COMUNICACIÓN Y INFORMÁTICA - Universidad Nacional de ...

Aislamiento y selección de Saccharomyces con mayor producción

de etanol a partir de chicha de jora procedente del Mercado de

Abasto de Monsefú- Perú, 2013

TESIS PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE

BIOLÓGO - MICROBIÓLOGO

AUTORA: Br. Victoria Gabriela Esquen Cuzma

ASESOR: Dr. Heber Robles Castillo

TRUJILLO – PERÚ

2013

Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.

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http://www.google.com.pe/url?sa=i&source=images&cd=&cad=rja&docid=TCXymK_BPmsuFM&tbnid=zMS6rwAJDO97jM:&ved=0CAgQjRwwAA&url=http://www.unasam.edu.pe/oficina/investigacion/index.php/2012-07-13-15-19-01/convenio-con-universidades&ei=72x9UoHhHMH54APl6IHoCg&psig=AFQjCNEjhPmDjToq_tZ7__v9057kMCnYMg&ust=1384037999535115

II

AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE

TRUJILLO QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE

BIÓLOGO-MICROBIÓLOGO

Dr. Orlando Velásquez Benites

RECTOR

Dra. Vilma Julia Mendez Gil

Vice-Rector Académico

Dr. Alberto Santiago Uceda Duclos

SECRETARIO GENERAL

Dr. Hermes Escalante Añorga

DECANO D ELA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Dr. César Augusto Jara Campos

SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Dra. Bertha Soriano Bernilla

DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE

MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA



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III

MIEMBROS DEL JURADO

Ms. C. Juan Wilson Krugg

PRESIDENTE

Dr. Heber Robles Castillo

SECRETARIO

Dra. Manuela Luján Velásquez

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IV

APROBACIÓN

Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Examinador, declaran

que el presente informe de Tesis ha cumplido con los requisitos formales y

fundamentales, siendo aprobado por UNANIMIDAD.

Ms. C. Juan Wilson Krugg

PRESIDENTE

Dr. Heber Robles Castillo

SECRETARIO

Dra. Manuela Luján Velásquez

VOCAL



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DEDICATORIA

A DIOS, por conservarme con salud y

darme la fuerza de vencer obstáculos en el

transcurso de mi vida

A mis padres, JOSÉ Y GLADYS

Por su apoyo incondicional, su ejemplo de perseverancia,

sus consejos y valores, por la motivación constante que

me ha permitido ser una persona de bien.

A mi hermana KAREN,

Por el apoyo brindado, a pesar de

las circunstancias, para realizarme

como profesional.

A MARKO,

Por todos los gratos momentos que pasamos

y estar siempre junto a mí en las buenas y en las malas.



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VI

AGRADECIMIENTO

Al Dr. Heber Robles Castillo, por concederme su apoyo y compartir sus

conocimientos, así como por su acertado asesoramiento en el presente trabajo de

investigación.

A la Sección Técnica del Departamento Académico de Microbiología y

Parasitología, en especial a la Ms. C. Carmen Lora Cahuas, por su apoyo y

facilidades para el uso de equipos, instrumentos y reactivos disponibles.

A los profesores de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y

Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo, por su amistad, dedicación, y

por brindarme sus conocimientos académicos durante mi formación como futura

profesional.

A mis tíos Jorge Cusma y Yola Malca, por el apoyo económico brindado y

alentarme a alcanzar mis sueños.

A mis compañeras y amigas, Sonia Grados y Claudia Bravo, por su

colaboración en el trabajo de la presente tesis.

A todas las personas que de una u otra manera estuvieron a mi lado, que

me enseñaron y me dieron ánimo. Gracias a todos.



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PRESENTACIÓN

Señores miembros del jurado.

En cumplimiento con las disposiciones vigentes del Reglamento de Grados

y Títulos de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de

Trujillo, someto a vuestra consideración y elevado criterio la presente tesis titulada:

“Aislamiento y selección de Saccharomyces con mayor producción de

etanol a partir de chicha de jora procedente del Mercado de Abasto de

Monsefú- Perú, 2013”, con el objeto de obtener el título profesional de Biólogo-

Microbiólogo.

Espero que la presente tesis sea de vuestra aprobación

.

Trujillo, Noviembre 2013.

