CAPITULO I

CONTROL DE CRECIMIENTO BACTERIANO.

1.1.-Fundamentos del control de los microorganismos.-

Los materiales alimenticios cuya composición es utilizada por el hombre con fines nutritivos, es también utilizado para los mismos fines por los microorganismos. La intervención microbiana sobre los diversos alimentos trae como consecuencia modificaciones en la calidad, que se conoce como deterioro, ocasionando pérdidas económicas muy importantes. La supervivencia y el crecimiento microbiano puede potenciar la presencia de algunos microorganismos que afectan la inocuidad de los alimentos, trayendo consigo enfermedades de origen alimentario, como son las infecciones y las intoxicaciones de origen microbiano.

Estas circunstancias han conducido a desarrollar una serie de tecnologías que buscan prevenirlos procesos de deterioro y la ocurrencia de las enfermedades microbianas transmitidas por los alimentos. La mayor parte de los procesos tecnológicos utilizados en la industria alimentaria se basan en fundamentos físicos, químicos y biológicos que permiten un control del crecimiento microbiano. El conocimiento de los reservorios naturales, de su sistema ecológico y de las técnicas que permitan su identificación y cuantificación son temas que complementan tales tecnologías y coadyuvan al mejor entendimiento de herramientas como la limpieza y desinfección en plantas industriales, la aplicación de buenas prácticas de manipulación de alimentos (BPM) y la implementación del sistema HACCP

1.2.-Importancia del control microbiano.-

Las razones principales para controlar los microorganismos son:

-Prevenir la transmisión de la infección y la enfermedad.

-Prevenir la contaminación o la proliferación de microorganismos perjudiciales.

-Prevenir el deterioro o destrucción de materiales por los microorganismos.

Los microorganismos se eliminan, inhiben o matan por medio de:

-Agentes físicos

-Procedimientos físicos

-Agentes químicos.

Definición de términos (`procedimientos físicos y agentes químicos).

-Esterilización: Es el proceso de destruir todas las formas de vida microbiana, es de forma completa y no de forma relativa.

-Desinfectante: Es un agente (por lo regular químico), capaz de matar las formas en desarrollo, pero no las esporas, de microorganismos patógenos; se aplica a un ser inanimado.

-Desinfección: Es la operación de destruir agentes infecciosos.

-Antiséptico: Toda sustancia que se opone a la sepsis o impide el desarrollo o acción de microorganismos. Aplicadas generalmente al cuerpo.

-Saneamiento: Consiste en reducir la población microbiana a niveles no peligrosos por medio de un agente (generalmente químico). La desinfección produce saneamiento pero no viceversa.

-Germicida (microbicida): Agente que mata las formas en desarrollo pero no forzosamente las esporas; se utilizan en todo tipo de aplicación.

1.3.-Factores que afectan el crecimiento microbiano.-

MÉTODOS FÍSICOS:

Los métodos físicos se utilizan a menudo para lograr la descontaminación, la desinfección y la esterilización microbiana.

CALOR: La exposición al agua en ebullición durante 10 minutos es suficiente para destruir células vegetativas, pero no es suficiente para destruir endosporas. No esteriliza.

La eficacia del calor como agente antimicrobiano, se puede expresar como el Tiempo de muerte térmico (TMT), que se define como el tiempo más corto necesario para destruir los microorganismos en una suspensión, a una temperatura específica y en condiciones definidas. Sin embargo como la destrucción es logarítmica no es posible eliminar completamente los microorganismos de una muestra.

Existen diversos métodos de control de microorganismos por medio del calor:

a. Esterilización por vapor (calor húmedo o autoclave): El agua es llevada a punto de ebullición de manera que el vapor llena la cámara, desplazando el aire frío. Cuando todo el aire es expulsado, se cierran las válvulas de seguridad y el vapor satura toda la cámara, por lo que incrementa la presión, hasta que se alcanzan los valores deseados (121°C y 15 lb presión).

En estas condiciones se destruyen todas las células vegetativas y endosporas en un tiempo que por lo general es de 15 minutos. Se piensa que el calor húmedo degrada los ácidos nucleicos, desnaturaliza proteínas y además alterar las membranas celulares.

Si no se cumplen las condiciones adecuadas, no hay esterilización. Para controlar el buen funcionamiento del equipo, se pueden incluir con la esterilización un control biológico o un indicador químico.

