C y
que sirvieron como controles. De todos los pacientes se disponía de muestras
histológicas parafinadas del injerto hepático obtenidas en el momento del trasplante
(antes de la infección del órgano por el VHC), así como a los 3 y a los 12 meses del
mismo. En estas muestras se cuantificó la expresión de tres receptores del VHC:SR-
BI, occludina y claudina. Además de evaluar los cambios en la expresión de
receptores y la relación de éstos con la gravedad de la recidiva, se estudió la
asociación entre los receptores del VHC y la cinética viral precoz post-trasplante, para
lo que se determinó la carga viral del VHC en suero de forma diaria durante la primera
semana post trasplante.
La expresión de receptores del VHC se evaluó mediante inmunofluorescencia, y en
lugar de cuantificar la expresión proteica mediante scores semicuantitativos, se utilizó
un software informático, IMARIS®, que permite cuantificar la intensidad de expresión
de fluorescencia de una proteína de dos maneras: el número de vóxeles (píxeles
tridimensionales) por encima de una intensidad mínima que se marca a priori y que
permanece igual en todas las muestras; y la suma de intensidades de cada uno de los
vóxeles positivos. Para optimizar el estudio y minimizar el error de muestra, se
estudiaron 10 campos por biopsia. Asimismo, se cuantificó la expresión de mRNA de
claudina y occludina en las muestras histológicas por reacción en cadena de la
polimerasa en tiempo real (rtPCR). Finalmente, se realizó un estudio de colocalización
de claudina y occludina mediante la utilización de un marcador de canalículo biliar,
CD10.
Discusión
93
El primer hallazgo relevante del presente estudio es que conseguimos observar la
expresión de los tres receptores estudiados. Mientras que SR-BI se observó
predominantemente en el polo basolateral de los hepatocitos, gracias a los estudios de
colocalización con CD10 se pudo concluir que la expresión de claudina-1 y occludina
está limitada de manera predominante al polo apical o canalicular de los mismo. De
hecho, las imágenes tridimensionales mostraron que CD10 se sitúa en el canalículo
biliar, probablemente en los microvilli de los hepatocitos, con claudina y occludina en
las membranas de los hepatocitos adyacentes.
A diferencia de lo reportado en estudios in vitro (86), la localización de estas
proteínas no varió con la infección por VHC: se observó el mismo patrón de expresión
tanto en las muestras previas al trasplante como en las obtenidas a los 3 y 12 meses
del mismo. De la misma manera, tampoco se observó retención citoplasmática de
claudina ni occludina. Sin embargo, observamos un aumento en los niveles de
expresión de claudina y occludina en las muestras post-trasplante, especialmente a los
12 meses, frente a los controles, en los que los niveles de expresión de estos
receptores se mantuvieron estables. Estos resultados son coincidentes con otros
estudios con muestras humanas que han observado una mayor expresión de claudina
en pacientes infectados por el VHC (53). Respecto a la cuantificación de mRNA, no
pudimos encontrar una correlación entre el nivel proteico evaluado por microscopía
confocal y los niveles de ARNm, aunque es conocido que la asociación entre mRNA y
expresión proteica varía de manera importante (209), además el VHC podria alterar la
expresión proteica a nivel posttranscripcional o alterando el tráfico transmembrana de
las proteínas de las uniones estrechas. Los pacientes en los que se observó una
mayor expresión de claudina fueron aquellos que desarrollaron una recurrencia
colestática de la hepatitis C post trasplante. Estos hallazgos son relativamente
esperables, ya que las uniones estrechas, de las cuales claudina forma parte, están
implicadas en la permeabilidad paracelular y actúan como barrera hepatobiliar (210).
De hecho, se han observado alteraciones en las proteínas de las uniones estrechas
Discusión
94
tanto en modelos murinos de enfermedades colestásicas (ligadura del conducto biliar),
como en síndromes colestásicos congénitos (211,212). Sin embargo, en general se ha
observado una disminución en los niveles de ARN mensajero de claudina y occludina
en estas entidades, aunque los datos acerca de la expresión proteica son
contradictorios. Si bien nuestros datos sugerirían que las formas colestásicas de la
recurrencia de la hepatitis C post trasplante hepático están relacionadas con un
aumento en la expresión de las proteínas de las uniones estrechas, el limitado número
de pacientes con esta forma de recurrencia (únicamente 12) y el hecho de no haber
realizado estudios funcionales de las uniones estrechas (el incremento de la expresión
de claudina podría deberse a formas no funcionantes de la misma) no permite extraer
conclusiones firmes acerca del papel de estas proteínas en la hepatitis colestásica
post trasplante.
Los niveles de expresión de SR-BI, claudina o occludina no se asociaron con la
gravedad de la recurrencia de la hepatitis C post-trasplante, aunque sí encontramos
una relación estadísticamente significativa entre la expresión de receptores en el
injerto en el momento del trasplante y la cinética viral precoz. En este sentido, la
abrupta caída en la carga viral en sangre que se produce en las primeras 24 hrs tras la
cirugía del trasplante, y que podría representar la captación masiva por el injerto de los
viriones circulantes, se asoció significativamente con la expresión de SR-BI en el
hígado trasplantado. Este hallazgo clínico apoyaría la hipótesis extraída de estudios in
vitro que sostiene que SR-BI es el primer receptor con el que los viriones contactan
para infectar el hepatocito, contribuyendo de una manera fundamental en la entrada
viral (46). Además, el aumento progresivo de carga viral en sangre que se produce en
la primera semana, y que representaría la replicación hepática efectiva en los primeros
días post trasplante, se asoció con los niveles de claudina y occludina. Nuestros
resultados podrían sugerir que estas proteínas de las uniones estrechas contribuirían
efectivamente en la transmisión viral célula a célula, facilitando la infección de nuevas
células y la replicación viral.