Br. Victoria Gabriela Esquen Cuzma



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RESUMEN

El presente trabajo de investigación tuvo como objeto aislar y seleccionar

Saccharomyces sp. con mayor producción de etanol a partir de Chicha de Jora del

mercado de abasto de Monsefú (Perú). Para ello, se tomaron muestras de 800 mL

de chicha de jora de cinco puestos de venta del mercado, con botellas de plástico

limpias y desinfectadas. Las muestras se llevaron al Laboratorio de Biotecnología

donde se homogenizó y conservó para el paso posterior de obtención de las

levaduras. El aislamiento de las levaduras productoras de etanol, se hizo por la

técnica de agotamiento por estría en placas Petri conteniendo Agar Sabouraud

Sacarosado al 4% (ASS) e incubado a Temperatura ambiente (25 ± 3ºC) por 5

días. Se aislaron siete colonias típicas de levaduras, las que al analizarlos al

microscopio y de manera bioquímica mostraron ser compatibles con la morfología

típica de Saccharomyces las que se les asignó BTL13. La evaluación de la

producción de etanol se hizo a través de la determinación de la Capacidad

fermentativa (productividades) de las levaduras aisladas y se utilizó el método de

Davies-Griffith modificado. Siendo los de mayor productividad los cultivos BTL13L-

D5 y BTL13L-D2, con 0.13 y 0.11 (x 10-2 g etanol/g lev.h), respectivamente.

Palabras clave: Aislamiento, Selección, Saccharomyces, Chica de Jora, Mercado de abasto, Monsefú.



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ABSTRAT

The aim this research was intended as ethanol producing yeasts isolated from corn

steep liquor from Monsefú food market of the province of Lambayeque - Peru. For

this purpose, samples of 800 ml from four Mayorista food market stalls, plastic

bottles clean and sanitized. Samples were taken to the Biotechnology Laboratory

where homogenized and preserved for later step of obtaining yeast. Isolation of

ethanol-producing yeast was made by the technique of exhaustion streak in Petri

dishes containing Sucrose Sabouraud Agar 4% (ASS) and incubated at room

temperature (25 ± 3 ° C) for 5 days. Seven yeast typical colonies were isolated,

which when analyzed under a microscope and showed biochemical way is

compatible with the typical morphology of Saccharomyces which BTL13 assigned.

Evaluating ethanol production was through determination fermentative capacity

(productivity) of the yeasts isolated and used the method of Davies-Griffith

modified. Being more productive crops BTL13L-D5 and BTL13L-D2, with 0.13 and

0.11 (x 10-2 g etanol/g lev.h), respectively

Keywords: Isolation. Saccharomyces, corn steep liquor, Food Market. Monsefú.



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X

ÍNDICE

Pág. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO QUE

OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO-MICROBIÓLOGO…….... II

MIEMBROS DEL JURADO…………………………………………………….…….… III

APROBACIÓN……………………………………………………………………………IV

DEDICATORIA……………………………………………………………………………V

AGRADECIMIENTO……………………………………………………………….…... VI

PRESENTACIÓN…………………………………………………………………….…VII

RESUMEN……………………………………………………………………….….…. VIII

ABSTRAT………………………………………………………………………………... IX

INDICE……………………………………………………………………………………. X

INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………...…..1

MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………………………..…….7

RESULTADOS……………………………………………………………………….…..10

DISCUSIÓN…………………………………………………………………………....…14

ENUNCIADO RESUMEN…………………………………………………………….....18

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………………………...19

ANEXOS……………………………………………………………………………..…...24



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INTRODUCCIÓN

Las levaduras se han definido como hongos microscópicos, unicelulares, la

mayoría se multiplican por gemación y algunas por escisión. Este grupo de

microorganismos comprende alrededor de 60 géneros y unas 500 especies.(1) Los

caracteres morfológicos de las levaduras se determinan mediante su observación

microscópica. La forma de la levadura puede ser de esférica a ovoide, en forma de

limón, piriforme e incluso alargada, en cuanto a su tamaño, su diámetro oscila de

2 – 8 µ por 3 – 15 µ de longitud. (2)

Las levaduras se hallan ampliamente distribuidas en el medio ambiente, sobre la

piel de algunas frutas, en la superficie de los vegetales, en el aparato digestivo de

los animales, etc. Ya que no poseen la capacidad de desplazarse por sí mismas

dependen de vectores como el viento, insectos, animales, incluso el hombre (3). La

microflora natural de los frutos ricos en azúcares fermentables está compuesta

fundamentalmente por mohos y en menor número bacterias y levaduras. (4)

