CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT-

SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT-

FONDO PARA EL DESARROLLO CIENTÍFICO Y TECNOLÓGICO –FODECYT-

UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACIA

INFORME FINAL

EVALUACIÓN DE FOCOS POTENCIALES DE PARAGONIMIASIS Y

DETERMINACIÓN MEDIANTE TÉCNICA MOLECULAR DE LA ESPECIE DE

PARAGONIMUS PRESENTE EN LOS DEPARTAMENTOS DEL ÁREA SUR DE

GUATEMALA.

PROYECTO FODECYT No. 63-2009

ANTONIETA RODAS RETANA

Investigadora Principal

GUATEMALA, AGOSTO DEL 2012.

AGRADECIMIENTOS:

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro

del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La

Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología –SENACYT- y al Consejo Nacional

de Ciencia y Tecnología –CONCYT-.

OTROS AGRADECIMIENTOS

La investigadora principal quiere agradecer a los investigadores que participaron como

equipo de trabajo del proyecto, los cuales fueron: Patricia Landaverde, Carlos

Montenegro, Vivian Monzón y Raquel Lima. Así mismo agradece, por el apoyo

financiero, a la Secretaria Nacional de Ciencia y Tecnología y al Consejo Nacional de

Ciencia y Tecnología, por su confianza en la investigación y sobre todo en nuestro

equipo. Queremos agradecer al Laboratorio de Entomología Aplicada y Parasitología y

a la Escuela de Biología por su apoyo en la realización del proyecto tanto en

instalaciones, equipo y material como en asesoría y orientación, en especial a la Ph. D.

Carlota Monroy. Además agradecer al equipo del Laboratorio por su apoyo en el

desarrollo de la investigación. A la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la

Universidad de San Carlos de Guatemala por ser nuestro respaldo legal, en especial al

Ph. D. Oscar Cóbar.

El equipo de investigación, también, desea agradecer al Lic. Ghandi Ponce, Srita.

Ivonne Gómez y Lic Mauricio García. Personal de la Sección de Entomología, en su

asesoría para la parte molecular, estadística y logística del proyecto, además al Sr Carlos

Ramos por su valiosa colaboración en el Campo

Y a las personas que consulten este documento y les sea de utilidad.

INDICE DE CONTENIDOS

RESUMEN i

SUMMARY (ABSTRACT) ii

PARTE I 01

I.1 INTRODUCCIÓN 01

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 03

I.2.1 Antecedentes en Guatemala 03

I.2.2 Justificación del Trabajo de Investigación 04

I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS 06

I.3.1 Objetivos 06

I.3.1.1 General 06

I.3.1.2 Específicos 06

I.3.2 Hipótesis 06

I.4 METODOLOGÍA 07

I.4.1 Localización 07

I.4.2 Variables 08

I.4.2.1 Variables dependientes 08

I.4.2.2 Variables independientes 08

I.4.3 Indicadores 08

I.4.4 Estrategia Metodológica 08

I.4.4.1 Población y Muestra 08

I.4.4.2 Unidades Muestrales 09

I.4.4.3 Unidades Experimentales 09

I.4.5 El Método 09

I.4.5.1 Colecta de cangrejos en los sitios de estudio 09

I.4.5.2 Búsqueda de Paragonimus y toma de datos de los

Hospederos intermediarios 09

I.4.5.3. Determinación de las especies de Paragonimus

presentes en las muestras colectadas 10

I.4.5.4 Extracción de ADN 10

I.4.5.5 Amplificación de ADN 11

I.4.5.5.1 Genoma mitocondrial 11

I.4.5.6 Visualización de las bandas 12

I.4.5.7 Purificación del ADN 12

I.4.5.8 Secuenciación 12

I.4.5.9 Análisis de Secuencias 12

I.4.5.10 Evaluación de coliformes 13

I.4.6 La Técnica Estadística 13

I.4.7 Los Instrumentos utilizados 13

PARTE II 14

MARCO TEÓRICO (CONCEPTUAL) 14

II.1 Paragonimus 14

II.1.1 Clasificación 14

II.1.2 Ciclo de vida de Paragonimus sp 14

II.2 Paragonimiasis 20

II.2.1 Patogenia y Fisiopatología 21

II.2.2 Manifestaciones Clínicas 21

II.2.3 Diagnostico 22

II.2.4 Epidemiología 25

II.2.5 Tratamiento 26

II.3 Control 26

II.4 Técnica molecular 27

II.4.1Identificación genética 27

II.4.2 Técnica de la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 28

II.4.3 ADN mitocondrial 29

II.5 Enfermedades olvidadas 29

II.6 Factores Físicos y Químicos del Agua 30

II.6.1 Potencial de Hidrogeno (PH) 30

II.6.2 Dureza 30

II.6.3 Alcalinidad 31

II.6.4 Conductividad 31

II.6.5 Sólidos 31

II.6.6 Turbidez 32

PARTE III 33

III.1 RESULTADOS 33

III.1.1 Estadísticos 33

III.1.1.1 Regresión múltiple lineal 33

III.1.2 Estadísticos genéticos 33

III.1.2.1 Polimorfismos genéticos 33

III.1.2.2 Recombinación 33

III.1.2.3 Test de neutralidad 34

III.1.2.4 Haplotipos 34

III.1.2.5 Flujo génico y coeficiente de diferenciación 35

III.1.3 Análisis filogenéticos 36

III.1.4 Análisis de los Resultados de la Muestra de Agua 37

III.2 DISCUCIÓN DE RESULTADOS 39

III.2.1 Estadísticos Genéticos 39

III.2.1.1 Polimorfismo Genético 39

III.2.1.2 Recombinación 39

III.2.1.3 Test de Neutralidad 39

III.2.1.4 Haplotipos 39

III.2.1.5 Flujo génico y coeficiente de diferenciación 39

III.2.2 Relaciones Filogenéticas 40

III.2.3 Distribución 40

III.2.4 Estadísticos 40

III.2.5 Características Físicas y Químicas del Agua de los sitios

de Colecta 40

PARTE IV 41

IV.1 CONCLUSIONES 41

IV.2 RECOMENDACIONES 43

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 44

IV.4 ANEXOS 48

PARTE V 57

V.1 INFORME FINANCIERO 57

LISTA DE FIGURAS

Nombre de figuras Pag.

Figura 1: Ciclo de vida del Parasito Paragonimus sp. 15

Figura 2: Huevos de Paragonimus sp. Biopsia pulmonar de paciente. Tinción

H&E.

16

Figura 3: Huevo con opérculo bien definido 17

Figura 4: Imagen del estadío de Miracidio de Paragonimus sp. 17

Figura 5: Imagen del estadío de Cercaria de Paragonimus sp. 18

Figura 6: Fotografía del estadío Metacercaria de Paragonimus sp. tomada en el

laboratorio del LENAP. Crédito: Vivian Monzón.

18

Figura 7: Fotografía del crustáceo (hospedero intermediario) colectado en el

proyecto. Crédito: Raquel Lima.

19

Figura 8: Fotografía de Paragonimus mexicanus, identificado mediante técnica

molecular. Crédito: Vivian Monzón.

21

Figura 9: Enquistamiento pulmonar de Paragonimus sp. observado en

radiografía

23

Figura 10: Pulmón de Zarigüeya (Didelphis virginiana), infectado

naturalmente con Paragonimus mexicanus. Se observan múltiples granulomas

en los lóbulos caudales, de tamaños y pesos variables, con pared delgada, color

blanco-grisáceo y consistencia blanda.

24

Figura 11: Fotografía del material y reactivos de PCR, utilizados dentro del

proyecto. Crédito: Raquel Lima.

28

Figura 12. Árbol consenso de Máxima versosimilitud y Máxima parsimonia,

mostrando los valores de soporte de Boostrap.

36

Figura 13: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de Escuintla de

Guatemala.

49

Figura 14: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de Jutiapa de

Guatemala

50

Figura 15: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de Retalhuleu de

Guatemala.

50

Figura 16: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de San Marcos de

Guatemala.

51

Figura 17: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de Santa Rosa de

Guatemala.

51

Figura 18: Mapa de los sitios de muestreo positivos del departamento de Santa

Rosa de Guatemala.

52

Figura 19: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de Suchitepéquez

de Guatemala.

52

Figura 20: Mapa general de los sitios de muestreo. 54

Figuras 21 y 22: Colecta de cangrejos en los ríos de los sitios de muestreo y

hospedero intermediario colectado. Créditos: Patricia Landaverde y Carlos

Montenegro.

55

Figuras 23 y 24: Toma de datos de los cangrejos colectaos y búsqueda del

Paragonimus en los hospederos intermediarios. Créditos: Vivian Monzón y

Raquel Lima.

55

Figura 25: Fotografía de una metacercaria de Paragonimus mexicanus,

extraída de los cangrejos colectados. Crédito: Vivian Monzón

56

Figura 26: Sitio de muestreo que presenta las condiciones ideales para la

presencia de cangrejos con posibilidad de infección con Paragonimus

mexicanus. Crédito: Patricia Landaverde.

56

LISTA DE TABLAS

Número y nombre de tabla Pag.

Tabla 1. Cebadores para amplificación del fragmento del citocromo b 11

Tabla 2: Clasificación de Paragonimus sp. 14

Tabla 3: Distintos tipos de aguas 31

Tabla 4: Regresión múltiple lineal para la presencia de Paragimus en cangrejos

de la costa sur de Guatemala. (p = 0.001724)

33

Tabla 5. Haplotipos encontrados para los individuos dentro de las poblaciones

de Paragonimus mexicanus de Guatemala y Ecuador. En negro se observan los

haplotipos encontrados en el presente estudio

34

Tabla 6. Valores de diferenciación genética, mostrando el grado de

diferenciación genetica entre los grupos. P.mexicanus-GuateR1; representa a

las poblaciones de P. mexicanus encontradas en el trabajo de campo del

presente estudio. P.mexicanus-GuateR2; representa a las poblaciones de P.

mexicanus encontradas en el estudio del 2003. P.mexicanus Ecuador;

representa a las poblaciones del 2003 obtenidas en Ecuador.

35

Tabla 7. Indices de diferenciacion globales para todos los grupos analizados de

Paragonimus mexicanus . Se excluyen las especies P. bangkokensis y P.

westermani.

36

Tabla 8. Promedio de los resultados del análisis microbiológico del agua en los

6 departamentos.

37

Tabla 9. Listado de los puntos de colecta realizados durante la investigación. 53

i

RESUMEN

La paragonimiasis es una enfermedad parasitaria causada por la duela Paragonimus y es

transmitida por el consumo del hospedero intermediario (cangrejos) crudo o mal cocido

La enfermedad puede llegar a afectar diversos sistemas de órganos que pueden ir desde

el sistema pulmonar hasta el sistema nervioso La enfermedad suele ser de difícil

diagnóstico ya que suele confundirse con tuberculosis o Histoplasmosis debido a que

presentan la misma sintomatología. Otro problema lo constituye el hecho de que incluso

el 20% de pacientes con paragonimiasis presenta radiografías de tórax El hospedero

final del parasito suele ser el humano, un mamífero silvestre o mamíferos domésticos

como perros, gatos, hámsters y cerdos, los cuales suelen ser vulnerables a contraer esta

enfermedad En Guatemala se conoció el primer caso de paragonimiasis en el año de

1945, encontrándose en pulmones de zorrillo y zarigüeya en la localidad de Cuilapa,

Santa Rosa. En el año 1986, se detectó el primer caso humano en un paciente que refirió

haber consumido cangrejos crudos en el área del Playón del río Los Esclavos, Santa

Rosa. Durante el año 1994 se evaluó la quebrada de San José en Cuilapa y el río San

Diego en Escuintla donde se encontró el parásito en los hospederos intermediarios;

cangrejos de río. Los parásitos encontrados se identificaron como Paragonimus

mexicanus .

Por esta razón investigamos en los 6 departamentos de la zona sur de Guatemala para

determinar el avance del parásito, pero para esto tuvimos que realizar numerosos

muestreos donde colectamos diferente numero de cangrejos ya que en los

departamentos de Escuintla, Suchitepequez Retalhuleu y San Marcos el numero de

cangrejos fue muy bajo ya que el pesticida con el que se rocía a la caña está afectando la

población de larva de cangrejos y sumado a eso el impacto humano, razón por la cual el

numero de cangrejos es significativamente menor comparado con la de los otros dos

departamentos Posterior a la colecta fueron evaluados en el laboratorio para verificar

en ellos la presencia de Paragonimus sp. Al constatar la presencia , fueron evaluados

molecularmente.

Los resultados obtenidos fueron satisfactorios ya que pudimos observar que el avance

de la presencia del parásito ha sido poco en relación con los años transcurridos desde el

último muestreo pero con relación a la abundancia de la infestación en dos ríos

podemos decir que el 100% de los cangrejos muestreados están infectados por lo que la

población circundante podemos decir que esta en un alto riesgo de contagio.

Adicionalmente la evaluación de las muestras de agua realizadas en cada río están

relacionadas proporcionalmente con la presencia y abundancia de cangrejos y a la vez

del parásito

Palabras claves: Paragonimus sp. Paragonimus mexicanus, paragonimus.

ii

ABSTRACT

Paragonimiasis is a parasitic disease caused by lung fluke Paragonimus, and the

transmission is caused by consumption of the intermediate host (crabs) raw or

undercooked. The disease can affect various organ systems that can range from the

pulmonary system to the nervous system. The disease is often difficult to diagnose

because it can be confused with tuberculosis or histoplasmosis, because they exhibit the

same symptoms. The final host of the parasite is usually human or mammals, wild or

domestic such as dogs, cats, hamsters and pigs, which are often vulnerable to this

disease. In Guatemala, the first known case of paragonimiasis was reported in the year

1945, found in the lungs of skunk and opossum in the town of Cuilapa, Santa Rosa. In

1986, was detected the first human case in a patient who reported having consumed raw

crabs in the area of Playon Río de los Esclavos, Santa Rosa. During 1994 was assessed

the San Jose creek and river Cuilapa San Diego in Escuintla where the parasite was

found in intermediate hosts, crabs. The parasites found were identified as Paragonimus

mexicanus.