El indicador biológico consiste en una ampolla estéril con un medio y un papel cubierto con esporas de Bacillus stearothermophilus o Clostridium. Luego de la esterilización se rompe la ampolla y se incuba por unos días. El indicador químico consiste en una cinta especial con letras o líneas que cambian de color después del tratamiento suficiente con calor.

b. Pasteurización: Se utiliza para sustancias o medios que no pueden ser calentadas a más de su temperatura de ebullición.

Un calentamiento breve a 55 o 60°C destruirá los microorganismos patógenos y disminuye los causantes de la descomposición de la sustancia. NO esteriliza.

Existen variaciones que son utilizadas en la industria de la leche: la pasteurización rápida (HTST high temperature short-term) que consiste en calentar a 72°C por 15 segundos. Y la pasteurización a temperatura ultra elevada (UTH ultrahigh temperature) que calienta a 140-150°C por 1 a 3 segundos.

c. Tindalización o esterilización fraccionada al vapor: se utiliza para químicos o material biológico que no puede llevarse a más de 100°C. Se calienta a una temperatura de 90°C a 100°C durante 30 minutos por tres días consecutivos y se incuba a 37°C entra cada calentamiento.

El primer calentamiento destruye células vegetativas pero no esporas, por lo que germinan a 37ºC y luego son eliminadas con el siguiente calentamiento.

d. Calor seco: Se utilizan hornos o estufas a una temperatura de 160-170°C por 2 o 3 horas. Es menos efectivo que el calor húmedo, pero no corroe utensilios metálicos. Es lenta y no se puede utilizar para material termo sensible.

e. Incineración: Destruye por completo los microorganismos. (calentar las asas en los mecheros).

f. Temperaturas bajas: Refrigeración y congelación, son únicamente bacteriostáticos. En general, el metabolismo de las bacterias está inhibido a temperaturas por debajo de 0° C. Sin embargo estas temperaturas no matan a los microorganismos sino que pueden conservarlos durante largos períodos de tiempo.

Esta circunstancia es aprovechada también por los microbiólogos para conservar los microorganismos indefinidamente. Los cultivos de microorganismos se conservan congelados a -70° C o incluso mejor en tanques de nitrógeno líquido a -196° C.

g. Desecación: Es de efecto bacteriostático y las esporas permanecen viables.

FILTRACIÓN: es utilizada para materiales termosensibles.

a. Filtros de profundidad: Se utilizan materiales fibrosos o granulados que forman una capa gruesa con canales de diámetro muy pequeño. La solución es aspirada al vacío y los microorganismos quedan retenidos o son adsorbidos por el material. Se utilizan diatomeas, porcelana no vidriada, asbestos.

b. Filtros de membrana: Son circulares con un grosor de 0.1 mm y con poros muy pequeños, de unos 2 μm por lo que los microorganismos no pueden atravesarlo.

Se fabrican de acetato de celulosa, policarbonato, fluoruro de polivinilo u otros materiales sintéticos.

RADIACIÓN:

a. Ultravioleta: Es letal para todas las clases de microorganismos por su longitud de onda corta y su alta energía. Es letal a 260 nm ya que es la longitud de onda que es más efectivamente absorbida por el ADN.

El mecanismo primario del daño al ADN es la formación de dímeros de timina lo que inhibe su función y replicación. Son escasamente penetrantes y se utilizan para superficies.

b. Ionizante: Niveles bajos pueden producir mutaciones e indirectamente resultar en la muerte, niveles altos son letales. Específicamente causan una serie de cambios en las células: ruptura de puentes de hidrógeno, oxidación de dobles enlaces, destrucción de anillos, polimerización de algunas moléculas, generación de radicales libres.

La mayor causa de muerte es la destrucción del ADN. Es excelente esterilizante y con penetración profunda en distintos materiales, por lo que se utilizan para esterilizar materiales termolábiles (termosensibles) como jeringas desechables, sondas, etc.

No se utilizan para medios de cultivo o soluciones proteicas porque producen alteraciones de los componentes.

APLICACIÓN DE ALTAS TEMPERATURAS PARA LA DESTRUCCION DE MICROORGANISMOS.-

La relación letal del calor es, como hemos visto, una relación de temperatura y tiempo afectada por muchas condiciones que se deben recordar al seleccionar el tiempo y la temperatura requeridas para reducir la población microbiana al nivel deseado. Los procedimientos prácticos en los que se emplea el calor se dividen convenientemente en dos categorías: calor húmedo y calor seco.

CALOR HUMEDO:

-Vapor a presión.-

El calor en la forma de vapor a saturación y a presión, es el agente más práctico y confiable para esterilizar. El vapor a presión proporciona temperaturas superiores a las que se obtienen por la ebullición. Además tiene varias ventajas el calentamiento rápido, penetración y humedad en abundancia, que facilitan la coagulación de las proteínas.