En la actualidad las levaduras más importantes empleadas en la fermentación,

desde el punto de vista biotecnológico y utilizadas en la industria agroalimentaria,

son las pertenecientes al género Saccharomyces (5), ya que estas presentan las

características de un productor de etanol ideal (6). Dentro de las especificaciones

que tendrían los organismos fermentadores se incluyen las siguientes

características: capacidad para fermentar un amplio rango de sustratos a altas

velocidades, tolerancia a etanol y la capacidad para producir altas concentraciones

de etanol, bajos niveles de formación de subproductos, tales como ácidos grasos y

glicerol y osmotolerancia. (5,7)

Las distintas especies de levaduras pueden ser muy diferentes en cuanto a su

fisiología, la mayoría necesitan más humedad para crecer y desarrollarse. El

intervalo de temperatura de crecimiento de las levaduras es en general, parecido

al de los hongos (8). Una reacción ácida del medio, próxima a un pH de 4 a 4.5,



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estimula el crecimiento de la mayoría de las levaduras, mientras que en medios

básicos, no crecen bien a no ser que se hayan adaptado a los mismos. En

general, los azúcares son la fuente energética más apropiada para las levaduras.

Todos los heterótrofos obtienen fundamentalmente su energía de las reacciones

de oxidación - reducción, es decir, aquellas en las que los electrones son

transferidos desde un compuesto, el dador electrónico, o agente reductor, a un

aceptor electrónico, el agente oxidante. (9) La fermentación es una de las diversas

rutas catabólicas mediante las cuales muchos organismos obtienen energía

química de varios combustibles orgánicos en ausencia de oxígeno molecular o, de

una manera más general, cualquier compuesto inorgánico oxidado. (10) Las

levaduras pueden obtener la energía que les es necesaria para vivir, siguiendo

dos vías en la transformación de los azúcares del mosto, la respiración y la

fermentación. La respiración es la vía oxidativa de los combustibles orgánicos por

el oxígeno molecular; el oxígeno actúa, por tanto, como el aceptor electrónico final

en la respiración. (11)

En la fermentación ocurre una degradación incompleta de los azúcares hasta CO2

y etanol. Los electrones pasan desde un intermediario orgánico producido en la

degradación del azúcar, el dador electrónico, hasta otro intermediario orgánico,

que actúa como aceptor electrónico. Este proceso libera muy poca energía; por

ello, las levaduras al utilizar esta vía deben transformar mucho azúcar en alcohol

para cubrir sus necesidades energéticas (11)

La fermentación alcohólica es una biorreacción que permite degradar azúcares (11),

mediante una reacción de óxido-reducción realizada por organismos que

transforman monosacáridos tales como: glucosa, fructosa y galactosa en alcohol

etílico y CO2 (12). Cualquier producto que contenga o hidratos de carbono

fácilmente transformables en azúcar fermentable, almidón o celulosa sirve para la

producción de alcohol etílico. (3) Es sin duda la fermentación la etapa clave en el

proceso de la elaboración de bebidas alcohólicas. (13)



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Los azúcares constituyen el mejor alimento energético de las levaduras. Muchas

pueden, por ejemplo, catabolizar la glucosa, ya sea en forma aerobia o anaerobia.

El proceso típico es la disimilación anaerobia, conocida como fermentación

alcohólica, el cual da como resultado etanol y dióxido de carbono. La siguiente

ecuación resume este proceso:

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2

Bajo condiciones aerobias, las levaduras, al utilizar el oxígeno del aire, pueden

oxidar la glucosa totalmente hasta dióxido de carbono y agua, o parcialmente,

produciendo productos como ácidos orgánicos y otros productos intermediarios. (8)

La capacidad e incapacidad para fermentar carbohidratos hasta etanol y CO2 es la

característica más usada para la diferenciación de especies. Aunque esto tiene

aplicación en la definición de géneros; por ejemplo, el género Saccharomyces, es

caracterizado por la fuerte fermentación de uno o más azúcares. Estas levaduras

son los microorganismos más importantes y los de mayor uso en la industria de

producción de bebidas alcohólicas; así tenemos que, parte de los jugos de frutas

sufre una fermentación natural causada por las levaduras silvestres presentes en

las frutas y que ha permitido el aislar y seleccionar dichas levaduras para la

producción más controlada y a mayor escala. (14)