For this reason we investigated in 6 departments of the south of Guatemala to

determine the progress of the parasite, but for this we had to make numerous samples.

Different numbers of crabs where collected in the departments of Escuintla,

Suchitepequez, Retalhuleu and San Marcos. In this places the number of crabs was very

low due to the pesticide that is sprayed into the cane plantations. This affect the

population of larvae crabs and added to that is the human impact, which is why the

number of crabs is significantly smaller than those of the other two departments. After

the collection the crabs were evaluated in the laboratory to verify the presence of

Paragonimus sp. If it was present the parasite, we proceed to the molecular evaluation.

The results were satisfactory because we observed that the advance of the parasite has

diminished in relation to the years since the last sampling. In relation to the abundance

of infestation in two rivers we can say that 100% of crabs sampled are infected with the

surrounding population that we can say that is a high risk of infection. Further

evaluation of the water samples taken at each river are proportionally related to the

presence and abundance of crabs and simultaneously to the parasite

Key Words: Paragonimus sp. Paragonimus mexicanus, paragonimus.

1

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN

La paragonimiasis en una enfermedad causada por un trematodo del género

Paragonimus que es causante de una enfermedad principalmente zoonotica, pero se han

identificado ocho especies de Paragonimus en el ser humano, el que actúa como

hospedero final. La distribución del género Paragonimus se encuentra localizado

principalmente en zonas pacífico costeras de Asia, África y América (Blair, Xu, &

Agatsuma, 1999). Las especies de Paragonimus son altamente evolucionadas, los parásitos

con un ciclo de vida complejo que implica a los caracoles, crustáceos y mamíferos. Las formas

adultas de especies de Paragonimus residen en los pulmones de una gran variedad de huéspedes

mamíferos, incluyendo seres humanos. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21420222).

La enfermedad es de comienzo gradual y puede evolucionar a una forma crónica. Las

dos formas principales son: la paragonimiasis clásica, que afecta los pulmones, y la

forma no clásica, que origina el síndrome de larva migrans que ocasiona paroxismos de

tos que suelen expulsar esputo sanguinolento y pardo por la presencia de huevecillos de

la especie de Paragonimus. A veces aparecen derrame pleural, neumotorax,

bronquiectasia y fibrosis pulmonar. Los síntomas tienden a ceder después de cinco años,

pero a veces persisten incluso por 20 años (Chen, 1978; Kang et. al., 2000).

Se ha reportado la enfermedad en el Sistema Nervioso Central, peritoneo, pared

intestinal, piel, hígado, bazo, ganglios linfáticos, riñones, ojos, órganos reproductores,

entre otros. A este respecto, de acuerdo a su ubicación, la paragonimiasis extrapulmonar

se ha clasificado en 4 tipos: paragonimosis cerebral, torácica, abdominal y generalizada.

Existen infecciones asintomáticas.

Entre las manifestaciones iniciales de la paragonimosis (fase aguda y de migración) se

encuentran: dolor abdominal cambiante, predominantemente epigástrico, con

irradiación hacia mesogastrio y región lumbar, tos seca, náusea y vómito, fiebre,

urticaria y eosinofilia. La migración pleural puede dar lugar a pleuritis, pericarditis y

mediastinitis agudas o crónicas. El diagnóstico diferencial de la paragonimiasis

pulmonar debe considerar cuadros compatibles con tuberculosis pulmonar, cáncer

pulmonar, hemosiderosis pulmonar, neumonía e histoplasmosis, entre otros, de acuerdo

a las estimaciones de la OMS existen al menos 22 millones de casos.

http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/parasitologia/paragonimosis.ht

ml.

La forma en que el ser humano suele infectarse con Paragonimus es por medio de la

ingesta de cangrejos crudos o mal cocidos infectados con la duela en su fase infectiva

denominada metacercaria. Debido a las costumbres alimenticias de sus habitantes, los

países asiáticos mantienen una constante vigilancia epidemiológica sobre las

infecciones de esta enfermedad. En Guatemala, la transmisión hacia seres humanos se

encuentra más reducida debido a una diferencia en la dieta con las poblaciones asiáticas.

Sin embargo, algunas comunidades guatemaltecas, cuya ubicación se encuentra aledaña

2

a ríos o cuerpos de agua, hacen de su dieta diaria el consumo de cangrejos, pudiendo

llegar a consumir cangrejos infectados con Paragonimus.

Guatemala es un país con un alto índice de enfermedades parasitarias, dentro de las

cuales se puede contar a la Paragonimiasis. Aun así, la enfermedad se considera como

una de las enfermedades olvidadas (descrita así por la OPS), y puede ser fácilmente

confundida con la tuberculosis, por tener una similar sintomatología (WHO, 2007).

A pesar de que existen algunos estudios que han identificado la presencia del parasito,

éstos solo se han realizado en pocas localidades de Guatemala (Rosas, 2000). De ahí

nació la inquietud del desarrollo y ejecución del presente proyecto, donde se pretendió

determinar la presencia de Paragonimus en nuevas comunidades en riesgo y tratar de

determinar la situación actual del parásito en los sitios donde ya ha sido reportada su

presencia. La identificación molecular del parásito también se realizó con el propósito

de comparar los análisis realizados en estudios anteriores, de hace más de diez años, con

el objetivo de verificar si efectivamente la especie identificada en ese entonces, es la

misma especie a la obtenida con este nuevo estudio, y de esta manera determinar la

presencia o no de nuevas especies de Paragonimus en Guatemala.

3

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1 ANTECEDENTES EN GUATEMALA

En 1946, Caballeros descubre Paragonimus sp., en los pulmones de un zorrillo y de un

tacuazín en el municipio de Guazacapán, Santa Rosa y a orillas del río Moca en

Suchitepéquez. Dicho autor los identifica como P. rudis pero posteriores estudios

determinaron que la especie era P. kellicotti (Rosas, 2000).

Aguilar, en 1955, identificó Paragonimus sp., en un tacuazín en el río María Linda

(Rosas, 2000). Peñalonzo et al. en 1986, identifican el primer caso de paragonimiasis en

un paciente procedente del área del río Los Esclavos en Santa Rosa. Al año siguiente,

Cruz realiza un estudio de trematodos en cangrejos en la misma localidad y otra vez se

reporta la presencia de Paragonimus sp. (Cruz, 1987).

Teni & Pinto (1993) demuestra de nuevo la presencia de Paragonimus sp., en la misma

área del río Los Esclavos. En este estudio se reporta el nombre de dos especies de

huéspedes intermediarios, un caracol (Aroapyrgus alleei) y un cangrejo

(Potamocarcinus c.f. guatemalensis). En ese mismo año, se reporta la prevalencia de P.

mexicanus en niños escolares en esta misma área.

Pérez (1994) utiliza el método de diagnóstico ELISA para detectar anticuerpos

específicos de Paragonimus en niños y adultos de dos poblaciones del departamento de

Santa Rosa. En sus resultados reporta la presencia del trematodo en dichas poblaciones.

En 1996, Pinillos realiza un estudio epidemiológico en el departamento de Santa Rosa

para determinar el porcentaje de huéspedes intermediarios infectados con Paragonimus

sp., en Chiquimulilla, Guazacapán y Taxisco. Además de reportar la presencia del

parásito, concluye que existe un alto consumo de cangrejos por parte de los habitantes

de estas áreas.

Rosas (2000) realizó un estudio de Paragonimus mexicanus en cinco afluentes del Río

Los Esclavos en Santa Rosa. En su estudio, colectó cangrejos para determinar la

presencia del parásito y de 312 cangrejos capturados, el 18.59% estuvo infectado.

Además inoculó artificialmente a cinco gatos para describir la sintomatología de la

enfermedad.

Iwagami et. al. (2003), realizaron un estudio filogenético y molecular basado en

secuencias de ADN de metacercarias de Paragonimus mexicanus de Guatemala y

Ecuador. Con el estudio se concluye que las especies de Paragonimus mexicanus, de

Guatemala y Ecuador, están genéticamente diferenciados probablemente al nivel de

subespecie.

4

I.2.2 JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

Más de 40 especies han sido descritas en el género Paragonimus., dichas especies han

sido reportadas en Asia, América y África. Infecciones humanas han ocurrido debido a

varias especies del género en distintas partes del mundo. Se ha estimado que más de 21

millones de personas alrededor del mundo se encuentran infectadas con éste parasito.

(Toscano et. al., 1995).

La paragonimiasis se encuentra dentro del grupo de las enfermedades olvidadas, este

hecho no hace que deje de ser importante ya que la presencia de este parásito afecta

tanto a la salud como a la economía de las comunidades. Para dicha economía

representa pérdidas, ya que debido a la sintomatología (fatiga, debilitamiento, pérdida

de peso, etc.) se produce un descenso considerable en la productividad humana. Las

poblaciones de bajos recursos son las que se encuentran más vulnerables a adquirir la

enfermedad; sin embargo, las poblaciones con un nivel de ingresos más alto no están

exentas de adquirir la enfermedad. Las poblaciones de bajos recursos, que habitan en

áreas aledañas a ríos o afluentes, son las más vulnerables ya que hacen del cangrejo o

camarón parte de su dieta cotidiana debido a que representa un costo bajo o nulo,

adquiriéndolo directamente de los ríos.

Además de afectar severamente la salud humana, Paragonimus puede llegar a afectar a

animales domésticos como cerdos, que si no son cocinados correctamente puede

constituir otro mecanismo de transmisión hacia el ser humano. Aparte de ser otro

mecanismo de transmisión, el hecho de estar infectados con el parásito puede hacer que

los animales no se desarrollen correctamente y morir antes de poder ser consumidos,

reduciendo de esta manera la alimentación disponible de las comunidades (Blair, Xu &

Agatsuma, 1999).

Los estudios realizados sobre el parásito y la enfermedad, se han llevado a cabo en

pocas partes del país (Tongu et. al., 1995; Rosas, 2000; Teni & Pinto, 1993). Por la falta

de información en la distribución del parásito, la enfermedad se puede diagnosticar

erróneamente como tuberculosis, generando un gasto extra al tratarla de manera

incorrecta. Es por ello que la información actualizada de la presencia de Paragonimus

en cangrejos consumidos por algunas comunidades puede ayudar a establecer nuevas

zonas de riesgo. Se debe tomar en cuenta el hecho de que la enfermedad no se encuentra

erradicada del país y aún puede generar problemas de salud en distintas comunidades y

gastos extras a entidades gubernamentales como el Ministerio de Salud. La información

de este estudio ofrecerá datos importantes sobre algunas áreas de distribución que

servirán para incrementar el conocimiento acerca de Paragonimus y para realizar

estudios comparativos.

Adicionalmente, es importante recalcar el hecho de que en los estudios anteriormente

desarrollados en el país, a pesar de que se realizaron técnicas moleculares para la

determinación de las especies del parásito, éstas identificaciones y reportes tienen más

de cinco años de haber sido realizados, por lo que nuevas determinaciones moleculares

pueden ratificar los reportes realizados con anterioridad e incluso pueden generar

5

nuevos reportes de distribución en el país. Autoridades como el Ministerio de Salud

pueden utilizar la información generada por este proyecto como una herramienta valiosa

para el combate de esta enfermedad, lo que facilitará la prevención o eliminación de

focos potenciales de paragonimiasis.

6

I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS

I.3.1 Objetivos

I.3.1.1 General

I.3.1.1.1 Evaluar focos potenciales de Paragonimiasis y determinación

mediante técnica molecular de la especie de Paragonimus presente en los

departamentos del área del Sur de Guatemala.

I.3.1.2 Específicos

I.3.1.2.1 Evaluar los posibles focos de Paragonimiasis y determinar

mediante técnica molecular la especie de Paragonimus presente en los

departamentos del área del Sur de Guatemala.

I.3.1.2.2 Determinar y evaluar la presencia de Paragonimus en ríos de los

departamentos de Jutiapa, Santa Rosa, Escuintla, Suchitepéquez,

Retalhuleu y San Marcos, durante el transcurso del año.

I.3.1.2.3 Determinar y evaluar la especie de Paragonimus presente en

hospederos intermediarios del área sur de Guatemala, utilizando ADN

mitocondrial.

I.3.1.2.4 Localizar y evaluar nuevas zonas de riesgo para la transmisión

de dicha enfermedad.

I.3.1.2.5 Realizar análisis microbiológicos (coliformes totales y fecales),

en los sitios de colecta seleccionados.

I.3.1.2.6 Divulgar a las autoridades, actores sociales e instituciones en el

campo de su competencia la información obtenida de la investigación.

I.3.2 Hipótesis

Paragonimus está presente en crustáceos colectados en ríos de áreas donde aún

no ha sido reportado para el país.