El aparato de laboratorio diseñado para usar vapor a presión regulada se llama autoclave.escencialmente es una cámara de vapor de doble pared equipada con dispositivos que permiten que la cámara se llene a saturación de vapor y se mantenga a la temperatura y presión deseada durante cualquier periodo.

Al manejar el autoclave es esencial que el aire d la cámara sea reemplazado completamente por vapor. Si queda aire dentro la temperatura en la cámara se reducirá mucho más que solo si hubiese vapor de la misma presión .no es la presión lo que mata a los microorganismos sin o la temperatura elevada de vapor.

El autoclave es una pieza indispensable en todo laboratorio de microbiología. Muchos medios de cultivo, diluciones (cantidades de agua medida en tubos de ensayo o matraces), soluciones y cultivos descartados se esterilizan rutinariamente con este aparato. Muchas veces, aunque no siempre, el autoclave se opera a una presión de 15 lb/pulgada cuadrada aproximadamente (121grados centígrados).el tiempo para alcanzar la esterilización dependerá de la naturaleza del material por esterilizar, el tipo de recipiente y el volumen. Así los tubos de cultivos liquidos se pueden esterilizar en 10 a 15 minutos a 121 grados centígrados; el mismo medio en cantidades

RADIACIONES.-

La energía se transmite a través del espacio en gran variedad de formas, generalmente llamadas radiaciones. Para nuestros propósitos, la más significativa es probablemente la radiación electromagnética, de la cual luz es un ejemplo. Las radiaciones electromagnéticas tienen la doble propiedad del fenómeno de ondas continuas y el fenómeno de partículas discontinuas; las partículas son paquetes, o quanta, de energía, algunas veces llamado fotones, que vibran a frecuencias diferentes. Las radiaciones de frecuencia determinada pueden describirse también por su longitud de onda, alfa; si alfa se mide en angstroms, donde 10,000 A = 1 um,la energía de la radiación es dada por 12350/alfa ev.Las radiaciones electromagnéticas pueden tener interacción en la materia en uno o dos sentidos en general.

Los rayos gamma y los rayos x, que tiene energía de más de 10Ev,se llaman radiaciones ionizantes porque tienen suficiente energía para empujar los electrones fuera de las moléculas y ionozarlos.Cuando estas radiaciones pasan a través de las células, se produce hidrogeno libre, radicales hidroxilos y algunos peróxidos que a su vez producen diferente tipo de daño,intracelular.Ademas como el daño recae en una gran variedad de materiales, las radiaciones ionizantes son poco especificas en sus efectos.

Las menos energéticas particularmente la luz ultravioleta, no se ionizan,si no que son absorbidas en forma específica por diferentes compuestos porque existan electrones y los elevan a niveles mayores de energía, así crean diferentes especies químicas que puedan ajustar en gran variedad de reacciones químicas imposible para moléculas no excitadas.

Además de las radiaciones electromagnéticas, los microorganismos se pueden someter a radiaciones acústicas(ondas de sonido) y a partículas subatómicas, como las que se desprenden al aminorar la radiactividad. La era atómica nos ha prevenido del daño que pueden producir las radiaciones y por ello se han hecho entonces enormes gastos para sufragar investigaciones dirigidas a determinar las dosis mínima de radiaciones que afectan a las células, como las perjudica y como se puede prevenir tal daño. Se han usado microorganismos para la mayor parte de estas investigaciones por las mismas razones que se usan en tantas otras áreas de investigación biológica básica; son fáciles de desarrollar y ayudan a realizar experimentaciones rápidas y eficientes.

Además de las investigaciones fundamentales, en microbiología radiactiva se han desarrollado muchas aplicaciones de las radiaciones ionizantes para esterilizar materiales biológicos. A este se le denomina esterilización fría porque las radiaciones ionizantes producen relativamente poco calor en el material que se irradia. Así mediante estos métodos es posible esterilizar sustancias sensibles al calor y tales procedimientos se han desarrollado en las industrias farmacéuticas y de alimentos.

Luz Ultravioleta:

La porción ultravioleta del espectro incluye todas las radiaciones desde 150 a 3900 A. Las longitudes de onda alrededor de 2650 A., tienen mayor eficacia como bactericidas .Aunque la energía radiante de la luz del sol está parcialmente compuesta por la luz ultravioleta, la mayoría de las longitudes de onda cortas de este tipo son filtradas por la atmosfera terrestre (ozono, nubes y humo).En consecuencia, las radiaciones ultravioletas en la superficie de la tierra están restringidas a una amplitud de 2870 a 3900 A. De esto podemos concluir que la luz del sol, bajo ciertas condiciones tiene capacidad microbiana, pero de un grado limitado.