Discusión
95
Entre las limitaciones de este estudio destaca el hecho de utilizar biopsias
parafinadas almacenadas, por lo que no se puede descartar que la preservación de las
muestras sea completa y homogénea. Además, no se ha evaluado el papel de las
drogas inmunosupresoras que se utilizan en el trasplante hepático y que
potencialmente podrían influir en la expresión de receptores: un estudio reciente que
utilizó la infección de células Huh7 con pseudopartículas virales mostró que dosis altas
de corticosteroides como las utilizadas en el trasplante hepático aumentan la
infectividad de estas pseudopartículas mediante un aumento en la expresión de
occludina y SR-BI (213). Finalmente, la utilización de cut-offs únicos y arbitrarios para
definir los niveles de expresión de receptores podría conducir a una infravaloración de
la expresión de alguna de estas proteínas.
Sin embargo, por otro lado, cabe subrayar que la utilización de estudios de
colocalización y de un software que cuantifica la expresión proteica dan fuerza a los
resultados del estudio. Además, a diferencia de los estudios in vitro, cuyos modelos
presentan múltiples diferencias con la realidad clínica, la determinación de los
receptores en muestras humanas permite estudiar el papel que éstos pueden jugar en
la infección por VHC de una manera más fisiológica.
Los resultados de este estudio pueden contribuir a comprender la patogenia de la
entrada del VHC en los hepatocitos, así como al desarrollo de anticuerpos o moléculas
capaces de bloquear la entrada viral en el injerto. Nuestros resultados sugerirían que
el bloqueo precoz de SR-BI podría al menos dificultar la entrada del VHC en el injerto
e impedir con ello la recurrencia posttrasplante. Además, el bloqueo de occludina o
claudina podría alterar la transmisión célula a célula y potencialmente retrasar o
impedir la hepatitis post trasplante. Potencialmente, la alteración de las proteínas de
las uniones estrechas podría modificar el curso clínico de la forma más grave de
recurrencia de la hepatitis C post trasplante, la hepatitis colestásica.
Discusión
96
6.2. Estudio 2: ARFI, Fibroscan®, ELF y sus combina ciones en
el diagnóstico no invasivo de la fibrosis hepática
El segundo estudio de la tesis evaluó de manera prospectiva la capacidad de tres
métodos no invasivos y sus combinaciones en la evaluación de la fibrosis hepática. La
evaluación de la fibrosis hepática es fundamental en Hepatología: el depósito
progresivo de fibrosis indica la gravedad de la enfermedad, por lo que el tratamiento
antiviral en hepatitis C está recomendado de manera clara en casos de fibrosis
significativa (F≥2 en las clasificaciones de METAVIR o Scheuer) (214). Probablemente
más importante incluso es la detección de los pacientes con cirrosis, ya que en estos
pacientes está indicado realizar prevención secundaria (detección precoz) del
carcinoma hepatocelular mediante ecografías semestrales (102), así como de la
presencia de varices esofagogástricas mediante gastroscopia. Dada la capital
importancia de la cuestión y las limitaciones inherentes al método considerado de
elección para el diagnóstico (la biopsia hepática) (161), cada vez parece más
importante encontrar métodos fiables que permitan realizar un diagnóstico preciso de
la fibrosis hepática minimizando complicaciones para los pacientes. Por ello, el
desarrollo de métodos no invasivos es uno de los campos en mayor crecimiento en la
actualidad en Hepatología.
En este estudio se reclutó prospectivamente una cohorte de 175 pacientes con
hepatopatía crónica de cualquier etiología, incluyendo pacientes trasplantados
hepáticos, que ingresaron en la Unidad de Corta Estancia del Servicio de Hepatología
del Hospital Clínic de Barcelona para realización de una biopsia hepática. Se
excluyeron cuatro pacientes trasplantados hepáticos cuyo diagnóstico histológico fue
rechazo, tres pacientes con insuficiencia renal crónica y dos pacientes que se
biopsiaron por vía transyugular y que presentaban ascitis, la cual impide realizar la
medición de la rigidez hepática con Fibroscan®. Además, 20 biopsias no cumplieron
Discusión
97
los estándares mínimos que generalmente se aceptan para realizar un diagnóstico
histológico (al menos 15 mm de longitud y 6 espacios porta) , por lo que también se
excluyeron estos pacientes, dejando el tamaño de muestra final en 146 (87
trasplantados hepáticos y 59 inmunocompetentes). La exclusión de los pacientes
cuyas biopsias son más proclives al error de muestra permite optimizar la capacidad
diagnóstica de la biopsia y con ello mejorar la fiabilidad de los resultados.
Dado que la cohorte estaba compuesta por pacientes trasplantados y no
trasplantados con hepatopatías de cualquier etiología, inicialmente se evaluó la
aplicabilidad de las técnicas y su capacidad diagnóstica de manera separada en los
dos grupos de pacientes. El primer hallazgo relevante es que ARFI se pudo realizar en
todos los pacientes, mientras que no conseguimos obtener una medición válida de
Fibroscan® en 8 pacientes trasplantados y en 8 inmunocompetentes. Un índice de
masa corporal elevado y un mayor perímetro abdominal fueron las variables que se
asociaron con el fallo de Fibroscan®.
La correlación entre Fibroscan® y ARFI fue muy buena, con coeficiente de
correlación de Pearson > 0.8 tanto en pacientes inmunocompetentes como en
trasplantados, e igualmente encontramos una relación estadísticamente significativa
entre los 3 métodos estudiados y los diferentes estadíos de fibrosis. De hecho, las
AUROC de ARFI, Fibroscan® y ELF para diagnosticar fibrosis significativa en los
pacientes inmunocompetentes fueron 0.89, 0.897 y 0.801, mientras que las AUROC
para diagnosticar cirrosis fueron 0.979, 0.961 y 0.894. En los pacientes trasplantados,
los valores de AUROC fueron muy similares (0.902, 0.867 y 0.811 de ARFI,
Fibroscan® y ELF para fibrosis significativa y 0.947, 0.938 y 0.834 para cirrosis). De
hecho, también los valores óptimos de corte tanto para diagnosticar la presencia de
fibrosis significativa como de cirrosis fueron muy similares en ambas poblaciones.