7

I.4 METODOLOGIA

I.4.1 Localización

Debido a que está enfermedad está muy asociada a las comunidades cercanas a ríos y

que en su dieta diaria requieren del consumo de cangrejos, se trabajó directamente con

personas que colectan cangrejos para su consumo personal. Se trabajó en los

departamentos de Jutiapa, santa Rosa, Escuintla, Suchitepéquez, Retalhuleu y San

Marcos, y en cada departamento se seleccionó dos comunidades cercanas a ríos, cuya

selección fue a través de la ubicación de los ríos por medio de fotointerpretación

utilizando sistemas de Información Geográfica (SIG), Se hizo de esta manera ya que el

acceso a los ríos a veces es limitado por su geografía, además por seguridad personal.

Las coordenadas de los sitios de muestreo fueron las siguientes:

Para el departamento de Jutiapa:

Jutiapa Amayito N 14°17´03.92" O 89° 56´58.55" 929 msnm

Jutiapa Paz N 14°17´9.21" O 89° 53´35.37" 889 msnm

Jutiapa Ostúa N 14°18´3.46" O 89° 54´22.78" 931 msnm

Jutiapa El salto N 14°17´2.29" O 89° 56´58.64" 928 msnm

Para el departamento de Santa Rosa:

Santa Rosa Usarin N 14°01´39.24" O 90° 25´54.13" 60 msnm

Santa Rosa Chiquimulilla N 14°05´23.98" O 90° 27.54.82" 244 msnm

Santa Rosa Guazacapán N 14°4´4.05" O 90° 24´56.14" 233 msnm

Santa Rosa El Astillero N 14°01´29.91" O 90° 25´22.30" 69 msnm

Santa Rosa Papaturro N 14°14´20.04" O 90° 19´33.65" 557 msnm

Santa Rosa Ixhuatán N 14°14´679" O 90° 15´09.72" 771 msnm

Santa Rosa Ixhuatán 1 N 14°14´679" O 90° 15´09.72" 771 msnm

Santa Rosa Ixhuatán 2 N 14°11´395" O 90° 16´05.98" 1240 msnm

Santa Rosa Maria Linda N 14° 6'53.53" O 90° 38' 24.45" 37 msnm

Para el departamento de Escuintla:

Escuintla El Baúl N 14°22´50.54" O 90° 0´57.03" 549 msnm

Escuintla La Laguneta N 14°17´14.65" O 90° 58´11.84" 290 msnm

Escuintla La Unión N 14°20´34.25" O 91° 3´48.87" 317 msnm

Escuintla Tierra Nueva N 14°15´54.65" O 90° 57´58.09" 239 msnm

Para el departamento de Suchitepéquez:

Suchitepéquez Río Negro N 14°32´43.38" O 91° 33.´35.03" 370 msnm

Suchitepéquez Sis N 14°30'42.85" O 91°34'41.13" 266 msnm

Suchitepéquez

Brazo del Vado

Hondo N 14° 33'10.54" O 91°27'29.60" 462 msnm

Suchitepéquez La Cascada N 14°32'46.81" O 91°34'02.91" 361 msnm

8

Suchitepéquez El Chiflón N 14° 33'40.79" O 91°30'21.94" 491 msnm

Para el departamento de Retalhuleu:

Retalhuleu Yuxiná N 14°32´52.01" O 89° 56´58.55" 275 msnm

Retalhuleu Brazo del Samalá N 14°34´21.23" O 91° 37´54.32" 330 msnm

Retalhuleu Yaxhá N 14°33´52.01" O 91° 40´55.89" 285 msnm

Retalhuleu Los Ajos

N 14° 35'18.52" O 91°35'48.93"

485 msnm

Para el departamento de San Marcos:

San Marcos Naranjo N 14°43´37.56" O 91° 52´24.11" 404 msnm

San Marcos La Isla N 14°44´05.38" O 92° 02´00.87" 80 msnm

San Marcos Nuevo Progreso N 14°47´39.68" O 91° 54´57.56" 594 msnm

San Marcos Los Pocitos N 14°46´41.47" O 91° 56´13.29" 477 msnm

San Marcos La Quebrada N 14°44´33.43" O 92° 02´32.58" 132 msnm

En el anexo 1 se muestra los sitios de muestreo en los ríos de los 6 departamentos del

área sur de Guatemala.

I.4.2. Variables

I.4.2.1. Variables dependientes

Los especímenes de Cangrejos colectados

I.4.2.2 Variables independientes

Los especímenes de Paragonimus obtenidos de los especímenes de

cangrejos

I.4.3. Indicadores

Presencia o ausencia de Paragonimus en hospederos intermediarios (cangrejos) y

Presencia o ausencia de los hospederos intermediarios (cangrejos) en los ríos y análisis

molecular de las especies.

I.4.4. Estrategia Metodológica

I.4.4.1. Población y Muestra

Población: Los hospederos intermediarios.

Muestra: Las metacercarias de Paragonimus.

9

I.4.4.2 Unidades muestrales

Los ríos

I.4.4.3 Unidades experimentales

Los cangrejos

I.4.5 El Método

I.4.5.1 Colecta de cangrejos en los sitios de estudio

Después de la selección de los sitios de muestreo se realizaron colectas casi

mensualmente durante el transcurso de 1 año La colecta se realizara a lo largo de los

ríos, seleccionando 5 puntos de muestreo. En cada punto se colectó a lo largo de

transectos de 10 metros y se espaciaron cada 5 metros. En cada punto de muestreo se

realizó una búsqueda de los hospederos intermediarios, cangrejos de río, durante un

total de 2 horas. La captura de cangrejos se realizó por medio de una colecta manual

buscando bajo las piedras y en agujeros al lado del río donde la tierra aún se encontraba

húmeda y con sombra (anexo 2).

Los puntos de muestreo fueron georreferenciados y se tomaron las muestras de agua

correspondientes a cada río. Por lo que se realizó el respectivo análisis microbiológico

(cantidad de coliformes) para evaluar el estado de conservación de los ríos que se

muestrearon.

Para el análisis de coliformes las muestras de agua se tomaron con envases de agua

pura nuevos (de medio litro) y al llegar al sitio de muestreo se vaciaron y se tomaron las

muestras de agua, se colocarán en la hielera y se trasladaran al laboratorio antes de 24

horas para su análisis.

Los cangrejos colectados se guardaron en recipientes herméticos de plástico con

tapadera, con capacidad máxima de 1 litro de agua, conteniendo hojarasca muy húmeda

para que de esta manera permanecieran vivos el mayor tiempo posible , donde fueron

trasladados al Laboratorio de Entomología Aplicada y Parasitología –LENAP- USAC,

en hieleras, para mantener a los cangrejos y a los trematodos vivos, el mayor tiempo

posible. Al llegar al laboratorio se sacrificaron quitando la caparazón del cangrejo y

sacando el hepatopáncreas.

I.4.5.2 Búsqueda de Paragonimus y toma de datos de los hospederos

intermediarios

En el laboratorio, los cangrejos que se colectaron fueron medidos de largo y ancho de

caparazón, se determinó el sexo y finalmente se le extrajo el hepatopáncreas. Se tomó

una muestra del hepatopáncreas con solución salina u se colocó entre dos portaobjetos

y se observaron al estereoscopio para la búsqueda de trematodos (anexo 3).

10

Cada trematodo que se encontró en la muestra del hepatopáncreas de los cangrejos se

extrajo y guardo en vacuntainer de 5ml en etanol al 95%, con la finalidad de mantener

la muestra como registro y como material disponible para pruebas de ADN.

I.4.5.3. Determinación de la especie de Paragonimus presente en las

muestras colectadas

La fuente de ADN para la identificación taxonómica se extrajo de las metacercarias

provenientes de los cangrejos (anexo 4). Las muestras se analizaron en el Laboratorio

de Entomología Aplicada y Parasitología, de la Escuela de Biología de la Universidad

de San Carlos de Guatemala. En el laboratorio de Biología Molecular del referido

centro de investigaciones, se trabajo todos los aspectos concernientes al trabajo de PCR,

desde la extracción del ADN de interés, la amplificación, la visualización y la

purificación del mismo.

I.4.5.4 Extracción de ADN:

La extracción de ADN de las muestras de metacercarias se realizó mediante el uso de

reactivos comerciales. En este caso, originalmente se iba a utilizar el kit DNeasy Tissue

kit, de QIAGEN. Sin embargo, se utilizó el método tradicional de extracción de ADN,

debido a que con el kit de extracción, no se obtuvo ADN de buena calidad. El

procedimiento que se lleva a cabo para la extracción del material genético se basa en la

lisis del tejido. El protocolo que se seguió para la extracción del material genético de las

muestras se detalla a continuación:

1. Alicuotar 100 µl de Buffer de maceración a un tubo de 1.5 ml. Macerar

completamente el parásito en el tubo con el buffer de maceración con ayuda de un

pistilo.

2. Centrifugar para homogenizar todo en el fondo del tubo.

3. Agregar 14 µl de K-Acetato 8M para obtener una concentración final de 1 M.

Mezclar bien. Después de centrifugar, incubar a 65ºC hasta que la muestra esté

completamente lisada. Se puede quedar incubando toda la noche.

4. Centrifugar por 10 minutos a velocidad máxima en una centrifugadora

refrigerada. Cuidadosamente transferir el sobrenadante. NO TRANSFERIR el

precipitado (descartable)

5. Agregar 200 µl de etanol al 95-100% en frío y mezclar bien. Incubar en hielo por

lo menos 10 minutos. Centrifugar a toda velocidad por 20 minutos en una

centrifugadora refrigerada. Descartar sobrenadante.

6. Enjuagar el pistilo con 100 µl de etanol frío al 70% después en 100 µl de etanol

frío al 95-100%.

11

7. Secar en aire o en una secadora al vacío. Disolver el precipitado en 50 µl de TE

estéril conteniendo 1U de ARNasa. Dejar sobre hielo por lo menos 1 hora.

8. Guardar las muestras en un congelador a -70°C si no se usarán inmediatamente.

(Dorn, 1997)

I.4.5.5. Amplificación de ADN

I.4.5.5.1. Genoma mitocondrial

Decidimos trabajar con el ADNmt debido a que es uno de los marcadores más

ampliamente utilizados para la identificación de especies según Avise (2004) y Mills

(2007). La amplificación de un fragmento del gen del citocromo c subunidad oxidasa 1,

cox 1, del ADNmt se llevará a cabo mediante PCR, técnica que envuelve la síntesis

enzimática in vitro de millones de copias de una secuencia específica de ADN (Pérez-

Sweeney et al., 2003). Para ello se utilizaron cebadores o primers específicos, los cuales

se unen mediante hibridación a regiones conservadas que delimitan las regiones

repetitivas. Se emplearon en este estudio un par de cebadores utilizados por Bowles et

al. (1993), los cuales amplifican para una región específica de aproximadamente 380

pares de bases, para lograr la identificación de las especies de tremátodos. La tabla 2

muestra los cebadores que utilizaremos.

La reacción en cadena de la polimerasa se aplicó siguiendo los protocolos utilizados por

Iwagami et al. (2000, 2003), quienes han trabajado en la identificación de diversas

especies de Paragominus de Asia, incluyendo un trabajo con muestras de Guatemala y

Ecuador, describiendo detalladamente los ciclos para el PCR.

Tabla 1. Cebadores para amplificación del fragmento del citocromo b

Secuencia de los

cebadores

FH5

5´-TTT TTT GGG CAT CCT

GAG GTT TAT-3´

FH3

5´-TAA AGA AAG AAC

ATA ATG AAA ATG-3´

Fuente: Iwagami et al., 2003b

El primer paso para el PCR, fue la preparación de la mezcla maestra, la cual contiene

los cebadores, la enzima polimerasa y el ADN de interés, además de otros reactivos

para mantener en óptimas condiciones la reacción. El siguiente paso es la amplificación

por medio del PCR en un termociclador, con la siguiente secuencia de pasos (Iwagami

et al., 2003b):

Primer paso: 94°C - 1 min.

Segundo paso: 30 ciclos de: 94°C - 1 min.

50°C - 1 min.

72°C - 2 min.

12

Los productos de amplificación o amplicones se almacenarán a 4°C hasta el momento

en que se procedió a la visualización de las bandas amplificadas.

I.4.5.6. Visualización de las bandas:

Después de la amplificación se debe comprobar la presencia de los fragmentos del ADN

de interés en los amplicones. Para ello se utilizaron geles de agarosa. Luego se observó

la banda de ADN obtenida, en un transiluminador a una longitud de onda de luz

Ultravioleta de 256 nanómetros (nm). Este método se lleva a cabo normalmente como

un paso para determinar si la amplificación fue exitosa. Las muestras que salió positiva

(es decir, que si amplificaron bien y por consiguiente se pudo observar su banda en el

gel) son las que se purificaron y posteriormente se enviarron a secuenciar.

I.4.5.7. Purificación del ADN de interés:

Después de haber obtenido el producto del PCR, debe realizarse una purificación del

ADN presente en los amplicones a partir de un kit comercial de purificación de

productos de PCR, el cual utiliza un proceso de purificación por medio de arrastre a

través de columnas. La purificación de ADN fue realizada por la universidad de

Washington a donde fueron enviadas las muestras.

I.4.5.8. Secuenciación:

Los productos obtenidos del ADN mitocondrial se mandaron a secuenciar. Debido a que

el proceso de secuenciación es un proceso muy complicado y extremadamente oneroso

de realizar, los fragmentos amplificados por PCR o amplicones se enviaron a un

laboratorio en la Universidad de Washington especializado en la técnica

I.4.5.9. Análisis de las secuencias

El primer paso después de obtener las secuencias es alinear y editar los fragmentos

mediante el software Clustal, con secuencias especificas de Paragominus (Iwagama et

al., 2000, 2003a y b). Luego, para determinar a qué especie pertenece una secuencia

determinada, la comparamos con secuencias de referencia de especies de Paragonimus,

las cuales están registradas en el GenBank, utilizando el programa BLAST. La

identificación de la especie se logra con el grado de similitud que presenta la secuencia

desconocida, en este caso proveniente de las metacercarias, con una secuencia conocida,

que proviene de la base de datos (Iwagama et al., 2000, 2003a y b).