La chicha de jora es un producto oriundo del Perú con más de 3000 años de

antigüedad, que se elabora artesanalmente y se consume, además, en otros

países de América del Sur, constituyendo un producto potencialmente

industrializable. (19) (20) En su elaboración artesanal con lleva una serie de etapas

que se encuentran sistematizadas en: malteado de maíz, molienda, cocción,

filtración y fermentación. (11)(21)



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Por otro lado, Monsefú es uno de los pueblos lambayecanos con profundo y

brillante pasado histórico, se encuentra ubicado a 14 km al sur de la ciudad de

Chiclayo, ha adoptado la bebida tradicional chicha de jora, el cual se expende en

mercados y restaurantes. (15) La chicha de jora es una bebida tradicional

consumida por los sectores medios y populares en la mayoría de regiones del

Perú, es en Lambayeque donde tiene un sabor especial; en tanto que es una

bebida alcohólica obtenida de la fermentación de la materia azucarada contenida

en el mosto de la malta de maíz, con un contenido alcohólico de 9% en volumen.

(16) (17) Por intermedio de la fermentación se activa la micro flora láctica nativa la

cuál es responsable de la fermentación láctica y/ o maloláctica. Las bacterias

lácticas son útiles como prebióticos por sus beneficios terapéuticos y nutricionales.

(18)

Al propiciar que los granos germinen y crezcan para obtener la jora, también

llamada winapu (del quechua winay que significa crecer), se desencadena el

proceso enzimático del malteado, que no solo desdobla el almidón, sino que

prepara el futuro sabor de la chicha. (21). La molienda tiene por objeto triturar la jora

para que las partículas del mismo se hidraten de modo que liberen fácilmente sus

sustratos y así producir el mosto de jora. El tamaño de la partícula deberá sopesar

entre la facilidad de liberación del extracto y la facilidad de recuperar el mosto. (22)

La cocción tiene por objeto extraer al máximo los compuestos solubles de la jora y

para ello se realiza una cocción que va de 6 a 24 horas. Se utiliza de 3 L a 10 L de

agua por cada kg de jora. La filtración separa el bagazo del mosto. Se realiza por

lo general empleando un cedazo. (11)

Para la fermentación se deja el mosto en cantaros de arcilla en donde se produce

la inoculación de microorganismos de manera natural ya que estos

microorganismos se encuentran en las porosidades de estos recipientes y son los

responsables de trasformar el mosto jora en la chicha de jora. (23)



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A lo largo de la fermentación se presenta una dinámica y sucesión de la

comunidad levaduriforme, directamente relacionada con el aumento en la

concentración de alcohol y variabilidad de compuestos orgánicos. Al inicio del

proceso es posible detectar la mayor diversidad de levaduras, y a medida que el

proceso avanza a las fases intermedia y final aparecen levaduras que se

caracterizan principalmente por su alcohol-resistencia y alto poder fermentativo

como la especie Saccharomyces cerevisiae. La intervención de las diferentes

especies de levaduras aporta propiedades organolépticas al producto final. (24)

La producción de bebidas alcohólicas utilizando levaduras, por fermentación de

azúcares es, por tanto, una de las aplicaciones de la biotecnología, más antiguas y

de gran importancia económica. (24) En el Perú, actualmente la demanda de

alcohol es superior a las posibilidades de suministro por lo que resulta de gran

interés elevar la producción de alcohol para satisfacer dicha demanda,

seleccionando levaduras capaces de experimentar mayor rendimiento alcohólico y

eficiencia fermentativa, por lo que el presente trabajo tiene como objetivo aislar y

seleccionar levaduras del género Saccharomyces con mayor producción de

etanol a partir de la chicha de jora procedente del Mercado de Abasto de Monsefú-

Perú.



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OBJETIVOS

Aislar y seleccionar Saccharomyces con capacidad fermentativa a partir de chicha

de jora del Mercado de Abasto de Monsefú- Perú.

Evaluar la productividad de los cultivos puros de levaduras del género

Saccharomyces aislados a partir de chicha de jora del Mercado de Abasto de

Monsefú- Perú.



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MATERIAL Y MÉTODOS

1. Material

1.1. Material biológico Chicha de jora de 5 puestos expendedores del Mercado de Abasto de Monsefú –

Perú.

1.2. Medios de cultivo y soluciones Agar Sabouraud Sacarosado (ASS) (Anexo 1)

Caldo Sabouraud Sacarosado (CSS) (Anexo 2)

2. Método

2.1. Recolección y transporte de las muestras Las muestras de chicha de jora, producidas en forma artesanal, fueron

recolectadas en frascos estériles de 800 mL, rotulándoles la fecha y hora. Se tuvo

cuidado de no taparlas herméticamente para facilitar la liberación de CO2. Luego

fueron transportadas al Laboratorio de Biotecnología del Departamento de

Microbiología y Parasitología, Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad

Nacional de Trujillo para su posterior procesamiento.