Se pueden obtener muchas lámparas que emiten concentraciones elevadas de luz ultravioleta en su región más efectiva 2600 a 2700 A., estas lámparas germicidas se usan profusamente para reducir la población microbiana en, por ejemplo quirófanos cuartos de llenado asépticos en la industria farmacéutica, donde tienen que `pipetear productos estériles para ponerlos en pequeños recipientes o ampolletas así como en la industria de alimentos y leche para tratar superficies contaminadas.

Una consideración práctica e importante en el uso de estos métodos para destruir microorganismos es que la luz ultravioleta tiene muy poca capacidad para penetrar la materia. Aun una pequeña capa de filtro de vidrio quita gran cantidad de luz. Así solo los microorganismos que se encuentran en la superficie de los objetos que se exponen directamente a la luz ultravioleta son susceptibles de ser destruidos.

Mecanismos de acción:

LA luz ultravioleta es absorbida por muchos materiales celulares pero más por los ácidos nucleicos, a los cuales causa gran daño. La absorción y las reacciones subsecuentes se efectúan predominantemente en las piriminidas de los ácidos nucleicos.Un a alteración importante es la formación de un dímero de la pirimidina en la cual dos piramiditas adyacentes se enlazan .A menos que los dímeros sean separados por enzimas intracelulares específicas, se inhibe la replicación del dna y puede a ver mutaciones.

Fotoreacctivacion:

Si se expone una suspensión de bacteria a la luz ultravioleta durante varios minutos, solo una pequeña porción será capas de formar colonias en un medio nutritivo y estas son al parecer, las viables. Sin embargo es una muestras de las células irradiadas se expone a la luz visible durante varios minutos, el número de sobrevivientes en esta muestra será mucho mayor que si estas bacterias hubieran sido expuestas a la luz ultravioleta por un tiempo más corto. Así el número de las células que aparentemente fueron dañadas han sido foto reactivadas por la exposición a la luz visble.La foto reactivación nunca llega al total de eficiencia, no todas las células se recuperan. La foto reactivación se efectúa por una enzima luz dependiente que reconoce los dímeros timina en el DNA y se une a estos de manera que se puede restablecer la estructura normal del DNA

Algunos microorganismos poseen un segundo mecanismo para reparar el daño producido en el DNA por las radiaciones ultravioleta. Este mecanismo no es luz-dependiente y necesita una secuencia de reacciones enzimáticas. Dos enzimas, una endonucleasa dímero específica, sujetan a los dímeros con varios de los nucleótidos vecinos. La pieza omitida de la cadena del DNA como resultado de la excision,se repara por la inserción enzimática de nucleótidos complementarios al cordón bueno. Dos enzimas realizan esto: un DNA polimerasa sintetiza el segmento necesario y un DNA ligasa reestablece su localización en el cordón.

Rayos x (rayos roentgen):

Los rayos x son letales para los microorganismos y formas superiores de vida. Al contrario de las radiaciones ultravioletas, los rayos x tienen considerable energía y capacidad de penetración .Sin embargo no son prácticos para el control de poblaciones microbianas porque:

-Cuesta mucho producirlos en cantidades suficientes.

-Son difíciles de utilizar eficientemente, ya que las radiaciones, sale en todas direcciones a partir del punto de origen. Aun así los rayos x sean empleado mucho en experimentos para producir mutantes microbianas.

Rayos gamma:

Las radiaciones gamma tienen mucha energía y son emitida por ciertos isotopos reactivos como Co.A raíz de gran cantidad de programas de investigación con energía atómica, se han obtenido grandes cantidades de isotopos radiactivos como

Sub productos de la fisión atómica los cuales son fuentes potenciales de radiaciones gamma. Estos rayos gamma son similares a los x pero tienen longitud de onda más corta, gran capacidad de penetración en la materia y son letales para todas las formas de vida, incluso los microorganismos.

Debido a su gran poder de penetración y efecto microbicida, los rayos gamma resultan cómodos para usarlo en la esterilización de materiales de considerable grosor o volumen, como alimentos empacados. Sin embargo se tienen que resolver ciertos problemas técnicos para poder usarlos en aplicaciones prácticas, por ejemplo el desarrollo de una fuente de una fuente de radiaciones para a uso a gran escala o el diseño de equipos que eliminen cualquier posibilidad que afecte al operador.