Para obtener una identificación de especie más confiable y robusta (Farrell et al., 2000),

se calcularon distancias genéticas entre los fragmentos de ADN que provienen de cada

muestra de metacercaria y las secuencias de referencia, mediante el modelo de 2

parámetros de Kimura, utilizando el paquete PAUP versión 4.0 (Swofford, 2000).

Luego, realizamos un análisis cluster del tipo “neighbour joining” con un remuestreo

bootstrap de 1000 repeticiones, utilizando el software RDP Beta 4.13 (recombination

detection program) (Darren et al., 2010).

13

I.4.5.10 Evaluación de Coliformes:

Se recolectó el agua de los ríos como una muestra representativa de este y se envió al

Laboclip antes de 24 horas y fue allí donde se evaluó y en se dieron los diferentes

resultados para cada lugar. Pero sin embargo todas las muestras dieron un resultado de

agua no propicia para el consumo humano.

I.4.6 La Técnica Estadística

Se evaluó las diferencias entre peso y altitud de los cangrejos infectados y no infectados

por medio de una regresión lineal múltiple. Los modelos Lineales múltiples buscan

encontrar la relación entre dos o más variables. Por ejemplo, la relación entre el peso al

nacer con sobrevivencia o fecundidad, relación entre variables ambientales y tamaño

poblacional, etc. En este caso, se aplicó un modelo de regresión lineal múltiple, con el

fin de buscar una relación que explicara presencia de Paragonimus en los cangrejos.

Todo esto se realizó con el paquete estadístico R versión 2.13.0

I.4.7. Instrumentos utilizados.

I.4.7.1 Equipo e instrumentos

Azafates plásticos. Tape

Marcadores permanentes Lápiz.

Libreta de campo. Masking-tape.

Calentador. Bisturí

Pipetas de plástico. Porta objetos

Cámara digital. Cubre Objetos

Claves de identificación. Guantes de Látex

Mayordomo.

Guantes de Nitrilo Vacutainer

Eppendorf Puntas de diferentes medidas

Contenedores plásticos para el transporte de los cangrejos.

Hielera para el transporte de los cangrejos.

I.4.7.2 Cristalería

Erlenmeyers de 100 ml.

Varillas de agitación.

Beackers

14

PARTE II

MARCO TEÓRICO

II.1. Paragonimus sp.

II.1.1 Clasificación:

Tabla 2: Clasificación de Paragonimus sp.

Reino Animal

Subreino Metazoa

Filo Platyhelminthes

Clase Trematoda

Subclase Digenea

Familia Paragonimidae

Subfamilia Troglotreminae

Género Paragonimus

Fuente: Le et. al., 2006.

El taxón Digenea es importante tanto económicamente como médicamente. Los

digeneos son llamados comúnmente duelas y son endoparásitos comunes en

vertebrados. Existen aproximadamente 11,000 especies de digeneos. Su desarrollo es

indirecto y el ciclo biológico incluye por lo menos dos estados infectivos, de ahí su

nombre (dos generaciones). El primer hospedero intermediario es generalmente un

gastrópodo y el segundo hospedero intermediario generalmente es un crustáceo, como

el cangrejo (Ruppert & Barnes, 1996).

Se han reportado múltiples especies de Paragonimus, de las cuáles 9 se han identificado

como patógenas para el humano, más adelante se hace mención detallada de estas. La

validez taxonómica de algunas especies se ha puesto en duda debido a la variación

morfológica en los trematodos adultos (Acha & Szyfres, 2003).

II.1.2 Ciclo de Vida de Paragonimus sp.

En general podemos clasificar a Paragonimus por su especificidad: Decimos que es del

tipo EURIXENO porque es un parásito que no tiene especificidad alguna, ya que se

encuentra en una gran variedad de animales. Además dependiendo el ciclo evolutivo se

puede clasificar también como DIHETEROXENO, ya que requiere de dos hospederos

para completar su ciclo de vida (Llop, Váldes-Dapena, Zuazo; 2001).

El humano es un tipo de hospedero DEFINITIVO para el parasito debido a que este se

encuentra en estadío adulto en humanos. También se puede decir que es un

TRANSMISOR PASIVO, porque el hospedero definitivo (que puede ser humano)

busca al organismo (cangrejo) infectado con el parásito (Paragonimus sp.) (Llop,

Váldes-Dapena, Zuazo; 2001).

15

Figura 1: Ciclo de vida del Parasito Paragonimus sp.

Fuente: Llop, Váldes-Dapena, Zuazo; 2001.

En la figura 1 se visualiza el ciclo de vida del parasito Paragonimus sp. El parásito

adulto habita los bronquiolos de sus hospederos definitivos, en pequeñas cavidades

quísticas, generalmente viven en parejas, encerradas en una capsula fibrosa con

contenido hematopurulento. Es un parásito hermafrodita que mide 8-16 mm x 3-4 mm

de grosor. Es vesiculoso o fusiforme, rosado a pardo-rojizo, parecido a un grano de

café, con un aplanamiento en el sentido dorso-ventral. Tiene una cutícula transparente

provista en toda su extensión de múltiples espinas de forma y tamaños variables,

presenta una ventosa oral y un acetábulo. Posee ciegos intestinales flexuosos y no

ramificados. Los huevos son ovoides, de 85 por 55 µm. Se encuentran en los esputos y

son más o menos frecuentes en las heces fecales. Los adultos generalmente se

16

encuentran dispuestos en pares en cavidades quísitcas del pulmón, abdomen

(mesenterio, hígado, bazo) o el cerebro. Su longevidad es de alrededor de seis años

(Rosas, 2000). Para el caso de Guatemala se han reportado tres especies de

Paragonimus: P. mexicanus, P. westermani y P. kellicotti (Fuentes, 1993; Rosas, 2000).

El huevo y el miracidio son las primeras dos partes del ciclo de vida. Una vez dentro del

huésped final, los huevos (figura 2) llegan al exterior en las heces o el esputo, que en 2

semanas a 2 meses, según la temperatura, deja salir en el agua dulce y se desarrolla la

forma larvaria el miracidio, que al salir del opérculo del huevo (figura 3), en menos de

24 horas, debe encontrar un caracol que le sirva de primer hospedero intermediario, el

cual cuando lo localiza, lo penetra por la cabeza o el tegumento. Bajo la epidermis del

molusco, el miracidio (figura 4) se transforma en esporocisto, que se instala en el

pulmón, se redondea y pierde los cilios, formando la redia, la tercera parte del ciclo, la

cual produce redias hijas que se fijan en el hepatopáncreas del molusco (Llop, Váldes-

Dapena, Zuazo; 2001).

Figura 2: Huevos de Paragonimus sp. Biopsia pulmonar de paciente. Tinción H&E.

Fuente: http://www.gefor.4t.com/parasitologia/paragonimuswestermani.html

17

Figura 3: Huevo con opérculo bien definido.

Fuente: http://www.gefor.4t.com/parasitologia/paragonimuswestermani.html

Figura 4: Imagen del estadío de Miracidio de Paragonimus sp.

Fuente: Vélez, Velásquez & Vélez, 2003.

Luego forma la cercaria (figura 5), la cuarta parte del ciclo y la primera fase infectiva

del parasito. Esta es de es de forma elipsoidal y de corta vida y tiene una minúscula cola

característica en forma de muñón o estilete. Su superficie corporal está recubierta de

finas púas y sus movimientos en el agua se asemejan a un distoma libre, flotando y

serpenteando, buscando determinados camarones y cangrejos. (Rosas, 2000; Le et al.,

2006). Al momento de abandonar el caracol, penetran en el cuerpo del segundo

18

hospedero (un crustáceo) instalándose en los músculos del mismo, dando lugar a la

forma enquistada de metacercaria que se hace infectante a los 40-54 días.

Figura 5: Imagen del estadío de Cercaria de Paragonimus sp.

Fuente: http://158.83.1.40/Buckelew/Paragonimus%20westerman%20cercaria.htm

La metacercaria (figura 6) es la segunda fase infectiva del parásito y la quinta parte del

ciclo. Se instala en el hospedero secundario (el cangrejo) y vive en el hepatopáncreas.

Tiene forma alargada ovoidal y tiene movimiento ameboide. Pueden ser observados

macroscópicamente y pueden sobrevivir alrededor de 72 horas en tejido muerto o tres

semanas en el agua (Soulbsby, 1987).

Cuando este hospedero es consumido por un mamífero (hospedero definitivo), las

metacercarias quedan libres dentro del intestino delgado, lo perforan y caen a la cavidad

abdominal donde 30 días después viajan a la cavidad torácia. Después atraviesan la

pleura y pulmones para instalarse en los bronquiolos, donde se hace adulto. Aquí se

agrupan en pares de vermes y se hacen adultos de 5-6 semanas en cavidades quísticas en

el interior del hospedero y pone huevos que por vía aérea son expulsados al exterior con

los esputos, mientras que los huevos ingeridos salen al exterior por las heces,

recomenzando el ciclo (Aguilar, 1997).

19

Figura 6: Fotografía del estadío Metacercaria de Paragonimus sp. tomada en el

laboratorio del LENAP. Crédito: Vivian Monzón.

Fuente: FODECYT 63-2009

El ciclo de vida de Paragonimus sp., como ya fue mencionado, consta de dos

hospederos intermediarios para completarlo, lo que lo hace un parásito poliheteroxeno.

Los primeros hospederos son caracoles gasterópodos pulmonados de los géneros Brotia,

Pomacea, Semissulcospira, entre otros. Los segundos son cangrejos (figura 7) y

langostinos de río: Astacus, Potamon, Eriochier y Sesarma, entre otros. Los hospederos

finales o definitivos son el hombre, animales domésticos como el gato, cerdo y el perro,

animales silvestres, como la nutria, zorrillo, mapaches, lobos, pizotes y demás

carnívoros (Aguilar, 1997).

Figura 7: Fotografía del crustáceo (hospedero intermediario) colectado en el proyecto.

Crédito: Raquel Lima.

Fuente: FODECYT 63-2009

20

II.2 Paragonimiasis

Enfermedad conocida también como duela pulmonar, diastomiasis pulmonar y

hemotisis endémica o parasitaria. Está distribuida en Asia en los países de Filipinas,

Taiwan, Japón y Norte de China. En América se distribuye en los países de Canadá,

Estados Unidos, Cuba, Brasil, Costa Rica, Ecuador, México, Panamá, Venezuela,

Honduras, Guatemala, Nicaragua. En algunos países se considera endémica, como

Camerún, China, Ecuador, Japón, Perú y República de Corea (OMS, 1993; Aguilar,

1997). Su agente causal es el trematodo del género Paragonimus, para América se han

reportado casos que involucran a las especies P. mexicanus (P. peruvianus), P.

westermani y P. kellicoti (Fuentes, 1993; Heymann, 2004).

En Guatemala, la presencia de Paragonimus se ha comprobado en distintas localidades.

Se reportó en el año 1946, cuando Caballeros identifica por primera vez a Paragonimus

en el río Los Esclavos del municipio de Cuilapa, departamento de Santa Rosa; también

se ha reportado en Guazacapán (Santa Rosa), río Moca (Suchitepéquez, Sololá), río

María Linda (Santa Rosa), en el departamento de Escuintla en 1994 (Fuentes, 1993;

Tongu et. al., 1995; Rosas, 2000).

En una revisión más detallada se cree que existen aproximadamente 50 especies de ese

género, aunque no todas son válidas. A continuación aparecen las 9 especies de

Paragónimus que se han identificado en humanos:

1. P. africanus

2. P. heterotremus

3. P. kellicotti

4. P. mexicanus

5. P. miyazakki

6. P. ohirai

7. P. skrjabini

8. P. uterobilateralis

9. P. westermani

Las especies consideradas más relevantes para la salud humana por su alta distribución,

alta prevalencia y notable patogenicidad es P. westermani, seguida de P. heterotremus

y con menor frecuencia P. mexicanus (figura 8) (Acha & Szyfres, 2003).

21

Figura 8: Fotografía de Paragonimus mexicanus, identificado mediante técnica

molecular. Crédito: Vivian Monzón.

Fuente: FODECYT 63-2009

II.2.1 Patogenia y fisiopatología

El parásito adulto se encuentra en cavidades quísticas del pulmón en 98 % de los casos,

el abdomen (mesenterio, hígado y bazo) o el cerebro, generalmente por pares, y su

longevidad es alrededor de 6 años. Produce reacción neutrófila y eosinofilia en los

tejidos con formación de cápsula gruesa y exudado purulento color café, con huevos y

cristales de Charcot Leyden (Acha & Szyfres, 2003).

La enfermedad principal se debe al paso de las larvas por los tejidos, en los que

producen abscesos y pequeñas hemorragias. El adulto causa lesión de tipo inflamatoria

en un inicio y luego formación de quistes fibrosos rodeados de material necrótico, lo

que ocurre principalmente en los pulmones (Acha & Szyfres, 2003).

II.2.2 Manifestaciones clínicas

Los hallazgos clínicos dependen de la cantidad de parásitos y de los órganos afectados.