2.2. Aislamiento de levaduras El aislamiento de las levaduras se realizó por la técnica de agotamiento de

muestra por estriado en placa Petri servida con Agar Sabouraud Sacarosado al

4% (ASS), se sembró las 2 últimas diluciones (10-5 y 10-6), e incubado a 25 + 3°C

por 5 días. Las colonias que se mostraron como típicos de levaduras y estuvieron



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libres de contaminantes, se seleccionaron, anotaron sus características y se les

asignó un código, (25) el cual fue BTL13 – seguida por la muestra:

B: biotecnología T: Trujillo L: levadura 13: año 2013

2.3. Identificación de Saccharomyces. Los cultivos puros fueron caracterizados fenotípicamente en base a la descripción

morfológica de las colonias, comportamiento cultural en Agar Sabouraud

Sacarosado; coloración Gram y diferenciación bioquímica, utilizando carbohidratos

como: lactosa, maltosa, manitol, sacarosa y fructosa. (26)

2.4. Obtención de cultivos puros de Saccharomyces. Cada colonia de levadura seleccionada en el paso anterior, se analizó al

microscopio a las cuales se les hizo una observación en fresco y una coloración

Gram. Aquellas colonias que se mostraron como levaduras del género

Saccharomyces y estuvieron libres de contaminantes, se trasladaron a tubos de

ensayo con ASS inclinado incubándolo a 25 + 3°C por 5 días. Luego de observar

el desarrollo microbiano, se les rotuló con su código y se conservó en refrigeración

hasta la evaluación de la capacidad fermentativa.

2.5. Obtención de biomasa de cultivos puros de levaduras. Obtenido los cultivos puros de levaduras, se procedió a realizar la obtención de

biomasa de los cultivos puros de levaduras haciendo un crecimiento en toda la

superficie del medio ASS al 4% contenido en placas petri, los que se cosecharon

con agua destilada estéril, luego se centrifugó a 2000 rpm por 15 minutos,

finalmente se obtuvo el peso de la biomasa de la levadura, la que está lista para

evaluar su capacidad fermentativa.



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2.6. Selección de la capacidad fermentativa por el método

de Davies-Griffith modificado. La biomasa de levaduras obtenido en el paso anterior se resuspendió en 20mL de

Caldo Sabouraud Sacarosado al 10 % (CSS) y se colocó en un dispositivo de

fermentación en condiciones asépticas. Luego se selló con parafina para evitar la

fuga del gas producida por las levaduras; en la parte del embone del dispositivo,

se instaló una manguera de venoclisis para recoger el gas. El otro extremo de la

manguera de venoclisis se introdujo en una jeringa hipodérmica de 20mL llena de

solución de NaCl al 23% coloreado con azul de metileno, donde se midió la

producción del gas producido por las levaduras a través del tiempo. (25)

2.7. Evaluación de la capacidad fermentativa de

Saccharomyces. La evaluación de la capacidad fermentativa de cada cultivo puro de levadura se

realizó midiendo la producción de CO2 durante diez horas continuas de

fermentación, haciéndose lectura cada 2 horas (por triplicado).

El volumen de CO2 producido cada dos horas fue convertido a gramos de

etanol/gramos de levadura por hora, luego se calculó la productividad para cada

cultivo. En este paso, se seleccionó a la levadura mejor productora de etanol.

2.8. Análisis de datos Las Capacidades fermentativas medida en productividades (g.etanol/g levadura.

hora) de cada cultivo puro de levadura aislada de Chicha de Jora del mercado de

abastos de Monsefú, se clasificaron, organizaron y presentaron en tablas y figuras.

Los datos obtenidos de las productividades de las levaduras seleccionadas, fueron

evaluados por la prueba de T- Student para comparar y observar las diferencias

significativas. (26)



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RESULTADOS

Se aisló 40 y seleccionó 7 levaduras productoras de etanol a partir de muestras de

chicha de jora de 5 puestos de venta del mercado de abastos de Monsefú. De los

que presentaron características macroscópicas y microscópicas compatibles con

Saccharomyces (Figura 1)

A las levaduras seleccionadas se evaluó la productividad de etanol, utilizando el

método de Davies-Griffith modificado, durante 10 horas.