Teniendo esto en cuenta, se intentó simplificar y unificar el enfoque estudiando ambas
poblaciones juntas. Para aumentar la fiabilidad de los resultados, la cohorte completa
se dividió en un set de entrenamiento y en un set de validación, ambos fueron
Discusión
98
comparables en cuanto a la proporción de pacientes trasplantados e
inmunocompetentes y en la prevalencia de fibrosis significativa y cirrosis. En el set de
entrenamiento, los AUROC de ARFI, Fibroscan® y ELF para diagnosticar la presencia
de fibrosis significativa fueron 0.879, 0.861 y 0.764, mientras que los valores para
diagnosticar cirrosis fueron 0.936, 0.918 y 0.841. Para diagnosticar fibrosis
significativa, los mejores puntos de corte fueron 1.44 m/s para ARFI, 8.3 kPa para
Fibroscan® y 9.4 para ELF, mientras para cirrosis los valores fueron, respectivamente
1.9 m/s, 14.8 kPa y 10.3. Se utilizaron estos puntos de corte para combinar las
técnicas, de manera sincrónica. En general, ELF coincidió en su diagnóstico (ausencia
o presencia de fibrosis significativa o cirrosis) con ARFI o Fibroscan® en
aproximadamente el 70% de los pacientes, y la combinación de los métodos clasificó
correctamente al 84-89% de estos pacientes (es decir, la combinación de métodos es
aplicable al 70% de todos los pacientes y clasifica correctamente al 60%,
aproximadamente). La combinación de ELF con Fibroscan® o ARFI obtuvo valores de
VPP del 86-89% para fibrosis significativa y del 54-60% para cirrosis, mientras que los
VPN fueron de 82-83% y 98-100%, respectivamente. En todos los casos, los valores
fueron superores que los de cada técnica por separado. Los hallazgos se reprodujeron
de manera clara en el set de validación.
En conclusión, este estudio mostró, en primer lugar, que la aplicabilidad de ARFI
es superior a la de Fibroscan®, permitiendo potencialmente estimar la rigidez hepática
de ciertos pacientes en los que obtener una medición válida de Fibroscan® es más
difícil, como los pacientes obesos. Además, nuestros datos sugieren que ARFI,
Fibroscan® y ELF son igualmente útiles desde el punto de vista de la capacidad
diagnóstica para evaluar la presencia de fibrosis significativa o cirrosis, y que los
puntos de corte de las técnicas son muy similares en pacientes trasplantados
hepáticos e inmunocompetentes. Finalmente, la combinación de ELF con ARFI o
Fibroscan® aumenta la fiabilidad diagnóstica al incrementar los valores predictivos de
los tests individuales.
Discusión
99
Las limitaciones de este estudio son, en primer lugar, el numero relativamente bajo
de pacientes incluidos; y, en segundo lugar, la heterogeneidad de la muestra, que está
compuesta por pacientes inmunocompetentes y trasplantados con hepatopatías de
diversas etiologías. En este sentido, el análisis por separado de estos pacientes para
posteriormente evaluar la cohorte completa en un set de entrenamiento y en un set de
validación fortalece los resultados y minimiza los posibles sesgos.
Este estudio contribuye a ampliar el arsenal para el diagnóstico no invasivo de la
fibrosis hepática. Por un lado, demuestra que ARFI tiene una capacidad diagnóstica de
fibrosis significativa o cirrosis similar a la de Fibroscan®, y que además puede ser
utilizado en circunstacias, como la obesidad, que no permiten el uso de Fibroscan®.
Por ello, la introducción de ARFI en la práctica clínica diaria podría servir para mejorar
el diagnóstico de la fibrosis hepática, teniendo en cuenta, además, que el software
está incluído en un ecógrafo convencional, lo que permite realizar un examen
ecográfico abdominal a la vez que se procede a evaluar la fibrosis hepática. Además,
nuestros resultados sugieren que en aquellos casos en los que el resultado de ARFI o
Fibroscan® coincide con el resultado de ELF las posibilidades de acertar el resultado
son muy elevadas, especialmente para confirmar la presencia de fibrosis significativa o
para descartar la presencia de cirrosis.
100
7. CONCLUSIONES
______________________________________________________
Conclusiones
103
1. Es posible detectar mediante inmunofluorescencia y cuantificar mediante
software especializado la expresión de los receptores del VHC en biopsias hepáticas
parafinadas de pacientes trasplantados por hepatitis C.
2. En biopsias hepáticas parafinadas de pacientes trasplantados, SR-BI se
detecta en el polo basolateral (sinusoidal) de los hepatocitos, mientras que claudina y
occludina predominan en el polo apical o canalicular.
3. La infección de los hepatocitos por el VHC induce un aumento cuantitativo en la
expresión de claudina y occludina, sin modificar su patrón morfológico. Esto es más
evidente en los pacientes con recurrencia severa de la hepatitis C.
4. La expresión de SR-BI, claudina y occludina en el momento del trasplante
hepático influye en la cinética viral precoz post-trasplante, lo que apoya su papel
clínico como receptores del VHC.
5. En cambio, estos receptores no parecen influir en la gravedad del depósito de
fibrosis en el injerto que tiene lugar en los primeros meses tras el trasplante hepático.
6. ARFI tiene una mayor aplicabilidad que Fibroscan® y por tanto permite evaluar
a una mayor cantidad de pacientes.
Conclusiones
104
7. La capacidad diagnóstica de ARFI, Fibroscan® y ELF para evaluar la presencia
de fibrosis significativa es buena, tanto en pacientes inmunocompetentes como en
pacientes trasplantados. ARFI y Fibroscan®, además, tienen una capacidad excelente
de diagnosticar la presencia de cirrosis en ambos grupos de pacientes.
8. Los puntos de corte de los tres métodos estudiados para diagnosticar fibrosis
significativa y cirrosis son equivalentes en pacientes trasplantados y no trasplantados.
9. La utilización simultánea de ELF con Fibroscan® o ARFI es aplicable
aproximadamente a un 70% de los pacientes en los que los métodos coinciden en su
diagnóstico.