Las infecciones con escaso número de estos trematodos generalmente evolucionan con

ausencia de síntomas (Acha & Szyfres, 2003). Existen tres formas principales de

presentación de acuerdo con su localización:

1. Forma pulmonar: el período de comienzo es insidioso, ocasionalmente con

fiebre repentina y hemoptisis. En la etapa aguda, la tos y la hemoptisis son los

síntomas predominantes; en la fase crónica, hay tos seca que aparece por la

22

mañana acompañada de hemoptisis ligera, esporádica y abundante. En un bajo

porcentaje de casos, los esputos son café-rojizos y/o purulentos. Los signos

físicos hacen pensar en una neumonía, bronquiectasia o tuberculosis. Hay toma

del estado general, pérdida de peso y debilidad; si la afectación es extensa,

encontramos fiebre, disnea, anorexia, malestar y fatiga.

2. Forma abdominal: pueden haber signos de formación de absceso en hígado,

bazo o cavidad abdominal. En las localizaciones a nivel de la pared del intestino,

los quistes se rompen y pueden aparecer diarrea, sangre y huevos en las heces.

3. Forma cerebral: los síntomas agudos son los de una meningoencefalitis, con una

duración de 1 a 2 meses, pero pueden existir recaídas durante 2 años. En los

casos crónicos se presentan signos de lesión de masa ocupativa, o embolia

cerebral, con parálisis y convulsiones motoras localizadas. Puede acompañarse

de hemorragia cerebral, trastornos visuales, atrofia óptica y retardo mental;

cuando se afecta la médula espinal, episodio que ocurre rara vez, se observa

compresión de esta con paraplejía, monoplejía, debilidad de las extremidades y

trastornos sensoriales.

(Acha & Szyfres, 2003).

Pueden presentase otras localizaciones de este género; en la paragonimosis cutánea, hay

formación de nódulos en tejidos subcutáneos, que casi siempre son indoloros. Pueden

ser migratorios, ulcerados y formar abscesos. Resultante del daño renal, se observa en

ocasiones hematuria con presencia de huevos en la orina al localizarse a nivel del

escroto. Los daños pueden simular una epididimitis o hernia inguinal encapsulada; en

estos casos los síntomas dependen de los órganos que tengan formaciones quísticas

(Acha & Szyfres, 2003).

El pronóstico es favorable en las infecciones ligeras que pueden evolucionar a la

curación espontánea a los 5 ó 6 años; las infecciones intensas con tuberculosis o

infecciones piógenas sobreañadidas, así como la forma cerebral, resultan de pronóstico

severo (Acha & Szyfres, 2003).

II.2.3 Diagnóstico

El diagnóstico de Paragonimus específico se basa en el hallazgo de pruebas de

inmunodiagnosis (Quijada, Lima dos Santos & Avdalov, 2005), además de la

observación de huevos del tremátodo en esputo o heces o en las lesiones cutáneas

(Rosas, 2000). Aunque representa un problema mayor de salud pública en Asia, en

América es una efermedad zoonótica con casual repercusión humana, debido

probablemente a las diferencias culturales y hábitos alimentarios de la población

expuesta (Rosas, 2000). Los hospederos finales por lo regular son mamíferos. La

enfermedad suele persistir durante años y la persona infectada puede parecer sana, se

pueden alcanzar estados crónicos de 5 a 20 años y en casos extremos hasta 30 años

(Kang et. al., 2000).

23

La paragonimosis se confirma, una vez realizados los diagnósticos clínicos y

epidemioló-gico, con el hallazgo de los huevos en el material expectorado o en materias

fecales. También se puede realizar la identificación del parásito en el líquido peritoneal,

obtenido del derrame pleural o en ocasiones por examen histopatológico de muestras

quirúrgicas (Acha & Szyfres, 2003).

Los huevos de todas las especies de Paragonimus son similares, por lo que no se puede

identificar la especie vía este estadío. A través de rayos X y por sintomatología, la

enfermedad puede ser confundida con tuberculosis o histoplasmosis (Alvarado, Pariona,

Beltrán, 2004). Se cree que existen 21 millones de personas infectadas alrededor del

mundo (Quijada, Lima dos Santos & Avdalov, 2005). Los síntomas de la enfermedad

incluyen tos, hemoptisis, dolor pleurítico de pecho. A pesar de que los pulmones son los

órganos más afectados, la infección extra-pulmonar es relativamente común,

encontrándose al parasito en el sistema nervioso central, en tejidos subcutáneos, pared

intestinal, cavidad peritoneal, hígado, ganglios linfáticos y las vías genitourinarias

(Chin, 2001; Heymann, 2004). Los casos menos frecuentes, pero más graves de la

paragonimiasis se producen cuando el parásito viaja al sistema nervioso central en lugar

de los pulmones.

Existen reportes de enquistamiento en la pared abdominal, cerebro, hígado y rara vez

sub-cutáneamente, como elevaciones redondas pequeñas y sólidas (County of Orange

Health Care Agency, 2006). También se han reportado casos de problemas oculares al

invadir el sistema nervioso, ocasionando glaucomas secundarios (Fontenla, Grau & Pita,

sin año).

Figura 9: Enquistamiento pulmonar de Paragonimus sp. observado en radiografía.

Fuente: Rev. Perú. Med. Exp. Salud Pública 21(2), 2004.

24

Figura 10: Pulmón de Zarigüeya (Didelphis virginiana), infectado naturalmente con

Paragonimus mexicanus. Se observan múltiples granulomas en los lóbulos caudales, de

tamaños y pesos variables, con pared delgada, color blanco-grisáceo y consistencia

blanda.

Fuente: Vet. Méx v.41 n.1 México ene./mar. 2010.

El esputo generalmente contiene estrías de pigmento pardo anaranjado, a veces de

distribución difusa, en las que con el microscopio pueden verse masas de huevecillos

cuya presencia confirma el diagnostico. Sin embargo, los colorantes acidorresitentes

que se emplean para identificar a los bacilos de la tuberculosis destruyen los huevecillos

e impiden el diagnostico. Los huevecillos también pueden ser ingeridos, en especial por

los niños, y aparecer en las heces, cuando se utilizan algunas técnicas de concentración

(Chin, 2001; Heymann, 2004).

Como exámenes complementarios se emplean:

1. Pruebas serológicas: se utilizan pruebas sensibles y específicas como:

contrainmuno-electroforesis, reacción de fijación del complemento y los ensayos

inmunoenzimáticos sobre fase sólida e Inmunoblot, que resultan de valor

especial para las infecciones extrapulmonares. La prueba cutánea no puede

usarse para confirmar una infección activa, pero sí para llevar un control.

2. Radiología: la mayor parte de los pacientes muestra una radiografía de tórax

anormal, con diferentes tipos de reacciones. Se observan sombras en anillos,

infiltración lineal o nodular, manchas calcificadas, engrosamiento pleural y

derrames. Las cavidades se muestran mejor en las tomografías, broncogramas o

tomografía de pulmón o cerebral. Esta última permite localizar con precisión el

sitio de la lesión; si existen lesiones antiguas se observan calcificaciones. El

exámen radiográfico resulta de utilidad pero puede resultar negativo aún en

25

pacientes sintomáticos, además su identificación puede ser difícil en áreas no

endémicas, porque se puede confundir con la tuberculosis.

3. La tomografía computarizada puede mostrar las lesiones con más fidelidad. El

diagnóstico específico se basa en la identificación de los huevos en el esputo, la

materia fecal, el derrame pleural o las biopsias. Las formas cerebrales son fáciles

de confundir con tumores o con cisticercosis y las cutáneas con otras formas de

larvas migratorias. Por tales motivos ha habido interés en el desarrollo de

exámenes indirectos.

4. Una prueba cutánea de sensibilidad débil y especificidad cuestionable fue

ampliamente usada en el pasado con fines epidemiológicos. En una provincia de

China en 1961 se encontró positiva que el 24% de los examinados eran positivas

pero solo se confirmo la mitad de los casos.

5. La prueba más común es el ensayo de inmunosurción enzimática (ELISA) con

antígenos específicos.

(Acha & Szyfres, 2003).

Otros exámenes de laboratorio revelan la eosinofilia, sobre todo al inicio de la

enfermedad y el aumento moderado del conteo de leucocitos. El diagnóstico diferencial

de las formas pulmonares deberá hacerse con la neumonía lobar, tuberculosis,

espiroquetosis bronquial y bronquiectasia; siempre hay que tener en cuenta si el

paciente proviene de área endémica. Otras entidades que se deben descartar son las

neoplasias malignas e infecciones parasitarias que afectan el pulmón. La forma cerebral

se debe distinguir de meningoencefalitis, tumor cerebral y otras infecciones parasitarias

que afectan el cerebro, como la cisticercosis. Los quistes cutáneos y nódulos deben

diferenciarse de la migración larvaria cutánea, y el material producido por los huevos en

estas lesiones, del contenido de los nódulos originados por infecciones ocasionadas por

otros trematodos (Acha & Szyfres, 2003).

II.2.4 Epidemiología

La paragonimosis ha sido notificada en el Lejano Oriente, Asia Sudoriental, la India,

África y América. China en la actualidad es el principal país endémico y le siguen en

probabilidad Laos y la provincia de Manipur de la India Myanmar (antigua Birmania).

En Japón y Corea está prácticamente eliminada. En América Latina, el país más

afectado es Ecuador. Se han señalado casos en Brasil, Colombia, Perú, Venezuela,

Costa Rica y México. Es menos común en EE. UU. y Canadá (Acha & Szyfres, 2003).

Reservorio. Los seres humanos, los perros, los gatos y los carnívoros salvajes son los

huéspedes definitivos y actúan como reservorios (Acha & Szyfres, 2003).

Modo de transmisión. La infección humana se adquiere por comer cangrejos o

langostinos crudos, con cocción inadecuada, salados o en salmuera, costumbre muy

popular en diferentes culturas. En las áreas donde esto no ocurre, la infección resulta de

26

la contaminación de los dedos u otro alimento con metacercarias antes de que estos sean

cocidos. La contaminación del agua potable es también posible, pues las metacercarias

viven en el agua hasta 3 semanas, después de ser liberadas del crustáceo muerto o

lesionado. Las personas infectadas pueden expulsar huevos durante 20 años. No hay

transmisión de una persona a otra (Acha & Szyfres, 2003)..

Medidas preventivas:

1. Educar a la población, en las zonas endémicas, respecto al ciclo de vida del

parásito.

2. Insistir en la cocción completa de los crustáceos.

3. Eliminación sanitaria de los esputos y las heces.

4. Uso de molusquicidas en las zonas donde sea factible.

5. En zonas endémicas, ante la aparición incluso de pequeños grupos de casos, se

deben examinar las aguas de la localidad en busca de hospederos, así como

identificar los reservorios para establecer medidas de control apropiadas.

(Acha & Szyfres, 2003).

II.2.5 Tratamiento

El medicamento de elección es el praziquantel a la dosis de 25 mg/kg, tres veces al día

por 3 días. De esta forma se ha logrado hasta 100 % de curación. En los casos que exista

afectación cerebral, se deben administrar corticosteroides, pues puede empeorar la

situación debido a la reacción local grave por muerte del parásito (Acha & Szyfres,

2003).

Es efectivo también el bithionol en la afección pulmonar a la dosis de 40 mg/kg en días

alternos por 10 a 15 días con 90 % de curación. En ocasiones se requiere de más de un

esquema de tratamiento (Acha & Szyfres, 2003).

Es importante resaltar que las metacercarias permanecen viables en vinagre, miso (pasta

de frijol), salmuera, sake y shoyu (salsa de soya). Sumergidas en alcohol al 47% pueden

resistir hasta 5 días. En cambio, son destruidas al ser sometidas a desecación (3 - 4 min)

o al ser cocinadas en agua (55 °C /20 min).

http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/parasitologia/paragonimosis.html

II.3 Control

En las áreas endémicas las medidas de control deben dirigirse a interrumpir el ciclo

mediante las siguientes acciones:

a) Educar a la población para que no consuman cangrejos, camarones y langostas

insuficientemente cocidos.

27

b) Tratar a la población en forma masiva para reducir el reservorio de la infección.

c) Eliminar perros y gatos sin dueño, con el mismo porpósito.

d) Eliminar en forma sanitaria las expectoraciones y materias fecales para prevenir la

contaminación de los ríos.

e) Controlar a los caracoles con los molusquicidas en el área donde sea factible.

Para que un programa de control sea efectivo, debe abarcar el área completa de un

sistema fluvial y otras regiones (Acha & Szyfres, 2003).

II.4 Técnica Molecular

II.4.1 Identificación genética

La identificación genética es el uso de análisis moleculares para la identificación certera

de especies, individuos e inclusive, para determinar el origen de muestras biológicas

como tejido o sangre (Allendorf & Luikart, 2007). La identificación molecular y

clarificación taxonómica aplicados al estudio de zoonosis representan un avance en la

habilidad de diagnosticar parásitos, lo que es un aporte valioso en estudios ecológicos y

epidemiológicos (Blair et al., 1997; van Herwerden, Blair & Agatsuma, 1999; Iwagami

et al., 2000; Pérez-Sweeney, 2003; Iwagami et al., 2003b; Le et al., 2006; Allendorf &

Luikart, 2007).

El uso de marcadores moleculares en la identificación de individuos ofrece varias

ventajas comparado con los métodos tradicionales de rastreo, como basarse en fenotipos

naturales por ejemplo (Avise, 2004): todos los individuos de todas las especies “portan”

estos marcadores naturales; los marcadores son transmitidos a través de generaciones;

técnicas modernas de laboratorio, como el PCR, ofrecen la posibilidad de obtener

muestras biológicas no invasivas y no destructivas; la identificación de un individuo en

particular es muy confiable, si se usan múltiples loci hipervariables producto de la alta

variación genética poblacional en especies sexuales. Sin embargo se requiere de equipo

especializado y una buena cantidad de dinero para llevar a cabo este tipo de análisis.