Los resultados de los estudios realizados sobre el efecto de las radiaciones ionizante en las células ha dado origen a la teoría de acción de “tiro al blanco” sobre ciertas sustancias de la célula bacteriana, a las cuales producen ionización que trae como resultado la muerte celular.

Rayos catódicos (radiación con haz de electrones):

Cuando se establece un potencial de voltaje elevado entre el cátodo y el ánodo en un tubo al vacío, el cátodo emite rayos de electrones, llamados rayos catódicos o haz de electrones. Se han diseñado equipos especiales para producir electrones de gran intensidad (millones de voltios)y estos electrones se han acelerado a velocidades extremas. Estos haces de electrones acelerados a esas velocidades son microbicidas, e incluso producen otros efectos en los materiales biológicos o de otros tipos.

El acelerador de electrones, que es un tipo de equipo que produce el haz de electrones a alto voltaje, se usa actualmente para esterilizar material quirúrgico, drogas y otros materiales. Una de las aplicaciones que tiene este procedimiento y la cual es única, es que el material se puede esterilizar después de empacado (las radiaciones penetran la envolturas)y a la temperatura ambiente. Las radiaciones del haz de electrones tienen poder de penetración limitado dentro de sus límites se logra la esterilización al cabo de exposiciones muy breves.

OTRAS FUERZAS FISICAS EN EL CONTROL DE LOS MICROORGANISMOS

Electricidad:

Se han investigado las corrientes eléctricas de altas y bajas frecuencia como medios para destruir microorganismos.El paso de corriente eléctrica a través de líquidos que contengan bacterias mata a un porcentaje de estas. La causa de la muerte se puede atribuir:

-alza de la temperatura producida por la corriente.

-Cambios químicos iniciados por la corriente, como la producción de cloro y ozono en cantidades muy pequeñas. La aplicación de la corriente eléctrica como agente practico para destruir microorganismos es limitada, aunque se han diseñado equipos que se usan para pasterizar leche, jugo de fruta y desinfectar agua.

Tensión superficial:

La entrecara o lindero, entre un líquido y un gas se caracterizan por las fuerzas desequilibradas de atracción entre las moléculas de la superficie del líquido y las del interior. Las moléculas en la entrecara de la superficie del líquido aire es arrastrada fuertemente hacia el interior por las moléculas que están debajo, mientras que las que están en el interior del líquido son atraídas uniformemente hacia todas las direcciones. Este comportamiento de las fuerzas de las fuerzas moleculares en la entrecara aire líquido le imparte una característica distintiva a la superficie del líquido conocida como tensión superficial. Este se puede comprobar poniendo sobre la superficie el agua de un vaso una aguja de acero limpia y seca, la cual flotara aunque el acero es más pesado que el agua lo que se puede explicar por el hecho de que las moléculas de la superficie están sometidas a fuerzas de atracción y producen una “película” bastante fuerte para soportar un objeto como la aguja. Si esta se pone en el agua en ángulo, se hundirá porque la película ha sido perforada. Las fuerzas superficiales también existen entre dos líquidos que no se mezclan y en la entrecara entre un sólido y un líquido. Aquí nos referimos a la tensión interfacial.

Estas fuerzas, la tensión superficial y la tensión interfacial, están íntimamente asociadas con los procesos de la vida de las células. Por ejemplo, una célula bacteriana que se está desarrollando en un medio debe ser capaz de acumular sustancias alimenticias en su superficie para asimilarlas. Los productos de desecho deben ser eliminados de la célula y arrojados lejos.

Así el desarrollo y los procedimientos de la división celular son indudablemente influidos, en parte por las fuerzas superficiales en los medios de cultivo.

Las sustancias de alta concentración que tienen efectos depresores de la tensión superficial, ejercen efectos dañinos sobre los microoganismos.Se sabe que los jabones, sales biliares y fenoles, asi como todos los depresores de la tensión superficial, tienen efectos adversos sobre las bacterias. De la incorporación de compuestos de tipo en los medios de cultivo resulta una gran variedad de respuestas que pueden alterar los procesos normales de la división celular, desarrollo, e incluso supervivencia. La acción de los desinfectantes se incrementa también por los depresores de la tensión superficial.

Filtración:

Algunos materiales particularmente los liquidos biológicos como el suero de los animales o las soluciones de sustancias como las enzimas y algunas vitaminas o antibióticos,son termolábiles,o sea se destruyen por el calor.Asimismo otros agentes físicos como las radiaciones son perjudiciales para estos materiales e imparacticos para esterlizarlos.En consecuiencia queda la opsion de filtración .

Filtros bacteriológicos.-