10. La combinación de métodos complementarios (ELF con Fibroscan® o ARFI)
aumenta la confianza diagnóstica al incrementar los valores predictivos y con ello la
fiabilidad de los resultados.
8. ANEXOS
______________________________________________________
ORIGINAL ARTICLE—LIVER, PANCREAS, AND BILIARY TRACT
Combinations of simple baseline variables accurately predictsustained virological response in patients with recurrent hepatitisC after liver transplantation
Gonzalo Crespo • Jose A. Carrion • Mairene Coto-Llerena • Zoe Marino •
Sabela Lens • Sofıa Perez-del-Pulgar • Montserrat Garcıa-Retortillo •
Rosa Miquel • Jaime Bosch • Miquel Navasa • Xavier Forns
Received: 11 July 2012 / Accepted: 29 August 2012
� Springer 2012
Abstract
Background The efficacy of antiviral therapy in patients
with hepatitis C recurrence after liver transplantation (LT)
is far from optimal and a careful selection of candidates
with the best chances to achieve sustained virological
response (SVR) is relevant. Moreover, investigating the
effects of sustained viral clearance on clinical outcomes is
particularly significant. We aimed to identify and combine
the best baseline predictors of SVR and to assess the
clinical outcomes of antiviral therapy after LT.
Methods We studied 144 hepatitis C virus (HCV)-infected
LT recipients who underwent antiviral therapy following
transplantation. Baseline predictors of SVR including donor
and recipient interleukin IL28B (IL28B) rs12979860 geno-
type were evaluated, and the long-term effects of antiviral
therapy on clinical outcomes were assessed.
Results The presence of an IL28B CC genotype with either
low viral load (VL), young donor age, or cyclosporine A
(CsA)-based immunosuppression identified individuals with
69–80 % probabilities of SVR. In contrast, only 20 % of
recipients with a CT/TT IL28B genotype and either high VL,
old donor age, or non-CsA immunosuppression achieved an
SVR (p = 0.004). Regarding clinical outcomes, the 5-year
cumulative probability of graft loss was 2 % for the SVR
patients and 48 % for non-responders (p \ 0.001).
Conclusions The use of simple combinations of baseline
variables including IL28B polymorphisms identifies HCV-
infected LT recipients with different probabilities of
response to antiviral treatment. SVR is associated with
improved clinical outcomes.
Keywords IL28B � Antiviral therapy � Cyclosporine A �Sustained virological response � Liver transplantation
Abbreviations
HCV Hepatitis C virus
LT Liver transplantation
IL28B Interleukin 28B
HVPG Hepatic venous pressure gradient
VL Viral load
EPO Erythropoietin
G-CSF Granulocyte colony-stimulating factor
RVR Rapid virological response
EVR Early virological response
SVR Sustained virological response
EOT End of treatment
PBMC Peripheral blood mononuclear cells
HIV Human immunodeficiency virus
CsA Cyclosporine A
AUROC Area under the receiver-operating characteristic
curve
Introduction
Recurrent hepatitis C virus (HCV) infection following liver
transplantation (LT) is universal in HCV-infected patients
at the time of LT [1] and carries important implications: up
to 30 % of patients develop graft cirrhosis only 5 years
G. Crespo � J. A. Carrion � M. Coto-Llerena � Z. Marino �S. Lens � S. Perez-del-Pulgar � M. Garcıa-Retortillo �J. Bosch � M. Navasa � X. Forns (&)
Liver Unit, Institut de Malalties Digestives, Hospital Clınic,
CIBERehd, IDIBAPS, Villarroel 170, 08036 Barcelona, Spain
e-mail: [email protected]
R. Miquel
Pathology Department, Hospital Clınic, CIBERehd, IDIBAPS,
Barcelona, Spain
123
J Gastroenterol
DOI 10.1007/s00535-012-0680-2
after transplantation [2] and their survival rate is lower
compared with that of HCV-negative LT recipients [3].
Thus, the need for antiviral treatment is frequent in this
population. However, the efficacy of therapy is signifi-
cantly lower than that in immunocompetent individuals,
and its side effects are frequent and often severe [4]. For
these reasons, addressing the pre-treatment probabilities of
response is especially important in HCV-infected LT
recipients. Apart from several well-known predictors of
response [5–11], recent studies have shown that interleukin
28B (IL28B) polymorphisms exert a strong influence on
the response to antiviral treatment following LT [12–16].
The main aim of our study was to construct useful treat-
ment algorithms based on the combination of baseline
predictors of response (including IL28B) in a large cohort
of treated patients. Because the progression of liver fibrosis
is accelerated in LT recipients, we also aimed to evaluate
the long-term effects of viral clearance on clinical
outcomes.
Patients and methods
Patients and treatment criteria
Between June 2001 and June 2009, 408 HCV-infected
patients underwent primary LT at our institution. Indica-
tions for antiviral therapy after LT remained the same
during the study period and included: (1) a liver biopsy
showing hepatitis C recurrence with a fibrosis stage C2
and/or a hepatic venous pressure gradient (HVPG)
C6 mmHg 1 year (or later) after LT; (2) before the first
year after transplantation, indications for treatment inclu-
ded cholestatic hepatitis, fibrosing cholestatic hepatitis, or
acute hepatitis with the presence of confluent necrosis.
During the study period a few patients received antiviral
treatment at milder stages of the disease in the setting of a
previously published randomized controlled trial [17]. All
patients provided their informed consent and our study was
approved by the Ethics Committee of the Hospital Clınic of
Barcelona in accordance with the guidelines of the 1975
Declaration of Helsinki.
Patient follow up during and after therapy
During antiviral therapy, a complete clinical history with
physical examination and laboratory work-up was per-
formed at weeks 2, 4, 8, and 12 and then every 1–2 months
until treatment completion, as well as whenever clinically
indicated. After the completion of treatment, patients were
assessed at weeks 4, 12, and 24, and every 3–4 months
thereafter. The occurrence of hepatic decompensation
(ascites, hepatic encephalopathy, variceal bleeding),
infections, graft rejection, and graft loss (death or retrans-
plantation) was assessed and recorded at each time point
during the follow up. The last time point evaluation for this
study was December 2011.