El caso particular de la identificación de especies mediante técnicas moleculares surgió

como una herramienta que lograba generar datos más confiables que los aportados por

los análisis morfológicos. Muchos marcadores moleculares se están usando actualmente

para la identificación de especies. El más ampliamente utilizado es el ADN

mitocondrial (ADNmt), aunque también se usan marcadores nucleares como los

microsatélites (Allendorf & Luikart, 2007; Mills, 2007).

El tipo de marcador molecular que ha de utilizarse depende de la escala a la cual se

quiere trabajar. Para separar entre especies, los marcadores 12S y 16S del ARN

ribosomal, que se encuentran dentro de la molécula de ADN mitocondrial, han dado

28

buenos resultados (Mills et al., 2000; Balitzki-Korte et al., 2005; Imaizumi et al., 2007).

Otros marcadores utilizados a nivel interespecífico son el gen o parte del gen del

citocromo b, el de citocromo c oxidasa I –COI-, la región control –D-Loop-, ATPasa 8,

NADH 5, todos marcadores del ADN mitocondrial (Mills et al., 2000; Blair et al.,

2005; Doanh et al., 2007; Doanh et al., 2009; Iwagami et al., 2003a,b). A nivel

intraespecífico uno de los más utilizados es el marcador nuclear de secuencias

repetitivas en tandem o microsatélites. En este estudio utilizaremos parte del gen del

citocromo c subunidad oxidasa 1 –cox1-, para la identificación taxonómica de los

especímenes de Paragonimus.

II.4.2 Técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Este método requiere la síntesis enzimática in vitro de millares de copias de una

secuencia específica de ADN, utilizando ADN Polimerasas. El método se basa en dos

propiedades de la enzima ADN Polimerasa (Mertens y Ammersmith, 1998): 1) Todas

las ADN Polimerasas, producen una nueva molécula de ADN tomando como molde el

ADN que se tiene como muestra, en la dirección 5’ a 3’; 2) Ninguna ADN Polimerasa

puede iniciar la síntesis de una nueva molécula de ADN sin que antes el ADN molde

tenga grupos 3’ OH terminales (llamados oligonucleótidos cortos, iniciadores,

cebadores o primers) (Pérez-Sweeney, 2003; Mills, 2007).

Figura 11: Fotografía del material y reactivos de PCR, utilizados dentro del proyecto.

Crédito: Raquel Lima.

Fuente: FODECYT 63-2009

29

II.4.3 ADN mitocondrial

Los genes presentes en la mitocondria son diferentes a los que se encuentran en el

material genético del núcleo. El ADN mitocondrial codifica principalmente productos

para el funcionamiento de la célula (y también las proteínas que conforman a la misma

mitocondria). Otra diferencia con el núcleo es que el material genético mitocondrial es

haploide. Además, una característica ventajosa del ADNmt es que está presente en

múltiples copias idénticas dentro de una célula, por lo que el análisis de dicho ADN se

puede llevar a cabo con una pequeña cantidad de muestra, o muestras de poca calidad

(Mills, 2007).

Además, el ADNmt no sufre recombinación y su herencia es exclusivamente maternal,

por lo que es una buena fuente de información acerca de patrones de relaciones

maternales, estructura sexual poblacional, determinación de reducciones en el tamaño

poblacional e inferencias acerca de los sistemas de apareamiento (Allendorf & Luikart,

2007; Mills, 2007).

II.5 Enfermedades olvidadas

Se estima que al menos 1 millón de personas en el mundo –la sexta parte de la

población mundial- sufre de una o más de las enfermedades olvidadas. Las poblaciones

más afectadas por estas enfermedades son las de mayor pobreza y más vulnerables y se

encuentra mayormente en las áreas tropicales y subtropicales del mundo (WHO, 2007).

Estas enfermedades desatendidas suponen una enorme carga económica en términos de

pérdida de productividad y los elevados costes que genera la atención médica

prolongada (OMS, 2003).

Las Enfermedades cubiertas por el Departamento de Enfermedades Olvidadas de la

OMS abarca Cólera, Leishmaniasis, Lepra, Fasciolaisis, Buruliasis, Filariasis Linfática,

Dengue y Dengue Hemorrágico entre otras (WHO, 2007).

La paragonimiasis, al igual que otras enfermedades, se encuentra dentro del grupo de las

enfermedades olvidadas, ya que son enfermedades que atraen poca atención en el

mundo industrializado; son enfermedades problemáticas desatendidas durante mucho

tiempo por gobiernos, investigaciones y agencias de financiamiento (OMS, 2003).

En la actualidad la paragonimiasis, es una enfermedad que no presenta mayor relevancia

para las autoridades nacionales de salud. Sin embargo, este hecho no hace que deje de

afectar a las poblaciones, en especial las poblaciones de escasos recursos. El ser una

enfermedad desentendida, genera vacios de información con respecto a su distribución y

presencia actual en el país.

Existen numerosos trabajos científicos que tratan de la biología inmunología y genética

de los parásitos que causan estas dolencias. Sin embargo este nuevo conocimiento no es

posible revertirlo en herramientas terapéuticas para la población afectada. Por el

contrario, estas enfermedades han sido sistemáticamente relegadas por los responsables

30

de los programas de investigación, tanto del sector público como del sector privado.

Esto se debe al hecho, de que las personas que sufren de enfermedades olvidadas son

pobres y no representan un retorno lucrativo suficiente que justifique una inversión de la

industria farmacéutica en investigación y desarrollo de nuevos medicamentos para estas

enfermedades. Queda claro, por lo tanto, que la crisis de falta de medicamentos para las

enfermedades olvidadas no alcanzó la actual proporción por falta de conocimiento

científico, ni por la brecha que existe entre la investigación básica y la preclínica. Esta

crisis es tanto el resultado de la falta de políticas públicas para I+D de medicamentos de

interés nacional de los países en desarrollo, como la falla de mercado provocada por el

bajo interés económico que estos pacientes representan para la industria.

http://malaria2.enfermedadesolvidadas.com/sysMisc.php?action=imprint.

II.6 Factores Físicos y Químicos del Agua

En esta sección se presenta los factores físicos y químicos del agua comúnmente

analizados en las pruebas de calidad de agua.

II.6.1. Potencial de Hidrogeno – pH

El agua está compuesta de iones hidrógeno (H+) y de hidróxido (OH-), el pH (potentia

hidrogenii) indica la concentración de iones hidrógeno en el agua siendo una de las

pruebas más comúnmente usadas en análisis de agua ya que el pH regula muchos de los

procesos químicos y fisiológicos del sistema. La escala del pH oscila entre 0 y 14, el

valor de “7” representa a una solución neutra, un valor menor de 7 indica una solución

ácida y un valor mayor de 7 representa una solución básica.

El ámbito del pH para la mayoría de organismos acuáticos es de 5.6 a 8.5 y los niveles

normales del pH varían dependiendo de la entrada de minerales al sistema. El agua con

un pH ácido puede ser perjudicial para los organismos acuáticos afectando

especialmente a los invertebrados y a los embriones de los peces (Aguirre, 2006).

II.6.2.Dureza

La dureza representa una medida de la cantidad de metales alcalinotérreos en el agua,

fundamentalmente Calcio (Ca) y Magnesio (Mg) provenientes de la disolución de rocas

y minerales que será tanto mayor cuanto más elevada sea la acidez del agua. Es una

medida, por tanto, del estado de mineralización del agua.

Se suele expresar como mg/l de CaCO3 o como grados franceses, teniendo en cuenta

que 10 mg/l es igual que un grado francés.

En función de este estado de mineralización, podemos distinguir distintos tipos de

aguas:

31

Tabla 3: Distintos tipos de aguas.

CLASIFICACION DUREZA (mg

CaCO3/L)

Blandas 0 – 100

Moderadamente

duras

101 – 200

Duras 200 – 300

Muy Duras > 300

Fuente: Aguirre, 2006.

II.6.3 Alcalinidad

La alcalinidad del agua es la suma de las concentraciones de los iones carbonato

(CO32-), bicarbonato (HCO3-) y e hidróxidos (OH-) siendo estos últimos despreciables

frente al resto.

Estas especies producen en el agua un efecto tampón ya que absorben protones

manteniendo el ph en un valor muy estable. Esta propiedad es muy importante para los

seres vivos en determinados medios como el flujo sanguíneo ya que mantienen el valor

de pH a un valor muy constante y estable frente a posibles variaciones en el medio

(Aguirre, 2006).

II.6.4 Conductividad

La conductividad es una medida de la capacidad que tiene el agua para conducir la

corriente eléctrica. La conductividad está relacionada por un parámetro llamado fuerza

iónica que viene determinado por la concentración y la carga de cada ión presente en el

agua.

Los valores de conductividad vienen expresados normalmente en µS/cm (microsiemens

por centímetro) (Aguirre, 2006).

II.6.5 Sólidos

Podemos distinguirlos en sólidos sedimentables, sólidos en suspensión y sólidos

disueltos, siendo los sólidos totales la suma de todos ellos. Estos sólidos, además de

poder suponer la presencia de cuerpos u substancias extrañas que pudieran en algún

caso no ser recomendables, aumentan la turbidez del agua y disminuyen la calidad de la

misma (Aguirre, 2006).

Los sólidos sedimentables son sólidos de mayor densidad que el agua, se encuentran

dispersos debido a fuerzas de arrastre o turbulencias. Cuando estas fuerzas y

32

velocidades cesan y el agua alcanza un estado de reposo, precipitan en el fondo. Suelen

eliminarse fácilmente por cualquier método de filtración (Aguirre, 2006).

Los sólidos en suspensión se mantienen en el agua debido a su naturaleza coloidal que

viene dada por las pequeñas cargas eléctricas que poseen estas partículas que las hacen

tener una cierta afinidad por las moléculas de agua. Este tipo de sólidos como tales son

difíciles de eliminar siendo necesaria la adición al agua de agentes coagulantes y

floculantes que modifican la carga eléctrica de estas partículas consiguiendo que se

agrupen en flóculos de mayor tamaño para así poder separarlos mediante filtración.

Ciertos sistemas de tratamiento de agua como la ozonización ya suponen de por sí un

buen método floculante ya que se produce la oxidación del hierro, manganeso y

aluminio, óxidos que son los que verdaderamente ejercen un fuerte poder floculante en

el agua aumentando la eficacia del filtro y mejorando la transparencia del agua

(Aguirre, 2006).

Los sólidos disueltos están relacionados con el grado de mineralización del agua ya que

son iones de sales minerales que el agua ha conseguido disolver a su paso. Están

relacionados con la conductividad del agua ya que un aumento de estos iones aumenta

la capacidad conductiva (Aguirre, 2006).

II.6.6 Turbidez

La turbidez es un parámetro relacionado con el grado de transparencia y limpieza del

agua que a su vez depende de la cantidad de sólidos en suspensión del agua que pueden

ser resultado de una posible actividad biológica o simplemente una presencia de

componentes no deseables. Se mide mediante la absorción que sufre un haz de luz al

atravesar un determinado volumen de agua. Para eliminar esta turbidez y así mejorar la

calidad del agua se usan los distintos tipos de filtros que hay en el mercado, mejorando

el rendimiento con el uso de floculantes (Aguirre, 2006).

33

PARTE III

III.1 RESULTADOS

III.1.1 Estadísticos

III.1.1.1 Regresión múltiple lineal

En el cuadro 2 se puede observar la regresión múltiple lineal para la presencia de

Paragonimus en los cangrejos colectados, en donde se obtuvo un valor de p = 0.001724

lo que nos está indicando que al menos una variable no presenta pendiente igual a cero,

por lo tanto existe una relación lineal entre la presencia de Paragonimus y al menos una

de las variables evaluadas. Dicha variable es la altitud, ya que al observar el Pr(>t) =

0.000961 nos está indicando que existe una relación entre la presencia de Paragonimus y

la altitud.

Tabla 4: Regresión múltiple lineal para la presencia de Paragimus en cangrejos de la

costa sur de Guatemala. (p = 0.001724)

Estimado error std. valor t Pr(>t)

Intercepto -0.1818521 0.2509444 -0.725 0.470236

Peso -0.0101952 0.0126387 -0.807 0.42165

Altitud 0.0010579 0.0003115 3.396 0.000961

Fuente: FODECYT 63-2009

III.1.2 Estadísticos genéticos.

III.1.2.1 Polimorfismo genético.

Los sitios polimórficos encontrados fueron 108 sitios de los cuales 24 eran

sitios individuales de dos variaciones y 84 sitios parsimoniosamente

informativos. Se encontraron 24 sitios individuales en la secuencia con dos

variaciones (Singleton variables sites–two variants). Sin embargo, no se

encontraron sitios individuales con tres o más variaciones (singleton variables

sites –three and four variants).

III.1.2.2 Recombinación.

Se hizo la prueba de recombinación para determinar la existencia de la misma y

evitar inferencias basadas en errores. Sin embargo a pesar de que es encontraron

algunos eventos de recombinación (Mínimo número de eventos recombinantes

Rm: 5) lo cual es en cierta forma comun encontrar se puede concluir que no

presentaron recombinación.

34

III.1.2.3 Test de neutralidad.

Se realizaron test de Fu and Li's D y Tajima para determinar la existencia de

algún evento que violara la neutralidad que se asume poseen los datos. Sin

embargo ambos análisis mostraron que no existían valores que fueron

significativos para violar la neutralidad de los datos.

