Coloraciones bacterianasObjetivo Comprender los pasos necesarios para realizar la tincin deGram Reconocer los microorganismos Gram positivos y negativos. Identificar la morfologa (coco, bacilo, etc) y tipo de tincin (Gram positiva o Gram negativa) de las cepas proporcionadas.

Fundamentos de la prcticaLa tincin de Gram fue creada por Hans Christian Gram a fines del siglo XIX y puede utilizarse para separar la mayora de las especies bacterianas en dos grandes grupos, a saber, las que captan el colorante bsico, cristal violeta (es decir las bacterias gran positivas), y las que pierden ese colorante por el lavado con el decolorante alcohol o acetona (es decir las bacterias gram negativas).TECNICAS DE TINCION PARA LA MICROSCOPIA OPTICA.Preparacin del extendido:Los mtodos de tincin se utilizan en forma directa con las muestras del paciente o se aplican a los preparados obtenidos a partir del desarrollo de los microorganismos en cultivos.Por lo general las muestras se colocan sobre el portaobjeto con un hisopo que contiene el material del paciente o con una pipeta dentro de la cual se encuentra la muestra de lquido aspirado. El material que se va a teir se coloca en forma de una gota (si la muestra es liquida) o se rota (si la esta e un hisopo) sobre la superficie de un portaobjeto limpio y seco.Es importante evitar la contaminacin de los medios de cultivo; por lo tanto, una vez que el hisopo toco la superficie de un portaobjetos no estril no debe utilizarse para la inoculacin posterior de medios de cultivo. Para la tincin de los microorganismos que crecen en cultivos puede utilizarse una aguja estril para transferir una pequea cantidad del cultivo desarrollado en un medio solido a la superficie del portaobjetos. Este material se emulsiona en una gota de agua o solucin salina 0.9% estril sobre el portaobjeto. En caso de cantidades pequeas que puedan perderse incluso en una gota de solucin fisiolgica se puede utilizar n aplicador de madera estril para obtener el material; luego este material se frota directamente sobre el portaobjetos que se va a teir se deja secar y se fija al portaobjeto mediante su colocacin sobre una platina caliente (a 60C) durante por lo menos 10 minutos o cubrindolo con metanol al 95% durante 1 minuto.Para examinar los microorganismos que crecen en medio lquido se aplica una muestra aspirada del caldo de cultivo sobre el portaobjetos, se seca y se fija antes de la tincin.La preparacin de los frotis vara de acuerdo con el tipo de muestra que se va a procesar y con los mtodos de tincin que se van a utilizar. No obstante la regla general para la preparacin de frotis es que debe aplicarse una cantidad de material suficiente sobre el portaobjeto para maximizar las posibilidades de detectar y diferenciar los microorganismos. Por ltimo, el mtodo de tincin que se debe utilizar esta determinado por el tipo de microorganismo buscado.

TINCION DE GRAMLa tincin de gram es la tcnica principal utilizada para el examen microscpico de las bacterias. Casi todas las bacterias de importancia clnica pueden detectarse con este mtodo.Las nicas excepciones son: Los microorganismos que se hallan casi con exclusividad dentro de las clulas husped (p. ej., clamidias). Los que carecen de pared celular (p. ej., micoplasmas y ureoplasmas). Los que tienen un tamao insuficiente para ser observados por el microscopio ptico (p. ej., espiroquetas). Los que tienen una diferente composicin en su pared y no captan los colorantes (p. ej., mycobacterias).

Tincin Primaria: Se utiliza Cristal Violeta, que tie todas las clulas moradas. Mordiente: Yodo o lugol. El yodo, aparte de matar bacterias, incrementa la afinidad del colorante primario con la clula, formando complejos insolubles con este. El complejo cristal violeta-yodo sirve para intensificar el color del tenido. Agente decolorante: Se utiliza alcohol etlico al 95%. El etanol tiene doble funcin: deshidratante de protenas y solvente de lpidos. El alcohol disuelve los lpidos de la parte externa de la pared celular Gram-negativa, haciendo la pared ms porosa. De esta manera, el complejo Cristal violeta-yodo es removido de la capa de mureina ms fina de las bacterias Gramnegativas, mientras que la pared ms gruesa de las Gram-positivas retiene el tinte en su interior. Tincin de Contraste: Safranina. Este tinte se utiliza para teir de rojo las clulas previamente decoloradas, o sea, las Gram-negativas.

Metodos y ProcedimientosMaterialesMateriales:Mechero de Bunsen

Portaobjetos

Pizeta

Hisopos

Equipo: Microscopio ptico

Reactivos:Cristal violetaSolucin de lugolAlcohol acetonaSafraninaAceite de inmersin

Muestra:Proporcionada por el alumno(a).

ProcedimientoExtensin: primeramente se agarro un portaobjetos y luego se coloc una pequea cantidad de la saliva que se obtuvo del hisopo y se extendi sobre el portaobjeto, luego se flamea la muestra para fijarlo con ayuda del mechero.Coloracin: Se aplic a la muestra fijada anteriormente una cantidad del colorante cristal violeta de Hucker suficiente para cubrir la superficie del extendido durante un minuto y se lav con agua destilada la muestra fijada, seguidamente se aplic lugol (mordiente) sobre toda la superficie del extendido durante un minuto, luego se agreg alcohol acetona para retirar el exceso de colorante (decolorante) y se lav con agua destilada, despus se aplic safranina (colorante de contraste) durante un minuto y nuevamente se la se lav la muestra pero esta vez con agua corriente, luego se dej secar la muestra, colocndola invertida sobre papel, una vez que la preparacin estuvo totalmente seca, se puso una gota muy pequea de aceite de inmersin y se observ al microscopio con el objetivo de inmersin. (Este procedimiento se repito una vez ms, para observar otro tipo de bacteriasResultadosSe pudo observar cocos, diplococos y algunos bacilos en las muestras obtenidos al verlas por el microscopio.

Conclusiones

El tamao de las bacterias dificulta su visin al microscopio, por eso la tincin de estas en la microbiologa es un tema sumamente trascendente. La tcnica de tincin tiene como finalidad crear un contraste entre la clula y el medio que la rodea, y una de las ms importantes, tanto por su aplicacin clnica para hacer una identificacin preliminar de la bacteria causal de la infeccin y por su practicidad, es la tincin de Gram. El estudio de la literatura acerca de la tincin de Gram nos permite tener un prembulo para poder diferenciar frente al microscopio los diferentes tipos de microorganismos, sin embargo, no hay que pasar por alto que es de suma importancia tener un completo estudio previo de los organismos y su reaccin a la tincin para poder dar una respuesta certera ante el cuestionamiento de la naturaleza de un microorganismo.

Bibliografa1. Koneman, E. Diagnostico microbiolgico, Editorial mdico panamericana,2. Jawetz Ernest, Microbiologa mdica, 17 edicin en espaol, Manual moderno, Mxico, Mxico 2002.3. Bailey & Scott, Diagnstico microbiolgico, 11 edicin, Editorial Panamericana, Buenos Aires Argentina, 2 004.4. Salazar Wilson, Guas de prctica de Laboratorio de Microbiologa, Depart. de publicaciones de la Facultad de Ciencias Mdicas, Quito Ecuador, 2007.