All patients underwent a liver biopsy, with or without an
HVPG measurement, prior to starting therapy. A single
expert pathologist, blinded to the clinical data, scored all
biopsies according to the METAVIR classification system.
Fibrosing cholestatic hepatitis was defined according to
international guidelines [18]. In patients who underwent
liver biopsy after completion of the therapy, improvement
of fibrosis status was defined as a reduction of C1 fibrosis
stage(s); worsening, as an increase of C1 fibrosis stage(s);
and stabilization as the same fibrosis stage as existed before
[17]. Regarding changes in HVPG measurement, HVPG
was considered to be increased if: (1) normal HVPG
(\6 mmHg) increased to portal hypertension; or (2) mild
portal hypertension (6–9.9 mmHg) increased to clinically
significant portal hypertension (C10 mmHg); in either
case, the HVPG increase needed to be C25 % of the
baseline HVPG value. An HVPG decrease was defined as
the reverse situation, and HVPG was considered to remain
stable when changes were \25 % of the baseline value
[17].
Antiviral treatment regimen and response definitions
Antiviral treatment consisted of pegylated interferon alpha-
2b (1.5 lg/kg/week) and ribavirin. The intended duration
of therapy was 48 weeks, regardless of HCV genotype,
except in six patients classified as partial responders
[decrease in viral load (VL) C2 log10 IU from baseline
without negativization at week 12 and undetectable HCV-
RNA at week 24], in whom treatment was extended to
72 weeks. Ribavirin dosing was weight-based (1000 mg if
weight was \75 kg, 1200 mg if C75 kg) and was inde-
pendent of the viral genotype. The criteria used to initiate
erythropoietin (EPO) or granulocyte colony-stimulating
factor (G-CSF) have been previously reported [17]. Rapid
virological response (RVR) was defined as undetectable
HCV-RNA at week 4 of therapy. Early virological
response (EVR) was defined as a decrease in VL of
C2 log10 IU at week 12 from baseline. Sustained virolog-
ical response (SVR) was defined as undetectable serum
HCV-RNA at the end of therapy (EOT) that persisted
for 24 weeks after treatment completion. Thirteen
non-responders who achieved a biochemical response
(normalization of transaminases, gamma-glutamyl trans-
peptidase (GGT), and alkaline phosphatase) received long-
term low-dose pegylated interferon after completing ther-
apy. These patients were not included in the long-term
clinical or histological analysis.
J Gastroenterol
123
HCV VL and genotype determination
HCV genotype was determined as previously described
[19]. VL was assessed using a polymerase chain reaction-
based assay (Cobas Taqman 48; Roche Diagnostics,
Manheim, Germany). VL was determined before the start
of therapy and at weeks 4, 12, 24, 48, and 72.
IL28B genotyping
Genomic DNA from LT recipients was extracted from
peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Genomic
DNA from donors was extracted from PBMC (when
available) or from formalin-fixed, paraffin-embedded liver
biopsy samples. The biopsy samples were obtained from
the donor before transplantation or immediately after graft
reperfusion during the transplant surgery [20]. Genotyping
of IL28B rs12979860 was performed as previously
described [21]. IL28B rs12979860 was defined as CC, CT,
or TT, and grouped as CC versus CT/TT as previously
reported [22].
Statistical analysis
Quantitative variables are expressed as median values
(ranges). For categorical variables, any differences
between groups were assessed using Fisher’s exact test,
while differences among quantitative variables were ana-
lyzed with a non-parametric test (Mann–Whitney for
unpaired samples and the Wilcoxon test for paired sam-
ples). A 2-sided p value of \0.05 was considered statisti-
cally significant. Multivariate forward stepwise logistic
regression analysis was performed to determine baseline
independent predictors of SVR. Variables with a p value of
\0.1 in the bivariate analysis and with available results for
C80 % of the cohort were included in the multivariate
analysis.
Results
Patients
Among the 408 patients who underwent primary LT due to
HCV-related end-stage liver disease at our institution
during the study period, 18 received simultaneous liver and
kidney transplantations, 28 cleared HCV while on the
waiting list, 14 were coinfected with HIV, and 38 survived
for\3 months. Among the remaining 310 patients, 120 did
not meet the criteria to receive antiviral treatment
throughout the follow-up period and 46 met the treatment
criteria but presented with comorbidities that prevented
therapy. Thus, 144 patients were included in the present
study. The baseline characteristics of the 144 included
patients are shown in Table 1.
Response to antiviral therapy
Seven patients (5 %) achieved an RVR, 92 (64 %) an EVR,
69 (48 %) showed undetectable HCV-RNA at EOT, and
finally 46 patients (32 %) achieved an SVR. Thus 23
patients (33 % of the patients with an EOT response) were
considered relapsers.