La Tabla 1, se observa la producción de etanol en gramos generados por cada

cultivo al fermentar en 10 mL de Caldo Sabouraud Sacarosado durante 10 horas

que duró la evaluación. Siendo los de mayor productividad los cultivos BT13L-D5 y

BT13L-D2, con 0.13 y 0.11 g.etanol/g levadura. h, respectivamente.

La Figura 2, muestra los perfiles de las productividades promedio de las levaduras

aisladas de la chicha de jora, obtenidas en Caldo Sabouraud Sacarosado y a

temperatura ambiente. La tendencia de la productividad es similar; sin embargo,

se observa una mayor productividad en los cultivos BT13L-D5 y BT13L-D2.



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Figura 1. Observación macroscópica, en ASS, y microscópica de levaduras

aisladas de la chicha de jora.



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Tabla 1. Capacidad fermentativa promedio (productividad) de Saccharomyces sp.

aisladas de Chicha de Jora del Mercado de Abastos de Monsefú – Perú, utilizando

el método de Davies-Griffith modificado.

Productividad (g.etanol/g levadura. h)

Saccharomyces Tiempo (horas)

2 4 6 8 10

BT13L -D1 0.015 0.033 0.048 0.066 0.078

BT13L-D2 0.023 0.041 0.067 0.091 0.110

BT13L-D3 0.016 0.034 0.052 0.075 0.100

BT13L-D5 0.028 0.055 0.096 0.110 0.130

BT13L-D6 0.014 0.027 0.042 0.060 0.074

BT13L-D8 0.013 0.026 0.041 0.055 0.071

BT13L-D9 0.015 0.025 0.038 0.053 0.070



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Figura 2. Perfiles de la productividad promedio de Saccharomyces aisladas de la

chicha de jora, en Caldo Sabouraud Sacarosado y a temperatura ambiente,

medida durante 10 horas.

0.00E+00

2.00E-02

4.00E-02

6.00E-02

8.00E-02

1.00E-01

1.20E-01

1.40E-01

0 2 4 6 8 10 12

Pro

du

ctiv

idad

pro

me

dio

(g.

eta

no

l/g

leva

du

ra. h

)

Tiempo (horas)

BT13L -D1

BT13L-D2

BT13L-D3

BT13L-D5

BT13L-D6

BT13L-D8

BT13L-D9



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DISCUSIÓN

Las levaduras son los microorganismos más utilizados para la producción

de etanol por la vía fermentativa, debido a que producen un mejor proceso de

separación después de la fermentación, además producen un contenido de

toxinas muy inferior a otros microorganismos. (27)

Para el aislamiento se usó Agar Sabouraud Sacarosado, en donde el crecimiento

de las colonias tuvo un aspecto característico al de Saccharomyces,

observándose el color, la textura y bordes de la colonia, lográndose aislar 40

levaduras de las diferentes muestras de chicha de jora. Las levaduras

fermentativas necesitan los azúcares para su catabolismo, es decir para obtener

energía necesaria para sus procesos vitales, pero además necesitan otros

substratos para su anabolismo como son nitrógeno, fósforo, carbono, azufre,

potasio, magnesio y vitaminas, especialmente de tiamina (vitamina B1). Por ello es

de vital importancia que el medio disponga de una base nutricional adecuada para

poder llevar a cabo la fermentación alcohólica. (28)Se usó ASS porque cumple con

las necesidades fisiológicas para el crecimiento y desarrollo de la levadura, siendo

materia nitrogenada, la peptona; azúcar, la sacarosa; un soporte sólido, el agar y

un pH ácido, ya que es más conveniente porque inhibe el crecimiento de las

bacterias. (29)

Saccharomyces muestra 5 fases de crecimiento bien definidas cuando es

cultivado en medios líquidos con glucosa como fuente de carbono: la fase lag, la

fase logarítmica, el cambio diáuxico, la fase postdiáuxica y la fase estacionaria. La

fase lag es un periodo de adaptación en el cual la célula se prepara para dividirse.