Fu and Li's F* test statistic: -0,52590 Statistical significance: Not significant,

P > 0.10

Tajima's D: -1,49144 Statistical significance: Not

significant, P > 0.10

III.1.2.4 Haplotipos.

Se encontraron 14 haplotipos como se muestra en el cuadro 3.

Tabla 5. Haplotipos encontrados para los individuos dentro de las poblaciones de

Paragonimus mexicanus de Guatemala y Ecuador. En negro se observan los haplotipos

encontrados en el presente estudio.

Haplotipo Individuos

Hap_1 1 [Rax12]

Hap_2 1 [Rax21]

Hap_3 3 [Rax25, Rax37, G6-P.mexicanus]

Hap_4 4 [Rax28, Rax31, Rax33, G4-P.mexicanus]

Hap_5 5 [Rax47, Rax35, 43012Rax11, 43026Rax48, G3-P.mexicanus]

Hap_6 3 [Rax39, Rax41, G2-P.mexicanus]

Hap_7 1 [43014Rax20]

Hap_8 2 [Ecuador-P.mexicanus, E3-P.mexicanus]

Hap_9 1 [E1-P.mexicanus]

Hap_10 1 [E2-P.mexicanus]

Hap_11 1 [E4-P.mexicanus]

Hap_12 1 [G1-P.mexicanus]

Hap_13 1 [G5-P.mexicanus]

Hap_14 1 [G7-P.mexicanus]

Fuente: FODECYT 63-2009

35

III.1.2.5 Flujo génico y coeficiente de diferenciación.

Tabla 6. Valores de diferenciación genética, mostrando el grado de diferenciación

genetica entre los grupos. P.mexicanus-GuateR1; representa a las poblaciones de P.

mexicanus encontradas en el trabajo de campo del presente estudio. P.mexicanus-

GuateR2; representa a las poblaciones de P. mexicanus encontradas en el estudio del

2003. P.mexicanus Ecuador; representa a las poblaciones del 2003 obtenidas en

Ecuador.

P.b

ankok

P.w

este

man

ii

P.m

exic

anus-

Guat

eR1

P.m

exic

anu

sEcu

ador

P.m

exic

anus-

Guat

eR2

P. bangkokensis 0 0,71695 0,97137 0,98068 0,96715

P.westemanii 0,71695 0 0,72009 0,75538 0,71731

P.mexicanus-

GuateR1 0,97137 0,72009 0 0,9104 0

P.mexicanus Ecuador 0,98068 0,75538 0,9104 0 0,89763

P.mexicanus-

GuateR2 0,96715 0,71731 0 0,89763 0

Fuente: FODECYT 63-2009

Se puede observar que los valores de diferenciación genética de la población de

Ecuador tiene valores similares a los que presentan P. bangkokensis y P. westermani

cuando se confrontan con las poblaciones de Guatemala. Lo que sugiere que P.

mexicanus de Ecuador tiene valores similares de diferenciación que las otras especies de

parásitos.

36

Tabla 7. Indices de diferenciacion globales para todos los grupos analizados de

Paragonimus mexicanus . Se excluyen las especies P. bangkokensis y P. westermani.

Δst 0,0142

γst 0,745

Nm 0,09

Nst 0,8524

Nm 0,04

Fst 0,8483

Nm 0,04

Fuente: FODECYT 63-2009

III.1.3 Análisis Filógeneticos.

Figura 12. Árbol consenso de Máxima versosimilitud y Máxima parsimonia,

mostrando los valores de soporte de Boostrap.

Fuente: FODECYT 63-2009

37

Como se observa, en la figura 12, hay una separación clara entre las poblaciones de

Ecuador y de Guatemala de Paragonimus.

En cuanto a las relaciones de parentesco entre todos los organismos estudiados pueden

mencionarse diversos factores peculiares. Las muestras que corresponden a las

producidas en el presente estudio se encuentran bajo el nombre de RaxXX. Los demás

individuos fueron secuencias obtenidas con anterioridad en otra investigación en 2003 y

son las que aparecen en cuadros amarillos (Iwagamia et al., 2003).

III.1.4 Análisis de los resultados de las muestras de agua

A continuación se presenta el promedio de los resultados microbiológicos de las

muestras de agua tomadas en los 6 departamentos del área sur de Guatemala.

Tabla 8. Promedio de los resultados del análisis microbiológico del agua en los 6

departamentos.

1. San Marcos

Análisis Resultado Dimensional NGO 001:99

Recuento Heterotrófico

en Placa

6.0x102 UFC/ mL

˚ por 48

h. en PCA

NPL

Coniformes Totales 1600 NMP/100

mL

NMP/100 mL < 2

Coniformes Fecales 1600 NMP/100

mL

NMP/100 mL < 2

Escherichia coli 1600 NMP/100

mL

NMP/100 mL < 2

2. Retalhuleu

Análisis Resultado Dimensional NGO 001:99

Recuento Heterotrófico

en Placa

6.0x10⁴ UFC/ mL ˚ por 48

h. en PCA

NPL

Coniformes Totales 16000

NMP/100 mL

NMP/100 mL < 2

Coniformes Fecales 1600 NMP/100

mL

NMP/100 mL < 2

Escherichia coli 1600 NMP/100

mL

NMP/100 mL < 2

3. Suchitepequez

Análisis Resultado Dimensional NGO 001:99

Recuento Heterotrófico

en Placa

6.0x10⁴ UFC/ mL ˚ por 48

h. en PCA

NPL

Coniformes Totales 16000

NMP/100 mL

NMP/100 mL < 2

Coniformes Fecales 1600 NMP/100

mL

NMP/100 mL < 2

Escherichia coli 1600 NMP/100

mL

NMP/100 mL < 2

38

4. Escuintla

Análisis Resultado Dimensional NGO 001:99

Recuento Heterotrófico

en Placa

2.0x10⁶ UFC/ mL ˚ por 48

h. en PCA

NPL

Coniformes Totales 50,000

NMP/100 mL

NMP/100 mL < 2

Coniformes Fecales 50,000

NMP/100 mL

NMP/100 mL < 2

Escherichia coli 50,000

NMP/100 mL

NMP/100 mL < 2

5. Jutiapa

Análisis Resultado Dimensional NGO 001:99

Recuento Heterotrófico

en Placa

3.0x10⁶ UFC/ mL ˚ por 48

h. en PCA

NPL

Coniformes Totales 24,000

NMP/100 mL

NMP/100 mL < 2

Coniformes Fecales 5,000 NMP/100

mL

NMP/100 mL < 2

Escherichia coli 5,000 NMP/100

mL

NMP/100 mL < 2

6. Santa Rosa

Análisis Resultado Dimensional NGO 001:99

Recuento Heterotrófico

en Placa

6.0x102 UFC/ mL

˚ por 48

h. en PCA

NPL

Coniformes Totales 000 NMP/100

mL

NMP/100 mL < 2

Coniformes Fecales 1600 NMP/100

mL

NMP/100 mL < 2

Escherichia coli <2 NMP/100

mL

NMP/100 mL < 2

Fuente: FODECYT 63-2009

Se observa una alta presencia de Coliformes totales y fecales en todos los ríos muestras

de los 6 departamentos en los que se desarrollo el proyecto.

39

III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

III.2.1 Estadísticos genéticos.

III.2.1.1 Polimorfismo genético.

La cantidad de sitios polimorficos nos indican que el marcador es el adecuado para el

estudio de la diversidad genética en Paragonimus ya que no presenta singlenton de más

de tres o cuatro variaciones que nos podrían indicar la posibilidad de saturación y por lo

tanto el posible aumento de homoplasia en el marcador analizado.

III.2.1.2 Recombinación.

Los posibles sitios de recombinación encontrados son un indicativo de la posibilidad de

observar recombinación. Sin embargo, el programa utilizado en DNAsp tiende a

sobrevalorar los eventos de recombinación, por lo cual se realizó otro análisis con RDP

Beta 4.13 (recombination detection program)(Darren et al., 2010), y se pudo observar la

nula existencia de recombinación. Esto apoya al marcador COI con una herramienta

adecuada para el estudio de relaciones de parentesco en Paragonimus.

III.2.1.3 Test de neutralidad.

El test de neutralidad muestra que tanto el marcador como las poblaciones no se

encuentran bajo el efecto de ningún tipo de selección u otra fuerza que pueda desviar las

frecuencias génicas. Por lo cual se puede considerar al marcador como adecuado para el

estudio de las relaciones de parentesco y estructuración genética entre poblaciones.

III.2.1.4 Haplotipos.

En el presente estudio se encontraron tres nuevos haplotipos procedentes de las nuevas

regiones donde se encontró Pargonimus mexicanus, donde no se había encontrado con

anterioridad. Cuatro haplotipos se encuentran repartidos entre el nuevo sitio y el sitio

anterior y finalmente tres haplotipos son exclusivos del sitio que en el 2003 fue

muestreado para la investigación. Esto sugiere que existe cierto grado de diferenciación

entre las poblaciones de Paragonimus mexicanus dentro de Guatemala. Sin embargo a

este nivel el marcador genético no es suficiente pues se necesitaría un marcador con

mayor variación genética para estudiar la variación entre poblaciones, tal como es el

caso de microsatélites. Así mismo, los haplotipos observados para Ecuador son

exclusivos de esa región y no se encuentran mezclados con los de Guatemala.

III.2.1.5 Flujo génico y coeficiente de diferenciación.

Como se observa tanto en la cuadro 3 de diversos coeficientes globales, solo para los

grupos dentro de lo que se considera P. mexicanus, y en la tabla 2 los coeficientes por

pares para cada grupo estudiado, se puede observar que existe un valor de

diferenciación genética enorme. En especial P. mexicanus de Ecuador presenta valores

de diferenciación con respecto a las poblaciones de Guatemala similares a los que

40

presenta P. westermani y P. bangkokensis, lo cual sugiere que en realidad este grupo se

trata de una especie diferente con valores de diferenciación similares a los encontrados

para las demás especies de Paragonimus.

III.2.2 Relaciones filogenéticas.

Al observar los clados que se forman con los grupos estudiados y los valores de soporte

de boostrap encontrados, se apoya la hipótesis de que el grupo de Paragonimus

mexicanus de Ecuador es en realidad otra especie diferente a P. mexicanus con valores

de diferenciación similares a los encontrados para otras especies de Paragonimus.

Dentro de Guatemala, al analizar las muestras colectadas en este proyecto y en el 2003

por Monroy y reportado por Iwagamia, et al., (2003) se puede observar una mezcla de

haplotipos sin importar del sitio donde se colectaron, con una leve separación observada

en los clados pero no apoyada por valores de diferenciación genética que se observan

nulos entre ambas poblaciones en Guatemala.

III.2.3. Distribución

Es probable que la distribución de Paragonimus, no esté en la ruta que planificamos ya

que en la literatura se describe su distribución en la costa del Pacífico, sin embargo con

los muestreos hemos rectificado que no es cerca de la costa ya que el sitio donde se

encontró la metacercaria está a aproximadamente a 100km de la costa del Pacífico y a

una altura de más de 750 a 800 msnm (anexo 5). Esto a la vez sugiere que debemos

tomar otras rutas de búsqueda, quizás basándonos en la calidad de agua y altura del

lugar, la acción antropomórfica y la deforestación del bosque que lo rodea.

III.2.4 Estadísticos.

El análisis de regresión lineal múltiple nos muestra que existe una relación entre la

altitud y la presencia de Paragonimus mexicanus. Lo cual explica la ausencia del

parásito en los demás sitios de muestreo que no sobrepasan los 800 msnm. Iwagami y

colaboradores (2003) lo reportaron arriba de los 800 msnm, lo que coincide con

nuestros resultados.

III.2.5 Características físicas y químicas del agua de los sitios de colecta

En base a los resultados obtenidos puede observarse que las condiciones del agua en

todos los departamentos no son las óptimas ya que presenta un alto índice de

contaminación en el cual no se puede decir que son las condiciones necesarias para las

metacercarias. Debido a esto es probable que no estén en lugares contaminados.

Además la contaminación limita la supervivencia de las larvas de cangrejos y caracoles

que son hospederos intermediarios indispensables para la presencia de Paragónimus.

41

PARTE IV.

IV.1 CONCLUSIONES

1. Luego de un extenso muestreo a lo largo del área sur de Guatemala se determinó

la presencia del parasito Paragonimus en un solo departamento de los

evaluados, que fue el departamento de Santa Rosa, lo que demuestra una

enfermedad focalizada en una sola área.

2. A través de la técnica molecular y el ADN mitocondrial, utilizada dentro del

estudio, se logró determinar que la especies de Paragonimus presente en el país

es Paragonimus mexicanus, ya que el análisis genético y filogenético demostró

una alta relación de los Paragonimus muestreados con la especies mexicanus.

3. De todos los ríos muestreados a lo largo del desarrollo del presente proyecto se

logró determinar que los únicos ríos con un alto índice de presencia del parasito

Paragonimus fueron los ríos localizados en Santa María Ixhuatan del

departamento de Santa Rosa, presentando cangrejos infectados en un 95%.

4. En referencia a lo descrito como resultados de las metacercarias encontradas,

podemos decir que la población de Santa María Ixhuatan es la población con un

riesgo inminente para la transmisión de la enfermedad e Paragonimiasis, ya que

fue el único lugar de los muestreados que presenta cangrejos infectados en un

95% y en consecuencia, esto sube las probabilidades de que la enfermedad esté

presente en la población. Adicionalmente, se deduce que la zona de riesgo no se

ha ampliado a otros departamentos aparentemente, ya que no lo podemos

afirmar porque el muestreo no se realizó en todos los ríos del País.