Baseline predictors of response to antiviral therapy
Pre-treatment variables that were associated with SVR in
the bivariate analysis were infection with genotypes 2–3,
recipient IL28B CC, mild fibrosis stage, low HVPG,
immunosuppression with cyclosporine A (CsA), young
donor age, and low baseline VL (Table 2). Other variables
such as donor or recipient gender, recipient age, antiviral
treatment before LT, time between LT and antiviral ther-
apy, or donor IL28B genotype were not significantly
associated with response to treatment. Despite the lack of
Table 1 Baseline characteristics of the patients included in the study
(n = 144)
n (%)/median (range)
Recipient age (years) 57 (30–70)
Recipient gender (M/F) 98 (68)/46 (32)
Recipient rs12979060 (CC/CT-TT)a 31 (24)/97 (76)
Donor age (years) 55 (11–79)
Donor gender (M/F) 86 (60)/58 (40)
Donor rs12979860 (CC/CT-TT)a 55 (50)/55 (50)
Viral genotype (1–4/2–3) 136 (94)/8 (6)
Baseline viral load (log10 IU/ml) 6.5 (4.5–9)
CsA/Tac/antimetabolitesb 46 (32)/90 (62)/8 (6)
Time from transplant (months) 14 (2–88)
Baseline HVPG (mmHg)c 7 (2–21)
Baseline fibrosis stage
Acute hepatitis 9 (6)
F0–1 24 (17)
F2–4 74 (51)
CH/FCH 37 (26)
Qualitative variables are shown as n (%) and quantitative variables as
medians (ranges)
M males, F females, CsA cyclosporine A, Tac tacrolimus, HVPGhepatic venous pressure gradient, CH cholestatic hepatitis, FCHfibrosing cholestatic hepatitisa rs12979860 genotyping was successfully performed in 128 recipi-
ents and 110 donorsb All patients received low-dose prednisone (5 mg/day) during
treatmentc Baseline measurements of HVPG were performed in 110 patients
J Gastroenterol
123
an association between donor IL28B genotype and SVR,
patients with donor and recipient CC genotype had a sig-
nificantly higher SVR rate (73 %, 11/15) than the
remaining patients (30 %, 28/93) (p = 0.001); thus sup-
porting the results previously published by our group and
others [12–16].
When incorporated into a multivariate analysis model,
the pre-treatment characteristics that were independently
associated with SVR included recipient rs12979860 geno-
type CC, low baseline VL, young donor age, and immu-
nosuppression with CsA. When patients with milder
disease (F0–F1 before treatment) were excluded from the
analysis, variables independently associated with SVR
remained the same (data not shown).
We aimed to simplify the pre-treatment assessment of
SVR probabilities using simple variables independently
associated with SVR in multivariate analysis. In order to
categorize the continuous variables independently associ-
ated with SVR (donor age and baseline VL), we calculated
the area under the receiver-operating characteristic curve
(AUROC) of these variables for the prediction of SVR. As
expected, the AUROCS of donor age and baseline VL were
only fair: the AUROC of donor age for the prediction of SVR
was 0.602 (95 % confidence interval [CI] 0.51–0.706,
p = 0.05), while the AUROC of baseline VL was 0.682
(95 % CI 0.586–0.777, p \ 0.001). The best cut-off value of
donor age was 53.5 years, which yielded a sensitivity of
59 % and specificity of 63 %, while cut-off values with 90 %
sensitivity and specificity were, respectively, 30 and
73 years. Regarding baseline VL, the best cut-off value was
6.35 log IU/ml (sensitivity and specificity 63 %), and values
with 90 % sensitivity and specificity were 5.76 and
7.1 log IU/ml. Taking into account that the best cut-off
values were very similar to the median values of the variables
in our cohort (55 years and 6.5 log IU/ml), we decided to use
these latter thresholds. Thus, 80 % of patients with an IL28B
CC genotype and a baseline VL of \6.5 log10 IU/ml
achieved an SVR, as compared with only 31 % of patients
with CC genotype and high baseline VL ([6.5 log IU/ml) or
32 % of those with CT/TT genotype and low VL. The lowest
response probabilities (21 %) were for patients with CT/TT
IL28B genotype and high VL (p \ 0.001; Fig. 1a). We were
also able to accurately classify patients according to their
response probabilities by combining recipient IL28B poly-
morphisms and donor age. In the best-case scenario (donor
age below 55 and IL28B CC), chances of achieving an SVR
were 69 %, whereas the SVR rates were only 20 % in those
individuals who were IL28B CT/TT and received a graft
from an old donor (p = 0.004; Fig. 1b). Finally, treatment
with CsA also appeared to have some influence in our cohort:
SVR rates ranged from 69 % in patients with a CC IL28B
genotype and CsA-based immunosuppression to only 20 %
in IL28B CT/TT patients who were not on CsA-based
immunosuppression (p = 0.004; Fig. 1c).
Table 2 Baseline characteristics associated with SVR in bivariate and multivariate analyses
Baseline characteristics SVR (n = 46) NR (n = 98) p (bivariate) p (multivariate) OR (95 % CI) multivariate
Recipient age (years) 57 (40–72) 57 (30–70) 0.75
Recipient gender (M/F) 32 (70)/14 (30) 66 (67)/32 (69) 0.93
Recipient rs12979860 (CC/CT-TT) 17 (40)/25 (60) 14 (16)/72 (84) 0.004 0.01 3.51 (1.36–9.07)
Donor age (\/C55 years) 29 (63)/17 (37) 42 (43)/56 (57) 0.02 0.002 0.21 (0.08–0.55)
Donor gender (M/F) 28 (61)/21 (45) 58 (59)/37 (38) 0.8
Donor rs12979860 (CC/CT-TT) 22 (55)/18 (45) 33 (47)/37 (53) 0.43
Viral genotype (1–4/2–3) 40 (87)/6 (13) 96 (98)/2 (2) 0.02 NS
Baseline viral load (\/C6.5 log IU/ml) 31 (67)/15 (33) 40 (41)/58 (59) 0.004 0.007 0.31 (0.13–0.72)
CsA/others 21 (46)/25 (54) 25 (25)/73 (75) 0.02 0.003 4.4 (1.62–11.6)
Time from transplant (months) 16 (2–80) 13 (2–88) 0.08 NS
Baseline HVPG (mmHg) 6 (2–12) 8 (2–21) 0.01
Baseline fibrosis stage 0.02 NS
Acute hepatitis 2 (4) 7 (7)
F0–1 14 (30) 10 (10)
F2–4 24 (52) 50 (51)
CH/FCH 6 (13) 31 (32)
Quantitative variables are shown as medians (ranges), and qualitative variables are shown as n (%). The analysis was performed including
‘‘donor age’’ and ‘‘baseline viral load’’ as either continuous or dichotomous variables (categorized by the median of the variable in the cohort),
obtaining similar results in terms of statistical significance. For an easier interpretation, results using the categorized form of the variable are
shown
CI confidence interval, OR odds ratio, M males, F females, CsA cyclosporine A, HVPG hepatic venous pressure gradient, CH cholestatic
hepatitis, FCH fibrosing cholestatic hepatitis, SVR sustained virological response, NR non-response, NS not significant
J Gastroenterol
123
Side effects
Only 40 % of the patients received at least 80 % of the
intended dose of ribavirin and pegylated interferon for at least
80 % of the intended duration of treatment. Most patients
(69 %) required ribavirin dose adjustments, while interferon
dose adjustment was required in 24 % of the patients. Side
effects led to early treatment discontinuation in 37 patients
(26 %), most of them due to infections, liver decompensa-
tion, and anemia. Indeed, the most frequent side effect was
anemia, which required the use of EPO in 93 (65 %) and
transfusion in 70 (49 %) patients. Twenty-six patients (18 %)
developed infections during therapy (including 3 with inva-
sive aspergillosis), while 17 (12 %) presented with liver
decompensation (15 with ascites, 2 with hepatic encepha-
lopathy; median time between treatment initiation and
decompensation: 20 weeks), and 6 (4 %) showed rejection (4
acute cellular, 2 chronic rejection). Four patients discontin-
ued treatment due to severe psychiatric symptoms, including
severe depression and aggressiveness. Finally, 11 patients
(8 %) died during treatment. The causes of death in these 11
patients were progression of hepatitis C recurrence in 10 and
chronic rejection in 1.