Durante la fase logarítmica las células alcanzan su máxima velocidad de

duplicación y llevan a cabo un metabolismo fermentativo del que se produce

etanol. Al disminuir la concentración de glucosa, las células atraviesan por el

cambio diáuxico, un periodo breve de tiempo en el cual no hay división, y la célula



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cambia de un metabolismo fermentativo a uno respiratorio. En la fase postdiáuxica

las células usan como fuente de carbono el etanol producido durante la fase

logarítmica e incrementan su resistencia al estrés gradualmente; en tanto que la

fase estacionaria se presenta cuando los nutrientes del medio se han agotado y no

hay división celular. (30)

El crecimiento en masa de las levaduras no resulta apropiado para su

identificación; en los cultivos de agar, como se presenta en la Figura 1, es difícil

diferenciar las colonias de levaduras de las de bacterias por lo que la observación

microscópica es una de las formas para su diferenciación, pero además se realizó

identificación bioquímica de las levaduras utilizándose carbohidratos como:

lactosa, manitol, maltosa, sacarosa y fructosa, se incubó durante 48h y a

temperatura ambiente, luego de este tiempo se observó crecimiento con grumos y

turbidez en las 3 últimas, tomándose estas como positivas y el resto negativas, en

el cual se comprobó que las levaduras aisladas y seleccionadas pertenecen al

género Saccharomyces. (31)

(Anexo 7)

En el presente trabajo se evaluó la productividad de las diferentes levaduras

aisladas de chicha de jora utilizando el método de Davies-Griffith modificado (32).

(Anexo 6) Este método permite calcular en forma indirecta la producción de etanol

midiendo el volumen de CO2 producido, esta equivalencia es factible debido a que

a partir, de un mol de glucosa se producen 2 moles de etanol y 2 moles de CO2;

por lo tanto, el número de moles de CO2 es equivalente al número de moles de

etanol producido. (27)Aunque no refleja verdaderamente la realidad, puesto que la

glucosa no toda se transforma en etanol y CO2 exclusivamente, es suficiente para

revelar el metabolismo característico de una levadura productora de alcohol, en

contraste con una levadura de panificación. (33)

Los resultados obtenidos de las levaduras, luego de ser identificadas con los

diferentes tipos de carbohidratos, demuestran que los cultivos aislados tienen



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diferentes capacidades fermentativas, siendo algunas mejores fermentadoras que

otras, como es el caso de la levadura BT13L-D5 que tuvo una productividad de

0.13 g.etanol/g levadura. h., este resultado fue obtenido utilizando el método de

Davies-Griffith modificado, resuspendido en Caldo Sabouraud Sacarosado al 10%

(CSS) y a temperatura ambiente, midiendo la productividad durante 10 horas

continuas.

La productividad obtenida no supera a otras levaduras antes aisladas, a pesar de

haberse trabajado con el mismo método, por ejemplo, Centurión (2008) aisló

levaduras productoras de etanol de fresa, ciruela y uva, siendo las mayores

productividades 2.86 x 10-2, 4.58 x 10-2 y 3.75 x 10-2 g etanol/g de lev.h.,

respectivamente. También se da en el caso de Robles (2012), quien aisló

levaduras productoras de etanol a partir de chicha de jora del mercado Mayorista

de Trujillo, en el cual las levaduras aisladas se les dio el código de BT-R1 Y BT-

R2, y mostraron productividades en promedio de 0.57 x 10-2 y 0.56 x 10-2 g

etanol/g de lev. h, respectivamente.

Estos resultados, probablemente fueron debidos, en el primer caso, a que no se

utilizó la Solución Azucarada Bufferada sino el Caldo Sabouraud Sacarosado, que

incluye otros componentes como el K2HPO4 y el NaH2PO4, en el cual su aporte

será esencial para el crecimiento, regular la síntesis de los lípidos y los

carbohidratos y mantiene la integridad de la pared celular, además a pH ácido

estimula la fermentación y la respiración, actúa como efector de numerosas

enzimas; piruvato quinasas, aldolasas, aldehídos deshidrogenosas, y permeasas e

interviene en la estructura de los ARN. (34)

En el segundo caso, que se trabajó con el mismo método y se utilizó el mismo

medio de fermentación, probablemente al momento de purificar los cultivos

provenientes de chicha de jora, se haya repicado células “agotadas” y produzca

poca actividad en la producción de etanol. Así mismo, cabe la posibilidad de haber

ocurrido un proceso degenerativo o deterioro gradual del rendimiento de las

levaduras como consecuencia de alguna mutación durante la manipulación. (35)



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Al considerar todos estos compuestos necesarios para un buen proceso en la

asimilación, no todas las levaduras aisladas tuvieron la capacidad de ser buenos

productores de etanol, debido a que varía con las diferentes clases, aún dentro de

un mismo género y de una misma especie.