5. A través de la evaluación de todas las muestras de agua tomadas en los ríos de

los sitios de muestreo, se logró determinar alta presencia de coliformes totales y

fecales en todos los ríos muestreados, lo que indica que una variable importante

para cerrar el ciclo de vida del parasito estaba presente en todos los sitios de

muestreo.

6. A través de la publicación generada por este proyecto, se alcanzara una

divulgación de los resultados obtenidos de este proyecto a las autoridades

competentes y locales, actores sociales e instituciones con relación en el tema.

La distribución de la publicación se realizará principalmente en el sitio donde se

encontró el parasito y en localidades que cumple con las características para la

posible presencia de este.

7. Una conclusión importante al observar el análisis genético y filogenético es que

el grupo de Ecuador se trata en realidad de otra especie con valores de

diferenciación muy marcados y que las poblaciones dentro de Guatemala, aun

con varios años de tiempo de muestreo, sugieren la existencia de un flujo génico

fuerte entre ambos grupos, lo cual indica que el parasito podría encontrarse

42

distribuido en otras áreas del país sin ningún problema y con buenas

posibilidades de sobrevivir al tener índices de diferenciación genética bajos que

sugieren que se trata de una gran población con flujo génico y dispersión.

8. Existe una relación directa entre la altitud y la presencia de Paragonimus

mexicanus en los cangrejos colectados.

9. Luego del análisis de los resultados de la presente investigación, se acepta

parcialmente la hipótesis planteada, ya que aunque no se encontró en los ríos de

5 de los 6 departamentos muestreados; se localizo el parasito en un río del

departamento de Santa Rosa, donde aún no había sido reportado.

43

IV.2 RECOMENDACIONES

1. Es necesario ampliar el muestreo del parasito Paragonimus a nivel nacional, con

la finalidad de apoyar o rechazar los resultados de la presente investigación.

2. Trabajar con los marcadores moleculares Microsatélites, ya que el alto

polimorfismo que éstos presentan podrían establecer el grado de diferenciación

entre las poblaciones de Paragonimus mexicanus dentro de Guatemala ya que a

este nivel el marcador genético no es suficiente.

3. Se deben realizar monitoreos mas precisos en todas las fuentes naturales de agua

cercanas a la población de Santa María Ixhuatan departamento de Santa Rosa, ya

que cerca de ésta fue que se encontró el foco de Paragonimiasis, con el fin de

tener mas herramientas con las que se puede hacer advertencias a las autoridades

de salud.

4. Se debe hacer un muestreo no solamente de cangrejos sino de mamíferos que

visitan los riachuelos donde fue localizado el parasito, ya que estos también son

hospederos definitivos para Paragonimus sp, y los siguientes en la cadena de

transmisión.

5. Deben realizarse sondeos, como la toma de muestras de heces, sangre, rayos X

y esputo para localizar a los pobladores con posibles afecciones de la

enfermedad. Ya que están expuestos a la transmisión del parasito presente en el

río cercano a la comunidad de Ixhuatán, Santa Rosa.

6. Establecer cuáles son las aldeas más afectadas y con ellos llevar a cabo los

análisis pertinentes y más específicos para monitorear la presencia de la

enfermedad en la región, ya que son aproximadamente 18,743 habitantes los de

municipio.

7. Es necesario revaluar los ríos con alta presencia de coliformes totales y fecales,

en búsqueda del parásito Paragonimus, ya que la presencia de los coliformes es

una característica importante para la existencia del parásito, y el ampliar el área

de los sitios de muestreo mejorara la colecta.

8. Es necesario ampliar la distribución de la publicación generada a través del

presente proyecto, ya que por lo menos, todas las autoridades nacionales de salud

deben estar al tanto de las características de la enfermedad, su distribución actual

y formas de transmisión.

9. Realizar una modelaje de nicho basado en la altitud para proponer una nueva ruta

donde pueda haber presencia de Paragonimus mexicanus, y evitar buscar en

lugares donde el parásito no se encuentre.

44

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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html.

48

IV.4 ANEXOS

49

IV.4 ANEXOS

A continuación se presentan los anexos correspondientes a los que se hacen referencia

en el texto.

IV.4.1. Anexo 1. Mapa de los sitios de muestreo en los ríos de los 6 departamentos del

área sur de Guatemala.

Figura 13: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de Escuintla de

Guatemala.

Fuente: FODECYT 63-2009

50

Figura 14: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de Jutiapa de Guatemala.

Fuente: FODECYT 63-2009

Figura 15: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de Retalhuleu de

Guatemala.

Fuente: FODECYT 63-2009

51

Figura 16: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de San Marcos de

Guatemala.

Fuente: FODECYT 63-2009

Figura 17: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de Santa Rosa de

Guatemala.

Fuente: FODECYT 63-2009

52

Figura 18: Mapa de los sitios de muestreo positivos del departamento de Santa Rosa de

Guatemala.

Fuente: FODECYT 63-2009

Figura 19: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de Suchitepéquez de

Guatemala.

Fuente: FODECYT 63-2009

53

IV.4.2. Anexo 2. Coordenadas y mapa de Guatemala señalando los sitios de muestreo.

Tabla 9: Listado de los puntos de colecta realizados durante la investigación.

Para el departamento de Jutiapa:

Jutiapa Amayito N 14°17´03.92" O 89° 56´58.55" 929 msnm

Jutiapa Paz N 14°17´9.21" O 89° 53´35.37" 889 msnm

Jutiapa Ostúa N 14°18´3.46" O 89° 54´22.78" 931 msnm

Jutiapa El salto N 14°17´2.29" O 89° 56´58.64" 928 msnm

Para el departamento de Santa Rosa:

Santa Rosa Usarin N 14°01´39.24" O 90° 25´54.13" 60 msnm

Santa Rosa Chiquimulilla N 14°05´23.98" O 90° 27.54.82" 244 msnm

Santa Rosa Guazacapán N 14°4´4.05" O 90° 24´56.14" 233 msnm

Santa Rosa El Astillero N 14°01´29.91" O 90° 25´22.30" 69 msnm

Santa Rosa Papaturro N 14°14´20.04" O 90° 19´33.65" 557 msnm

Santa Rosa Ixhuatán N 14°14´679" O 90° 15´09.72" 771 msnm

Santa Rosa Ixhuatán 1 N 14°14´679" O 90° 15´09.72" 771 msnm

Santa Rosa Ixhuatán 2 N 14°11´395" O 90° 16´05.98" 1240 msnm

Santa Rosa Maria Linda N 14° 6'53.53" O 90° 38' 24.45" 37 msnm

Para el departamento de Escuintla:

Escuintla El Baúl N 14°22´50.54" O 90° 0´57.03" 549 msnm

Escuintla La Laguneta N 14°17´14.65" O 90° 58´11.84" 290 msnm

Escuintla La Unión N 14°20´34.25" O 91° 3´48.87" 317 msnm

Escuintla Tierra Nueva N 14°15´54.65" O 90° 57´58.09" 239 msnm

Para el departamento de Suchitepéquez:

Suchitepéquez Río Negro N 14°32´43.38" O 91° 33.´35.03" 370 msnm

Suchitepéquez Sis N 14°30'42.85" O 91°34'41.13" 266 msnm

Suchitepéquez

Brazo del Vado

Hondo N 14° 33'10.54" O 91°27'29.60" 462 msnm

Suchitepéquez La Cascada N 14°32'46.81" O 91°34'02.91" 361 msnm

Suchitepéquez El Chiflón N 14° 33'40.79" O 91°30'21.94" 491 msnm

Para el departamento de Retalhuleu:

Retalhuleu Yuxiná N 14°32´52.01" O 89° 56´58.55" 275 msnm

Retalhuleu Brazo del Samalá N 14°34´21.23" O 91° 37´54.32" 330 msnm

Retalhuleu Yaxhá N 14°33´52.01" O 91° 40´55.89" 285 msnm

Retalhuleu Los Ajos N 14° 35'18.52" O 91°35'48.93" 485 msnm

54

Para el departamento de San Marcos:

Fuente: FODECYT 63-2009

Figura 20: Mapa general de los sitios de muestreo

Fuente: FODECYT 63-2009

San Marcos Naranjo N 14°43´37.56" O 91° 52´24.11" 404 msnm

San Marcos La Isla N 14°44´05.38" O 92° 02´00.87" 80 msnm

San Marcos Nuevo Progreso N 14°47´39.68" O 91° 54´57.56" 594 msnm

San Marcos Los Pocitos N 14°46´41.47" O 91° 56´13.29" 477 msnm

San Marcos La Quebrada N 14°44´33.43" O 92° 02´32.58" 132 msnm

55

IV.4.3. Anexo 3. Colecta de hospederos intermediarios (cangrejos en los sitios de

muestreo).

Figuras 21 y 22: Colecta de cangrejos en los ríos de los sitios de muestreo y hospedero

intermediario colectado. Créditos: Patricia Landaverde y Carlos Montenegro.

Fuente: FODECYT 63-2009 Fuente: FODECYT 63-2009

IV.4.4. Anexo 4. Toma de datos de los hospederos intermediarios (cangrejos) y

búsqueda de Paragonimus en el hepatopáncreas.

Figuras 23 y 24: Toma de datos de los cangrejos colectaos y búsqueda del

Paragonimus en los hospederos intermediarios. Créditos: Vivian Monzón y Raquel

Lima.

Fuente: FODECYT 63-2009 Fuente: FODECYT 63-2009

56

IV.4.5. Anexo 5. Metacercarias de Paragonimus mexicanus, extraídos de los cangrejos

colectados.

Figura 25: Fotografía de una metacercaria de Paragonimus mexicanus, extraída de los

cangrejos colectados. Crédito: Vivian Monzón.

Fuente: FODECYT 63-2009

Anexo.4.6. Anexo 6. Río que presenta las condiciones ideales para la colecta de

cangrejos.

Figura 26: Sitio de muestreo que presenta las condiciones ideales para la presencia de

cangrejos con posibilidad de infección con Paragonimus mexicanus. Crédito: Patricia

Landaverde.

Fuente: FODECYT 63-2009

57

Nombre del Proyecto:

Numero del Proyecto: 063-2009

Investigador Principal y/o Responsable del Proyecto: LICDA. ANTONIETA GUADALUPE RODAS RETANAMonto Autorizado: Q233,619.10 01/06/2010

Plazo en meses 12 MESES

Fecha de Inicio y Finalización: 01/06/2010 al 31/05/2011

Menos (-) Mas (+)

0 SERVICIOS PERSONALES

35 Retribuciones a destajo Q 3,880.00 Q 3,000.00 Q 880.00

1 SERVICIOS NO PERSONALES

181

Estudios, investigaciones y proyectos de

factibilidad 98,500.00Q 17,000.00Q 101,445.00Q Q 14,055.00

181

Estudios, investigaciones y proyectos de

factibilidad (Evaluación Externa de Impacto) 8,000.00Q Q 8,000.00

121 Divulgación e información 4,000.00Q 4,000.00Q Q -

122 Impresión, encuadernación y reproducción 500.00Q 500.00Q Q -

133 Viáticos en el interior 14,750.00Q 7,848.00Q Q 6,902.00

182 Servicios médico-sanitarios 18,000.00Q 17,000.00Q Q 1,000.00

185 Servicios de capacitación 8,000.00Q Q 8,000.00

189 Otros estudios y/o servicios 3,600.00Q Q 3,600.00

2 MATERIALES Y SUMINISTROS

241 Papel de escritorio 270.00Q 269.98Q Q 0.02

243 Productos de papel o cartón 200.00Q 95.50Q Q 104.50

244 Productos de artes gráficas 50.00Q 70.00Q 116.20Q Q 3.80

261 Elementos y compuestos químicos 34,986.00Q 13,870.00Q 19,324.70Q Q 1,791.30

262 Combustibles y lubricantes 4,000.00Q 2,461.07Q Q 1,538.93

267 Tintes, pinturas y colorantes 1,000.00Q 1,000.00Q Q -

268 Productos plásticos, nylon, vinil y pvc 8,000.00Q 984.56Q Q 7,015.44

272 Productos de vidrio 600.00Q Q 600.00

291 Útiles de oficina 580.00Q 580.00Q Q -

292 Útiles de limpieza y productos sanitarios 565.00Q 202.40Q Q 362.60

295

Útiles menores, médico-quirúrgicos y de

laboratorio 14,750.00Q 14,750.00Q 10,000.00Q 8,868.96Q Q 1,131.04

3

PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E

INTANGIBLES

329 Otras maquinarias y equipos 6,700.00Q 4,929.66Q Q 1,770.34

GASTOS DE ADMÓN. (10%) 21,238.10Q 21,238.10Q

233,619.10Q 45,620.00Q 45,620.00Q 176,864.13Q Q 56,754.97

MONTO AUTORIZADO 233,619.10Q Disponibilidad 57,654.97Q

(-) EJECUTADO 175,964.13Q

SUBTOTAL 57,654.97Q

(-) CAJA CHICA

TOTAL POR EJECUTAR 57,654.97Q

FICHA DE EJECUCIÓN PRESUPUESTARIA

LINEA:

FODECYT

"Evaluación de focos potenciales de Paragonimiasis y determinación mediante técnica molecular de la

especie de Paragonimus presente en los departamentos del área sur de Guatemala"

Orden de Inicio (y/o Fecha primer pago):

PRÓRROGA AL 31/08/2011

Pendiente de

Ejecutar Grupo Renglon Nombre del Gasto

Asignacion

Presupuestaria

TRANSFERENCIA

Ejecutado

PARTE V

V.1 INFORME FINANCIERO