Clinical outcomes after antiviral therapy
Patients were followed for a median time of 43 months
(range 2–114) after completing therapy. Graft loss was
significantly higher in non-responders than in patients who
achieved an SVR (Fig. 2a): the 1- and 5-year graft sur-
vivals were 82 and 52 %, respectively, in non-responders;
and 98 % in patients who achieved an SVR (log-rank
p \ 0.001). The probability of clinical decompensation
after treatment was also significantly higher in non-responders
than in responders (Fig. 2b): the 5-year cumulative proba-
bility of decompensation was 42 % in non-responders
and 2 % in patients who achieved an SVR (log-rank
p \ 0.001).
We assessed the long-term histological and hemody-
namic outcomes by repeated liver biopsy and/or by deter-
mining liver hemodynamics in a subgroup of patients.
Forty-nine patients (27 non-responders and 22 patients who
achieved an SVR) had paired histological assessments
performed before therapy and 3 years after completing
treatment. In the 22 patients who achieved an SVR, fibrosis
had improved by at least one fibrosis stage in 9 (41 %),
remained stable in 9 (41 %), and worsened (one fibrosis
stage) in only 4 (18 %), while the figures for non-
responders were 4, 37, and 59 %, respectively (p \ 0.001).
Thirty-four patients (22 non-responders, 12 SVR) had
paired HVPG measurements obtained before therapy and
3 years after treatment completion. HVPG improved or
remained stable in all assessed patients who achieved an
SVR, while it improved in 2 (9 %) non-responders,
remained stable in 11 (50 %), and worsened in the
remaining 9 (41 %) (p = 0.002).
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
CT/TT
55 y
0
20
40
60
80
100
80%
31%21%
69%
40%31%
20%
% S
VR
% S
VR
32%
IL28B
VL
CC
< 6.5 log
CC
6.5 log
CT/TT
< 6.5 log
CT/TT
6.5 log
IL28B
DA
CC
<55 y
CC
55 y
CT/TT
<55 y
a b
15 16 44 53 16 15 51 46
p<0.001 p=0.004
c
CT/TT
Others
69%
47%39%
20%%
SV
R
IL28B
IMS
CC
CsA
CC
Others
CT/TT
CsA
14 17 28 69
p=0.004
≥≥ ≥ ≥
Fig. 1 Sustained virological
response according to the
combination of the recipient
interleukin 28B (IL28B)
genotype and baseline viral load
(a), donor age (b), or
immunosuppression (c). VLviral load, DA donor age
(y years), IMSimmunosuppression, CsAcyclosporine A. The median
values for baseline viral load
and donor age in the cohort
(6.5 log10 IU/ml and 55 years,
respectively) were used as the
thresholds to categorize the
variables
J Gastroenterol
123
Discussion
The efficacy of antiviral therapy is clearly suboptimal in
HCV-infected liver transplant recipients and side effects
are common and often severe. Thus, a careful selection of
patients is crucial in this setting. In this regard, the com-
bination of donor and recipient IL28B genotype has proved
helpful to separate groups of patients with different
response probabilities in several studies [12–16], with
those CC recipients with a CC donor harboring the highest
SVR rates. However, assessing IL28B genotype in donors
may be difficult, as liver tissue or PBMC from the donor
are not always available. For this reason, using simpler
variables may be of interest to facilitate response predic-
tion. In this large series of treated patients, apart from
IL28B CC genotype of the recipient, young donor age, low
baseline VL, and immunosuppression with CsA showed
independent associations with SVR. Low VL is a well-
known predictor of SVR in immunocompetent patients,
and it has also been shown to influence response to anti-
viral therapy after LT in most studies [4]. In contrast, donor
age has been less frequently associated with SVR after LT,
although it has been evaluated in only a minority of studies
[4]. Patient age is clearly associated with response to
antiviral therapy with pegylated interferon and ribavirin in
immunocompetent patients [23]; however, the mechanisms
by which age influences response are unclear, although
they may be related to a decreased tolerance to therapy or a
higher prevalence of advanced fibrosis in older patients.
Nevertheless, the observation that donor (liver) age also
influences response probabilities after transplant would
suggest that the intrahepatic response to interferon is
impaired in elderly patients. Indeed, oxidative stress, which
is associated with age, has been shown to impair interferon-
a signaling in Huh-7 cells [24]. Whether this mechanism
plays a significant role in interferon resistance in the clin-
ical setting remains to be elucidated, and more studies are
required, both before and after transplant.
While viral genotype was significantly associated with
SVR in our bivariate analysis, it did not remain as an
independent predictor of SVR in the multivariate analysis,
possibly owing to the low number of non-1-genotype-
infected patients. Similarly, and in keeping with most
studies [4], baseline fibrosis stage was not an independent
predictor of SVR, although a clear association between
disease severity and probabilities of response was sug-
gested in the bivariate analysis.