También la influencia de la temperatura es muy importante sobre el desarrollo de

la fermentación alcohólica. La disminución o el aumento de la temperatura en un

intervalo entre 4 y 40°C afecta el funcionamiento de numerosas actividades

enzimáticas. En este intervalo, una variación de temperatura afecta negativamente

la tasa de crecimiento alrededor de un óptimo situado entorno a 30°C (36), es por

eso que este trabajo fue realizado a temperatura ambiente.

El pH tiene un marcado efecto en la velocidad de crecimiento y en el rendimiento.

El pH óptimo para algunos organismos en especial para las levaduras se

encuentra en un rango de 4.0 a 6.0. Un cambio en el valor de pH puede afectar su

composición o su naturaleza de la superficie microbiana al disociarse ácidos y

bases. Este último puede afectar la floculación de la biomasa o la adhesión a las

paredes. El pH tiene una gran influencia en los productos finales del metabolismo

anaerobio. (34)



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ENUNCIADO RESUMEN

Se aislaron 40 cultivos de levaduras con capacidad fermentativa a partir de chicha

de jora del Mercado de Abasto de Monsefú- Perú.

Se seleccionaron 7 cultivos puros de levaduras del género Saccharomyces con

capacidad fermentativa a partir de chicha de jora del Mercado de Abasto de

Monsefú- Perú.

Se evaluó la productividad de los cultivos puros de levaduras del género

Saccharomyces aislados a partir de chicha de jora del Mercado de Abasto de

Monsefú- Perú, siendo los de mayor productividad los cultivos BT13L-D5 y BT13L-

D2, con 0.13 y 0.11 g.etanol/g levadura. h, respectivamente.



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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Tesis para optar el título de Biológo. Universidad Michoacana de San

Nicolás de Hidalgo. México.

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11) García, V.; Mamani, G. 2008. Selección de Levaduras nativas

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Maestro en Ciencias en Biología Experimental. Universidad Michoacana

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14) Wiseman, A. 1986. Principios de Biotecnología. Edit. Acribia S.A.

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Molina. Lima-Perú.



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http://dialnet.unirioja.es/servlet/autor?codigo=2033347



http://dialnet.unirioja.es/servlet/revista?codigo=6706

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http://www.munimonsefu.gob.pe/

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agroindustriales y comerciales de la chicha de jora y quinua en las

comunidades beneficiarias del proyecto “Runa Kawsay”. Tesis para

optar el título de Ingeniero Agroindustrial. Ecuador.

21) Vásquez V. et al. Efecto de la dilución de chicha de maíz (Zea mays) y

caudal de ingreso a un sistema de irradiación ultravioleta en el

contenido de bacterias mesófilas. Agroind Sci. 2011; 1 (1): 6- 14.

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Química. 2012; 32 (1): 34-42

28) Vergel J. 1995. Evaluación de la capacidad fermentativa de cinco

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29) Arenas R. 2010. Micología Médica Ilustrada. 4ta ed. Edit. Mc Graw-Hill

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31) Mercedes-Ferreyra, M. 2006. Estudio del Proceso Biotecnológico para

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33) Villanueva T.,E; H. Robles C. y M. Otininiano G. 2008. Guía de

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ANEXOS



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Anexo 1. Composición de Agar Sabouraud Sacarosado (ASS) al 4 %

Componentes Cantidad

Peptona 1.0 g

Sacarosa 4.0 g

Agar 2.0 g

Agua destilada 100.0 mL

pH 6.0 + 0.2

Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos y a 15 lb de presión, enfriar a

45 °C y servir en placas de Petri y tubos estériles.



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Anexo 2. Composición del Caldo Sabouraud Sacarosado (CSS) al 10%

Componentes Cantidad

Peptona 1.0 g

Sacarosa 10.0 g

Agua destilada 100.0 mL

pH 6.0 + 0.2

Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos y a 15 lb de presión.



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Anexo 3. Frascos conteniendo ASS con cultivos de levaduras aisladas a partir de

chicha de jora.



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Anexo 4. Crecimiento de Saccharomyces en ASS, incubado a temperatura

ambiental.



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Anexo 5. Carbohidratos usados en la identificación bioquímica.



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Anexo 6. Sistemas para medir la productividad de etanol de Saccharomyces,

incubado a temperatura ambiente (25 + 3), durante 10 horas.



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Anexo 7. Tabla utilizada para la identificación bioquímica para Saccharomyces.



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