By combining the variables independently associated
with SVR, it was possible to accurately stratify patients
according to their response probability. Our results are
particularly helpful from a clinical point of view, because
they could be easily applied in routine practice. Interest-
ingly, the combination of a favorable IL28B genotype with
either a low VL or a young donor age identifies a group of
patients with high probabilities of response to peginter-
feron and ribavirin therapy. Our findings would also sup-
port the use of a CsA-based regimen during antiviral
therapy, as suggested by some other studies [25, 26], but
these data must be confirmed in specifically designed
prospective studies. It is important to acknowledge that
patients with a high probability (70–80 %) of response to
peginterferon and ribavirin represented only 11–13 % of
our cohort, but antiviral treatment with this schedule may
be a clear option in these patients even in case of mild
hepatitis C recurrence, especially taking into account the
excellent outcomes of patients who are able to achieve an
SVR. On the other hand, there was a group of patients with
very low response probabilities (*20 %); in these cases,
Log-rank < 0.001
Log-rank < 0.001
SVR (n=46)
SVR (n=46)
NR (n=74)
NR (n=74)
a b
Fig. 2 Kaplan–Meier analysis showing cumulative probabilities of
graft survival (a) and clinical decompensation (b) after treatment
completion, in patients who achieved a sustained virological response
(SVR) (n = 46) and non-responders (NR) (n = 74). Patients who died
while on therapy and those who received long-term pegylated
interferon were not included in the analysis
J Gastroenterol
123
particularly in subjects with severe recurrence, triple ther-
apy including new direct antivirals may be the only choice
to reach sustained viral clearance [27]. However, it is
important to note that attention needs to be paid to drug-
drug interactions and potentially life-threatening side
effects [28–30], and more studies are required before triple
therapy can be recommended.
While a recent systematic review including more than
400 patients could not show a clinical benefit of anti-HCV
treatment after transplantation [31], some studies have
suggested that those subjects who receive antiviral treat-
ment following transplantation present higher patient and
graft survival than untreated recipients [32, 33]. These
effects seem most pronounced in those patients who
achieve an SVR [10, 11], highlighting the importance of
clearing HCV in this difficult-to-treat population. In a
previous study we demonstrated that viral clearance was
associated with short-term (end-of-treatment) beneficial
histological and hemodynamic effects [17]. However, the
information on the long-term effects of antiviral therapy on
liver histology and hemodynamics is scarce [34]. In this
regard, our present results in a subgroup of patients who
underwent a liver biopsy and/or determination of liver
hemodynamics 3 years after treatment completion suggest
that an SVR results in long-term stabilization or regression
of fibrosis, with its consequent impact on portal pressure.
Our results strongly support those recently reported by
Berenguer et al. [11], who showed that regression or sta-
bilization of fibrosis was most evident in biopsies obtained
at least 12 months after the completion of therapy. Actu-
ally, by clearing HCV, the cause of injury and its mediators
(inflammation) are eliminated, reducing fibrogenesis.
Nevertheless, fibrosis regression (by scar matrix degrada-
tion) would require longer periods to take place, and may
be more evident in those individuals in whom fibrosis
deposition is recent and still within a remodeling process
[35]. Indeed, the median time from transplantation to
antiviral treatment in our cohort was only 13 months, and
more than 80 % of individuals underwent antiviral therapy
\2 years following LT.
It is most likely that the above-mentioned histological
and hemodynamic effects are responsible for the reduction
in the probabilities of developing clinical decompensation
(as well as the significant improvement in graft survival)
observed in patients achieving an SVR. In keeping with
other studies [10, 11, 32, 33], in our cohort only 3 indi-
viduals who achieved an SVR died during follow up, and
only one of these deaths was liver-related. In contrast,
approximately half of the non-responders had lost their
grafts 5 years after treatment completion, with most graft
losses resulting from recurrent hepatitis C.
Our study has some limitations, mainly because of its
retrospective nature. However, the fact that we undertook a
single-center study in which patients were strictly and
prospectively followed under protocol-guided conditions
strengthens our results. Another limitation of our study is
its potential applicability in the future, because antiviral
therapy with direct-acting antivirals will probably change
the management of patients with recurrent hepatitis C.
Nevertheless, there are very limited data on the safety and
efficacy of such antiviral regimens including telaprevir/
boceprevir in the transplant setting and it will probably take
a few years until direct-acting antivirals will be used in
these patients [27–30].
In summary, we have shown that the combinations of
recipient IL28B genotype with certain simple baseline
variables are useful tools with which to predict the prob-
abilities of achieving an SVR to antiviral therapy for
recurrent hepatitis C, a finding that may help physicians to
better indicate antiviral therapy in this difficult setting.
Importantly, an SVR to antiviral therapy after transplan-
tation yields significant improvements in the status of liver
fibrosis and in HVPG, which ultimately result in clear
clinical benefits.
Acknowledgments Xavier Forns and Miquel Navasa received
support in part by grants from Instituto de Salud Carlos III (PI08/0239
and PI10/01551, respectively), Ministerio de Economıa y Competi-
tividad, co-funded by Fondo Europeo de Desarrollo Regional, Union
Europea, Una manera de hacer Europa. X. Forns received support
from the EIHCV Marie Curie Research Training Group (MRTN-CT-
2006-035599). G. Crespo was supported by grants from Hospital
Clınic (Ajut a la Recerca Josep Font) and the Fundacion BBVA.
M. Coto-Llerena is supported by the Ministerio de Asuntos Exteriores
y Cooperacion (Agencia Espanola de Cooperacion Internacional), and
Z. Marino by the Fundacion BBVA. CIBERehd is funded by the
Instituto de Salud Carlos III.
Conflict of interest Xavier Forns received unrestricted Grant sup-
port from Roche and MSD, and Miquel Navasa received speaker fees
from Novartis. The authors have no other potential conflicts of
interest to disclose regarding the manuscript.
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